Nghiên cứu phát triển kỹ thuật phát hiện chủng vi khuẩn escherichia coli o157h7 và tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu

coli O157:H7 là loại vi khuẩn sinh độc tố, trong hệ gen vùng nhân chứa 2 gen mã hóa cho độc tố đặc trưng của vi khuẩn này là Stx1 và Stx2 [64], được sử dụng như là những marker cho việ

Trang 1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN -

Trang 2

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng

bày trong luận án là trung thực

Một số kết quả đã được công bố riêng hoặc đồng tác giả, phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong luận án này!

Hoàng Phú Hiệp

Trang 3

LỜI CẢM ƠN

Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới PGS TS

Lê Quang Huấn, PGS TS Nguyễn Bích Nhi đã hướng dẫn, chỉ bảo tận tình ngay từ những bước đi đầu tiên và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận án này

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp

–

thực hiện đề tài luận án

Tôi xin cảm ơn Bộ môn Di truyền và SHHĐ, Khoa Sinh-KTNN, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu

Tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè tôi đã tạo mọi điều kiện và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận án

Tôi xin trân trọng cảm ơn!!!

Thái Nguyên, ngày 29 tháng 09 năm 2014

Nghiên cứu sinh

Hoàng Phú Hiệp

Trang 4

Trang

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 VI KHUẨN E COLI O157:H7 3

1.1.1 Đặc điểm chung của chủng vi khuẩn E coli O157:H7 3

1.1.2 Độc tố Shiga-like toxin: Bản chất và tác hại 7

1.1.3 Nguyên nhân và diễn biến khi ngộ độc 12

1.1.4 Tình hình ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn ở Việt Nam 13

1.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VÀ XÁC ĐỊNH VI KHUẨN E COLI O157:H7 15

1.2.1 Phương pháp PCR dựa trên ADN 15

1.2.2 Kỹ thuật LAMP 19

1.2.3 Sử dụng kháng thể tái tổ hợp trong phát hiện E coli O157:H7 20

1.3 KHÁNG THỂ 25

1.3.1 Mảnh kháng thể 27

1.3.2 Kháng thể tái tổ hợp 28

1.3.3 Kỹ thuật biểu lộ trên phage 30

1.3.4 Tình hình nghiên cứu sử dụng kháng thể ở Việt Nam 35

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37

2.1 Vật liệu nghiên cứu 37

2.1.1 Sinh phẩm 37

Trang 5

2.1.2 Hóa chất 37

2.1.3 Các cặp mồi được sử dụng 38

2.2 Thiết bị 38

2.3 Phương pháp nghiên cứu 39

2.3.1 ứu ADN 39

2.3.2 Kỹ thuật bộc lộ trên thực khuẩn thể (phage display) 45

2.3.3 ứu protein 48

2.3.4 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu 53

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 54

3.1 XÁC ĐỊNH VI KHUẨN E COLI O157:H7 BẰNG KỸ THUẬT GEN 54

3.1.1 Xác định chủng vi khuẩn E coli O157:H7 bằng kỹ thuật phân tích gen mã hóa 16S rARN 54

3.1.2 Sử dụng đoạn gen Stx1 và Stx2 để xác định E coli O157:H7 60

3.1.3 Sử dụng kỹ thuật LAMP xác định vi khuẩn E coli O157:H7 66

3.2 NGHIÊN CỨU THU NHẬN KHÁNG THỂ ĐẶC HIỆU ĐỐI VỚI VI KHUẨN E COLI O157:H7 VÀ TÁCH DÒNG XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN MÃ HÓA KHÁNG THỂ 72

3.2.1 Sàng lọc kháng thể từ thư viện Griffin.1 72

3.2.2 Chọn dòng phage kháng thể đặc hiệu với vi khuẩn E coli O157: H7 75

3.2.3 Nhân bản gen mã hóa kháng thể bằng PCR 77

3.2.4 Giải trình tự gen mã hoá kháng thể 78

3.3 TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN KHÁNG THỂ TÁI TỔ HỢP 82

3.3.1 82

3.3.2 Thiết kế vector pET28a-TRX biểu hiện gen mã hóa kháng thể 83

3.3.3 85

Trang 6

3.3.4 iểu hiện gen mã hóa kháng thể 86

3.4 TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA KHÁNG THỂ TÁI TỔ HỢP 89

3.4.1 89

3.4.2 pháp lai blot 92

3.4.3 Kiểm tra hoạt tính của kháng thể tái tổ hợp bằng ELISA 94

3.4.4 ạt nano 95

97

98

99

PHỤ LỤC 112

Trang 7

THUẬT NGỮ VIẾT TẮT

CDC Centers for Disease Control and

E coli Escherichia coli Escherichia coli

EDTA Ethylene Diamine Tetra acetic Acid Ethylene Diamine Tetra acetic Acid

assay

Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme

Kỳ

Amplification

Phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt đặc hiệu

SDS-PAGE SDS- Polyacrylamide gel

STEC Shiga-like toxin producing

Escherichia coli Shiga-like toxin producing Escherichia coli

Trang 8

Trang 9

Trang 10

Số hiệu

3.6

Sơ đồ hình cây thể hiện mối quan hệ giữa E coli O157:H7 với chủng

khác đƣợc xây dựng trên cơ sở so sánh trình tự gen 16S ARN của chủng

E coli O157:H7 nghiên cứu (mã số HQ658163) và các chủng khác trên

Ngân hàng Gen

57

3.8 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen Stx1 với cặp mồi vector pJET 59 3.9 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen Stx2 với cặp mồi vector pJET 60

3.15

Khả năng gắn kết của hỗn hợp phage thu đƣợc sau mỗi vòng sàng lọc

3.16 Sơ đồ nguyên lý kỹ thuật ELISA dùng trong xác định độ nhạy của phage 72

Trang 11

Kết quả đánh giá ái lực của dòng phage 20 với tế bào E coli O157:H7

Hình ảnh kết quả phản ứng Dot blot của kháng thể tái tổ hợp với kháng

Trang 12

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Có nhiều nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm như: nguyên liệu sản xuất không đảm bảo, quy trình sản xuất không phù hợp, phương pháp bảo quản không đúng cách dẫn đến sản phẩm bị hư thối do nhiễm khuẩn hoặc hóa chất độc hại Các nghiên cứu gần đây đã xác định một trong những nguyên nhân của nhiều

trường hợp ngộ độc thức ăn là do vi khuẩn E coli E coli thuộc nhóm vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae, có nhiều trong tự nhiên, trong ruột của người và gia súc E coli nhiễm vào đất, nước… từ phân của động vật Khi gặp điều kiện thuận lợi cho sự phát triển chúng sẽ gây bệnh Đa số các chủng E coli là những chủng ít độc hại, tuy nhiên cũng có vài chủng rất độc như chủng E coli O157:H7 có thể tìm

thấy trong ruột và trong phân của các loài gia súc, đặc biệt là trong chất thải của bò

và các sản phẩm từ bò

Trên thế giới, chủng vi khuẩn E coli O157:H7 gây ra nhiều vụ ngộ độc lớn, năm 2007, ở Nhật Bản có 54 sinh viên thuộc trường Musashino bị ngộ độc khi sử dụng thức ăn của nhà trường, năm 2011, tại Mỹ vi khuẩn này gây ra 63 nghìn trường hợp nhiễm bệnh, 2100 trường hợp nhập viện, 20 trường hợp tử vong CDC ước tính có khoảng 76 triệu ca ngộ độc thức ăn tại Mỹ mỗi năm, với 325.000 người nhập viện và 5.000 ca tử vong, gây thiệt hại từ 6,5 đến 35 tỷ USD Ở Việt Nam, theo thống kê của Cục Vệ sinh An toàn Thực phẩm, năm 2011 có 148 vụ ngộ độc, trong

đó có 4700 người mắc với 3663 người phải nhập viện và 27 người tử vong Năm

2012 có 168 vụ ngộ độc, trong đó có 5541 người mắc với 4335 người nhập viện và

34 người tử vong Số liệu thống kê trong quý III năm 2013 cho thấy, trong 40 vụ ngộ độc thực phẩm thì 23 vụ do vi sinh vật gây ra

Chủng vi khuẩn E coli O157:H7 được xác định lần đầu tiên ở Việt Nam vào năm 2005, sau đó đã có nhiều nghiên cứu về chủng vi khuẩn E coli O157:H7 Trong các vụ dịch gây tiêu chảy ở nước ta hiện chưa tìm thấy sự hiện diện của chủng E coli

O157:H7, tuy nhiên những vi khuẩn thuộc các nhóm khác gây ngộ độc và các bệnh liên quan đã được phát hiện trong nhiều trường hợp Trong sinh hoạt hàng ngày,

Trang 13

không ngoại trừ trường hợp chúng ta bị nhiễm E coli O157:H7 thông qua tiếp xúc

hay phơi nhiễm với phân người, động vật và gia cầm

Việc xác định nhanh, chính xác sự có mặt của vi khuẩn E coli O157:H7

trong các mẫu thực phẩm góp phần bảo vệ sức khỏe cho con người là cần thiết

Việc sử dụng kháng thể kháng E coli O157:H7, một trong những yếu tố quan trọng

để phát hiện E coli O157:H7 Chính vì vậy, chúng tôi đã lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu phát triển kỹ thuật phát hiện chủng vi khuẩn Escherichia coli O157:H7 và tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Nghiên cứu các kỹ thuật phát hiện chủng vi khuẩn E coli O157:H7 và tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu với E coli O157:H7

3 Nội dung nghiên cứu

(i) Xác định chủng E coli O157:H7 bằng các kỹ thuật di truyền

(ii) Tạo dòng gen mã hóa cho kháng thể đặc hiệu chủng vi khuẩn E coli

O157:H7

(iii) Thu nhận và xác định độ nhạy, tính đặc hiệu của kháng thể tái tổ hợp đặc

hiệu vi khuẩn E coli O157:H7;

Trang 14

1.1 VI KHUẨN E COLI O157:H7

1.1.1 Đặc điểm chung của chủng vi khuẩn E coli O157:H7

Vi khuẩn E coli O157:H7 hiện diện một cách tự nhiên trong ruột người và

động vật, có thể được tìm thấy trong ruột và trong phân của các loài gia súc, đặc biệt

là trong phân bò, chất thải của bò và các sản phẩm như thịt bò, sữa bò chưa khử trùng [51] Thịt băm, thịt xay, thịt hamburger thường có tỷ lệ nhiễm khuẩn cao

nhất, ngoài ra E coli cũng còn có thể nhiễm vào nguồn nước, rau xanh, trái cây, giá

sống, rượu táo, sữa và các loại nước trái cây trong lon, trong hộp nếu chúng không được hấp khử trùng trước khi bán ra

Các chuyên gia ước tính rằng ở Mỹ mỗi năm có khoảng 70 nghìn người mắc

bệnh liên quan đến E coli O157:H7 [108] Ở những người bình thường, E coli

O157:H7 gây rối loạn tiêu hóa như đau bụng, tiêu chảy, nôn, thân nhiệt có thể tăng chút ít Bình thường bệnh tự khỏi sau 1 tuần hay 10 ngày Bệnh có thể rất nặng ở trẻ

em, người cao tuổi và ở những người mà hệ miễn dịch đã bị suy yếu do bệnh tật 5% trường hợp có thể gây biến chứng sau vài ba tuần bị nhiễm bệnh Độc tố Shiga-

3-like toxin của E coli O157:H7 gây sung huyết, hủy hoại niêm mạc ruột, gây tiêu chảy

có máu, làm hư thận và đồng thời làm giảm lượng nước tiểu Đây là hội chứng dung

huyết và suy thận (Hemolytic Uremic Syndrome, HUS), rất nguy hiểm có thể gây tử

vong, hoặc phải lọc thận suốt đời [74]

Loài (species): E coli

Hình 1.1 Hình ảnh vi khuẩn E coli

Trang 15

E coli O157:H7 thuộc nhóm vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae, thuộc

loại trực khuẩn Gram âm, di động bằng tiêm mao quanh tế bào, không tạo bào tử, có

vỏ ngoài (capsule) và có lông bám (pili) (Hình 1.1) E coli O157:H7 có cấu tạo đơn

giản gồm bên ngoài là vách tế bào, tiếp theo là màng sinh chất, hai lớp màng này liên kết chặt chẽ với nhau để bảo vệ tế bào Bên trong lớp màng là tế bào chất, nơi chứa các enzyme, đường, ATP, và các phân tử khác [62], [66]

E coli O157:H7 là vi sinh vật kị khí không bắt buộc, có khả năng hô hấp và

lên men, không sinh bào tử, tế bào tồn tại dạng đơn lẻ hoặc theo cặp đôi Khoảng nhiệt độ tồn tại của vi khuẩn này từ 7-50C, tối thích ở 37C, bị tiêu diệt ở nhiệt độ

có thể tồn tại được ở điều kiện pH 2,5 ở 37C trong 2-7 giờ, pH tối ưu cho vi khuẩn hoạt động là từ 6-7 [16] Vi khuẩn bị ức chế trong môi trường có nồng độ muối là

8,5%, chậm phát triển ở nồng độ muối trên 2,5% E coli O157:H7 sản sinh ra độc

tố gọi là Shiga-like toxin (hoặc Verocytoxin) do có sự giống nhau với độc tố gây

bệnh lị được tạo ra bởi Shigella dysenteria type 1, vi khuẩn này cũng gây ra HUS ở nhiều quốc gia trên thế giới Có rất nhiều chủng vi khuẩn E coli cũng sản sinh Shiga-like toxin nhưng E coli O157:H7 là chủng phổ biến nhất Độc tố này được

cho là yếu tố gây bệnh của vi khuẩn [33]

E coli O157:H7 không có khả năng lên men đường sorbitol và cellobiose,

không tạo ra β-D-glucuronidase do đó không chuyển hóa D-glucuronide (MUG) thành 4- methylumbelliferone nên khi chiếu dưới đèn UV khuẩn lạc không phát huỳnh quang (Hình 1.2) Khi nuôi cấy trên môi trường Fluorocult có bổ sung sorbitol và MUG do không có khả năng lên men đường

4-methylumbelliferyl-β-sorbitol, khuẩn lạc có màu xanh nhạt phân biệt với các vi khuẩn E coli khác khuẩn

lạc có màu vàng do lên men được đường sorbitol Đây là đặc điểm được sử dụng trong xét nghiệm để phát hiện sự có mặt của vi khuẩn này [62]

Trang 16

Hình 1.2 Hình ảnh vi khuẩn E coli O157:H7 trên môi trường có MUG [105]

Dưới ánh sáng UV 365 nm, trên môi trường có MUG vi khuẩn E coli O157:H7

không phát quang, các chủng vi khuẩn E coli khác phát quang

ADN của vi khuẩn E coli O157:H7 gồm hệ gen vùng nhân có kích thước

khoảng 5,5 triệu bp, gồm 5483 gen và 2 plasmid: plasmid lớn (pO157) có kích thước 9,3 kb và plasmid nhỏ (pOSAKI) kích thước 3,3 kb, 7 chuỗi rARN (16S, 23S, 5S); số chuỗi của tARN và mARN là 102 (Bảng 1.1) Tỷ lệ G+C là 50,5 % Chủng

E coli O157:H7 là loại vi khuẩn sinh độc tố, trong hệ gen vùng nhân chứa 2 gen mã

hóa cho độc tố đặc trưng của vi khuẩn này là Stx1 và Stx2 [64], được sử dụng như là

những marker cho việc phân loại và phát hiện Mặt khác các phương pháp này cho thấy các chủng là thể liên tục chứ không phải phân thành các chủng khác nhau

Trang 17

Hình 1.3 Bản đồ hệ gen (genome) của vi khuẩn E coli O157:H7 [107]

Tên của vi khuẩn bắt nguồn từ 2 loại kháng nguyên quan trọng nhất của E

coli là kháng nguyên O (Ohne- kháng nguyên soma) và kháng nguyên H (Hauch-

kháng nguyên lông) [33], ngoài ra còn có kháng nguyên K (capsular) và kháng nguyên F (fimbriae) Kháng nguyên soma O được xác định bởi phần polysaccharide của thành thế bào lipopolysaccharide, còn kháng nguyên H được xác định bởi protein roi Có 174 kháng nguyên O (đánh số thứ tự từ 1- 181, trong đó không có các số 31, 47, 67, 72, 93, 94 và 122) và 53 kháng nguyên H

Bảng 1.1 Các thông số hệ gen của vi khuẩn E coli O157:H7

E.coli) Nielsen tìm thấy 312 chủng STEC phân lập từ bệnh nhân ở Đan Mạch thuộc

50 nhóm O và 75 type O:H [66] Phương pháp phân loại dựa vào kháng nguyên O và

H là chủ yếu, tuy nhiên nhiều vi khuẩn E coli được phân lập bao gồm cả một số

nhóm STEC chỉ có một kháng nguyên O hoặc một kháng nguyên H hoặc không có cả hai trong hệ thống quốc tế, do đó không thể phân loại bằng type huyết thanh

Do type huyết thanh O157:H7 có vai trò quan trọng đối với các bệnh ở người, vì vậy thông thường vi khuẩn STEC cũng có thể chia thành 2 type chính là O157 và nonO157 Tuy nhiên nhiều type nonO157 như O104:H4 vẫn gây ra các vụ

Trang 18

ngộ độc thực phẩm và các bệnh liên quan [13] Sự kết hợp giữa các type huyết thanh với các mức độ gây bệnh khác nhau ở người dẫn tới việc đề xuất phân chia nhóm STEC thành 5 type gây bệnh từ A tới E Type gây bệnh A chứa nhóm O157:H7 và O157:NM, được coi là nguy hiểm nhất Type gây bệnh B chứa các type O26:H11, O103:H2, O111:NM, O121:H19 và O145:NM giống với chủng STEC O157 về nguyên nhân gây bệnh nhưng tỷ lệ bùng phát thành dịch thì thấp hơn Type gây bệnh C bao gồm những type ít liên quan tới bệnh HUS, không tạo thành dịch như O91:H21 và O113:H21 Type gây bệnh D gồm một số type liên quan tới bệnh tiêu chảy và type E gồm nhiều chủng STEC không gây bệnh ở người

1.1.2 Bản chất và tác hại độc tố Shiga-like toxin

Theo CDC (Centers for Disease Control and Prevention-Trung tâm Kiểm

soát và Phòng chống Dịch bệnh Mỹ), E coli O157:H7 là một trong bốn chủng vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy sau các chủng Campylobacter sp., Salmonella sp.và

Shigella sp Bốn chủng này nằm trong nhóm độc tố Shiga toxin được sản xuất bởi

E coli (STEC) Nhân tố gây bệnh chính của STEC là prophage mã hóa cho độc tố Shiga Độc tố này gây bệnh tiêu chảy và cả hội chứng Xuất huyết ruột

(Hemorrhagic Colitis- HC) và HUS [88] STEC sinh ra hai loại độc tố gọi là Shiga

toxin 1 và Shiga toxin 2 Các yếu tố gây độc khác bao gồm một protein màng ngoài gọi là intimin (protein quan trọng giúp vi khuẩn tồn tại trong ruột) và enterhemolysin mã hóa bởi một plasmid được gọi là pO157 Enterohemolysin góp phần gây độc bằng cách phân hủy tế bào hồng cầu giúp tạo ra nguồn cung cấp sắt cho vi khuẩn

Trang 19

Hình 1.4 Cấu trúc độc tố Shiga-like toxin [106]

Phần mầu đỏ: Tiểu phần A Phần mầu xanh: Tiểu phần BĐộc tố Shiga toxin được xác định lần đầu tiên bởi Kiyoshi Shiga vào năm

1898 do vi khuẩn Shigella dysenteriae tiết ra Vài năm sau người ta nhận thấy mối

liên quan giữa độc tố này với các bệnh tiêu chảy, hội chứng HUS và một số bệnh khác Độc tố Shiga toxin có hai họ là Shiga toxin I và Shiga toxin II được mã hóa

bởi 2 gen tương ứng là Stx1 và Stx2 Hai độc tố này có thể phát hiện trong E coli

O157:H7 và các type huyết thanh STEC độc lập hoặc cùng với nhau [15] Loại độc

tố này không gây hại đối với động vật, nhưng khi được vi khuẩn tiết ra trong ruột của người nó có thể gây xung huyết Độc tố Shiga toxin là một protein có cấu trúc

tiểu phần B (mỗi tiểu phần có khối lượng 7,691 kDa) (Hình 1.4) [12], [28], [33] Trong đó tiểu phần A chứa một mảnh A1 (27,5 kDa) có chứa các vị trí cắt của enzyme và một mảnh A2 (7,5 kDa) được liên kết thông qua một cầu disulfide [40] Tiểu phần A nằm trên một mặt phẳng tạo bởi 5 tiểu phần B, đầu C của tiểu phần A được giữ ở vị trí trung tâm của 5 tiểu phần B

Trang 20

Hình 1.5 Nguyên lý gây chết tế bào của Shiga-like toxin

Tiểu phần A có vai trò như một enzyme N-glycosidase cắt một base adenine ở

vị trí 4324 của tiểu phần 28S rARN thuộc ribosome 60S dẫn tới quá trình tổng hợp protein trong tế bào nhiễm bệnh bị dừng lại Đây là nguyên nhân chính dẫn đến quá trình chết của tế bào do không tạo ra được các sản phẩm cần thiết cho quá trình sống [27] Tiểu phần B có vai trò đưa độc tố vào trong tế bào chủ Năm tiểu phần B có các

vị trí kết hợp với glycolipid trên bề mặt của tế bào đích, do vậy, năm tiểu phần này tương tự như cầu nối trung gian để tiểu phần A xâm nhập vào trong tế bào Trong trường hợp không có tiểu phần A, tiểu phần B vẫn tạo cấu trúc pentamer có chức năng tương tự holotoxin trong quá trình liên kết với glycolipid trên bề mặt tế bào Thụ thể của độc tố Shiga-like toxin là glycolipid globotriaosylceramide (Gb3), Gb3

có vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của độc tố bởi tất cả các tế bào dễ bị nhiễm Shiga-like toxin thì đều có Gb3 trên bề mặt tế bào, trong khi đó những tế bào không có Gb3 trên bề mặt thì có khả năng kháng lại độc tố (Hình 1.5)

Năm 1977, Konowalchuk và cộng sự đã báo cáo rằng chủng gây bệnh E coli O26:H11 thuộc nhóm EPEC (Enteropathogenic E coli- E coli gây bệnh đường ruột)

sản xuất một chất độc tác động trên tế bào Vero và đặt tên là Vero toxin [47] O'Brien

Trang 21

và cộng sự (1987) cho rằng, độc tố Vero toxin mà Konowalchuk nghiên cứu rất giống

với độc tố Shiga toxin được sản xuất bởi Shigella dysenteriae type 1, và nó có thể bị

vô hiệu hóa bằng anti-Shiga toxin, do đó một tên mới được đưa ra là Shiga-like toxin [71] Độc tố Vero toxin do Konowalchuk và cộng sự mô tả giống với độc tố Shiga toxin về đặc điểm di truyền và protein Do vậy, các tên Shiga-like toxin, Shiga toxin

và Vero toxin được sử dụng thay thế cho nhau, kết quả là tên các chủng VTEC

(verotoxin producing E coli), SLTEC (Shiga-like toxin producing E coli) và STEC

đều được sử dụng Các bệnh như HC, HUS thường gây ra bởi nhóm STEC hoặc

là gây bệnh, tuy nhiên không phải tất cả các chủng STEC đều gây bệnh HC hoặc

HUS Nhóm vi khuẩn E coli O157:H7 thuộc nhóm EHEC Nếu xét về độc tố của nó,

E coli O157:H7 phải thuộc về nhóm VTEC, SLEC hoặc STEC Điều này có thể

được khẳng định khi cơ chế gây bệnh của vi khuẩn được mô tả đầy đủ

Shiga-like toxin I

Shiga-like toxin I là một nhân tố độc lực của E coli O157:H7 gây bệnh ở

người Giống như các độc tố khác của họ Shiga toxin, nó bao gồm một tiểu phần (A) có chức năng enzyme và năm bản sao của một tiểu đơn vị liên kết (B-

pentamer) Shiga-like toxin I được mã hóa bởi gen Stx1 Các gen Stx1 có cấu trúc bảo tồn cao giống với độc tố Shiga toxin do dysenteriae loại 1 tạo ra Trước đây, gen Stx1 được biết chỉ có duy nhất một biến thể [55], ngày nay người ta biết thêm một số biến thể khác của Stx1 là Stx1c [102] và Stx1d [17] Biến thể Stx1c không

tìm thấy trong vi khuẩn STEC và không liên quan đến bệnh ở người

Shiga toxin và Shiga-like toxin I đều là những thành viên trong họ độc tố Shiga toxin Chúng chỉ khác nhau ở một điểm (Ser45 và Thr45) trong tiểu phần A

và tiểu phần B giống hệt nhau Cấu trúc tinh thể 5 mặt pentamer tiểu phần B của Shiga-like toxin và Shiga holotoxin đã được xác định, cả hai cấu trúc đều chứa cấu trúc thụ cảm Cấu trúc dự đoán của hai vị trí thụ cảm đã được xây dựng mô hình dựa trên những đặc điểm bề mặt khác của các độc tố trong họ Đã có báo cáo rằng cấu trúc tinh thể của năm mặt Shiga-like toxin I B tạo phức hợp với cấu trúc tương

Trang 22

tự Gb3 Cấu trúc này đã chỉ ra sự tồn tại của ba vị trí kết hợp với Gb3 của tiểu phần

B, một trong đó tương ứng với vị trí được dự đoán trước Kết quả về cấu trúc của Ling và cộng sự là nghiên cứu đầu tiên về sự tương tác giữa độc tố và thụ thể của nó (là vị trí trung gian nhận dạng tế bào đích) [52]

Độc tố Shiga-like toxin II

Độc tố Shiga-like toxin II trong E coli O157:H7 do gen Stx2 mã hóa Gen

Stx2 có nhiều biến thể như Stx2, Stx2b, Stx2c, Stx2d, [45], nhưng chỉ có biến thể Stx2c được tìm thấy trong chủng E coli O157:H7 [27] Các biến thể Stx2 được phân

biệt với nhau nhờ các đặc điểm như hoạt tính sinh học, phản ứng miễn dịch, hoặc thụ thể mà nó kết hợp Do đặc tính kết hợp với thụ thể khác nhau dẫn đến khả năng gây độc đối với từng tế bào khác nhau Các nghiên cứu cho thấy chủng vi khuẩn

STEC tạo Stx2 (Stx2a, 2c và 2d) có liên quan chặt chẽ với hội chứng HUS hơn các chủng vi khuẩn chỉ sinh ra Stx1 [29] Shiga-like toxin II không giống hoàn toàn với

Shiga-like toxin I Shiga-like toxin II có nhiều đặc tính sinh học giống với Shiga toxin đặc biệt là trình tự nucleotide và protein, Shiga-like toxin II có cùng điểm đẳng điện và độ bền nhiệt với Shiga toxin, cùng bị trung hòa bởi huyết thanh Các

kỹ thuật giải trình tự nucleotide và so sánh amino acid cho thấy Shiga-like toxin I

và Shiga-like toxin II có tỷ lệ tương đồng về gen là 99% và chỉ khác nhau một amino acid trong tiểu phần “A” Tuy nhiên Shiga-like toxin II lại có tính kháng nguyên khác với Shiga-like toxin I bên cạnh đó Shiga-like toxin II không bị vô hiệu bởi anti-Shiga-like toxin hoặc kháng thể kháng Shiga-like toxin I Shiga-like toxin

II có nhiều trình tự và tính kháng nguyên đa dạng hơn Shiga-like toxin I [27], [33]

Shiga-like toxin I và Shiga-like toxin II có độc tính khác nhau đối với từng loại tế bào So với Shiga-like toxin I, Shiga-like toxin II độc hơn gấp 1000 lần đối với tế bào nội mô mao mạch thận của người [11] Siegler và cộng sự (2003) đã thử nghiệm so sánh ảnh hưởng của Shiga-like toxin I và Shiga-like toxin II trên mô hình động vật linh trưởng [87] Siegler đã tiêm Shiga-like toxin II vào tĩnh mạch dẫn tới biểu hiện lâm sàng và bệnh HUS đặc trưng, trong khi tiến hành tương tự đối với Shiga-like toxin I thì không thấy sự phát triển bệnh So sánh cấu trúc tinh thể của

Trang 23

Shiga-like toxin II và Shiga toxin cho thấy có 4 điểm cấu trúc khác biệt lớn có thể giải thích cho sự liên quan giữa Shiga-like toxin II với HUS Sự khác biệt lớn nhất

là do vị trí hoạt động của Shiga-like toxin II, khả năng gây độc hơn có thể do tiểu đơn vị A của Shiga-like toxin II hình thành cấu trúc xoắn 2 vòng sau khi đi qua vòng trung tâm cấu trúc pentamer của 5 tiểu phần B Một trong ba vị trí liên kết với thụ thể trong cấu trúc pentamer tiểu phần B của Shiga-like toxin II có hình dạng khác so với các cấu trúc pentamer-B của Shiga-like toxin [27]

Shiga-like toxin II không chỉ gây độc tế bào đối với tế bào Vero và Hela, mà còn gây độc trong ruột thỏ, gây chết do tê liệt trên chuột thí nghiệm Tuy nhiên khi

phân tích các mẫu E coli O157:H7 phân lập được từ các đợt dịch và những bệnh

nhân mắc HUS cho thấy rằng các chủng này không sản sinh một độc tố duy nhất mà cùng sản xuất cả hai loại Shiga-like toxin Như vậy có thể có một mối liên hệ giữa

cả hai loại độc tố này trong quá trình gây bệnh của vi khuẩn, tuy nhiên điều này vẫn chưa được chứng minh [20]

1.1.3 Nguyên nhân và diễn biến khi ngộ độc

Sau khi ăn hoặc uống thực phẩm nhiễm E coli O157:H7, vi khuẩn cùng với

thức ăn qua thực quản, dạ dày, ruột non xuống ruột già của bệnh nhân Tại đây, vi khuẩn sẽ bám lên các gờ răng lược của thành ruột, sinh sản, tiết ra độc tố phá hủy tế bào niêm mạc ruột, xâm nhập vào các mạch máu bên dưới thành ruột Vì độc tố của

vi khuẩn làm tế bào niêm mạc ruột bị phá hủy nên thành ruột trở nên mỏng hơn, gây

ra xuất huyết ruột và đi ngoài ra máu Khi độc tố của vi khuẩn đã vào trong các mạch máu, nó sẽ gây ra sự ngưng kết các tế bào tiểu cầu và fibrin tạo thành khối, các khối tiểu cầu và fibrin này khi di chuyển trong lòng mạch sẽ gây cản trở tốc độ

di chuyển của các tế bào máu khác, làm tăng áp suất của máu lên thành mạch, trong thời gian dài sẽ làm tăng huyết áp của bệnh nhân (Hình 1.6) Mặt khác, các khối ngưng kết này chính là nguyên nhân gây ra HUS vì chúng làm nghẽn các mạch máu nhỏ, khiến máu không đi hết được tới các tế bào làm giảm chức năng của các cơ quan gây suy tạng đặc biệt là thận

Trang 24

Hình 1.6 Nguyên lý gây bệnh của E coli O157:H7

Triệu chứng điển hình nhất khi bị nhiễm vi khuẩn E coli O157:H7 là: tiêu

chảy, ói mửa, đau bụng quặn thắt, sốt nhẹ, mệt mỏi, đôi khi đi ngoài có máu Tiếp theo là một số vấn đề sức khỏe gồm các triệu chứng sau: (i) Viêm đại tràng xuất huyết có triệu chứng là đau bụng, đi ngoài (có thể đi ngoài ra máu) Viêm đại tràng

xuất huyết được coi là biểu thị đặc trưng cho việc nhiễm E coli O157:H7 hoặc là sự phát triển của HUS 38-61% trường hợp nhiễm E coli O157:H7 đều có triệu chứng

này Thời kỳ ủ bệnh thường từ 1-9 ngày trong các đợt dịch Đối với trẻ em hiện tượng tiêu chảy kéo dài lâu hơn (9,1 2 ngày) so với người trưởng thành (6,6 1,1 ngày) và cuối cùng thường là triệu chứng đi ngoài ra máu [16], [20]; (ii) Hội chứng HUS được đặc trưng bởi các dấu hiệu như: thiếu máu do dung huyết, tiểu cầu vón cục

và suy thận, hội chứng này xuất hiện chủ yếu xuất hiện ở trẻ dưới 10 tuổi và người cao tuổi Các triệu chứng đầu tiên của HUS là: người bệnh xanh xao, thiếu máu, bí tiểu, phù và suy thận cấp, các triệu chứng này bắt đầu từ khoảng một tuần sau khi nhiễm vi khuẩn Một nửa bệnh nhân HUS phải lọc thận và tỉ lệ tử vong của số bệnh nhân này là 3-5% Một số biến chứng khác của HUS có thể gồm tai biến, hôn mê, đột quỵ, tăng huyết áp, khoảng 15% trường hợp bệnh nhân gặp các biến chứng như trên

sẽ bị suy thận mãn tính [16], [20]; (iii) Tử vong: các trường hợp tử vong do E coli

O157:H7 thường xảy ra với người cao tuổi với nguyên nhân chủ yếu do tiêu chảy, HUS, xuất huyết, phát ban, sốt cao [20]

1.1.4 Tình hình ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn ở Việt Nam

Trang 25

Chủng vi khuẩn E coli O157:H7 được xác định lần đầu tiên ở Việt Nam vào năm 2005 [65], tiếp đó đã có những nghiên cứu về E coli O157:H7 [7], [9], [94]

Trong các vụ dịch gây tiêu chảy ở nước ta hiện chưa tìm thấy sự hiện diện của chủng

E coli O157:H7, tuy nhiên những vi khuẩn thuộc các nhóm khác gây ngộ độc và các

bệnh liên quan đã được phát hiện trong nhiều trường hợp [35] Theo thống kê của của Bộ Y tế, từ năm 2004-2009 đã có 1.058 vụ ngộ độc thực phẩm, trung bình 176,3 vụ/năm, số người bị ngộ độc thực phẩm là 5.302 người/năm, số người chết là

298 người (49,7 người/năm), tính trung bình tỷ lệ người bị ngộ độc thực phẩm cấp tính là 7,1 người/100 nghìn dân/năm Năm 2009 có 152 vụ ngộ độc thực phẩm với 5.212 người mắc và 31 người tử vong So sánh với năm 2008, số vụ ngộ độc/năm

2009 giảm 53 vụ (25,9%); số người mắc giảm 2.616 người (33,4%); số người đi viện giảm 1.888 người (31,3%); và số người bị tử vong giảm 26 trường hợp ( 42,6%) Về nguyên nhân ngộ độc thực phẩm, 29,6% số vụ do thực phẩm bị ô nhiễm

vi sinh vật, 5,2% số vụ do hóa chất, 24,7% do thực phẩm có sẵn độc tố tự nhiên, 40,5% số vụ không xác định được nguyên nhân [104]

Trong năm 2013, ở nước ta đã xảy ra nhiều vụ ngộ độc nghiêm trọng, trong

đó nguyên nhân chủ yếu là do vi khuẩn E coli gây ra (thống kê trong quý III năm

2013 trong 40 vụ ngộ độc thực phẩm thì 23 vụ do vi sinh vật gây ra) Trong 5 ngày (từ 23-28/5/2013) có 163 người ở Bến Tre nhập việ

Kết quả kiểm nghiệm của Viện

E coli, Coliform Shigella Ngày 4/10/2013 xảy ra vụ ngộ độc tại Công ty TNHH Một thành viên Wondo Vina (trụ sở tại xã Long Bình Điền, huyện Chợ Gạo tỉnh Tiền Giang) làm 1200 công nhân phải nhập viện Nguyên nhân

được xác định là do thức ăn nhiễm vi khuẩn Salmonella Ngày 16/10/2013 gần 400

người bị ngộ độc khi sử dụng bánh mỳ ở Quảng Trị, trong đó 382 người phải nhập

viện Nguyên nhân cũng được xác định do vi khuẩn Salmonella gây ra Tiếp theo

ngày 17/10/2013, 113 công nhân ở Bình Dương ngộ độc do ăn thịt bò do bị nhiễm

vi khuẩn lostridium perfringens

Trang 26

Hàng năm trên cả nước xảy ra nhiều vụ ngộ độc thực phẩm nghiêm trọng,

tuy nhiên chưa có vụ ngộ độc thực phẩm nào gây ra bởi E coli O157:H7 Mặc dù

vậy, không thể loại trừ khả năng vi khuẩn này sẽ bùng phát thành dịch bệnh trên diện rộng Trong nhiều nghiên cứu [7], [9] các nhà nghiên cứu đã phát hiện được vi khuẩn này nhiễm trong thịt lợn, thịt bò tại các cửa hàng tạp hóa Do vậy, việc đưa ra

các phương pháp phát hiện, chẩn đoán nhanh và kháng thể đối với vi khuẩn E coli

O157:H7 là có tính thiết thực

1.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VÀ XÁC ĐỊNH VI KHUẨN E

COLI O157:H7

1.2.1 Phương pháp PCR dựa trên ADN

Hiện nay, phương pháp truyền thống dựa trên các đặc điểm hình thái, huyết thanh vẫn đang là công cụ quan trọng trong phân loại vi khuẩn Các phương pháp

về hình thái học, huyết thanh học thường được kết hợp với các phương pháp nhuộm (ví dụ như nhuộm Gram) thường được sử dụng trong nhận dạng Tuy nhiên, các phương pháp truyền thống này chưa đủ để phân loại những loài gần nhau Trong một số trường hợp, phân loại truyền thống gặp trở ngại do một số đặc tính dùng cho nhóm vi sinh vật này nhưng lại không có ý nghĩa với nhóm vi sinh vật khác Điều này dẫn đến nhiều trường hợp phải xác định lại tên phân loại của một số vi sinh vật Mặt khác, đối với những loài có độ tương đồng cao về mặt hình thái thì phân loại truyền thống sẽ khó có thể đạt được hiệu quả Nhược điểm này của phân loại truyền thống hoàn toàn có thể bổ sung nhờ phân loại học phân tử

Ngày nay, do những tiến bộ khoa học kĩ thuật trong sinh học phân tử, di truyền học phân tử, phương pháp phân loại vi khuẩn đã được bổ sung nguồn đặc điểm phân loại theo genotype Các kết quả nghiên cứu so sánh sinh hóa đã chứng minh được rằng thành phần và trình tự nucleotide của ADN và rARN, các loại gen điều khiển trao đổi chất, thành phần và cấu tạo các bào quan là những bằng chứng đáng tin cậy để xác định loài Kết hợp với phương pháp phân loại theo đặc điểm hình thái (phenotype) thì phương pháp phân loại dựa vào những phân tích, so sánh

Trang 27

trình tự gen đang được coi là công cụ để xác định vi khuẩn ở nhiều bậc định loại loài Đặc biệt phân tích trình tự của rARN còn là phương tiện để điều tra và định danh những loài vi khuẩn không thể nuôi cấy trong môi trường nhân tạo [3] Hiện nay, đại đa số các nhà khoa học đồng ý với quan niệm 2 chủng được coi là 2 loài riêng biệt nếu chúng giống nhau dưới 70% khi tiến hành lai ADN Keswani và cộng

sự (2001) đã chứng minh rằng nếu sự tương đồng giữa hai trình tự gen 16S rARN thấp hơn 98,6% thì xác suất để mức độ giống nhau trong phép lai ADN thấp hơn 70% sẽ là 99% Vì thế giá trị tương đồng 98,6% của trình tự gen 16S rARN được coi là ngưỡng để phân biệt hai loài khác nhau Tuy nhiên, cũng có nhiều nhà khoa học lấy giá trị này là 98% [44]

Phân loại vi khuẩn theo phương pháp sinh học phân tử là sự phát hiện, mô tả,

và giải thích tính đa dạng sinh học ở mức độ phân tử giữa các loài và các chủng trong phạm vi một loài Có thể dựa trên sự nghiên cứu so sánh các gen trong hệ gen nhân, hệ gen các bào quan (ty thể và lục lạp) hoặc các sản phẩm của gen (protein, enzyme) Trong các bào quan, ribosome là bào quan có vai trò sản xuất protein từ những phân tử mARN Về cấu tạo, ribosome gồm có protein và rARN rARN của ribosome thường bảo thủ giữa các loài và là vùng ít bị biến đổi Những gen này tiến hóa chậm hơn so với các gen khác, do vậy, chúng được sử dụng như những công cụ

để phân loại Các rARN thường giống nhau Khác với các vi khuẩn, ribosome nhân chuẩn (Eukaryotes) chứa 4 loại phân tử rARN là: 5S, 5,8S, 18S và 28S Đối với các

vi sinh vật nhân sơ (Prokaryote), ribosome chỉ chứa 3 loại phân tử rARN là: 5S, 16S

và 23S Trong đó, gen 16S rARN mã hóa cho phân tử rARN loại 16S được xem là phù hợp nhất cho việc nghiên cứu phân loại các vi sinh vật nhân sơ Gen mã hóa cho 5S rARN có kích thước khoảng 120 nucleotide, dễ đọc và so sánh trình tự, nhưng lại không đủ để phân biệt một cách chi tiết giữa các chủng Ngược lại, gen

mã hóa cho 23S rARN lại có kích thước lớn, khoảng 3.000 nucleotide, gây khó khăn cho việc tách dòng, đọc và so sánh trình tự Do vậy, trong định danh vi khuẩn thường dựa vào trình tự của đoạn 16S rARN Gen 16S rARN có kích thước khoảng

1540 nucleotide [75], có nhiều ưu điểm: (i) phổ biến trong tất cả các sinh vật Prokaryote; (ii) kích thước và tính bảo thủ về chức năng của gen là kết quả của tỷ lệ

Trang 28

đột biến thấp trong suốt quá trình tiến hóa và (iii) vùng bảo thủ có thể được sử dụng

để thiết kế mồi trên các đơn vị phân loại, cũng như chín vùng siêu biến (V1- V9) có thể được sử dụng hiệu quả để phân biệt giữa các đơn vị phân loại Chính vì thế nên gen 16S rARN có thể được coi là một marker cho nghiên cứu phân loại [56] Thêm vào đó, trên gen 16S rARN có chứa các vùng biến đổi (variable) và vùng bán bảo tồn (semi-conserved) cho phép xác định tính đặc trưng ở mức độ chủng, loài [19]

Do vậy, gen 16S rARN đã được các nhà khoa học nghiên cứu kỹ lưỡng và đã thiết

kế được rất nhiều cặp mồi để nhân đoạn gen này bằng kỹ thuật PCR Đây là một thuận lợi cho các nghiên cứu phân loại dựa trên các gen mã hóa 16S rARN Ngoài

ra, người ta còn sử dụng vùng đệm giữa gen 16S rARN và 23S rARN để nghiên cứu

về tính đa dạng của prokaryote [30] Có nhiều kết quả nghiên cứu sử dụng kỹ thuật PCR để phát hiện hoặc phân loại các loài vi khuẩn Ví dụ gần đây nhất, Mizrahi-Man (2013) cũng sử dụng trình tự ngắn gen 16S rARN để phân loại [56] Theo Hoo

và cộng sự, trong 7 năm (2001- 2007) sử dụng trình tự 16S rARN đã phát hiện được

215 loài mới trong đó có 29 loài mới Tác giả cũng khẳng định nên sử dụng các phương pháp khác để bổ sung cho phương pháp sử dụng gen 16S rARN [101]

Bên cạnh các gen rARN, các gen độc tố cũng được sử dụng trong phân loại học phân tử Các gen này thường là những gen gây độc nằm trong các vi khuẩn gây

bệnh ở các loài Ví dụ, đối với E coli O157:H7 các gen độc tố thường được sử dụng như gen Stx1, Stx2, eae, ehxA, saa Hầu hết các kỹ thuật sinh học phân tử được sử

dụng để phát hiện và phân loại vi khuẩn đều là những phương pháp hiện đại như PCR, Real-time PCR, kỹ thuật LAMP Mỗi phương pháp có ưu điểm và nhược điểm riêng phù hợp với từng đối tượng và các gen nghiên cứu Việc sử dụng các gen độc tố để phát hiện các vi khuẩn độc trong các mẫu nghiên cứu hoặc mẫu thực phẩm cũng là một hướng được nhiều nhà khoa học quan tâm Năm 2010, Sanchez

sử dụng các kỹ thuật PCR, kiểu huyết thanh, kiểu phage và kỹ thuật PFGE

(pulsed-field gel electrophoresis) trên các gen Stx1, Stx2, ehxA, eae và saa để xác định sự phát tán và các đặc điểm của vi khuẩn E coli O157:H7 và vi khuẩn tạo Shiga toxin

không phải là O157 [14], [84] Cũng trong năm 2010, Sahilah và cộng sự đã sử

dụng kỹ thuật PCR và kỹ thuật RAPD để xác định vi khuẩn E coli O157:H7 trong

Trang 29

20 mẫu thịt bò từ các cửa hàng bán lẻ thịt bò thuộc Selangor, Malaysia Kết quả cho

thấy, có 14 mẫu dương tính với Stx1 và Stx2, 5 mẫu dương tính với Stx1 và 1 mẫu

âm tính với cả Stx1 và Stx2 Tác giả cho rằng, 20 mẫu phân lập là 20 loại E coli

O157:H7 khác nhau, điều đó có thể cho thấy mức độ biến đổi di truyền địa lý ở mức

Trang 30

: MicroSEQ E coli , TaqMan® E coli O157:H7 Detection Ki

65oC Phương pháp này có hiệu quả khuyếch đại cao khoảng 109-1010 lần trong 15-60 phút So với các phương pháp như PCR, Realtime PCR LAMP có nhiều ưu điểm hơn như: chính xác, đơn giản, giá thành thấp và đặc biệt là thời gian thực hiện ngắn

và có thể phát hiện kết quả bằng mắt thường Do vậy, LAMP thường được sử dụng

để tạo các bộ kit chẩn đoán nhanh được phổ biến rộng rãi trên thế giới

Phương pháp LAMP rất đơn giản, dễ thực hiệ

: hai mồi trong (FIP và BIP) và hai mồi ngoài (F3 và B3) [59] Hơn nữa Nagamine và cộng sự (2002) đưa ra phương pháp mới bằng cách đặt mồi vòng xuôi và ngược (LF và LB) làm phản ứng LAMP được tiến hành nhanh hơn [63] LAMP là phản ứng nhân bản ADN hết sức đặc hiệu, chỉ xảy ra khi có điều kiện cần

và đủ cho phản ứng, đó là chỉ khi cả 4 chuỗi mồi, bao gồm các mồi đơn F3, B3, các mồi FIP (F1c+F2), BIP (B1c+B2) bám được vào 6 chuỗi đích của khuôn, thì sản phẩm ADN-vòng mới được tạo ra và mới phát hiện được Chỉ một hay vài mồi không hoạt động, hoặc không bám đặc hiệu, sản phẩm ADN-vòng sẽ không được tạo ra Đặc biệt sản phẩm của phản ứng có thể quan sát bằng mắt thường do sự kết

Trang 31

tủa của phản ứng tạo muối pyrophosphate (Mg2P2O7) hoặc phát quang khi nhuộm bằng thuốc nhuộm [31], [58]

Phát hiện E coli O157:H7

Từ khi kỹ thuật LAMP được phát triển đến nay, trên thế giới có nhiều nghiên cứu

ứng dụng kỹ thuật LAMP để phát hiện E coli O157:H7 và một số vi khuẩn gây độc

khác đặc biệt là họ EHEC Hầu hết các nghiên cứu này dựa trên các gen gây độc như

Stx1, Stx2, rfb, eae [34], [54], [98] Đây là những nhân tố quan trọng gây nên các

bệnh ở người như xuất huyết ruột, HUS Một vài nghiên cứu, phát triển kỹ thuật

LAMP phát hiện E coli O157 trong thịt bò, thận bò, phân bò và những sản phẩm

khác từ bò [72] Từ những nghiên cứu này, Công ty Eiken đã chế tạo thành công các

kit xác định nhanh E coli O157 Kit cho phép phát hiện độc tố trong thực phẩm và

môi trường, tuy nhiên giá thành của kit còn đắt (500 USD cho 48 phản ứng)

1.2.3 Sử dụng kháng thể tái tổ hợp trong phát hiện E coli O157:H7

Từ đầu thế kỷ 19 các nhà khoa học đã ứng dụng tính đặc hiệu của phản ứng kháng nguyên-kháng thể để nhận diện và xác định kiểu huyết thanh của các tác nhân gây bệnh Khi kháng thể đặc hiệu xuất hiện trong mẫu, chúng sẽ liên kết trực tiếp với kháng nguyên tạo thành phức hợp miễn dịch kháng nguyên-kháng thể, phức hợp này được phát hiện bằng một kháng thể khác đã được đánh dấu enzyme hoặc huỳnh quang Kháng nguyên có thể là toàn bộ vi khuẩn hoặc một phần của tế bào vi khuẩn Phát hiện sự có mặt của kháng thể vẫn được sử dụng trong các nghiên cứu

để chứng minh rằng con vật đó có tiếp xúc với mầm bệnh hay không; hoặc sàng lọc một nhóm cá thể để xác định tỷ lệ nhiễm bệnh trong quần thể Mặc dù phát hiện kháng thể có tầm quan trọng trong xác nhận sự có mặt của kháng thể nhưng nó không nhất thiết là chỉ thị trong miễn dịch dự phòng và cũng không phải là một chỉ thị cho biết có mầm bệnh đó trong thời điểm hiện tại hay không [4]

Trên thế giới đã có những nghiên cứu về kháng thể kháng vi khuẩn E coli

O157:H7 [4 3] [4 8] Năm 2004, Kanitpun và cộng sự [4 3] đã sử dụng công nghệ biểu lộ trên phage (phage display) trên dòng tế bào hybridoma chuột để tạo ra kháng thể đối với kháng nguyên roi H7 và lipopolysacharide (kháng nguyên O157) Kích

Trang 32

thước kháng thể kháng O157 khoảng 36 kDa, còn kháng thể kháng H7 là 30 kDa Cũng trong năm 2004, sử dụng protein intimin và EspA tái tổ hợp để phản ứng gây miễn dịch trên thỏ và sàng lọc thư viện phage bằng kỹ thuật biểu lộ trên phage,

Kühne và cộng sự [4 8] cũng tạo ra các kháng thể đặc hiệu với vi khuẩn E coli

O157:H7 Kháng thể nhận biết EspA cũng có thể nhận ra một protein từ chủng O157 DM3 đột biến và protein của chủng O111 Các kháng thể này được kiểm tra chức năng bằng các kỹ thuật lai bao gồm ELISA, Western blot, dot blot và chứng minh được tiềm năng sử dụng của kháng thể trong chẩn đoán liên quan đến vi

khuẩn E coli O157:H7

Trên thế giới đã có những nghiên cứu về kháng thể kháng vi khuẩn E coli

O157:H7 Năm 2004, Kanitpun và cộng sự [43] đã sử dụng công nghệ biểu lộ trên phage đối với dòng tế bào hybridoma chuột để tạo ra kháng thể đối với kháng nguyên roi H7 và lipopolysacharide (kháng nguyên O157) Kích thước kháng thể kháng O157 khoảng 36 kDa, còn kháng thể kháng H7 là 30 kDa Cũng trong năm

2004, sử dụng protein intimin và EspA tái tổ hợp để phản ứng gây miễn dịch trên thỏ và sàng lọc thư viện phage bằng kỹ thuật biểu lộ trên phage, Kühne và cộng sự

[48] cũng tạo ra các kháng thể đặc hiệu với vi khuẩn E coli O157:H7 Kháng thể

nhận biết EspA cũng có thể nhận ra một protein từ chủng O157 DM3 đột biến và protein của chủng O111 Các kháng thể này được kiểm tra bằng các kỹ thuật lai bao gồm ELISA, Western blot, dot blot và chứng minh được tiềm năng sử dụng của

kháng thể trong chẩn đoán liên quan đến vi khuẩn E coli O157:H7

Kỹ thuật ELISA

ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) là kỹ thuật sử dụng kháng thể đơn dòng (mAb- Monoclonal Antibody) được phủ bên ngoài những đĩa giếng Nếu có sự hiện diện của kháng nguyên mục tiêu trong mẫu nó sẽ được giữ lại trên

bề mặt giếng Các kháng nguyên này sẽ được phát hiện bằng cách sử dụng kháng thể thứ hai có gắn với enzyme như horseradish peroxidase hay alkaline phosphatase Khi bổ sung một cơ chất đặc hiệu của enzyme vào giếng, enzyme sẽ xúc tác phản

Trang 33

ứng thủy phân cơ chất để tạo ra các phản ứng có màu hay phát sáng Bằng cách theo dõi sự chuyển màu, có thể phát hiện sự hiện diện và định lượng được kháng nguyên

Kháng nguyên (antigen) là những chất có khả năng huy động hệ miễn dịch tiết ra kháng thể đặc hiệu với chúng gây ra phản ứng miễn dịch đặc hiệu Kháng nguyên có thể có bản chất là protein lạ, acid nucleic, một số lipid và polysaccharide

E coli có 3 cấu trúc kháng nguyên với tên gọi là O, K và H

Kháng thể (antibody) là protein - globulin được sinh ra bởi tế bào lympho tham gia phản ứng miễn dịch đặc hiệu với kháng nguyên đĩa giếng ELISA (microplate) là một phiến nhựa phẳng với nhiều "giếng" được sử dụng như những ống nghiệm nhỏ Microplate đã trở thành một công cụ tiêu chuẩn trong nghiên cứu phân tích và phòng thí nghiệm thử nghiệm chẩn đoán lâm sàng ELISA được dùng phổ biến trong các khảo nghiệm miễn dịch, là xét nghiệm chẩn đoán y tế hiện đại trên người và động vật

ELISA còn được dùng để phát hiện kháng nguyên hoặc kháng thể trong mẫu thông qua phản ứng đặc hiệu kháng nguyên-kháng thể Bằng phương pháp đo gián tiếp cường độ phản ứng của enzyme của phức hợp miễn dịch người ta có thể lượng hóa được kháng nguyên và kháng thể cần phát hiện Nguyên lý chung là các kháng nguyên hoặc kháng thể được gắn trên một giá thể rắn, chính các nhân tố này sẽ bẫy bắt kháng thể hoặc kháng nguyên đặc hiệu Sau khi rửa để loại bỏ các vật liệu không bám lên thành các giếng của phiến nhựa, kháng thể thứ hai được đánh dấu bằng enzyme được bổ sung thêm vào giếng phản ứng Phân tử kháng thể này sẽ gắn với một epitope khác trên phân tử kháng thể thứ nhất Sau khi rửa lần thứ 2 để loại

bỏ lượng kháng thể dư thừa, cơ chất được thêm vào và phản ứng enzyme xảy ra ELISA được sử dụng rộng rãi dưới dạng các bộ hóa chất (kit) để phát hiện và định lượng vi sinh trong thực phẩm trong thời gian vài giờ sau khi tăng sinh Kỹ thuật

có thể đạt được 104 cfu/ml)

c

E coli O157:H7 như: E coli

Trang 34

ty Diagnostic Automation, E coli O157 antige

sổ hiện kết quả để liên kết với kháng thể đã được cố định tại đó Tại cửa sổ hiện kết quả đã gắn một vạch kháng thể tóm bắt, và một vạch kháng thể đặc hiệu loài Nếu trong mẫu có chứa kháng nguyên quan tâm thì phức chất đó sẽ liên kết với kháng thể tóm bắt, kết quả tạo thành một băng mầu có thể quan sát bằng mắt thường

Trang 35

Ngược lại nếu trong mẫu không chứa kháng nguyên hoặc kháng thể quan tâm thì phức chất sẽ liên kết với kháng thể đặc hiệu loại tạo thành băng màu Vì vậy, thử nghiệm bao giờ cũng xuất hiện băng màu tại cửa sổ đối chứng cho dù mẫu được kiểm định là âm tính hay dương tính Nếu cửa sổ hiện kết quả xuất hiện hai băng màu thì mẫu được kiểm định là dương tính [4]

kiểm tra so với vùng điều khiển là không quan trọng

, E coli O157:H

- ) Người ta đã sử dụng nhiều phương pháp khác nhau để phát hiện chúng như: đếm tế bào dưới kính hiển

vi, đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch, miễn dịch học bằng enzyme, đầu dò enzyme, ELISA, kit chẩn đoán bằ ện E coli O157:H7 trong thực phẩm là sử dụng kỹ thuật làm giầu, xác định khuẩn lạc nghi ngờ có E coli

Sorbitol MacConkey (SMAC) sau khi ủ ở 37oC trong 24 giờ Từ nhữ i ngờ, các tính chất sinh hóa và ngưng kết đặc hiệu

được tiến hành kiểm tra để khẳng định là E.coli O157:H7 Tuy nhiên, tất cả các

phương pháp nêu trên đều không thể phát hiện chính xác số lượ ở nồng

độ thấp Để khắc phục nhược điểm này, người ta đã và đang ứng dụng các loại vật

Trang 36

liệu nano phát quang như hạt vàng, hạt silica chứa tâm màu hay chấm lượng tử

ức hợp bền vững hơn và kháng thể không mất hoạt tính lâu hơn Sau khi tạo được phức hợ ặc hiệu với hạt nano, kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang được sử dụng để phát hiện và xác định số lượ

Có nhiều cách phát hiệ : quan sát và đếm trực tiế

ới kính hiể ; xác định số lượ

bằ ẩn giữa cường độ phát quang của vi khuẩn gắn hạt nano và số lượng

vi khuẩn trong dung dịch chuẩn Cường độ phát huỳnh quang là hàm số f của số

1.3 KHÁNG THỂ

Kháng thể là một sản phẩm đặc hiệu được hệ miễn dịch tổng hợp giúp cơ thể tấn công các tác nhân gây bệnh Các kháng thể là các immunoglobulin (có bản chất glycoprotein), do các tế bào lympho B, các tương bào (biệt hóa từ lympho B) tổng hợp và tiết ra giúp hệ miễn dịch nhận biết và vô hiệu hoá các tác nhân lạ, chẳng hạn các vi khuẩn hoặc virus

Kháng thể có cấu trúc hình chữ Y, có hai bộ “cành” gắn vào một “thân” Các đầu chữ Y được gọi là vùng biến đổi, ở phía đầu các cành chứa các vùng gắn kết kháng nguyên và thân là một vùng hằng định Các vùng hằng định chứa “lẫy khởi động” chức năng phản ứng lại kích thích bằng việc gắn kết các phức hệ của tế bào khác trong hệ miễn dịch Kháng thể gồm 4 chuỗi polypeptide, 2 chuỗi nặng và 2

Trang 37

chuỗi nhẹ nối với nhau bằng 1 cầu disulfide, hai chuỗi nặng được nối với nhau bởi 2 cầu disulfide Kiểu của chuỗi nặng quyết định phụ dạng của Ig (IgA, IgD, IgG, IgM

và IgE) Mỗi chuỗi có vùng biến đổi và vùng hằng định (vùng không biến đổi) Vùng biến đổi nằm ở đầu amino của chuỗi polypeptide Các vùng siêu biến đổi hoặc vùng quyết định tính bổ trợ được xác định trong vùng biến đổi của cả chuỗi nặng và chuỗi nhẹ Đây là những vùng nhận diện và liên kết đặc hiệu với vùng epitope của kháng nguyên (hay còn gọi là paratope) [5]

Kháng thể đa dòng là một tập hợp các kháng thể đặc hiệu với các epitope khác nhau trên một kháng nguyên cho trước Trong đáp ứng miễn dịch, cơ thể tổng hợp nhiều kháng thể tương ứng với các epitope của cùng một kháng nguyên: đáp ứng như vậy gọi là đa dòng Kháng thể đơn dòng là tập hợp các kháng thể đồng nhất với nhau về bản chất cùng nhận biết và gắn kết với một thụ thể Các kháng thể đơn dòng chỉ nhận biết một epitope trên một kháng nguyên cho sẵn Theo định nghĩa, tất cả các kháng thể đơn dòng cùng một dòng thì giống hệt nhau và được sản xuất bởi cùng một dòng tương bào Kháng thể đơn chuỗi là phân tử kháng thể gồm vùng biến đổi chuỗi nặng kết hợp với vùng biến đổi chuỗi nhẹ

Hình 1.7 Cấu trúc chung của một số loại kháng thể [96]

ABD: Antigen Binding site Linker: Đoạn nối

V H : Vùng biến đổi chuỗi nặng V L : Vùng biến đổi chuỗi nhẹ

C H : Vùng hằng định chuỗi nặng C L : Vùng hằng định chuỗi nhẹ

Trang 38

Nghiên cứu dựa trên phản ứng cắt của enzyme đối với immunoglobulin cho thấy rằng phân tử có thể chia thành hai phần mà vẫn có thể liên kết với kháng nguyên (được biết như là các mảnh Fab và một phần Fc) [73] Dạng 2 cánh vẫn được hình thành bởi mảnh Fab trong khi gốc là phần Fc Chuỗi nặng và chuỗi nhẹ của Fab có thể kết hợp thành một Fv, vùng chịu trách nhiệm kết hợp với kháng nguyên Mảnh Fab chứa chuỗi nhẹ hoàn chỉnh và một nửa đầu N (Fd) của chuỗi nặng (Hình 1.7) Trong vùng biến đổi của chuỗi nặng (VH) và chuỗi nhẹ (VL) có ba vùng siêu biến sẽ được xếp gần nhau trong quá trình cuộn xoắn protein, đây chính

là vị trí kết hợp với protein Những vùng siêu biến đổi này được biết như là những

được tạo nên từ trình tự dòng gốc VH, D, JH và mỗi VL được tạo bởi trình tự VK hoặc λ

và JK hoặc λ Sự kết hợp khác nhau có thể tạo thành lượng lớn các mảnh bao gồm 300

VH, 12 D và 4 JH, vì thế có nhiều sự kết hợp giữa các mảnh, hơn nữa bất kỳ chuỗi nặng nào có thể kết hợp với bất kỳ chuỗi nhẹ khác Cuối cùng, đột biến soma có thể

là nguyên nhân thay đổi amino acid và làm đa dạng thêm Do vậy, hệ thống miễn dịch được trang bị nhiều bản copy kháng thể để đối phó với số lượng lớn kháng nguyên trong cuộc đời

1.3.1 Mảnh kháng thể

Các phân tử kháng thể chứa các domain protein riêng biệt mà có thể phân tách bằng protease hoặc được tạo ra nhờ kỹ thuật tái tổ hợp Hai mảnh kháng thể được thiết kế gắn với kháng nguyên- Fab và Fv được tách dòng và bộc lộ trên phage Mảnh kháng thể lớn hơn- Fab gồm các phần VH-CH và VL-CL liên kết với

VL Dạng tái tổ hợp của Fv là mảnh biến đổi đơn chuỗi (scFv) được nối với nhau bằng một đoạn peptide, thường gồm 15 amino acid có trình tự (Gly4Ser)3 và được biểu hiện như một chuỗi polypeptide đơn Đoạn peptide nối này thường giàu Glycine để tạo tính linh hoạt, cũng như giàu Serine và Threonine cần cho khả năng hòa tan và có thể kết nối vùng đầu N của VH với vùng đầu C của VL hay ngược lại (Hình 1.8)

Trang 39

Hình 1.8 Sơ đồ cấu tạo của mảnh kháng thể đơn chuỗi.

Protein này giữ lại được tính đặc hiệu của globulin miễn dịch gốc mặc dù đã loại bỏ đi vùng hằng định và đưa thêm vào một đoạn peptide nối Đoạn nối cho

(VL) tạo thành phân tử đơn chuỗi Phân tử tái tổ hợp tạo ra vẫn bảo tồn hoạt tính nhận biết và liên kết đặc hiệu với kháng nguyên đích [96] Đặc điểm của các mảnh kháng thể khác nhau được tóm tắt trong bảng 1.2

Bảng 1.2 Đặc điểm của các mảnh kháng thể [96]

Mảnh

kháng thể

Kích thước (kDa)

Số

(linker) dài 15 amino acid

2 mảnh scFv-CH3

-CH1-CH2-CH3) và 2 chuỗi nhẹ (VL-CL)

Không giống các mAb thường được tạo ra trong nuôi cấy tế bào động vật có

vú, scFv thường được tạo ra trong quá trình nuôi tế bào vi khuẩn như E coli

1.3.2 Kháng thể tái tổ hợp

Trang 40

Kháng thể tái tổ hợp là thuốc thử cần thiết cho nghiên cứu, chẩn đoán và điều trị [42] Nhu cầu sử dụng kháng thể trong nghiên cứu khoa học, trong chẩn đoán và điều trị bệnh ngày càng lớn, đặc biệt là các kháng thể đặc hiệu có nguồn gốc từ người, nhưng nguồn kháng thể người thường khó kiếm được Vì vậy, phương pháp chung để thu nhận được các kháng thể là từ động vật gây miễn dịch và sau đó nhân tính hóa để hạn chế tối đa phản ứng miễn dịch khi sử dụng Phương pháp này đã được sử dụng trong hơn một thế kỷ nay Kháng thể huyết thanh đầu tiên được tạo ra

ở ngựa và kháng trực tiếp lại bệnh bạch cầu

Công nghệ hybridoma là một bước ngoặt quan trọng cho phép sản xuất kháng thể đơn dòng [46] Các kháng thể đơn dòng sản xuất theo phương pháp Kohler và Milstein năm 1975 có ứng dụng rất lớn trong nghiên cứu khoa học để xác định sự tương tác giữa các phân tử, xác định các vùng quyết định kháng nguyên Tuy nhiên, khi ứng dụng trong điều trị lại gặp những trở ngại về tính hiệu quả do chúng nhanh chóng bị trung hòa (cơ thể người bệnh sinh kháng thể kháng lại nó, gọi tắt là hiện tượng HAMA- Human Antimouse Antibody) [95] Để khắc phục vấn đề này, các nhà khoa học đã sử dụng kỹ thuật gen để: tạo kháng thể đơn dòng dạng ghép và sản xuất kháng thể có bản chất của người hoàn toàn

Kháng thể đơn dòng dạng ghép (Chimeric Monoclonal Antibody) là kháng thể mang vùng biến đổi có nguồn gốc của chuột và vùng hằng định có nguồn gốc của người Kháng thể đơn dòng dạng ghép làm tăng hiệu quả điều trị và giảm hiện tượng HAMA Trên thực tế đã có 5 kháng thể đơn dòng dạng ghép được bán trên thị trường ở nhiều nước để điều trị bệnh miễn dịch và ung thư Các kháng thể hoàn toàn có bản chất của người mới được nghiên cứu trong những năm gần đây và đang trong giai đoạn thử nghiệm

Kháng thể đơn dòng được “nhân” hóa (Humanized monoclonal antibody) là kháng thể mang vùng CDR có nguồn gốc từ chuột, phần còn lại của vùng biến đổi

và vùng hằng định có nguồn gốc từ người Những trình tự protein của chuột đã được sửa đổi để tăng sự tương đồng với kháng thể được sản xuất tự nhiên trong người Quá trình nhân hóa thông thường được áp dụng để phát triển kháng thể của

Định dạng
Số trang	133
Dung lượng	6,64 MB