Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford

Trong môi trường acid, Coomassie Brilliant Blue G-250 liên kết chặt chẽ với protein, tương tác với cả nhóm kỵ nước và các nhóm mang điện tích dương trên phân tử protein làm dung dị[r]

4.3 Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford

4.3.1 Nguyên tắc

Dựa vào phản ứng màu của protein với xanh Coomassie (Coomassie Brilliant Blue G-250) và khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595 nm Trong môi trường acid, Coomassie Brilliant Blue G-250 liên kết chặt chẽ với protein, tương tác với cả nhóm kỵ nước và các nhóm mang điện tích dương trên phân tử protein làm dung dịch có màu xanh Cường độ màu tỷ lệ với nồng độ protein trong dung dịch Dựa vào đường chuẩn protein suy ra hàm lượng protein trong dung dịch mẫu

Hình 2.4 Phản ứng tạo màu của protein với Coomassie Brilliant Blue G250

4.3.2 Cách tiến hành

4.3.2.1 Lập đường chuẩn

Tiến hành theo bảng 2.4

Bảng 2.4 Chuẩn bị các ống nghiệm xây dựng đường chuẩn

Dựng đường chuẩn albumin biểu diễn sự tương quan giữa lượng albumin và giá trị OD

đo được ở bước sóng 595 nm

4.3.2.2 Xác định hàm lượng protein

Lấy 2 ống nghiệm:

- Ống thí nghiệm: 0,1 ml dung dịch protein (enzyme) + 2 ml Bradford

- Ống đối chứng: 0,1 ml nước cất + 2 ml Bradford

Đem đo độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm và ghi nhận mật độ quang sau 2 phút đến 1 giờ Từ giá trị OD đo được, dựa vào đường chuẩn albumin suy ra hàm lượng protein

Các ống nghiệm

Ống 0

Ống 1

Ống 2

Ống 3

Ống 4

Ống 5

Dung dịch albumin

Thuốc thử Bradford ml 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0

Lắc đều Để yên 10 phút Đo độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm

Chú ý: Ống 0 là ống kiểm chứng, các ống khác là ống thí nghiệm.