Trắc nghiệm, bài giảng pptx các môn chuyên ngành Y dược hay nhất có tại “tài liệu ngành Y dược hay nhất”; https://123doc.net/users/home/user_home.php?use_id=7046916. Slide kiểm nghiệm seminar về sắc ký hiện đại ppt dành cho sinh viên ngành Y dược. Trong bộ sưu tập có trắc nghiệm kèm đáp án chi tiết các môn, giúp sinh viên tự ôn tập và học tập tốt môn kiểm nghiệm seminar về sắc ký hiện đại bậc cao đẳng đại học ngành Y dược và các ngành khác
Trang 1Ứng dụng Sắc ký lỏng trong Kiểm nghiệm
PHÂN TÍCH VÙNG DẤU VÂN TAY CỦA
OXYTROPIS FALCATE BẰNG UPLC-ESI-MS
Trang 2Tóm tắt, giới thiệu
(Abstract, introduction)
Kết quả và bàn luận
(Result and discussion)
Nguyên liệu - Phương pháp
Trang 6• Cung cấp hình thái tích hợp và thông tin hóa học của một hệ thống phức tạp
• Xác định tính xác thực của dược liệu
Sắc ký lỏng siêu hiệu năng
Trang 7Nguyên liệu – Phương pháp
• Waters ACQUITY UPLCTM (waters, milford, MA, USA) bộ phát hiện mảng photodiode
• Waters ACQUITY Triple Quadrupole-MS/MS được trang bị ESI/APCI đa chế độ Z-Spray
• Nguồn ion hoạt động ở cả chế độ ion dương và chế độ âm
• Thu thập và xử lý dữ liệu được thực hiện bởi Masslynx 4.1
Trang 8Detector options PDA eλ, PDA, ELS, SQD,
Column manager options High temperature, Column heater Column heater/cooler, Column manager
Sample manager
Binary solvent manager
Trang 9 Hóa chất và nguyên vật liệu
Acetonitrile cho sắc ký
(Merck Co ,Darmstadt, Đức)
Các hóa chất khác thuộc loại phân tích
(CT thuốc thử hóa học Thiên Tân, Trung Quốc)
Nước siêu tinh khiết
(Shanghai Laikie Instrument Co Ltd., Thượng Hải, Trung Quốc)
Nguyên liệu – Phương pháp
21 lô O falcate (số S1 - S21) được thu thập từ tỉnh Cam Túc,
tỉnh Thanh Hải và khu tự trị Tây Tạng của Trung Quốc ( Bảng 1)
S1 Tỉnh Thanh Hải S8 Tỉnh Thanh Hải S15 Tỉnh Thanh Hải
S2 Tỉnh Cam Túc S9 Tỉnh Thanh Hải S16 Tỉnh Thanh Hải
S3 Tỉnh Thanh Hải S10 Khu tự trị Tây Tạng S17 Tỉnh Thanh Hải
S4 Tỉnh Cam Trúc S11 Tỉnh Thanh Hải S18 Khu tự trị Tây Tạng
S5 Tỉnh Thanh Hải S12 Tỉnh Thanh Hải S19 Tỉnh Cam Túc
S6 Tỉnh Thanh Hải S13 Tỉnh Thanh Hải S20 Tỉnh Cam Túc
S7 Tỉnh Thanh Hải S14 Tỉnh Thanh Hải S21 Tỉnh Cam Túc
Bảng 1 Nguồn của 21 lô O falcate
Trang 10Phân lập từ O falcate và được xác định bởi 1H NMR, 13C NMR và MS
Hình 1 Cấu trúc hóa học của các chất tham chiếu (đỉnh 16, 17, 22-30)
Trang 11Nguyên liệu – Phương pháp
Hạ nhiệt độ,
bổ sung thể tích
Dịch chiết
Trang 12• Hệ thống đánh giá độ tương tự cho sắc ký dấu vân tay của TCM-
Traditional Chinese medicine (phiên bản 2004 A)
Trang 13Kết quả và thảo luận
Lượng lớn các peak trên UPLC
270nm
Bước sóng phát hiện
để thiết lập dấu vân tay
• Nghiên cứu ảnh hưởng của pha động
• Phổ hấp thu 190-400nm
• Nhiệt độ cột và thể tích tiêm
Dung dịch acid acetic 0,5% (dung môi A) và
acetonitril (dung môi B)
Nhiệt độ cột 30 ° C Thể tích tiêm 2 μL
Trang 14• Cột BEH C18 (50 × 2.1mm i.d., hạt 1.7 µm)
• Tốc độ rửa giải 0,3 mL/phút
• Tái cân bằng với 2% acetonitril trong 2 phút
• Nhiệt độ buồng mẫu là 18oC
• Phổ hấp thu 190-400nm và phát hiện ở 270nm
• Phân tích full-scan MS và SIR ở chế độ ion dương
• Nhiệt độ nguồn ở 110°C và nhiệt độ khử solvat ở 350°C
• Các điện áp mao quản 3.0 kV và điện áp cone 25 V
• Tốc độ khí khử và khí cone (nitơ) là 600 L/h và 50 L/h
• Phổ khối m/z 50-800 ở chế độ dương
Trang 15Kết quả và thảo luận
Hiệu quả chiết
Trang 16 Phương pháp chiết:
Dung môi chiết được đánh giá riêng biệt:
Thời gian chiết và khối lượng mẫu:
=> Lựa chọn Siêu âm do sự đơn giản của nó
=> Lựa chọn: 80% metanol làm dung môi chiết
=> Lựa chọn: 45 phút và 2.0g là phù hợp và tối ưu
2pp chiết xuất O.falcate là chiết ngược dòng và siêu âm, cả hai điều cho hiệu suất là tương đương nhau.
Metanol, ethanol và metanol nước (80%, 60%, 50%, 40% và 30%) và ethanol nước (80%, 60%, 50%, 40% và 30%)
Thời gian chiết khác nhau (15, 30, 45 và 60 phút) và khối lượng mẫu (0,5, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0 và 4.0 g) đã được nghiên cứu và so sánh bằng UPLC
Trang 17Kết quả và thảo luận
Độ chính xác:
Độ chính xác Cách tiến hành
Giá trị độ lệch chuẩn tương đối (RSD)
Thời gian lưu Diện tích peak Tiêu chuẩn
Trong ngày Đo sáu lần tiêm liên tục/ngày 0-0,7% 1,0-3,4%
≤10%
Giữa các ngày Đo trong sáu ngày liên tiếp 0-0,5% 1,5-6,1%
Trang 18 Độ lặp lại:
• Kiểm tra bằng cách tiêm 6 dung dịch mẫu khác nhau được chuẩn bị theo quy trình giống nhau
• Tất cả giá trị đều trên 0,99 và giá trị RSD :
o Thời gian lưu là 0-0,5%
o Diện tích peak 1,3-2,6%
Trang 19Kết quả và thảo luận
Độ ổn định:
• Các dung dịch mẫu giống nhau được phân tích ở các khoảng thời gian 4 giờ khi bảo quản trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng
• Dung dịch mẫu có thể được coi là ổn định trong vòng 24 giờ vì tất cả giá trị đều trên 0,99 và giá trị RSD:
o Thời gian lưu là 0-0,9%
o Diện tích peak 1,1-3,3%
Trang 20 Tính đặc hiệu:
•Các loại dược liệu, Oxytropis kansuensis Bunge và Oxytropis melanocalyx Bunge thuộc cùng một chi với O
falcate đã được phân tích trong các điều kiện tối ưu để nghiên cứu tính đặc hiệu của phương pháp đã phát triển.
Hình 2 Sắc ký đồ của O Kansuensis (A), O melanocalyx (B) and O falcate (C).
Như trong Hình 2, các sắc ký đồ của O kansuensis và O melanocalyx khác với O falcate đáng kể.
=> Phương pháp được dùng để phân tích dấu vân tay của O falcate là đặc hiệu
Như trong Hình 2, các sắc ký đồ của O kansuensis và O melanocalyx khác với O falcate đáng kể.
=> Phương pháp được dùng để phân tích dấu vân tay của O falcate là đặc hiệu
Trang 21Kết quả và thảo luận
Thiết lập UPLC dấu vân tay và phân tích tương tự (SA):
• 21 lô mẫu đã được chuẩn bị và phân tích riêng biệt trong các điều kiện tối ưu cho UPLC
• Người ta thấy rằng số lượng đỉnh sắc ký của mẫu S5 và S10 ít hơn so với các mẫu khác và hồ sơ vân tay sắc
ký của mẫu S21 khác biệt rõ ràng với các mẫu khác
Hình 3 UPLC dấu vân tay cho 21 lô O falcate.
Số lượng đỉnh của mẫu S5 và S10 ít hơn so với các mẫu khác
Sắc ký đồ của mẫu S21 khác biệt rõ ràng với các mẫu khác.
Trang 22 Thiết lập UPLC dấu vân tay và phân tích tương tự (SA):
• Các đỉnh chung được chọn theo thông tin phù hợp dựa trên ba nguyên tắc sau:
1. Các đỉnh được chọn phải có mặt trong hơn 90% mẫu
2. Các đỉnh sắc ký được chọn đại diện cho các thành phần là tinh khiết và loại các đỉnh có thể gây trở ngại cho phán đoán
3. Các đỉnh nên được phân bố đều và ổn định
Hình 4 Sắc ký dấu vân tay chuẩn
Trang 23Kết quả và thảo luận
Bảng 3 Sự giống nhau của dấu vân tay của 21 bộ mẫu
Trang 24• Độ tương quan của tất cả các mẫu đều cao hơn 0,900 ngoại trừ S5 (0,679), S10 (0,425), S18 (0,865) và S21
(0,699)
• Các mẫu thu được từ tỉnh Thanh Hải và Cam Túc có thể được phân loại như một nhóm và được gọi là “đạt tiêu chuẩn".
• Các mẫu S10 và S18 thu được từ khu tự trị Tây Tạng, mẫu S5 thu được từ tỉnh thanh hải và mẫu S21 thu được từ tỉnh cam
túc đều là “không đạt tiêu chuẩn”
Các thành phần hóa học của các mẫu từ các vị trí thu thập khác nhau cho thấy sự khác biệt nhỏ, trong khi các mẫu
của cùng một nguồn có thể là sự khác biệt đáng kể
Trang 25Kết quả và thảo luận
• Dấu vân tay sắc ký nhấn mạnh sự giống nhau của cùng một nhóm thuốc và sự tương đồng được phản ánh bởi tính toàn vẹn và độ mờ của sắc ký
Tóm lại, sự tương đồng không đủ thích hợp để phân tích các mẫu khác nhau, do đó HCA và PCA sẽ cần thiết
trong nghiên cứu
Trang 26• HCA là một phương pháp phân tích hóa học để phân cụm các mẫu dựa trên các cấu hình hóa học tương tự, các mẫu có đặc điểm tương tự sẽ được sắp xếp thành một cụm mới để cung cấp một sơ
đồ hình cây
• Trong nghiên cứu này, HCA đã được thực hiện bằng phần mềm SPSS 16.0 dựa trên phương pháp Ward và sử dụng bình phương khoảng cách Euclide làm thước đo độ tương tự mẫu Cụ thể như sau:
Trang 27Kết quả và thảo luận
21 lô mẫu chia thành 3
nhóm
Nhóm II: S2, S4 (tỉnh Cam Túc)
Nhóm III: S12, S15 (tỉnh Thanh Hải)
Nhóm I: các mẫu còn lại.
Trang 28Hình 5 Sơ đồ hình cây theo cụm thu được từ dữ liệu diện tích peak UPLC của 21 loài O.falcate mẫu
Kết quả cho thấy: Chất lượng của O falcate không chỉ liên quan
đến nguồn gốc địa lý, mà còn liên quan đến môi trường phát triển, số năm sinh trưởng, mùa thu hoạch và các yếu tố khác
Trang 29Kết quả và thảo luận
PCA là một công cụ hóa học tự động được sử dụng rộng rãi để giảm thiểu thông tin và giảm kích
thước mẫu, đồng thời đơn giản hóa việc phân tích và tính toán
• Nhiều chỉ số liên quan ban đầu được chuyển thành các chỉ số toàn diện bằng phân tích PCA
• Vùng dấu vân tay sở hữu số lượng lớn các đỉnh sắc ký và được đặc trưng bởi một số tương quan giữa các đỉnh
Đơn giản hóa bằng cách áp dụng PCA, được đặc trưng bằng cách giảm các tập dữ liệu đa chiều
Trang 30 Trong nghiên cứu :
• Các diện tích peak của 30 đỉnh sắc ký phổ biến trong vùng dấu vân tay được phân tích là 30 biến.
• 21 lô mẫu được phân tích và phân loại thêm bởi PC
• Tổng cộng 21 × 30 ma trận dữ liệu đã được hình thành
Trang 31Kết quả và thảo luận
-Biểu đồ phân tán của PCA được hiển thị trong Hình 6, được cung cấp bởi hai thành phần chính đầu
tiên PC1 và PC2
Hình 6 Biểu đồ phân tán điểm thu được từ PCA của 21 lô O.falcate
Biểu đồ phân tán điểm cho thấy các mẫu thu được từ ba nguồn gốc có chất lượng tương tự nhau.
Trang 32Nó cũng gợi ý rằng chất lượng của 21 lô O falcate là tương tự nhau.
tham khảo có giá trị hơn để đánh giá chất lượng của O falcate một cách khách quan.
Trang 33Kết quả và thảo luận
11 hợp chất tham chiếu được phân lập từ O falcate, được áp dụng để tối ưu hóa các tham số MS và để xác định các
hợp chất tương ứng trong cây.
Các thông số được
thay đổi
Nguồn nhiệt độ
Dòng khí khử (Nitơ) Nhiệt độ phân lập
Điện áp mao quản
Trang 34ion âm và điện áp hình nón ảnh hưởng đáng kể đến quá trình ion hóa
Hình 7 Sắc ký đồ UPLC-PDA ở bước sóng 270 nm (a), và sắc ký đồ tổng các ion của loài O.falcate ở trạng thái ion dương (b).
Trang 35Kết quả và thảo luận
• Ở trạng thái ion dương ESI, các ion [M + H]+ đã được quan sát, trọng lượng phân tử được xác định dựa trên thông tin của ion [M + H]+
• Trong tài liệu này, 11 đỉnh phổ biến trong hồ sơ sắc ký được xác định bằng cách so sánh thời gian lưu, phổ tử ngoại và trọng lượng phân tử so với các hợp chất tham chiếu (Bảng 4)
Bảng 4 Các đặc trưng của 11 đỉnh phổ biến trong hồ sơ sắc ký bằng phương pháp UPLC – PDA – ESI – MS
Trang 36Phân tích MS của O falcate
Hình 8a Phổ khối của acid cinnamic (đỉnh 17)
Trang 37Kết quả và thảo luận
• Phổ khối của acid cinnamic (đỉnh 17) và 3-phenyl-N- (2-phenylethyl) -2-propenamide (đỉnh 26)
Trang 38giá chất lượng của 21 lô O falcate
• Các thông tin UPLC cho thấy rằng chất lượng của O falcate có liên quan đến các yếu tố
khác nhau như bản gốc địa lý, môi trường phát triển, năm sinh trưởng, mùa thu hoạch, v.v
Phương pháp được phát triển trong nghiên cứu này sẽ cung cấp một tài liệu tham khảo quan trọng để
kiểm soát chất lượng của O falcate.
Trang 39Ứng dụng Sắc ký lỏng trong Kiểm nghiệm
Bài báo: T.J Zhao, J Chen, J.P Shi, Fingerprint analysis of Oxytropis falcate using ultra-performance liquid chromatography–electrospray
ionization tandem mass spectrometry (UPLC-ESI-MS), Anal Methods, 2015,7, 6810-6820