SEMINAR phân tích vùng dấu vân tay của oxytropis falcate bằng UPLC ESI MS

Trắc nghiệm, bài giảng pptx các môn chuyên ngành Y dược hay nhất có tại “tài liệu ngành Y dược hay nhất”; https://123doc.net/users/home/user_home.php?use_id=7046916. Slide kiểm nghiệm seminar về sắc ký hiện đại ppt dành cho sinh viên ngành Y dược. Trong bộ sưu tập có trắc nghiệm kèm đáp án chi tiết các môn, giúp sinh viên tự ôn tập và học tập tốt môn kiểm nghiệm seminar về sắc ký hiện đại bậc cao đẳng đại học ngành Y dược và các ngành khác

của Oxytropis falcate bằng

UPLC-ESI-MS

11

MARKETING PRESENTATION

3

TỔNG QUAN

33

MARKETING PRESENTATION

MS

Nhận diện & định lượng các hợp chất

có trong O.falcate

44

5

GIỚI THIỆU

55

MARKETING PRESENTATION

Sắc kí vùng dấu vân tay cho biết thông tin

về cấu hình và xác định thành phần

UPLC-PDA-ESI-MS

66

7

• Về cây O.falcate:

 Oxytropis falcate Bunge, thuộc họ Đậu, phân bố chủ yếu ở cao

nguyên Thanh Hải-Tây Tạng, Trung Quốc, được ghi nhận trong

Dược điển Trung Quốc vào năm 1977.

 Được mệnh danh như “Vua của các loại thuốc”

 Công dụng: điều trị các chứng tăng bạch cầu, xuất huyết, tác dụng giảm đau, kháng viêm, lành vết thương, chữa các bệnh cúm, bệnh than,…

 Thành phần chính flavonoid

77

MARKETING PRESENTATION

8

THỬ NGHIỆM

 THIẾT BỊ

 ĐIỀU KIỆN UPLC VÀ MS

 PHÂN TÍCH DỮ LIỆU

88

9

THIẾT BỊ

• Waters ACQUITY UPLCTM (Waters, Milford, MA, USA)

ghép bơm nhị phân, tiêm mẫu tự động, bộ phận điều biến nhiệt, đầu dò PDA eλ

• Dữ liệu được ghi nhận và xử lý bằng hệ thống Masslynx 4.1.

99

MARKETING PRESENTATION

11

THUỐC THỬ VÀ NGUYÊN LIỆU

• Acetonitril dùng cho sắc kí: Merck Co (Darmstadt, Germany)

• Hóa chất khác: Tianjin Chemical Reagent Co (Tianjin, China)

• Nước siêu tinh khiết sử dụng hệ thống tinh khiết OKP: Shanghai Laikie Instrument Co Ltd (Shanghai, China)

• Hợp chất liên quan

11

MARKETING PRESENTATION

13

ĐIỀ U KIỆN UPLC VÀ MS

• UPLC vùng dấu vân tay bằng Waters ACQUITY UPLC BEH

 Nhiệt độ cột: 30 oC, nhiệt độ phòng bảo quản mẫu 18 oC

 Thể tích tiêm mẫu: 2 μL và tiến hành partial loop with needle

overfill

 Vùng hấp thu: 190-400 nm

15

ĐIỀU KIỆN UPLC VÀ MS

• Full-scan MS và sự ghi nhận ion chọn lọc (SIR) ở chế độ ion

dương Tín hiệu từ PDA đến ESI thông qua mao dẫn

 Nguồn nhiệt: 110°C, nhiệt độ khử solvat: 350°C

 Điện áp mao dẫn: 3,0 kV, điện áp cone: 25 V

 Tốc độ dòng của khí khử solvat: 600 L/h, đầu khí cone (N2): 50 L/h. 

 Vùng phổ khối: 50-800 m/z

`

14

MARKETING PRESENTATION

16

CHUẨN BỊ MẪU CHUẨN

 Hòa tan trong 80% methanol

 Lọc qua màng lọc 0,2 μm

 Bảo quản ở 0-4 oC trước khi phân tích

3 T H Ử N G H I Ệ M

15

17

CHUẨN BỊ MẪU THỬ

• Phơi khô toàn cây và nghiền thành bột

• Cân chính xác 2,00 g bột vào bình nón nút mài

• Chiết với 50 mL 80% methanol trong 45 phút trong bể siêu âm ở

70 kHz

• Để yên đến nhiệt độ phòng

• Lọc qua giấy lọc và màng lọc 0,2 μm

16

MARKETING PRESENTATION

18

PHÂN TÍCH DỮ LIỆU

• Phần mềm SPSS 16.0

• Phần mềm SIMCA-P 12.0

• Phần mềm đánh giá tính tương thích cho sắc kí vùng dấu vân

tay của thuốc đông dược (Version 2004 A)

3 T H Ử N G H I Ệ M

17

19

KẾT QUẢ - BÀN LUẬN

18

• TỐI ƯU HÓA CÁC ĐIỀU KIỆN UPLC

• TỐI ƯU HÓA CÁC ĐIỀU KIỆN CHUẨN BỊ MẪU THỬ

 ĐỘ CHÍNH XÁC

 ĐỘ LẶP LẠI VÀ ĐỘ ỔN ĐỊNH

 ĐỘ ĐẶC HIỆU

• SỰ THÀNH LẬP UPLC VÙNG DẤU VÂN TAY VÀ

PHÂN TÍCH TÍNH TƯƠNG THÍCH (SA)

• PHÂN TÍCH PHÂN NHÓM THEO THỨ BẬC (HCA)

• PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN CHÍNH (PCA)

• PHÂN TÍCH KHỐI PHỔ

MARKETING PRESENTATION

20C

4 K Ế T Q U Ả - B À N L U Ậ N

T Ố I Ư U H Ó A C Á C Đ I Ề U K I Ệ N U P L C

Yếu tố Mục đích Khảo sát Điều kiện

Bước

sóng phát

hiện

Nhiều peak hơn

190-400

• Thu được độ phân giải, tính đối xứng và số lượng peak đặc trưng

Nhiệt độ

cột

Sự phân tách hiệu quả

25-45 °C 30 °C

• Nhiệt độ cột cao hơn có thể mang lại thời gian phân tích ngắn hơn, nhưng không thể cung cấp sự phân tách hiệu quả hơn

bị ảnh hưởng

• Thể tích tiêm không đủ, số lượng peak đặc trưng có thể bị

và nước với một số chất thêm vào gồm acid acetic, acid formic và acid

phosphoric

Acid acetic 0,5% (A) và acetonitril (B) ở chế

độ gradient tuyến tính

• Acetonitril có thể cung cấp áp suất cột thấp hơn và đường nền ổn định hơn so với

methanol

• Nhiều peak sẽ được xuất hiện hơn khi sử dụng dung dịch acetonitril và acid acetic

• Acid acetic 0,1%, đường nền không ổn định.

• Acid acetic 0,1% và 0,3%, chiều cao peak thấp hơn và với nồng độ tăng liên tục, không thấy sự khác biệt rõ rệt giữa ba nồng độ

• Acid acetic (dưới 0,3%) không đủ cao để đảm bảo sự ổn định của các thành phần gradient, thời gian gradient, hình dạng gradient và thành phần ban đầu của pha động.

Acid acetic (0,1%, 0,3%, 0,5%, 0,7%

và 1,0%)

20

MARKETING PRESENTATION

Chiết bằng siêu âm

Dung môi

chiết

Methanol Ethanol Methanol - nước (80%, 60%, 50%, 40% và 30%) Ethanol - nước (80%, 60%, 50%, 40% và 30%)

80% methanol

Số lượng peak và diện tích peak của hầu hết các hợp chất cao hơn so với các dung môi khác.

để nhận dạng.

21

4 K Ế T Q U Ả - B À N L U Ậ N

MARKETING PRESENTATION

24C

Độ chính xác trong

1 ngày có giá trị RSD của RT là 0- 0,7% và của PA là 1,0-3,6%

Độ chính xác giữa

các ngày có giá trị RSD của RT là 0- 0,5% và của là PA 1,5-6,1%, thấp hơn

nhiều so với tiêu chuẩn quốc gia là 10%.

RT: thời gian lưu PA: diện tích peak

MARKETING PRESENTATION

cả đều cao hơn

0,99 và giá trị RSD của RT là 0-0,9% và

PA là 1,1-3,3%.

27

T H Ẩ M Đ Ị N H P H Ư Ơ N G P H Á P

• Oxytropis kansuensis Bunge và Oxytropis melanocalyx Bunge thuộc

cùng một chi với O falcate đã được phân tích trong các điều kiện

tối ưu để nghiên cứu tính đặc hiệu của phương pháp

Đ Ộ Đ Ặ C H I Ệ U

26

MARKETING PRESENTATION

28C

T H Ẩ M Đ Ị N H P H Ư Ơ N G P H Á P Đ Ộ Đ Ặ C H I Ệ U

Hình 4.1 Sắc ký đồ của O kansuensis (A), O melanocalyx (B) và O falcate (C)

27

=> Sắc ký đồ của O kansuensis và O melanocalyx khác với O

falcate đáng kể Điều này chỉ ra rằng phương pháp được sử dụng để

phân tích dấu vân tay của O falcate là đặc hiệu.

4 K Ế T Q U Ả - B À N L U Ậ N

29

S Ự T H À N H L Ậ P U P L C V Ù N G D Ấ U V Â N TAY

P H Â N T Í C H T Í N H T Ư Ơ N G T H Í C H ( S A )

• Phân tích vùng dấu vân tay của TCMs:

 cung cấp tài liệu tham khảo để phân loại và kiểm soát chất lượng dược liệu

 cơ sở để thể hiện chất lượng và tính ổn định của dược liệu

• 21 lô mẫu được thu thập từ tỉnh Cam Túc, tỉnh Thanh Hải và Khu tự trị Tây Tạng của Trung Quốc đã chuẩn bị và được tách riêng biệt bởi

UPLC trong các điều kiện tối ưu

28

MARKETING PRESENTATION

 Số lượng peak của mẫu S5 và S10 ít hơn so với các mẫu khác.

 Sắc kí đồ của mẫu S21 khác biệt rõ ràng với các mẫu khác.

4 K Ế T Q U Ả - B À N L U Ậ N

tương thích dấu vân tay sắc ký

• Sự giống nhau của các sắc ký đồ được đánh giá bằng cách tính hệ

số tương quan và giá trị cosin của góc vectơ

• Khi các hệ số tương quan giữa mỗi sắc ký đồ của các mẫu cao hơn 0,9, các mẫu được coi là có liên quan cao và có thể được phân loại thành một nhóm

30

MARKETING PRESENTATION

tương tự nhau dựa trên 3 nguyên tắc sau:

 Các peak được chọn phải có mặt trong hơn 90% số lượng mẫu

 Các peak được chọn đại diện cho các thành phần tinh khiết và các peak có thể gây khó khăn cho việc lựa chọn tốt hơn là không nên

chọn

 Các peak nên được phân bố đều và ổn định

32

MARKETING PRESENTATION

Các giá trị của tính tương thích đều > 0,900 trừ mẫu S5 (0,679) (Thanh

Hải), S21 (0,699) (Cam Túc) và S10 (0,425) và S18 (0,865) (Khu tự trị Tây

Tạng) không đạt tiêu chuẩn (unqualified).

4 K Ế T Q U Ả - B À N L U Ậ N

=> TPHH của các mẫu khác nhau có thể không do ảnh hưởng do cùng

một khu vực, mà liên quan đến thời gian thu thập hoặc môi trường

phát triển.

MARKETING PRESENTATION

36C

S Ự T H À N H L Ậ P U P L C V Ù N G D Ấ U V Â N TAY

P H Â N T Í C H T Í N H T Ư Ơ N G T H Í C H ( S A )

• Tính tương thích không đủ để phản ánh sự phân bố của các loại

dược liệu Vùng dấu vân tay nhấn mạnh tính tương thích của cùng một nhóm và tính tương thích được phản ánh bởi tính toàn vẹn và

độ mờ của sắc ký đồ

=> Do đó cần có HCA và PCA

35

4 K Ế T Q U Ả - B À N L U Ậ N

36

MARKETING PRESENTATION

Tây Tạng, Thanh Hải, Cam Túc

Hình 4.4 Sơ đồ cây phân nhóm theo diện tích peak UPLC

Cam Túc Thanh Hải

Tây Tạng, Thanh Hải, Cam Túc

 Khoảng cách giữa ba nhóm là ngắn Nói cách khác, các mẫu được thu

thập từ tỉnh Thanh Hải có mối quan hệ chặt chẽ với hai nhóm còn lại về chất lượng

 Sự phân nhóm mẫu, chất lượng mẫu không chỉ liên quan đến nguồn gốc địa lý, mà còn liên quan đến môi trường phát triển, năm sinh

trưởng, mùa thu hoạch và các yếu tố khác.

4 K Ế T Q U Ả - B À N L U Ậ N

39

P H Â N T Í C H T H À N H P H Ầ N C H Í N H ( P C A )

• PCA là một công cụ được sử dụng rộng rãi để trích xuất thông tin

và giảm kích thước dữ liệu, đơn giản hóa việc phân tích và tính toán đồng thời Trên cơ sở không mất hoặc mất ít thông tin gốc,

nhiều chỉ số liên quan ban đầu được chuyển thành dữ liệu toàn diện bằng PCA Vùng dấu vân tay có một số lượng lớn peak trong sắc ký

và được đặc trưng bởi sự tương quan giữa các peak  

• Sử dụng phần mềm SIMCA-P 12.0, diện tích của 30 peak phổ biến ở vùng dấu vân tay được phân tích như 30 biến số 21 lô mẫu được phân loại và phân tích sâu hơn bằng PCA Do đó, tạo thành một ma trận dữ liệu 21x30 Biểu đồ phân tán của PCA được thể hiện qua

hình 6, dưới sự hỗ trợ của 2 thành phần chính đầu tiên là PC1 và PC2

38

MARKETING PRESENTATION

40C

P H Â N T Í C H T H À N H P H Ầ N C H Í N H ( P C A )

Hình 4.5 Biểu đồ phân tán điểm thu được từ PCA của 21 lô O falcate

39

Biểu đồ phân tán điểm cho thấy các mẫu thu được từ ba nguồn gốc có

chất lượng tương tự nhau

=> Kết quả của PCA là tương ứng với kết quả thu được từ HCA.

4 K Ế T Q U Ả - B À N L U Ậ N

 Lưu lượng khí khử solvat (N2)

 Điện áp mao quản (chế độ ion dương - chế độ ion âm)

 Điện áp cone

 Lưu lượng khí cone

Chế độ ion dương phù hợp với việc phát hiện 11 hợp chất tham chiếu tốt hơn chế độ ion âm và hiệu điện thế cone ảnh hưởng đáng kể đến quá trình ion hóa.

• Trong chế độ ion dương ESI, các ion [M+H]+ đã được quan sát và trọng lượng phân tử được xác định dựa trên thông tin của các ion [M+H]+ 40

MARKETING PRESENTATION

42C

P H Â N T Í C H K H Ố I P H Ổ

Hình 4.6 Sắc ký UPLC-PDA ở 270nm (a) và sắc ký ion đồ của O falcate (S4) ở chế độ

4 K Ế T Q U Ả - B À N L U Ậ N

MARKETING PRESENTATION

45

KẾT LUẬN

 Kỹ thuật UPLC phân tích vùng dấu vân tay của O.falcate với độ

chính xác, độ lặp lại, độ ổn định và độ đặc hiệu cao

 Chất lượng của O.falcate có liên quan đến nhiều yếu tố khác

nhau như nguồn gốc địa lý, môi trường trồng trọt, tuổi thọ,

mùa thu hoạch…

 UPLC-ESI-MS có liên quan đến việc sử dụng ion [M+H] + ở chế

độ ion dương và sự ghi nhận ion chọn lọc (SIR).

 11 peak trong sắc kí đồ được xác định dựa trên sự so sánh thời gian lưu, phổ UV và khối lượng phân tử cùng với hợp chất

liên quan.

 Bài nghiên cứu cung cấp tài liệu tham khảo quan trọng cho

việc sử dụng kỹ thuật UPLC trong nhận dạng và kiểm định

CẢM ƠN THẦY VÀ CÁC BẠN ĐÃ LẮNG NGHE

45