SEMINAR high throughput analysis of 19 endogenous androgenic steroids by ultra performance convergence chromatography tandem mass spectrometry

Trắc nghiệm, bài giảng pptx các môn chuyên ngành Y dược hay nhất có tại “tài liệu ngành Y dược hay nhất”; https://123doc.net/users/home/user_home.php?use_id=7046916. Slide kiểm nghiệm seminar về sắc ký hiện đại ppt dành cho sinh viên ngành Y dược. Trong bộ sưu tập có trắc nghiệm kèm đáp án chi tiết các môn, giúp sinh viên tự ôn tập và học tập tốt môn kiểm nghiệm seminar về sắc ký hiện đại bậc cao đẳng đại học ngành Y dược và các ngành khác

Chủ đề:

High-throughput analysis of 19

endogenous androgenic steroids by ultra-performance convergence chromatography tandem mass

spectrometry

1 Giới thiệu

Hormon Steroid đóng vai trò quan trọng trong điều hòa một số quá trình sinh lý của cơ thể.

Các rối loạn nội tiết như :

- Tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh (CAH)

- Hội chứng buồng trứng đa nang (PCOS)

- Bệnh aldosteron nguyên phát và ung thư phụ thuộc hormone như tuyến tiền liệt và ung thư vú có liên quan đến việc rối loạn sản xuất hormone steroid

Những khác biệt về cấu trúc, riêng biệt cho từng hoocmon steroid, làm phức tạp đáng kể sự phân tách của các phân tử có cấu trúc tương tự, bao gồm các đồng vị.

1 Giới thiệu

Phương pháp sắc ký khí-khối phổ (GC- MS) cho độ phân giải và độ nhạy tốt, nhưng chuẩn bị mẫu rất phức tạp:

gồm thủy phân và dẫn xuất hóa, và không dùng cho các xét nghiệm thông lượng cao.

Mặc dù sắc ký lỏng song song khối phổ (LCR - MS / MS) không đạt được độ phân giải như GC-MS,

Nhưng trong hầu hết các trường hợp, LC-MS / MS không yêu cầu dẫn xuất hóa mẫu

và thiết bị sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UHPLC) có thời gian chạy giảm đáng kể so với

LC truyền thống.

2 Thực Nghiệm

Hệ thống sắc ký hội tụ siêu hiệu năng UPCC PDA-MS

2 Thực Nghiệm

Máy khối phổ 3 tứ cực Xevo TQ-S (Xevo TQ-S triple quadrupole mass spectrometer)

(Waters, Milford, USA)

2 Thực Nghiệm2.1 Hóa chất và thuốc thử

reductase type 1 (SRD5A1) ho c ặc 3α-hydroxysteroid

dehydrogenase type 3 (AKR1C2).

2 Thực Nghiệm

2.2 Chuẩn bị mẫu chuẩn

Từ chuẩn mix, chuẩn bị 1mL mẫu chuẩn (0.01-250 ng/ml):

15 hợp chất steroid A4, T,

11OHA4, 11KA4, 11OHT, 11KT,

5α-dione, epiAST, DHT, 3α-adiol,

11KDHT, 11OHAST, 11OHepiAST,

11KAST và 11KepiAST) (trong

Ethanol 1 mg/ml tuyệt đối, -20 độ

C)

Chuẩn mix

1000 ng/mL trong MeOH

Chuẩn mix 1 ng/mL trong MeOH

2 Thực Nghiệm

Chiết với MTBE tỷ lệ 1:3, lắc với tốc độ 1000 rpm/15 phút trước khi để ở -80 C / 1giờ ⁰C / 1giờ

Mẫu thử

Mẫu chuẩn

Lớp MTBE chứa các steroid

ống kính nhiệt phân: cho bay hơi ở 55⁰C dưới dòng khí nitrogen Sau đó mẫu được tái tạo trong 150 μL L methanol 50% và trữ ở

-20⁰CPhân tích

2.3 Chiết xuất steroid

2 Thực Nghiệm

2.4 Thiết bị và điều ki n sắc ký ện sắc ký

Convergence ManagerSample Manager

Column ManagerDetector

Binary Solvent Manager

Acquity UPC2 system (Waters corporation, Milford, USA) Cột Acquity UPC2 BEH 2-EP (3mm x 100 mm, hạt 1.7 μL m)

2 Thực Nghiệm

2.4 Thiết bị và điều ki n sắc ký ện sắc ký

Xevo TQ-S triple quadrupole mass spectrometer

- Pha đ ng: CO ộng: CO 2 lỏng trong methanol

- Nhiệt độ cột: 60⁰C; ABPR: 2000 psi

- Thể tích tiêm mẫu: 2 μL L

- Chương trình gradient tuyến tính: methanol 2 – 9.5% (4 phút), → tách các C19 steroid

- Tốc đ dòng: 2mL/phút ộng: CO

2 Thực Nghiệm

2.4 Thiết bị và điều ki n sắc ký ện sắc ký

Định lượng (Xevo TQ-S triple quadrupole mass spectrometer)

Kỹ thu t MRM, ESI+ật MRM, ESI+

Tốc đ dòng MSộng: CO 0.2 mL min-1

Điện thế mao quảnNguồn nhi tện sắc ký 3,8 kV120⁰CNhi t hóa hơiện sắc ký 500⁰C

Tốc đ hóa hơiộng: CO

-1

150 L.h-1

Thông số MS

2 Thực Nghiệm

Thông số thiết lập MRM và dữ li u thu được bằng massLynx 4.1 (Waters corporation)ện sắc ký

LOD : Nồng đ thấp nhất mà tại đó tỷ số S/N > 3 được đo cho các ion định tính ộng: CO

LOQ: Nồng đ thấp nhất mà tại đó tỷ số S/N > 10 cho các ion định lượng và S/N > 3 ộng: CO cho các ion định tính với % RSD ≤ 20%

ULOQ: là nồng đ cao nhất của chất phân tích trên đường cong tuyến tính, ộng: CO

đ chính xác chấp nh n ≤ 15% ộng: CO ật MRM, ESI+

Đ đúng và đ chính xác: ộng: CO ộng: CO xác định bởi các nồng độ sau: 0.25, 2.5, 25, 50 và 100 ng/mL

- Đ đúng: l p lại với n=8 → %RSD ộng: CO ặc

- Đ chính xác: l p lại với n=6 (3 ngày) → %RSD ộng: CO ặc

- Đ tái l p: 2 người, 4 ngày ở nồng đ 25 và 100 ng/mL ộng: CO ặc ộng: CO

2 Thực Nghiệm2.5 Thẩm định phương pháp

2 Thực Nghiệm

2.6 So sánh với sự tách và định lượng bằng UPLC-MS/MS

UPLC high strength silica (HSS) T3 column (2.1 mm × 50 mm, 1.8 mm)

Thiết bị

Xevo TQ-S triple quadrupole mass spectrometer

(Waters, Milford, USA)

2 Thực Nghiệm

2.6 So sánh với sự tách và định lượng bằng UPLC-MS/MS

UPLC ACQUITY (Waters,

Mil- ford, USA)

Thông số chạy UPLC:

2 Thực Nghiệm

Sử dụng UPLC high strength (HSS) cột T3 (2,1 mm 50 mm, 1,8 µm) (Waters, Mil- ford, USA)

cùng với UPLC ACQUITY (Waters, Mil- ford, USA) như đã mô tả

Các pha động : (A) 0,1% axit formic và (B) 100% methanol

Gradient tuyến tính trong 5 phút từ 55% A đến 75% B được sử dụng để tách các steroid C19

Tốc độ dòng 0,6 mL/ min và nhiệt độ cột của 50 ◦ C

Thể tích tiêm là 20,0 µ L

Phân tích bằng kỹ thuật ghi phổ (multiple reaction monitoring MRM) sử dụng ion hóa tia điện dương (ESI+)

Các thiết lập sau đây đã được sử dụng: điện áp 4,0 kV, nguồn nhiệt 150 ◦ C, nhiệt độ hóa hơi 500 ◦ C, khí hóa hơi

1000 L/ h và cone gas 150 L/h

Thu thập và phân tích dữ liệu bằng MassLynx 4,1 (Waters Corporation)

So sánh với sự tách và định lượng bằng UPLC-MS/MS

3 Kết quả

3.1 Tách bằng UPCC

UPCC -MS / MS xác định 19 và định lượng 15 steroid C19 , bao gồm tất cả các chất chuyển hóa con đường 11OHA4,

Sử dụng cột BEH 2-EP kích thước hạt 1,7 micro m trong 5 phút

Tốc độ dòng chảy 2,0 mL/min và ABPR là 2000 psi

3.1 Tách bằng UPCC

11Kepi AST và 11KDHT cũng như 3α -adiol và

11OHAST không được giải quyết

3.1 Tách bằng UPCC

Thứ tự rửa giải thu được bằng phương pháp UPCC

3.2 Khối phổ

Dung dịch rửa giải UPC2 đảm bảo ion hóa các steroid bằng ESI

Tốc độ dòng chảy tối ưu là 0,2 mL/min

Methanol chứa 1% acid formic cung cấp hiệu quả ion hóa

- Ion thu được ở dạng ion dương là các bị proton hóa dạng [M+H]+.

- Ion thu được nhiều nhất cho AST, epiAST, 11OHAST và 11OHepiAST là [M−H2O+H]+.

3.3 Hiệu suất và xác nhận

3.3.1 Phạm vi hiệu chuẩn

15 steroids có sẵn

LOQs dao động từ 0,01 đến 10 ng/mL

Độ nhạy tăng gấp 50 lần đối với các steroid dễ bị ion hóa, như T và A4,

Cải tiến đáng kể trong LOQ cho các steroid khó ion hóa , chẳng hạn như DHT (5 lần)

Mặc dù khối lượng tiêm thấp hơn 10 lần

Phương trình bậc hai phù hợp với các giá trị r2 chấp nhận được (>0,9906) cho các đường cong tiêu chuẩn bao gồm tiêu chuẩn 250 ng/mL,

Tuy nhiên, do độ bão hòa của độ đúng và độ chính xác của máy dò đều lớn hơn 20% ở nồng độ này và tiêu chuẩn này, do đó loại trừ khỏi phạm vi hiệu chuẩn

Do đó, giới hạn định lượng trên (ULOQ) là 100 ng/mL

3.3 Hiệu suất và xác nhận

3.3.2 Độ đúng và độ chính xác

% RSD được chấp nhận là thu được cho tất cả các nồng độ cho cả độ đúng và độ chính xác, được xác định trong ba ngày (Bảng 3) [20]

3.3 Hiệu suất và xác nhận

3.3.2 Độ đúng và độ chính xác Độ tái lập trong phòng thí nghiệm được

thể hiện trong Bảng bổ sung 2

3.3 Hiệu suất và xác nhận

3.3.3 Phục hồi, hiệu quả matrix và hiệu quả phục hồi

4 Bàn luận

Độ nhạy của phương pháp vượt trội (5 -50 lần) cho bất kỳ phương thức nào (không có chất dẫn xuất)

Độ nhạy tăng lên là do sự kết hợp của tốc độ dòng chảy tối ưu đạt được bằng cách

- thiết lập bơm

- giảm các chất gây nhiễm trung tính gây nhiễu bằng hướng dẫn ion StepWave [24]

Hạn chế cho tăng độ nhạy là phạm vi tuyến tính giảm do bão hòa của máy dò ở nồng độ cao hơn Khắc phục bằng cách pha loãng mẫu hơn nữa

Độ nhạy tăng cho phép nhà phân tích điều tra sự trao đổi chất steroid trong nuôi cấy tế bào ở nồng độ sinh lý lần đầu tiên

Ví dụ:

chúng tôi đã có thể đo lường sự trao đổi chất của 10 nM 11KT và T bằng dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt [18] Những thí nghiệm như vậy trước đây đã dựa vào việc sử dụng nồng độ cơ chất siêu âm

do những hạn chế về độ nhạy Hơn nữa, tăng độ nhạy đạt được bằng cách sử dụng thể tích tiêm chỉ 2

µL, trong khi các phương pháp MS / MS UPLC thông thường dựa vào thể tích tiêm 5 -20 µL để đạt được độ nhạy

Tài liện sắc kýu tham khảo

1 PGS.TS Hoàng Thị Kim Huyền và cộng sự (2006 ), Dược lâm sàng, (NXB Y Học Hà Nội), trang 207-209

2 Elzette Pretorius1, DonitaJ.Africander, MaréVlok2, MeghanS.Perkins,

JonathanQuanson,Karl-HeinzStorbeck, (2016), 11-Ketotestosterone and 11 Ketodihydrotestosterone in Castration Resistant Prostate Cancer: Potent Androgens Which Can No Longer BeIgnored