Enhancing the quality of fresh snakehead fish fillets through improved handling and storage

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan mọi kết quả của đề tài: “Khảo sát tình hình nhiễm và định danh tảo phụ sinh Epiphytic algae trên rong sụn Kappaphycus alvarezii nuôi trồng tại Khánh Hòa”

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG

TRẦN VĂN TUẤN

KHẢO SÁT TÌNH HÌNH NHIỄM VÀ ĐỊNH DANH TẢO

PHỤ SINH (Epiphytic algae) TRÊN RONG SỤN

(Kappaphycus alvarezii) NUÔI TRỒNG TẠI KHÁNH HÒA

LUẬN VĂN THẠC SĨ

KHÁNH HÒA - 2020

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG

TRẦN VĂN TUẤN

KHẢO SÁT TÌNH HÌNH NHIỄM VÀ ĐỊNH DANH TẢO

PHỤ SINH (Epiphytic algae) TRÊN RONG SỤN (Kappaphycus alvarezii) NUÔI TRỒNG TẠI KHÁNH HÒA

PGS TS Nguyễn Văn Duy

Phòng Đào tạo Sau Đại học:

KHÁNH HÒA – 2020

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan mọi kết quả của đề tài: “Khảo sát tình hình nhiễm và định

danh tảo phụ sinh (Epiphytic algae) trên rong sụn (Kappaphycus alvarezii) nuôi

trồng tại Khánh Hòa” là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi, và chưa từng được

công bố trong bất cứ công trình khoa học nào khác cho tới thời điểm này

Kết quả này là một phần của đề tài cấp bộ “Nghiên cứu tảo phụ sinh (Epiphyte algae)

trên rong sụn (Kappaphycus alvarezil) nuôi trồng tại Khánh Hòa và Ninh Thuận” do

Ths Khúc Thị An làm chủ nhiệm đề tài (mã số B2016-TSN-01)

Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện đề tài nghiên cứu và hoàn thành luận văn đều đã được cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn đều chính xác và được chỉ rõ nguồn gốc

Khánh Hòa, ngày 23 tháng 03 năm 2020

Tác giả luận văn

Trần Văn Tuấn

iv

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm o n các thầy cô trong Viện Công nghệ sinh học & Môi trường, Tru ờng Đ i học Nha Trang giảng d y và t o điều kiện thuận lợi cho tôi viẹ c thực hiẹ n lu n va n này

Tôi đ c biẹ t cảm o n TS Đặng Thuý Bình và ThS Khúc Thị An đã t n tình

hu ớng dẫn, chỉ bảo để tôi c thể hoàn thành lu n va n cao học

Tôi xin cảm ơn Quý thầy cô và cán bộ viên chức trong Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đ i học Nha Trang

đã t o điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành công việc nghiên cứu thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn các b n học viên Cao học lớp CHSH16-1 Trường Đ i học

Nha Trang và các thành viên của đề tài “Nghiên cứu tảo phụ sinh (Epiphyte algae) trên rong sụn (Kappaphycus alvarezil) nuôi trồng t i Khánh Hòa và Ninh Thuận ” do Ths

Khúc Thị An làm chủ nhiệm đề tài (mã số B2016-TSN-01) đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tiến hành thực nghiệm Đặc biệt cảm ơn em Trương Thị Oanh và Nguyễn Quang Sáng đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện nghiên cứu đề tài Xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu và các đồng nghiệp Trường THCS & THPT Đ Sar_tỉnh Lâm Đồng nơi tôi đang công tác đã luôn t o điều kiện và ủng hộ tôi vượt qua những kh khăn trong quá trình học tập và thực hiện luận văn

Cuối cùng xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến gia đình, b n bè, anh chị, … đã luôn yêu thương, động viên và ủng hộ tôi vượt qua những kh khăn trong quá trình học tập

và thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn

Khánh Hòa, ngày 23 tháng 03 năm 2020

Tác giả luận văn

Trần Văn Tuấn

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN iii

LỜI CẢM ƠN iv

MỤC LỤC v

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH MỤC BẢNG viii

DANH MỤC HÌNH ix

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN x

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 4

1.1 Đặc điểm sinh học của rong sụn Kappaphycus alvarezii 4

1.1.1 Hệ thống phân lo i 4

1.1.2 Đặc điểm hình thái rong sụn 4

1.1.3 Đặc điểm sinh sản rong sụn 5

1.1.4 Phân bố 6

1.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của rong sụn 6

1.1.5.1 Độ mặn 6

1.1.5.2 Dòng chảy và lưu thông 7

1.1.5.3 Nhiệt độ 7

1.1.5.4 Cường độ ánh sáng 7

1.1.5.5 Dinh dưỡng 7

1.2 Tổng quan về epiphyte 7

1.2.1 Khái quát về epiphyte 7

1.2.2 Phân lo i epiphyte 9

1.2.3 Ảnh hưởng của epiphyte lên rong sụn 9

1.2.4 Tình hình nghiên cứu về bệnh epiphyte trong và ngoài nước 10

1.2.4.1 Chỉ thị phân tử rbcL của DNA lục l p 10

1.2.4.2 Các nghiên cứu về epiphyte ở ngoài nước 11

vi

1.2.4.3 Các nghiên cứu về epiphyte trong nước 13

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Thời gian và địa điểm 14

2.2 Đối tượng nghiên cứu 14

2.3 Sơ đồ khối nghiên cứu 14

2.4 Phương pháp nghiên cứu 15

2.4.1 Thu mẫu và địa điểm nghiên cứu 15

2.4.2 Khảo sát tình hình nhiễm và xác định epipyle algae (tảo phụ sinh) trên rong sụn 16

2.4.2.1 Xác định các d ng epiphyte trên rong sụn 16

2.4.2.2 Xác định mật độ epiphyte trong các mẫu rong sụn 16

2.4.3 Định lo i epiphyte bằng phương pháp hình thái và di truyền 16

2.4.3.1 Định lo i piphyte bằng đặc điểm hình thái 16

2.4.3.2 Định lo i epiphyte bằng phương pháp sinh học phân tử 17

2.4.3.3 Kiểm chứng phân lo i và xây dựng mối quan hệ phát sinh chủng lo i 18

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21

3.1 Các d ng tảo phụ sinh và triệu chứng 21

3.2 Định lo i Epiphyte dựa trên đặc điểm hình thái và di truyền 24

3.2.1 Định lo i dựa trên đặc điểm hình thái 24

3.2.2 Kiểm chứng định lo i epiphyte bằng phương pháp sinh học phân tử 26

3.2.2.1 Tách chiết DNA và khuếch đ i gen rbcL của DNA lục l p 26

3.2.2.2 Kiểm chứng định lo i bằng chỉ thị phân tử 27

3.3 Khảo sát mối quan hệ phát sinh loài Melanothamnus thailandicus 27

KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 29

Kết luận 29

Khuyến nghị 29

TÀI LIỆU THAM KHẢO 30 PHỤ LỤC I

viii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR 18 Bảng 2.2 Thông tin về trình tự, địa điểm thu mẫu và mã số genbank của các loài epiphyte 19

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Rong sụn nuôi trồng bằng phương pháp cột dây treo bề mặt t i vịnh Vân

Phong, Khánh Hoà 4

Hình 1.2 Vòng đời của rong sụn Kappaphycus alvarezii 6

Hình 1.3 Sơ đồ khái quát và thuật ngữ của các d ng epiphyte 8

Hình 1.4 “Goose bumps” do nhiễm Neosiphonia apiculata trên tản của rong Kappaphycus 9

Hình 1.5 Cấu t o của lục l p 10

Hình 1.6 Bộ gen lục l p của loài Arabidopsis thaliana (Họ Cải) 11

Hình 1.7 Các mẫu bị nhiễm epiphytes 12

Hình 2.1 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 14

Hình 2.2 Bản đồ thu mẫu rong sụn nhiễm epiphyte t i Khánh Hòa 15

Hình 3.1 Rong sụn bị nhiễm các epiphyte d ng sợi bám ngoài (mũi tên) 21

Hình 3.2 Rong sụn bị nhiễm true epiphyte (D ng u lồi) 22

Hình 3.3 Mật độ trung bình true epiphyte theo tháng năm 2017 và 2018 t i Vân Phong 23

Hình 3.4 Hình thái ngoài của Melanothamnus thailandicus 24

Hình 3.5 Đặc điểm hình thái Ceramium clarionense 25

Hình 3.6 Hình ảnh điện di DNA tống số và sản phẩm khuếch đ i gen rbcL của loài Melanothamnus thailandicus 26

Hình 3.7 Vị trí khác biệt Nucleotide 27

Hình 3.8 Cây phát sinh loài 28

x

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Rong sụn (Kappaphycus alvarezii Doty) sinh trưởng tự nhiên ở vùng biển Châu

Á Thái Bình Dương, nhất là vùng Đông Nam Á Trong những năn gần đây, nghề nuôi rong sụn phát triển m nh g p phần x a đ i, giảm ngèo Epiphyte hiện diện thường xuyên và là một thành phần quan trọng trong hệ sinh thái biển Tuy nhiên, bệnh do epiphyte đã gây ảnh hưởng rất lớn đến năng suất và chất lượng của rong sụn, như bệnh trắng nhũn thân (ice-ice disease) Cho đến nay, các nghiên cứu về bệnh do epiphyte vẫn còn h n chế Trong những thập kỷ gần đây, chỉ thị phân tử được sử dụng rộng rãi trong phân lo i thực vật, trong đ , chỉ thị Ribulose bisphosphate carboxylase large subunit (rbcL) của DNA lục l p chứng tỏ là công cụ hữu hiệu trong định lo i và khảo sát mối quan hệ phát sinh loài

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài nhằm khảo sát tình hình nhiễm, định lo i và khảo sát mối quan hệ phát sinh loài của epiphyhte phụ sinh trên rong sụn nuôi trồng

t i Khánh hoà (Vịnh Cam Ranh và Vân Phong) dựa trên đặc điểm hình thái và di truyền Các phương pháp chính đã được thực hiện bao gồm: khảo sát d ng và triệu chứng nhiễm epiphyte, xác định mật độ epiphyte trên rong sụn; định lo i bằng đặc điểm hình thái; kiểm chứng định lo i epiphyte và khảo sát mối quan hệ phát sinh loài dựa trên chỉ thị phân tử rbcL của DNA lục l p

Kết quả bước đầu cho thấy bệnh epiphyte xuất hiện vào khoảng thời gian từ tháng 3 đến tháng 8 hằng năm Epipyhte c 3 d ng ký sinh trên rong sụn, gồm: d ng

sợi bám ngoài và d ng sợi xâm lấn và d ng u lồi (Melanothamnus thailandicus) Trong

đ , M thailandicus là loài ghi nhận mới ở Việt Nam và trên song sụn

Mật độ rong sụn nhiễm epiphyte tăng từ tháng 6 đến tháng 8, c sự khác biệt c ý nghĩa thống kê giữa tháng 6 và tháng 8, và giữa mật độ nhiễm epiphyte năm 2017 và 2018

Trình tự rbcL của epiphyte thể hiện sự tương đồng cao (99.98%) với loài M

thailandicus phân bố ở Thái Lan Cây phát sinh loài cho thấy M thailandicus ở Khánh Hòa

và Thái Lan sắp xếp cùng nhánh, và cùng với các loài thuộc giống Melanothamnus t o

thành nhánh đồng d ng

Việc khảo sát tình hình nhiễm và định lo i chính xác epiphyte trên rong sụn t i Khánh Hoà g p phần phát hiện sớm triệu chứng bệnh, từ đ đưa ra biện pháp phòng và trị bệnh epiphyte trên rong sụn hiệu quả Bên c nh đ , nghiên cứu bổ sung thành phần loài và dữ liệu di truyền rong phụ sinh vào khu hệ rong Việt Nam

Từ khóa luận văn: Rong sụn, Epiphyte, Kappaphycus alvarezii, Melanothamnus,

Khánh Hòa

1

MỞ ĐẦU

Rong sụn c tên khoa học là Kappaphycus alvarezii (Doty), là loài sinh trưởng và

c nguồn gốc tự nhiên ở vùng biển Châu Á Thái Bình Dương, nhất là vùng Đông Nam

Á Rong sụn là loài rong biển c giá trị kinh tế cao dùng để chế biến carrageenan, một chế phẩm được ứng dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp chế biến thực phẩm, y dược, mỹ phẩm Nghề trồng rong sụn hiện nay đem l i lợi ích kinh tế khá lớn cho nhiều nước trên thế giới, đặc biệt là các nước Đông Nam Á như Philippines, Malaysia, Indonesia với tổng sản lượng chiếm lên đến 95% tổng sản lượng rong sụn khô tiêu thụ trên toàn thế giới, ước chừng khoảng 160.000 tấn khô/ năm (Huỳnh Quang Năng, 2006; Hayashi, 2010) Hiện nay, việc nuôi trồng rong sụn trở thành một trong những ngành kinh tế của nhiều quốc gia c bờ biển trên thế giới, trong đ c Việt Nam

Ở Việt Nam, diện tích nuôi trồng rong sụn hiện nay còn khá ít, tổng diện tích trồng trên cả nước chỉ vào khoảng 500 ha, tập trung vào các vùng chính là vịnh Vân Phong (khoảng 200 ha), vịnh Cam Ranh (khoảng 150 ha) của tỉnh Khánh Hòa và vùng Sơn Hải (khoảng 100 ha) của tỉnh Ninh Thuận Nghề trồng rong sụn trở thành cây x a

đ i giảm nghèo của các hộ ngư dân ven biển (Đào Duy Thu và cs, 2014)

Rong sụn nuôi trồng hiện nay ở nước ta được bắt nguồn từ Philippine, được di nhập về từ tháng 2 năm 1993 do một giáo sư người Nhật mang qua làm giống (một bụi nặng khoảng 500g), từ đ nghề nuôi trồng rong sụn ở các địa phương như Khánh Hòa, Ninh Thuận, Phú Yên, phát triển m nh (Huỳnh Quang Năng, 2006)

Từ năm 2011 đến nay, sản lượng rong sụn của Việt Nam không đủ để cung cấp cho nhu cầu nội địa, thêm vào đ là nhà máy sản xuất carrageenan với nhu cầu nguyên liệu khoảng 6000 tấn khô/năm (Công ty cổ phần thương m i Duy Mai, Sơn Hải), mở

ra thêm cơ hội cho nghề nuôi trồng rong sụn phát triển m nh (Trần Mai Đức, 2014) Khánh Hòa với lợi thế đường bờ biển dài 200 km, với hơn 200 hòn đảo lớn nhỏ, nhiều vũng, vịnh lớn như Vân Phong, Nha Trang, Cam Ranh, c khí hậu ôn hòa là điều kiện thuận lợi để nuôi trồng rong sụn Vì vậy rong sụn được xem là đối tượng phù hợp cho việc nuôi trồng t i các vùng vịnh của tỉnh Khánh Hòa để mang l i lợi ích kinh

tế cao, g p phần phát triển kinh tế và x a đ i giảm nghèo

Tuy nhiên hiện nay nghề trồng rong sụn ở nước ta đang phải đối mặt với rất nhiều kh khăn và thách thức như nguồn giống và chất lượng nguồn giống không đảm bảo, năng suất và chất lượng rong đang giảm, đặc biệt khí hậu đang thay đổi phức

t p do ảnh hưởng của biến đổi khí hậu toàn cầu (cường độ ánh sáng tăng, độ mặn nước biển cao, mực nước biển dâng, ) làm dễ dẫn đến bùng phát các dịch bệnh như bệnh ice-ice và bệnh epiphyte trên rong nuôi

Các nghiên cứu trên thế giới về bệnh epiphyte ở các nước c sản lượng rong sụn lớn (Indonesia, Malaysia, Philippines, Ấn Độ, Trung Quốc) đã chỉ ra rằng bệnh epiphyte gây ảnh hưởng rất lớn đến năng suất và chất lượng của rong sụn Các công bố

đã chỉ ra mùa vụ là nhân tố chính ảnh hưởng đến việc bùng phát dịch epiphyte và gây nhiễm khuẩn thứ cấp ở rong sụn (Hurtado và cs, 2006; Munxoz và Sahoo, 2007; Vairappan và cs, 2009)

Ở Việt Nam các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào các kỹ thuật nuôi trồng và chiết suất carrageenan từ rong sụn Sau khi hiểu biết về kỹ thuật nuôi trồng và bắt đầu phát triển nghề nuôi trồng rong sụn thì người dân mới thấy được sự xuất hiện của các loài tảo

phụ sinh (epiphytic algae) trong quá trình nuôi đã ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát

triển của rong sụn Tuy nhiên để hiểu rõ thì vẫn chưa c nghiên cứu cụ thể nào c thể

mô tả chi tiết rõ ràng về các loài rong tảo phụ sinh này Các nghiên cứu gần đây cũng chỉ tập trung vào bệnh nhũn thân (ice-ice), các nghiên cứu về bệnh epiphyte vẫn còn rất

ít, chỉ tập trung vào tìm hiểu nguyên nhân gây bệnh Và các kết quả chỉ ra rằng bệnh xuất hiện khi c sự thay đổi của các yếu tố môi trường như ánh sáng, nhiệt độ, độ mặn

và các vi sinh vật trên cây rong sụn (Lê Mai Hương và cs, 2010)

Từ những phân tích và nhận định như trên, chúng tôi nhận thấy các nghiên cứu

về epiphyte trên cây rong sụn ở Việt Nam vẫn còn tương đối ít, chưa làm rõ được các vấn đề liên quan đến nguyên nhân phát sinh, yếu tố ảnh hưởng đến sự bùng phát bệnh

epiphyte hay là tên gọi chính xác của các loài epiphytic algae Do đ cần c những

nghiên cứu chuyên sâu hơn để tìm hiểu rõ về đặc điểm , định danh, phân lo i sơ bộ cũng như tìm ra các biện pháp khắc phục hiệu quả khi rong sụn bị nhiễm epiphyte Để

đáp ứng nhu cầu thực tế, tôi thực hiện đề tài “Khảo sát tình hình nhiễm và định

danh tảo phụ sinh (Epiphytic algae) trên rong sụn (Kappaphycus alvarezii) nuôi

trồng tại Khánh Hòa”

3

Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu của đề tài nhằm khảo sát tình hình nhiễm, định lo i và khảo sát mối quan hệ tiến h a epiphyhte phụ sinh trên rong sụn nuôi trồng t i Khánh hoà dựa trên đặc điểm hình thái và di truyền

Nội dung nghiên cứu đề tài

- Nội dung 1: Khảo sát triệu chứng và các d ng nhiễm Epiphytic algae trên rong sụn

- Nội dung 2: Khảo sát mật độ nhiễm Epiphytic algae trên rong sụn t i Khánh Hòa

- Nội dung 3: Định lo i và khảo sát mối quan hệ tiến h a của Epiphytic algae

nhiễm trên rong sụn dựa trên đặc điểm hình thái và di truyền

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Ý nghĩa khoa học

Việc khảo sát tình hình nhiễm và định danh epiphyte trên rong sụn g p phần hiểu được sơ bộ về triệu chứng, mùa nhiễm và phát triển bộ sưu tập các loài epiphyte ở Việt Nam và trên thế giới Từ đ , cung cấp dữ liệu khoa học và mối quan hệ tiến hoá các

loài epiphyte phụ sinh trên rong sụn ở Việt Nam

Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả của đề tài g p phần hiểu được đặc điểm và tình hình nhiễm epiphyte trên rong sụn, nhằm định hướng nuôi trồng rong sụn ở tỉnh Khánh hoà hiệu quả và năng suất hơn

Chi: Kappaphycus (Doty, 1888)

Loài: K alvarezii (Doty) Doty ex Silva 1996

1.1.2 Đặc điểm hình thái rong sụn

Kappaphycus alvarezii (Hình 1.1) c thân hình trụ đặc, nhiều nhánh nhỏ, dài

khoảng 15 - 40 cm (Trono và Fortes, 1988) Trên thân c các nhánh mọc không đều

nhau, trên các nhánh c các mấu nhỏ hoặc u lồi K alverazii c các d ng hình thái

khác nhau: dòng màu xanh lục, dòng màu nâu hoặc dòng màu xanh đen và chúng thay đổi màu sắc tùy vào điều kiện ánh sáng của môi trường và độ sâu nuôi trồng Rong sụn

c 2 d ng thân là d ng thân bò (bụi lớn, thân chính phân nhiều nhánh, mỗi nhánh c

nhiều nhánh nhỏ) và d ng thân thẳng (thân chính dài, to và ít phân nhánh) K alverazii

trong điều kiện tự nhiên ở biển thường sống bám vào các vật cứng hoặc nằm trong các hốc đá khi không bám được Giải phẫu lát cắt ngang thân, quan sát dưới kính hiển vi, bên trong thân là các tế bào hình tròn xắp xếp c trật tự, kích thước tế bào lớn dần từ trong trung tâm ra ngoài rìa mẫu mô (Trono, 2001)

Hình 1.1 Rong sụn nuôi trồng bằng phương pháp cột dây treo bề mặt tại vịnh Vân Phong, Khánh Hoà a) toàn cảnh khu vực nuôi, b) một dây rong

5

1.1.3 Đặc điểm sinh sản rong sụn

Vòng đời của Kappaphycus alverazii (Hình 1.2) bao gồm sự luân phiên của ba

thể: tứ bào tử thực vật hay cây bào tử bốn (tetrasporophyte), giao tử (gametophyte) đực và cái, bào tử quả (carposporophyte) hay tảo quả (cystocarp) Tứ bào tử thực vật (thể lưỡng bội 2n) và cây giao tử (thể đơn bội n) c kích thước lớn và đồng hình (giống nhau về hình d ng tản) Bào tử quả (2n) c kích thước rất nhỏ và kí sinh trên

cây giao tử cái (Luxton, 1999, Trần Mai Đức, 2005) Trong tự nhiên, K alvarezii sinh

sản theo các hình thức: sinh sản sinh dưỡng (vegetative reproduction) bằng các đo n thân nhánh của cây rong, sinh sản đơn tính (asexual reproduction) bằng bào tử ở Tứ bào tử thực vật và sinh sản hữu tính (sexual reproduction) bằng sự kết hợp giữa tinh tử của cây giao tử đực với giao tử cái của cây giao tử cái (Azanza và Aliza, 1999) Các hình thức sinh sản trên luân phiên xảy ra trong tự nhiên và các d ng cây rong sụn cũng đồng thời tồn t i và phát triển (Granbom và cs, 2004)

Tuy c nhiều hình thức sinh sản nhưng trong nuôi trồng rong sụn chủ yếu là dựa vào hình thức sinh sản dinh dưỡng bằng các đo n thân nhánh Trong kỹ thuật nuôi trồng rong sụn, giống để trồng là các đo n thân nhánh, được buộc bằng các dây treo vào hệ thống của dàn đáy hoặc dàn nổi Chúng c thể là cây giao tử đực, cây giao tử cái hay cây bốn bào tử nhưng không c điều kiện và khả năng thực hiện quá trình sinh sản hữu tính và đơn tính, mà chỉ sinh trưởng và phát triển theo hình thức sinh sản dinh dưỡng từ chồi mầm để thành cây mới (Ohno và ctv, 1995) Hình thức sinh sản này làm cho cây rong sụn c thể bị biến đổi về mặt hình thái cũng như tốc độ tăng sinh khối và các chất dinh dưỡng tích lũy trong cây rong theo các điều kiện sinh thái môi trường (Trần Mai Đức, 2005)

Hình 1.2 Vòng đời của rong sụn Kappaphycus alvarezii

(http://surialink.seaplant.net/abc_eucheuma/1/47.htm)

1.1.4 Phân bố

Kappaphycus spp phân bố từ khoảng +10o vĩ độ, đặc biệt là từ các nước Đông Nam Á mở rộng sang phía đông Châu Phi và Brazil Tuy nhiên cho đến nay khu vực Đông Nam Á, chủ yếu là Brunei, Indonesia, Malaysia và Philippines c tiềm năng lớn nhất cho việc mở rộng trồng rong biển nhiệt đới, chiếm khoảng 60% địa điểm trồng trên toàn cầu (IFC, 2003)

1.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của rong sụn

1.1.5.1 Độ m n

Rong sụn là loài rong ưa mặn, chúng sinh trưởng và phát triển m nh ở vùng nước

c độ mặn cao (khoảng 28-32 psu), ở độ mặn thấp (khoảng 18-20 psu) chúng chỉ c thể tồn t i trong thời gian ngắn (khoảng 5-7 ngày) và nếu kéo dài nhiều ngày chúng sẽ ngừng phát triển và chết (Rolando và Oliver, 2009)

7

1.1.5.2 Dòng chảy và lưu thông

Yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng và phát triển, cũng như chất lượng của rong sụn là vùng nước nuôi trồng phải thường xuyên trao đổi và luân chuyển (t o ra do dòng chảy, dòng triều hay s ng bề mặt) (Hurtado và cs, 2006)

C thì rong sẽ ngừng sinh trưởng

1.1.5.4 Cường độ ánh sáng

Rong sinh trưởng và phát triển m nh nhất ở cường độ ánh sáng 30.000 - 50.000 lux, ánh sáng cao quá hay thấp quá ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của rong (Ohno và cs, 1996)

1.1.5.5 Dinh dưỡng

Rong sụn không đòi hỏi nhiều về chất dinh dưỡng Trong nước biển, các chất dinh dưỡng c sẵn đủ cung cấp cho cây rong sụn phát triển Chỉ trong điều kiện nước tĩnh, ít được trao đổi và nhiệt độ nước cao (mùa nắng - n ng, trong các thủy vực nước tĩnh như ao, đìa nhân t o) rong sụn mới đòi hỏi dinh dưỡng cao hơn cho sự sinh trưởng (gồm các muối Amon, nitrat và photphat) Ở các vùng c hàm lượng các muối dinh dưỡng cao (gồm: Amon, Nitrat, Phot phat), tốc độ sinh trưởng của rong sụn nhanh hơn

và c thể giúp cây rong sụn phát triển ổn định trong các điều kiện không thuận lợi (nhiệt độ cao, độ muối thấp, dòng nước ít lưu chuyển) (Ohno và cs, 1996)

1.2 Tổng quan về epiphyte

1.2.1 Khái quát về epiphyte

Epiphyte là thực vật biểu sinh, d ng thực vật phát triển không ký sinh trên một giá thể thực vật khác và nhận nước, chất dinh dưỡng từ không khí, mưa và từ các mảnh vụn tích tụ xung quanh

Đối với epiphyte trên rong sụn còn được gọi là true epiphyte (Hình 1.3)

Hình 1.3: Sơ đồ khái quát và thuật ngữ của các dạng epiphyte

Sự xuất hiện của epiphyte trên rong sụn c thể liên quan tới những thay đổi về dòng chảy, cường độ ánh sáng, nhiệt độ cũng như độ mặn của môi trường nuôi Dịch bệnh do epiphyte đã bùng phát và làm suy giảm sản lượng của rong sụn nuôi trồng ở Philippines và Malaysia (Hurtado, 2006; Vairappan, 2006) Mối tương quan giữa sự xuất hiện của epiphyte và dòng chảy của nước đã được quan sát bởi Hurtado và cs

(2006) Kết quả cho thấy với khu vực c dòng chảy chậm loài Polysiphonia sp xuất

hiện trên rong sụn với tần số cao hơn 65% và cao hơn so với khu vực c dòng chảy tốc

độ cao là 17%

Vairappan và cs (2009) mô tả triệu chứng của việc nhiễm epiphyte trên rong sụn với sự xuất hiện ban đầu là các đốm đen, sau đ lớn dần và gây ra biến d ng t i vị trí xâm nhiễm từ phía vỏ vào đến tủy Sau hai tuần thì chiều dài của epiphyte < 0,5 mm

và mật độ < 25,0 epi/cm2 Khi trưởng thành, epiphyte xuất hiện trên rong bệnh với

hình d ng sợi được gọi là “goose bumps” (Hình 1.4) Quá trình phát triển của epiphyte

nhiễm trên rong sụn từ giai đo n đầu đến giai đo n epiphyte trưởng thành ở các loài true epiphyte là tương tự nhau

9

Hình 1.4: “Goose bumps” do nhiễm Neosiphonia apiculata trên tản của rong

Kappaphycus (a) Giai đoạn cuối nhiễm epiphyte (b) Epiphyte tăng lên và khởi

phát nhiễm trùng vi khuẩn cơ hội Thang đo = 300 µm (Vairappan và cs., 2008) 1.2.2 Phân loại epiphyte trên rong sụn

Theo mô tả của Hurtado và Critchley (2006) thì epiphyte trên rong sụn được phân chia thành 5 kiểu và kiểu 5 được cho là kiểu gây thương tổn nhiều nhất đến rong sụn, vì chúng vừa phá hủy bên ngoài, vừa xâm lấn và phá hủy cả cấu trúc bên trong của cây rong

- Kiểu 1: epiphyte bao phủ bên ngoài bề mặt cây rong, không c dấu hiệu của sự tổn thương mô tế bào vật chủ

- Kiểu 2: epiphyte bám dính chặt trên bề mặt ngoài nhưng cũng không thấy sự tổn thương mô tế bào vật chủ

- Kiểu 3: epiphyte xâm nhập vào lớp ngoài của vách tế bào vật chủ không tổn thương đến tế bào

- Kiểu 4: epiphyte xâm lấn vào lớp ngoài của vách tế bào chủ, gây hủy ho i đến đến vỏ tế bào chủ

- Kiểu 5: epiphyte xâm lấn vào trong mô tế bào, gây phá hủy và tổn thương cho

tế bào

1.2.3 Ảnh hưởng của epiphyte lên rong sụn

Song song với việc đi tìm nguyên nhân và phân lo i các d ng epiphyte thì một vấn

đề khác cũng được chú trọng đ là khảo sát sự ảnh hưởng và khả năng gây h i của epiphyte đối với rong sụn Pang và cs (2011) đã nghiên cứu và chỉ ra epiphyte

(Neosiphonia savatieri) tác động trực tiếp đến quá trình quang hợp của rong sụn ở

Trung Quốc thông qua phương pháp huỳnh quang Chlorophyll Kết quả cho thấy

epiphyte đã ảnh hưởng tới quá trình hình thành phức hợp oxy, làm giảm ho t động của trung tâm phản ứng và các chất nhận PSII Giảm khả năng quang hợp của rong cũng chính là nguyên nhân làm rong chậm tăng trưởng dẫn đến giảm sản lượng của rong sụn Ngoài việc ảnh hưởng trực tiếp tới khả năng quang hợp của rong, làm giảm sản lượng và năng suất rong, epiphyte còn ảnh hưởng đến chất lượng của carrageenan chiết suất từ rong sụn Vairappan và cs (2013) thu các mẫu rong khỏe m nh và mẫu rong bệnh ở Malaysia để tiến hành kiểm tra và so sánh hàm lượng và chất lượng carrageenan Kết quả hàm lượng carrageenan của mẫu rong bị nhiễm bệnh là 20,5%

DW thấp hơn so với rong khỏe m nh là 65,5% DW, hàm lượng phenol và acid béo của mẫu rong bị nhiễm bệnh cao hơn so với rong khỏe m nh, độ nhớt của rong bệnh cũng giảm 74,5%, khả năng t o gel giảm 52,6% so với rong khỏe m nh Ở 5oC thì nhiệt độ

n ng chảy carrageenan ở rong bệnh cao hơn rong khỏe m nh Đồng thời, kích thước phân tử carrageenan cũng giảm 80 kDa ở rong bệnh so với 800 kDa ở rong khỏe

1.2.4 Tình hình nghiên cứu về epiphyte trong và ngoài nước

1.2.4.1 Chỉ thị phân tử rbcL của DNA lục lạp

DNA lục l p nằm ở tất cả các thực vật quang hợp Trong lục l p, DNA phân bố ở

chất nền: lơ lửng hoặc neo vào các cấu trúc khác (Hình 1.5) DNA lục l p c d ng

vòng, mang các gen chứa thông tin di truyền mã hoá các sản phẩm cho ho t động quang hợp ở thực vật, cũng như một số ho t động khác của tế bào và cơ thể

Hình 1.5 Cấu tạo của lục lạp (11-DNA lục lạp) 1: màng ngoài; 2: khoang gian màng; 3: màng trong; 4: chất nền lục lạp; 5: xoang tilacoit; 6: màng tilacoit; 7: grana; 8: lamen; 9: hạt tinh bột; 10: riboxom; 11: DNA; 12: vi giọt chất béo

(https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Chloroplast.svg)

diphosphate carboxylase oxygenase) gọi là gen rbcL (hình 1.6) Gen này được nghiên cứu nhiều trong việc phát sinh thực vật và tiến hoá phân tử ở thực vật ký sinh

Hình 1.6 Bộ gen lục lạp của loài Arabidopsis thaliana (Họ Cải)

(https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Plastomap_of_Arabidopsis_thaliana.svg)

1.2.4.2 Các nghiên cứu về epiphyte trên rong sụn ở ngoài nước

Các nghiên cứu về epiphyte trên rong sụn ở thế giới hiện nay chủ yếu tập trung ở các nước c diện tích nuôi trồng rong sụn lớn như Philippines, Malaysia, Indonesia,

Ấn Độ và Trung Quốc (Pang và cs, 2011)

Epiphyte trên rong sụn đã xuất hiện ngay từ thời gian đầu nuôi trồng rong sụn và đã được ghi nhận là phụ sinh nguy hiểm đối với rong sụn, nhưng các nghiên cứu về tác h i của epiphyte chỉ được thực hiện vào những năm 2000 t i một số nước như Indonesia, Malaysia, Philippines Các công bố chỉ ra rằng mùa vụ là nhân tố chính ảnh hưởng đến

việc bùng phát dịch epiphyte và nhiễm khuẩn thứ cấp ở rong chủ (Hurtado và cs, 2006; Munxoz và Sahoo, 2007; Vairappan và cs, 2009) Ngoài ra sự bùng phát dịch epiphyte còn c liên quan đến sự thay đổi lớn về các yếu tố nhiệt độ và độ mặn (Vairappan, 2007)

và ảnh hưởng của dòng nước, cường độ ánh sáng (Hurtado và cs, 2006)

Hình 1.7 Các mẫu bị nhiễm epiphytes Từ trái sang phải: Ceramium,

Boodlea composite, Neosiphonia, và Ulva (Hurtado và Critchley, 2006)

Thông thường các loài epiphyte gây ra biến d ng t i vị trí xâm nhiễm phía vỏ đến bên trong rong sụn, sau đ dẫn đến nhiễm khuẩn cơ hội, kết quả là làm giảm sinh khối của rong sụn (Largo và cs, 1995; Hurtado và Biter, 2007; Vairappan, 2009)

Vairappan và cs (2009) đã thu mẫu rong sụn nhiễm epiphyte ở các nước Philippines, Indonesia, Malaysia và Tanzania và tiến hành các nghiên cứu nhằm định danh loài, xác định mật độ, và mô tả các triệu chứng của rong bị nhiễm bệnh Qua đ

đã xác định Neosiphonia apiculata là nh m ưu thế ở cả 4 nước với mật độ tương đối

cao lên đến 88,5 epi/cm2

ở Philippines Triệu chứng ban đầu là các đốm đen xuất hiện trên thân rong, sau đ phát triển thành sợi, trưởng thành t o nên d ng lông t c xung quanh thân rong

Vairappan và cs (2014) tiếp tục kết luận rằng Epiphyte gây h i cho tế bào rong theo 2 con đường: thay đổi vật liệu của tế bào và thay đổi quá trình biến đổi năng lượng (ở thực vật, quang hợp là quá trình biến đổi dinh dưỡng cơ bản, là con đường duy nhất biến đổi năng lượng ánh sáng thành năng lượng h a học, là con đường để tồn

t i và phát triển) Không chỉ năng suất rong giảm, tính chất vật lý và h a học của carrageenan chế biến từ rong sụn bị nhiễm epiphyte cũng bị thay đổi Mẫu rong nhiễm epiphyte c nhiều acid béo và hợp chất phenol cao hơn so với các mẫu rong bình thường, nhiệt độ n ng chảy cao hơn, cường độ gel thấp hơn, kích thước phân tử thì nhỏ hơn bình thường (Vairappan và cs, 2014)

13

Các nghiên cứu của Hurtado và cs (2006), Vairappan và cs (2009) đã mô tả và

định danh được một số loài phổ biến như Neosiphonia savatieri, Colaconema

infestans, Neosiphonia apiculata, Polysiphonia sp

1.2.4.3 Các nghiên cứu về epiphyte trên rong sụn ở trong nước

Ở Việt Nam các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào các kỹ thuật nuôi trồng và chiết suất carrageenan từ rong sụn (Nguyễn Nguyên Chiến, 2006, Ngô Thị Thu Thảo

và cs, 2010) Gần đây, các nghiên cứu về nuôi cấy mô rong sụn đem l i hiệu quả kinh

tế (Ph m thi Mai, 2019)

Nghiên cứu về tảo phụ sinh trên rong sụn còn rất h n chế Theo Nguyễn Hữu Đ i (1999), tảo phụ sinh hiện diện thường xuyên trên cỏ biển và là một thành phần quan trọng trong hệ sinh thái Nghiên cứu xác định được 58 loài tảo phụ sinh trên cỏ biển ở Khánh hòa, trong đ c 3 loài lần đầu được ghi nhận cho khu vực

Sau khi hiểu biết về kỹ thuật nuôi trồng và bắt đầu phát triển nghề nuôi trồng thì người dân thấy được sự xuất hiện của các loài tảo phụ sinh trong quá trình nuôi ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của rong sụn Tuy nhiên để hiểu rõ thì vẫn chưa c nghiên cứu cụ thể nào c thể mô tả chi tiết rõ ràng về các lo i tảo phụ sinh này

Thông qua tìm hiểu từ các tài liệu nước ngoài, kết hợp với tìm hiểu thông tin từ người nuôi trồng thì bệnh epiphyte được người nuôi trồng gọi là bệnh “lông rong” hay

“sớn lông” Biểu hiện là các đốm đen xuất hiện trên thân hoặc các sợi rong bám đầy trên bề mặt rong sụn, c khả năng ăn sâu vào trong tế bào rong sụn làm tổn h i cấu trúc mô, làm rong sụn yếu dần, chậm phát triển và bị tổn thương, c thể dẫn tới ho i

tử

Các nghiên cứu gần đây ở nước ta cũng chỉ tập trung vào bệnh nhũn thân ice), các nghiên cứu về bệnh epiphyte vẫn còn rất ít, chủ yếu chỉ tập trung vào tìm hiểu nguyên nhân gây bệnh và các kết quả đã chỉ ra rằng bệnh epiphyte xuất hiện khi c sự thay đổi của các yếu tố môi trường như ánh sáng, nhiệt độ, độ mặn và các vi sinh vật trên cây rong sụn (Lê Mai Hương và cs, 2010)

(ice-CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm

Thời gian từ Tháng 6 năm 2017 đến tháng 12 năm 2018

2.2 Đối tượng nghiên cứu

Tảo phụ sinh (Epiphytic algae) trên các mẫu rong sụn (Kappaphycus alvarezii)

thu t i Khánh Hòa

2.3 Sơ đồ khối nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành theo sơ đồi khối trình bày ở Hình 2.1

Hình 2.1 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu

Quan sát và thống

kê mật độ nhiễm epiphyte

Định lo i epiphyte bằng hình thái học

Điện di kiểm tra DNA tổng số

Giải trình tự Định danh loài

Mô tả đặc điểm, hình thái

Tách epiphyte ra khỏi thân rong sụn

Tách chiết DNA tổng số

15

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Thu mẫu và địa điểm nghiên cứu

Mẫu rong sụn được thu t i các vị trí khác nhau, trải đều trên diện tích nuôi trồng của các hộ nuôi t i Cam Phúc Bắc (11058‟7‟‟ vĩ độ bắc, 109012‟8‟‟ kinh độ đông), Cam Ranh

- Khánh Hòa và Vịnh Vân Phong (12039‟38” vĩ độ Bắc, 109020‟47” kinh độ Đông), V n

Ninh - Khánh Hòa từ tháng 6 năm 2017 đến tháng 12 năm 2018 (Hình 2.2)

Hình 2.2 Bản đồ thu mẫu rong sụn nhiễm epiphyte tại Khánh Hòa Khung hình

vuông màu xanh chỉ khu vực thu mẫu (Địa điểm được chi tiết)

Thu mẫu bằng cách chèo thuyền thúng dọc theo các dây rong nuôi Khu vực nuôi rong sụn c hình chữ nhật nên cách mỗi đo n khoảng 10 mét, kéo dây rong lên và lấy ngẫu nhiên một bụi rong sụn nặng khoảng 200gram (không lựa chọn rong nhiễm hay rong không nhiễm) Số lượng mẫu rong sụn mỗi lần thu là 5kg

Các mẫu rong sau khi thu được bao bọc bằng giấy báo, sau đ vận chuyển về phòng thí nghiệm trong các thùng xốp được làm ẩm (nhiệt độ 22 + 20

C) bằng nước biển (Sulistian và cs., 2012) Mẫu rong sau đ được lưu giữ trong các bể kính (80/50/30 cm) chứa nước biển, chiếu sáng tự nhiên, và sục khí ở để giữ mẫu tươi