Nghiên cứu sử dụng phân đoạn dịch chiết giàu polyphenol từ hạt keo dậu (leucaena leucocephala) để hạn chế sự biến đen của tôm thẻ chân trắng trong quá trình bảo quản lạnh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM --- o0o --- ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT GIÀU POLYPHENOL TỪ HẠT KEO DẬU leucaena l

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

- o0o -

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT GIÀU POLYPHENOL TỪ HẠT KEO DẬU (leucaena leucocephala)

ĐỂ HẠN CHẾ SỰ BIẾN ĐEN CỦA TÔM THẺ CHÂN TRẮNG

TRONG QUÁ TRÌNH BẢO QUẢN LẠNH

Giảng viên hướng dẫn: TS Nguyễn Thế Hân

Sinh viên thực hiện: Huỳnh Thị Xuân Quỳnh

Mã số sinh viên: 56130330

Khánh Hòa – năm 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là nghiên cứu của chính bản thân Các số liệu, kết quả nghiên cứu trình bày trong luận án hoàn toàn trung thực và chưa có một ai công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu khoa học nào

Khánh Hòa, Ngày 12 tháng 07 năm 2018

Sinh viên thực hiện

Huỳnh Thị Xuân Quỳnh

LỜI CẢM ƠN

Để có thể hoàn thành đồ án của mình em đã nhận được sự giúp đỡ rất nhiều từ thầy

cô giáo, gia đình và bạn bè

Lời đầu tiên em xin chân thành cảm ơn đến Quý thầy cô giáo trường Đại Học Nha Trang nói chung và Quý thầy cô trong Khoa Công Nghệ Thực Phẩm nói riêng đã tận tình giảng dạy và truyền đạt kiến thức cho em trong suốt thời gian học tập tại giảng

đường đại học, đặc biệt là thầy T.S Nguyễn Thế Hân, người đã luôn tận tình hướng

dẫn, quan tâm, giúp đỡ và tạo điều kiện cho em hoàn thành đề tài nghiên cứu một cách tốt nhất

Em xin cảm ơn Thầy cô quản lý phòng thí nghiệm đã tạo mọi điều kiện để em hoàn thành đề tài này

Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn tới gia đình, bạn bè những người đã luôn bên cạnh động viên tạo động lực cho em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu

Những kiến thức em học được từ thầy cô cùng với sự giúp đỡ động viên từ tất cả mọi người đã giúp em nỗ lực hoàn thành tốt Đồ án này và sẽ là hành trang vững chắc giúp em vững bước trong tương lai

Tuy có những nỗ lực, cố gắng cùng với nền kiến thức còn hạn chế, bài viết không tránh khỏi những sai sót Rất mong nhận được những lời góp ý của Quý thầy cô để đề tài nghiên cứu của em được hoàn thiện với chất lượng tốt nhất

Xin kính chúc Quý thầy cô trường Đại Học Nha Trang lời chúc sức khỏe, thành công và thịnh vượng trong cuộc sống cũng như trong công tác

Khánh Hòa, ngày 12 tháng 07 năm 2018

Sinh viên thực hiện

Huỳnh Thị Xuân Quỳnh

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN iii

LỜI CẢM ƠN iv

MỤC LỤC v

DANH MỤC HÌNH viii

DANH MỤC BẢNG ix

LỜI MỞI ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 4

1.1 Giới thiệu về tôm thẻ chân trắng Litopenaeus vannamei 4

1.1.1 Tôm thẻ chân trắng 4

1.1.2 Thành phần hóa học và dinh dưỡng 5

1.1.3 Các biến đổi của tôm sau khi chết 7

1.1.3.1 Các biến đổi về cảm quan 8

1.1.3.2 Biến đổi do vi sinh vật 9

1.1.3.3 Biến đổi hóa học 9

1.1.3.4 Biến đổi do enzyme 10

1.1.4 Hiện tượng biến đen và biện pháp ngăn chặn 11

1.1.4.1 Enzyme tyrosinase 11

1.1.4.2 Hiện tượng biến đen 12

1.1.4.3 Biện pháp ngăn chặn biến đen ở tôm 13

1.1.4.4 Các quy định mang tính pháp lý đến việc sử dụng chất chống biến đen 14

1.2 Giới thiệu về cây keo dậu Leucaena leucocephala 16

1.2.1 Cây keo dậu 16

1.2.2 Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng của hạt keo dậu 17

1.3 Các phương pháp tách chiết 17

1.3.1 Cơ sở của quá trình tách chiết 17

1.3.2 Các phương pháp tách chiết bằng dung mô 18

1.3.2.1 Phương pháp ngấm kiệt (Percolation) 18

1.3.2.2 Phương pháp ngâm dầm (Marceration) 18

1.3.2.3 Phương pháp chiết soxhlet 18

1.3.2.4 Phương pháp lôi cuốn hơi nước 19

1.3.3.1 Dung môi chiết 19

1.3.3.2 Nhiệt độ chiết 19

1.3.3.3 Thời gian chiết 20

1.3.3.4 Độ mịn của nguyên liệu 20

1.3.3.5 Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 21

1.3.3.6 Độ ẩm của nguyên liệu 21

1.4 Tổng quan tình hình nghiên cứu liên quan đến nội dung đề tài 21

1.4.1 Nghiên cứu nước ngoài 21

1.4.2 Nghiên cứu trong nước 22

CHƯƠNG 2 24

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Đối tượng nghiên cứu 24

2.1.1 Tôm thẻ chân trắng 24

2.1.2 Hạt keo dậu 24

2.2 Hóa chất 24

2.3 Dụng cụ và thiết bị 24

2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 25

2.4.1 Quy trình bố trí thí nghiệm tổng quát 25

2.4.2 Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của tỷ lệ NL/DM (w/v) đến hàm lượng polyphenol tổng số 27

2.4.3 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số của dịch chiết hạt keo dậu 28

2.4.4 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số của dịch chiết hạt keo dậu 29

2.4.5 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của dung môi đến khả năng thu hồi dịch chết giàu polyphenol từ hạt keo dậu (tách phân đoạn) 31

2.4.6 Thí nghiệm sử dụng dịch chiết từ hạt keo dậu để hạn quá trình biến đen trên tôm thẻ chân trắng trong quá trình bảo quản lạnh 32

2.5 Phương pháp phân tích 33

2.5.1 Xác định hàm ẩm 33

2.5.2 Xác định hàm lượng polyphenol tổng số 34

2.5.3 Phương pháp cho điểm 34

2.5.4 Phương pháp phân tích hình ảnh 34

2.5.5 Phương pháp cảm quan biến đen ở tôm 34

2.5.6 Phương pháp sử lý số liệu 35

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ NL/DM đến hàm lượng polyphenol tổng số 36

3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số 38

3.3 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số 40

3.4 Hàm lượng polyphenol tổng số của các dung môi chiết 42

3.5 Nghiên cứu khả năng hạn chế biến đen tôm thẻ chân trắng trong quá trình bảo quản bằng nước đá từ dịch chiết hạt keo dậu 44

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48

4.1 Kết luận 48

4.2 Kiến nghị 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 PHỤ LỤC I

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) 4

Hình 1.2 Sơ đồ biến đổi của động vật thủy sản sau khi chết 8

Hình 1.3 Cơ chế biến đen ở tôm 13

Hình 1.4 Cây keo dậu Leucaena leucocephala 16

Hình 2.1 Hạt keo dậu (Leucaena leucocephala) 24

Hình 2.2 Sơ đồ quy trình nghiên cứu tổng quát 25

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của tỷ lệ NL/DM đến 27

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng 28

Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng 30

Hình 2.6 Bố trí thí nghiệm thu nhận polyphenol từ các phân đoạn dịch chiết 31

Hình 2.7 Sơ đồ bố trí thí nghiệm hạn chế biến đen ở tôm bằng phân đoạn chiết từ hạt keo dậu 33

Hình 3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ NL/DM đến hàm lượng polyphenol tổng số của dịch chiết hạt keo dậu; Các chữ cái khác nhau trên các cột chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê (p<0,05) 36

Hình 3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số của dịch chiết hạt keo dậu; Các chữ cái khác nhau trên các cột chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) 38

Hình 3.3 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số của dịch chiết hạt keo dậu; Các chữ cái khác nhau trên các cột chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) 41

Hình 3.4 Hàm lượng polyphenol tổng số của một số phân đoạn dung môi chiết từ hạt keo dậu 43

Hình 3.5 Biến đổi điểm cảm quan biến đen ở tôm thẻ chân trắng bảo quản lạnh 44

Hình 3.6 Biến đổi giá trị màu xám của tôm thẻ chân trắng bảo quản lạnh 45

Hình 3.7 Biến đổi màu sắc của tôm thẻ chân trắng trong quá trình bảo quản lạnh 46 Hình 3.8 Biến đổi điểm cảm quan chất lượng của tôm thẻ chân trắng bảo quản lạnh 47

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của thịt tôm so với thịt động vật khác 6 Bảng 1.2 Thành phần hóa học của một số loại tôm tươi 7 Bảng 1.3 Một số chất ức chế enzyme gây trong Trái cây, rau quả và thủy hải sản 14 Bảng 1.4 Luật 98/72/EC của Liên minh châu Âu xác định nồng độ sunlfua tối đa cho phép có trong động vật giáp xác 15 Bảng 1.5 Thành phần hóa học cơ bản của hạt keo dậu 17

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

DOPA: Dihydroxyphenylalanine

NL/DM: Nguyên liệu/dung môi

VASEP: Vietnam Association of Seafood Exporters and Producers

EU: European Union

PPO: Polyphenoloxydase

ATP: Adenosine Triphosphat

ADP: Adenosine Diphosphat

IQF: Individual Quick Frozen

EDTA: Ethylenne Diamine Tetraacetic Acid

EGCG: Epigallocatechin gallate

LỜI MỞI ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Tôm là một trong những đối tượng thủy sản được nuôi nhiều nhất ở trên thế giới

và Việt Nam Với điều kiện thuận lợi về tự nhiên và khí hậu, Việt Nam đã và đang phát triển ngành nuôi trồng thủy sản đặc biệt là ngành nuôi tôm một cách mạnh mẽ Hiện nay, tôm là sản phẩm quan trọng mũi nhọn của ngành thủy sản Việt Nam và luôn chiếm phần lớn trong kim ngạch xuất khẩu thủy sản Trong chế biến, bảo quản tôm nguyên liệu là công việc rất quan trọng nhằm duy trì chất lượng ban đầu để tạo ra sản phẩm có chất lượng tốt Một trong những biến đổi chất lượng thường gặp nhất ở tôm nguyên liệu sau khi thu hoạch là hiện tượng biến đen Tuy nhiên, biến đen không phải biểu hiện của việc giảm dinh dưỡng hay độ tươi nhưng nó chứng tỏ rằng tôm đã mất chất lượng cảm quan nên bị hạ loại chất lượng và giá thành cũng sẽ bị hạ theo từng hạng chất lượng Để hạn chế hiện tượng biến đen trong quá trình bảo quản và giữ giá trị cho tôm, người ta thường sử dụng các loại hóa chất có tác dụng chống biến đen như các hợp chất sulfite, clorin, polyphosphat Tuy các chất hóa học này có khả năng chống biến đen và giữ được độ tươi của tôm nguyên liệu rất hiệu quả nhưng hiện nay những quy định mang tính pháp lý về an toàn thực phẩm của nhiều nước không cho phép hoặc hạn chế sử dụng các loại hóa chất này, vì dư lượng của chúng trong sản phẩm gây dị ứng cho người sử dụng, đặc biệt là những người bệnh hen suyễn [28].Chính vì lẽ đó, người ta đang hướng đến sử dụng các chất chống biến đen có nguồn gốc tự nhiên và an toàn đối với người sử dụng như axit kojic, axit ascorbic [24], axit citric [41], axit oxalic [60] Các loài thực vật giàu các hợp chất polyphenol như flavonoid, tocopherols, coumarins và dẫn xuất axit cinnamic có tác dụng chống oxy hóa cao [34] Gần đây, đã có nghiên cứu rằng chiết xuất hạt nho có thể ức chế melanosis trong tôm [30] Rất nhiều loài thực vật có chứa các hợp chất chống oxy hóa cao như trà xanh, nấm ăn, rau mùi, hạt nho, hạt keo dậu, tảo… chúng không những an toàn đối với người sử dụng mà còn có tác dụng hỗ trợ sức khỏe

Tyrosinase (hay còn gọi là polyphenol oxydase) được biết đến như là một enzyme chủ chốt trong quá trình tổng hợp melanin Tác động của PPO là xúc tác quá trình oxi hóa phenol thành quinon tạo màu nâu trong mô tế bào bị tổn thương PPO là nguyên nhân chính gây ra hiện tượng hóa nâu ở nhiều loại trái cây, rau củ và biến đen trên một

số loại hải sản (chủ yếu là tôm) trong quá trình thu hoạch, bảo quản và chế biến Sự biến

đen ảnh hưởng đến chất lượng và giảm giá trị cảm quan thực phẩm, tác động đến nền kinh tế, ảnh hưởng đến nhà sản xuất và ngành công nghiệp chế biến thực phẩm Theo một số báo cáo của Tổ chức lương thực và nông nghiệp Liên Hợp Quốc, sự biến đen đã làm giảm giá trị kinh tế của các mặt hàng trái cây, rau quả và hải sản Các hợp chất ức chế tyrosinase hiện nay như acid fumaric, acid isophthalic, morin có khả năng ức chế sự biến đen của thủy sản và rau quả Tuy nhiên, việc sử dụng các hóa chất ảnh hưởng đến vấn đề an toàn thực phẩm do dư lượng hóa chất gây lo ngại cho người tiêu dùng Chính

vì thế việc tìm kiếm các hợp chất ức chế có nguồn gốc tự nhiên để đảm bảo an toàn chất lượng cho sản phẩm hiện nay vẫn là mối quan tâm của các ngành chế biến và bảo quản thực phẩm

Cây keo dậu, tên khoa học Leucaena leucocephala, có nguồn gốc từ miền Nam

Mexico và miền Bắc Trung Mỹ và hiện nay nó phân bố khắp các vùng nhiệt đới trên thế giới [32] Cây keo dậu phát triển ở hầu hết các vùng sinh thái của Việt Nam, nhưng nhiều ở nam Trung Bộ, như ở Khánh Hòa Keo giậu sinh trưởng tốt trên đất thoát nước,

ít chua, có thể thích ứng với đất mặn vừa ven biển Keo giậu chịu khô hạn rất tốt nhưng không chịu úng đặc biệt là khi còn non Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu chỉ ra tác dụng của các sản phẩm từ cây keo dậu đối với sức khỏe con người và động vật Các bộ phận của cây keo dậu được điều chế làm thuốc xổ giun, thuốc tránh thai, thuốc phá thai

và tạo màng bao cho thuốc [27], [64] Ngoài ra, mimosine và một acid amin từ hạt keo dậu được báo cáo là có hoạt tính chống ung thư và ức chế sự phát triển của tóc [22] Những nghiên cứu gần đây cho thấy cây keo dậu có chứ rất nhiều hoạt chất sinh học có khả năng chống oxy hóa, ức chế hoạt động enzyme PPO [48], kháng khuẩn Ở nước

ta, keo dậu chủ yếu được sử dụng là thuốc, thức ăn trong chăn nuôi Tuy nhiên cho đến nay, vẫn chưa có nghiên cứu nào được công bố về điều kiện chiết phù hợp để chiết hợp chất giàu polyphenol từ hạt keo dậu; khả năng hạn chế biến đen của phân đoạn dịch chiết giàu polyphenol từ hạt keo dậu và ứng dụng dịch chiết từ hạt keo dậu để hạn chế

sự biến đen ở tôm thẻ chân trắng

Xuất phát từ thực tế trên, đề tài “Nghiên cứu sử dụng phân đoạn dịch chiết giàu

polyphenol từ hạt keo dậu (Leucaena leucocephala) để hạn chế sự biến đen của tôm thẻ

chân trắng trong quá trình bảo quản lạnh”

2 Mục tiêu của đề tài

Thu nhận phân đoạn dịch chiết giàu polyphenol từ hạt keo dậu và thử nghiệm khả năng hạn chế sự biến đen của tôm thẻ chân trắng trong quá trình bảo quản lạnh

3 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện chiết đến hiệu quả chiết polyphenol từ hạt

keo dậu;

- Nghiên cứu hàm lượng polyphenol tổng số của phân đoạn dịch chiết từ hạt keo

dậu;

- Nghiên cứu khả năng hạn chế sự biến đen ở tôm thẻ chân trắng của phân đoạn

dịch chiết giàu polyphenol từ hạt keo dậu

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

- Đề tài cung cấp dữ liệu khoa học về điều kiện thích hợp để thu nhận phân đoạn dịch chiết giàu polyphenol từ câu keo dậu, có khả năng hạn chế sự biến đen trên đối tượng tôm thẻ chân trắng Từ đó, làm cơ sở cho quá trình tinh sạch các hợp

chất từ nguồn nguyên liệu thực vật này

- Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở để ứng dụng dịch chiết và các chất tinh sạch từ cây keo dậu trong việc hạn chế sự biến đen của tôm bảo quản sau thu

hoạch

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về tôm thẻ chân trắng Litopenaeus vannamei

1.1.1 Tôm thẻ chân trắng

Tên khoa học: Litopenaeus vannamei

Tên tiếng Anh: White Shrimp

Tên gọi khác: Penaeus vannamei

Tôm thẻ chân trắng thuộc ngành: Arthropoda; lớp: Malacostraca; bộ: Decapoda; họ: Penaeidae; giống: Litopenaeus; loài: Lipopenaeus vannamei

Hình 1.1 Tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei)

Tôm chân trắng vỏ mỏng có màu trắng đục nên có tên là tôm Bạc, bình thường

có màu xanh lam, chân bò có màu trắng ngà nên gọi tôm chân trắng Chuỳ là phần kéo dài tiếp với bụng Dưới chuỳ có 2 – 4 răng cưa, đôi khi có tới 5 – 6 răng cưa ở phía bụng Những răng cưa đó kéo dài, đôi khi tới đốt thứ hai Vỏ đầu ngực có những gai gân và gai râu rất rõ, không có gai mắt và gai đuôi (gai telssm), không có rãnh sau mắt, đường gờ sau chuỳ khá dài đôi khi từ mép sau vỏ đầu ngực Gờ bên chuỳ ngắn, chỉ kéo dài tới gai thượng vị Có 6 đốt bụng, ở đốt mang trứng, rãnh bụng rất hẹp hoặc không có Telsson (gai đuôi) không phân nhánh Râu không có gai phụ và chiều dài râu ngắn hơn nhiều so với vỏ giáp Xúc biện của hàm dưới thứ nhất thon dài và thường có 3 – 4 hàng,

phần cuối của xúc biện có hình roi Gai gốc (basial) và gai ischial nằm ở đốt thứ nhất chân ngực Ở vùng biển tự nhiên, tôm chân trắng thích nghi sống nơi đáy là bùn, độ sâu khoảng 72 m, có thể sống ở độ mặn trong phạm vi 5 – 50‰, thích hợp ở độ mặn nước biển 28 – 34‰, pH = 7,7 – 8,3, nhiệt độ thích hợp 25 – 32oC, tuy nhiên chúng có thể sống được ở nhiệt độ 12 – 28oC

Tôm thẻ chân trắng là tôm nhiệt đới, phân bố vùng ven bờ phía Đông Thái Bình Dương, từ biển Pêru đến Nam Mê – hi – cô, vùng biển Equađo; Hiện tôm chân trắng đã được di giống ở nhiều nước Đông á và Đông Nam á như Trung Quốc, Thái Lan, Philippin, Indonexia, Malaixia và Việt Nam Ở Việt Nam tiềm năng nuôi tôm rất lớn,

có 3260 km bờ biển, 12 đầm phá và các vịnh, 112 cửa sông gạch, hàng ngàn đảo lớn nhỏ là điều kiện thuận lợi cho việc nuôi trồng các loại thủy sản nước lợ, mặn Tôm thẻ chân trắng lần đầu tiên gia nhập vào Việc Nam năm 2000 và được phát triển tại nhiều địa phương như: Ninh Thuận, Bình Thuận, Phú Yên, Khánh Hòa và lan rộng khắp cả nước Tính đến hết tháng 6 năm 2008, diện tích nuôi tôm thẻ chân trắng của Việt Nam

đã đạt hơn 12,400 ha và đã thu hơn 12,300 tấn Nhờ có giá trị dinh dưỡng cao mà hiện nay tôm thẻ chân trắng được người tiêu dùng ở các thị trường lớn ưa chuộng như: Mỹ, châu Âu, Nhật Bản…

1.1.2 Thành phần hóa học và dinh dưỡng

Tôm là loại thực phẩm ưa chuộng trên thế giới vì tôm có giá trị dinh dưỡng cao, thơm ngon hơn so với cá và một số động vật trên cạn Thành phần hóa học của thịt tôm gồm: Protein, lipid, glucid, chất khoáng vitamin, enzyme và hormone Thành phần có hàm lượng cao là nước, Protein, lipid và chất khoáng, hàm lượng glucid trong tôm rất ít

và tồn tại dưới dạng glycogen Ngoài ra trong tôm còn chứa 1 lượng carbonhydrate 1%

- 2% [7]

 Nước

Chiếm 70÷80% trọng lượng tôm Nhờ có hàm lượng nước cao làm cho thân tôm mềm mại và bóng mượt tăng tính hấp dẫn khi cảm quan Tuy nhiên, nước là môi trường hoạt động của vi sinh vật Vì vậy, nước đóng vai trò quan trọng trong quá trình chế biến

và bảo quản

 Protein

Là thành phần hóa học chủ yếu trong cơ thịt tôm và chiếm tỷ lệ 70÷80% trọng lượng khô Thành phần cấu tạo nên protein là các acid amin Trong tôm có khoảng

18÷21 acid amin khác nhau và hầu như có đủ các acid amin không thay thế (tryptophan, lysine, threonine, isoleucine, phenylalanine, methionine, valine)

 Chất ngấm ra

Hàm lượng chất ngấm ra chiếm 2÷3% trọng lượng tôm, trong đó có khoảng 1/3

là chất hữu cơ mà thành phần lớn là chất hữu cơ có đạm, phần còn lại là chất vô cơ Chất ngấm ra nhiều ít đứng về mặt sinh lý, mùi vị thì nó chiếm một vai trò quan trọng, nó quyết định mùi vị đặc trưng cho sản phẩm có tác dụng kích thích vị làm tăng khả năng tiêu hóa, chất ngấm ra là môi trường thuận lợi cho vi sinh vật gây thối rữa phát triển

 Lipid, glucid và sắc tố

Trong thị tôm có rất ít mỡ chiếm 0,3÷1,4% trọng lượng tôm Hàm lượng glucid cũng rất ít Tôm đem gia nhiệt như luộc, nấu hay dùng acid vô cơ hoặc rượu để ngâm thì vỏ của chúng đều biến thành màu đỏ gạch, các sắc tố đó được gọi la astaxin Astaxin là sản phẩm của astaxanthin Trong vỏ tôm astaxanthin kết hợp với protein cá màu xinh tím

 Vitamin và chất khoáng

Trong thị tôm có chứa một hàm lượng vitamin, đặc biệt là vitamin nhóm B Nhóm vitamin này tan trong nước nên trong quá trình bảo quản và chế biến rất dễ bị thất thoát Vitamin nhóm B có vai trò giúp tiêu hóa, tăng trọng lượng và phát triển cơ thể Trong thịt tôm gồm có các chất khoáng như: Fe, Ca, K, P…

Vì tôm có đầy đủ các thành phần dinh dưỡng giàu vitamin, giàu đạm, giàu khoáng

dễ tiêu hóa, cần thiết cho dinh dưỡng cơ thể con người Vì thế sản phẩm tôm ngày càng được sử dụng càng nhiều, xuất khẩu tôm ngày càng tăng, kéo theo nhu cầu về tôm

nguyên liệu ngày càng nhiều [10]

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của thịt tôm so với thịt động vật khác [15], [7]

Bảng 1.2 Thành phần hóa học của một số loại tôm tươi [15], [10], [55]

Đặc điểm thành phần của tôm khác với cá:

- Hàm lượng lipid thấp, hàm lượng các hợp chất nitơ phi protein cao (khoảng 20% tổng lượng nitơ) Cấu trúc protein trong thịt tôm khá đặc biệt, có tới 30% protein

là các protein dạng dễ hòa tan trong nước Protein của thịt tôm có chứa các acid amin arginin, metionin, phenylalanin cao hơn nhiều so với thịt cá Protein của tôm chứa đầy

đủ các acid amin không thay thế với hàm lượng khoảng 3910,9 mg% Lượng lipid ít và phần lớn cấu tạo từ các acid béo không bão hòa do đó thịt tôm rất dễ tiêu hóa [1], [15]

- Chất khoáng trong thịt tôm giàu Ca, Mg và một lượng phospho đáng kể Ngoài

ra còn có một số nguyên tố vi lượng

- Vitamin đáng chú ý trong thịt tôm là vitamin nhóm B

Thành phần hóa học của tôm thường khác nhau theo giống loài Trong cùng một loài nhưng điều kiện sống khác nhau thì thành phần hóa học cũng khác nhau Ngoài ra thành phần hóa học của tôm còn phụ thuộc vào trạng thái sinh lý, mùa vụ, thời tiết… Sự khác nhau về thành phần hóa học và sự biến đổi của chúng làm ảnh hưởng rất lớn đến mùi vị và giá trị dinh dưỡng, đến việc bảo quản tươi nguyên liệu và quá trình chế biến tôm [5], [7], [15]

1.1.3 Các biến đổi của tôm sau khi chết

Theo quy luật chung thì sau khi chết cơ thể động vật thủy sản sẽ chuyển qua các

độ tươi giảm dần đi đến thối rữa và hư hỏng hoàn toàn theo thời gian bảo quản nguyên liệu Sự biến đổi của tôm sau khi chết cũng tuân theo quy luật này

Tôm nguyên liệu sau khi chết trong cơ thịt tôm xảy ta hàng loạt những biến đổi phức tạp, đặc biệt là những biến đổi về mặt hóa học dưới tác dụng của enzyme nội tại

và vi sinh vật, làm cho nguyên liệu bị biến chất và dẫn đến không còn sử dụng được

Các biến đổi đó không phải tuân theo một thứ tự nhất định mà chúng thường gối lên nhau Các quá trình này đã bắt đầu quá trình khác nối tiếp nhau Các quá trình biến đổi đó có thể tóm tắt theo sơ đồ sau:

Hình 1.2 Sơ đồ biến đổi của động vật thủy sản sau khi chết

1.1.3.1 Các biến đổi về cảm quan

Biến đổi cảm quan là những biến đổi được nhận biết nhờ các giác quan như bề ngoài, mùi vị, cấu trúc Khi thủy sản vừa chết thì cơ thịt mềm mại đàn hồi tốt, sau một thời gian chuyển sang trạng thái cứng Khi ở giai đoạn tê cứng, các sợi cơ bị co rút cực

độ Khi hết giai đoạn này, cơ hết cứng, cơ sẽ duỗi ra và trở nên mềm mại nhưng không còn đàn hồi như trước khi tê cứng, cơ thịt chuyển sang giai đoạn mềm hóa, lúc này chúng bị biến dạng, thân mềm nhão, hư hỏng Thời điểm xuất hiện và thời gian tê cứng phụ thuộc tùy vào giống loài và chịu ảnh hưởng của các yếu tố như nhiệt độ bảo quản, quá trình xử lý thu hoạch, đánh bắt, kích cỡ, tình trạng cơ thể trước khi chết

1.1.3.2 Biến đổi do vi sinh vật

Thủy sản sau khi chết quá trình sinh tổng hợp trong cơ thể sẽ dừng lại, enzyme trong cơ thịt sẽ tiến hành quá trình tự phân giải, đồng thời lúc đó vi sinh vật sẽ phân hủy những sản phẩm của quá trình tự phân giải thành sản phẩm cấp thấp, làm cho nguyên liệu biến chất hư hỏng và đó chính là hiện tượng thối rữa Vi sinh vật là nguyên nhân chính gây thối rữa nguyên liệu và cơ chất chính của quá trình thối rữa là protein Muốn phân giải được protein, trước tiên vi sinh vật phải tiết ra các enzyme phân giải protein ngoại bào và thủy phân protein thành các hợp chất có phân tử nhỏ hơn (các polypeptide

và oligopeptide) Các chất này hoặc tiếp tục được thủy phân thành aminoacid nhờ các peptidase ngoại bào hoặc xâm nhập ngay vào tế bào vi sinh vật sau đó mới chuyển thành aminoacid Một phần các aminoacid này được vi sinh vật sử dụng trong quá trình tổng hợp protein của chúng, một phần khác được tiếp tục phân giải theo những con đường khác để sinh NH3, CO2 và nhiều sản phẩm trung gian khác Sau khi tôm chết, gặp điều kiện thuận lợi thì các vi sinh vật phát triển rất nhanh Vi sinh vật gây thối rửa có hai nhóm, một nhóm là những vi sinh vật tồn tại trong nguyên liệu trong quá trình sống, còn một nhóm là do ô nhiễm trong quá trình bảo quản và chế biến Đối với quá trình gây thối rữa của nguyên liệu không phải các loài vi sinh vật đều tác dụng như nhau mà trong

đó họ Pseudomonas là tích cực nhất còn các loài khác thì phát triển ít và một số thì giảm

đi Tôm sau kho chết nếu không kịp thời gian bảo quản thì số lượng vi sinh vật tăng lên rất nhanh đặc biệt là ở phạm vi nhiệt độ thích hợp [8]

1.1.3.3 Biến đổi hóa học

 Sự phân giải glycogen

Tôm sau khi chết, glycogen trong cơ thể dần dần bị phân giải Đây là một quá trình yếm khí rất phức tạp xảy ra bằng con đường phosphoril hóa với sự tham gia của Adenosintriphosphat (ATP) và được biểu thị một cách đơn giản như sau:

(C6H10O5)n + n H2O 2n C3H6O2

Glycogen Acid lactic

Glycogen phân giải sản sinh ra acid lactic làm cho pH của cơ thịt thay đổi Sự acid hóa môi trường này có tác dụng hạn chế phần nào sự phát triển của vi sinh vật gây

thối rữa Những biến đổi của các chất đường và đường có chứa phospho trong mô cơ làm mất dần vị ngọt và hương vị đặc trưng của tôm tươi

 Sự biến đổi của Adenosintriphosphat (ATP)

ATP là hợp chất quan trọng tham gia tải năng lượng tự do trong quá trình oxy hóa các chất trao đổi Những bước đầu tiên của quá trình phân hủy ATP trong mô cơ thịt tôm xảy ra rất nhanh và nhờ tác dụng của enzyme nội tại Quá trình biến đổi của ATP được tóm tắt bằng sơ đồ sau:

 Sự phân giải phân hủy acid amin

Trong quá trình tự phân giải enzyme trong tổ chức cơ thịt phân giải protit thành acid amin, tiến thêm bước nữa là vi sinh vật phân hủy các acid amin thành các sản phẩm cấp thấp làm cho tôm thối rữa Trong quá trình thối rữa chủ yếu phân hủy acid amin thành các sản phẩm thấp như indol, skatol, phenol, putrescin, các loại acid có đạm, acid béo cấp thấp,

H2S, thioalcol, CH4, NH3, CO2… Có thể quy về 5 loại phân giải acid amin: phản ứng làm mất gốc amin, phản ứng làm mất gốc cacboxy, tác dụng cùng làm mất gốc caboxyl và amin, phân giải các phân tử acid amin và phân giải các chất đạm khác [1], [8]

1.1.3.4 Biến đổi do enzyme

Tôm sau khi tê cứng dần dần trở lại mềm, ta gọi đó là sự tự phân giải Quá trình này do các loại enzyme nội tại trong tôm hoạt động phân giải khi tôm còn sống do sự tồn tại của kháng thể, cho nên các loại enzyme thủy phân không hoạt động tự phân giải

tổ chức của mình, nhưng khi tôm đã chết kháng thể này mất đi nên hoạt động của enzyme

sẽ trở nên dễ dàng Trong quá trình này có nhiều loại enzyme tham gia nhưng chủ yếu

là enzyme cathepsin phân giải protein thành peptone, enzyme tripsin và entrerokinaza tiếp tục phân giải các sản phẩm trung gian thành acid amin Sự tự phân giải là do enzyme nội tại gây ra, còn sự thối rữa là do vi sinh vật ở bên ngoài xâm nhập vào hoạt động, sản phẩm cuối cùng của quá trình tự phân giải là acid amin, các đạm hòa tan, còn quá trình thối rữa là sản phẩm cấp thấp đối nát, Nếu không có quá trình thối rữa thì quá trình tự phân giải sẽ không tăng lên một cách vô hạn mà sẽ đạt tới trạng thái cân bằng ở mức độ sản phẩm nào đó [8]

Trong quá trình tự phân giải chủ yếu là tự phân giải protein nhưng chất béo cũng

có sự biến đổi Phân giải chất béo chủ yếu là do enzyme lipase và xảy ra song song với quá trình phân giải protein Quá trình tự phân giải tuy làm cho tôm chuyển từ cứng sang mềm nhưng vẫn còn tươi tốt

Quá trình tự phân giải phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố, như giống loài, môi trường

pH, các loại muối, ảnh hưởng của nhiệt độ Sự khác nhau về giống loài dẫn đến sự hoạt động của enzyme là khác nhau Tác động tự phân giải ở động vật máu lạnh nhanh hơn lài máu nóng, vì enzyme trong động vật máu lạnh mạnh hơn của loài máu nóng Còn nếu tăng độ acid của môi trường tức là giảm pH tác dụng tự phân giải tăng lên nhưng

pH giảm đến một mức độ nhất định làm enzyme không hoạt động được nữa thì tác dụng

tự phân giải lại giảm, ngược lại pH càng tăng thì tác dụng tự phân giải càng giảm Muối

ăn cũng làm cản trở càng lớn, nhưng không làm ngừng được quá trình tự phân giải Ở dung dịch nước muối bão hòa, quá trình tự phân giải vẫn xảy ra nhưng rất chậm… nhiệt

độ cũng ảnh hưởng rất nhiều đến quá trình tê cứng, phân giải cũng như thối rữa sau này Trong phạm vi nhiệt độ thích hợp thì cứ tăng 10oC thì tốc độ phân giải tăng 2 – 3 lần Khi nhiệt độ giảm thì tốc độ tự phân giải sẽ giảm, là do nhiệt độ quá cao hay quá thấp đều làm giảm sự hoạt động của enzyme Nhiệt độ thích hợp của enzyme ở từng loài khác nhau là khác nhau [8]

1.1.4 Hiện tượng biến đen và biện pháp ngăn chặn

1.1.4.1 Enzyme tyrosinase

Tyrosinase hay còn gọi là enzyme polyphenol oxydase là một enzyme monooxygenase có chứa Cu2+ tham gia vào hai phản ứng riêng biệt của quá trình chuyển hóa melanin Một là hydroxy hóa monophenol thành odiphenol, hai là oxy hóa O –

diphenol thành O – quinon Sau đó O – quinon tham gia một loạt các phản ứng để tạo

và nông nghiệp Liên Hợp Quốc, sự biến đen đã làm giảm giá trị kinh tế của các mặt hàng trái cây, rau quả và hải sản Các hợp chất ức chế tyrosinase hiện nay như acid fumar, acid isophthalic, morin có khả năng ức chế sự biến đen của thủy sản và rau quả

1.1.4.2 Hiện tượng biến đen

Tôm sau khi thu hoạch được vài giờ sẽ bắt đầu xuất hiện những chấm đen Màu

ở mang nối vỏ bị mất tạo ra những viền đen Ngay tại nơi nối khớp chân cũng bị đổi màu, rồi đến khắp cả chân

Hiện tượng biến đen là quá trình sinh học tự nhiên xảy ra trong tôm Ngay khi tôm bị chết, đã bắt đầu xuất hiện những tế bào riêng biệt bị phá hủy và bị phân chia thành những chất đơn giản bởi enzyme tyrosinase Trong đó acid amin đóng vai trò cơ bản trong việc hình thành đốm đen là tyrosine Enzyme tyrosine chứa trong một lớp màng trong suốt dưới vỏ, ban đầu không có sự xuất hiện của enzyme gây sự biến đen, dưới tác động của các enzyme thủy phân protein, tyrosine được phát tán vào các mô tế bào Dưới tác dụng xúc tác của enzyme tyrosinase, tyrosine chuyển thành dihydroxyphenylalanine (DOPA) có màu vàng nhạt Tyrosinase tiếp tục xúc tác chuyển hóa DOPA thành DOPA-quinon có màu vàng Các DOPA- quinon này đa tụ lại tạo thành những đốm đen ở tôm

Khi tôm chết lớp màng này bị vỡ, giải phóng enzyme ra ngoài xúc tác cho phản ứng oxy hóa tyrozin và phenylalanin trong môi trường có oxy không khí đã hình thành những vệt nâu Những vệt này tập hợp lại tạo nên chất màu tối Melanin, từ đây phát triển thành các đốm đen Quá trình này xảy ra rất nhanh đặc biệt trong điều kiện nhiệt

độ cao, một số trường hợp đốm đen ở trên tôm còn sống, do tôm chịu sự va chạm trong môi trường sống [15] Hiện tượng biến đen sẽ làm giảm giá trị của tôm do không đáp ứng được tiêu chuẩn để chế biến các sản phẩm xuất khẩu Cơ chế biến đen của tôm được trình bày tóm tắt ở hình:

Hình 1.3 Cơ chế biến đen ở tôm

1.1.4.3 Biện pháp ngăn chặn biến đen ở tôm

Quá trình xảy ra nhanh, đặc biệt trong điều kiện nhiệt độ cao Tóm lại điều kiện cần thiết để hình thành melanin là:

- Cơ chất là tyrosine

- Oxy hoặc không khí

- Enzyme tyrosinase

Vì vậy để ngăn chặn hiện tượng biến đen ở tôm nguyên liệu thì chỉ cần khử bỏ một trong ba thành phần cơ bản trên Trong đó biện pháp làm ức chế hoặc làm chậm hoạt động của enzyme tyrosinase như bảo quản ở nhiệt độ thấp hơn 4oC, sử dụng các hóa chất có tác dụng ức chế hoạt động của enzyme Trong quá trình bảo quản hay vận chuyển thì nên ngăn cách tôm với không khí, không nên cho tôm tiếp xúc trực tiếp với oxy không khí mà chứa đựng tôm trong các bao bì không thấm khí hoặc bảo quản tôm ngập trong nước Bảo quản nước đá kết hợp hóa chất (Nguyễn Việt Dũng, 1998)[10] Nếu bảo quản bằng nước đá tỷ lệ 2:1 thì thời gian bảo quản là 3 ngày, còn bảo quản bằng nước đá kết hợp với Kalisorbate 0,1% thì thời gian bảo quản là 6 ngày.Nếu bảo quản trong hỗn hợp sau thì thời gian bảo quản được 17 ngày: Kalisorbate (KS)

citric Tuy nhiên hầu hết các chất này đều có thể làm ảnh hưởng không tốt đối với người sử dụng, nên vấn đề đặt ra là tìm ra nhiều hợp chất tự nhiên có thể ngăn ngừa biến đen ở tôm mà không ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người tiêu dùng

1.1.4.4 Các quy định mang tính pháp lý đến việc sử dụng chất chống biến đen

Các chất chống biến đen sử dụng phổ biến được trình bày ở Bảng 1.3 dưới đây:

Bảng 1.3 Một số chất ức chế enzyme gây trong Trái cây, rau quả và thủy hải sản [40]

Chất khử Sulphiting; cysteine; glutathione; acid ascorbic

và dẫn xuất

Tác nhân acid hóa Acid citric; acid phosphoric

Chất ức chế enzyme Acid carboxylic mạch vòng; rượu béo; anion;

peptide; dẫn xuất resorcinol

Hiện nay, hầu hết các sản phẩm trong Bảng được sử dụng cho trái cây và chế biến rau quả nhưng không chấp nhận được cho chế biến thủy sản vì:

- Quy định luật lệ của các quốc gia nhập khẩu không cho phép sử dụng các chất này vì chúng có tác dụng độc hại trực tiếp hoặc gián tiếp như EDTA, acid kojic… mặc

dù chúng có thể ngăn chặn sự hình thành đốm đen ở tôm rất hiệu quả

- Ảnh hưởng đến kết cấu, hương vị của thủy sản nên không được khách hàng chấp nhận Ví dụ như acid ascorbic gây ra màu vàng ở tôm

- Hiệu quả của việc xử lý không tối ưu sơ với những chất khác

- Các chi phí cho việc xử lý là không thỏa đáng

Mặc dù sulfite không được coi là chất độc hại, nhưng là chất có thể gây ra vấn

đề sức khỏe đối với một số người tiêu dùng, đặc biệt là những người bị hen suyễn Do vậy, nhãn của sản phẩm phải ghi rõ rằng sản phẩm có chứa metabisulfite được sử dụng như các chất phụ gia dùng trong chế biến

Tiêu chuẩn liên quan đến tỷ lệ tối đa được phép thay đổi tùy thuộc vào các quốc gia Như Hoa Kỳ và Nhật Bản chấp nhận tối đa dư lượng SO2 trong cơ thịt là 100ppm, nhưng đối với Liên minh châu Âu thì yêu cầu dư lượng SO2 thay đổi tùy theo kích thước của tôm được trình bày ở Bảng

Bảng 1.4 Luật 98/72/EC của Liên minh châu Âu xác định nồng độ sunlfua tối đa cho

phép có trong động vật giáp xác

Sản phẩm tươi, đông lạnh và đông lạnh sâu

1.2 Giới thiệu về cây keo dậu Leucaena leucocephala

1.2.1 Cây keo dậu

Hình 1.4 Cây keo dậu Leucaena leucocephala

Keo dậu hay keo giậu có tên khoa học: Leucaena leucocephala, tên thường gọi:

Keo Dậu (Miền Bắc), Táo Nhơn (Miền Trung), Bình Linh (Miền Nam) Tên gọi khác: Keo Giậu, Keo Giun, Bọ Chét, Bọ Chít…Tên tiếng Anh: White Leadtree, White

Popinac, Jumbay; tên khoa học: Leucaena leucocephala Cây keo dậu thuộc bộ Fabales;

họ Fabaceae; phân họ Mimosoideae; tông Mimoseae; chi Leucaena; loài Leucaena leucocephala Keo dậu là cây có cây gỗ nhỏ, cao tới 5m, không có gai, vỏ thân màu xám

nhạt, tán lá hẹp Lá kép lông chim hai lần, cuống chung dài 12 – 20mm, lá lông chim 4

– 8 đôi, lá chét 12 – 18 đôi gần như không cuống và hình lưỡi liềm, dài 10 – 15mm, rộng

3 – 4mm Lá nhẵn, trên cuống lá cấp 1 có các tuyến hình chậu (một đặc điểm điển hình thuộc phân họ trinh nữ) Lá non mềm, giầu đạm nên dùng là rau cho người và thức ăn

cho gia súc Cụm hoa hình đầu ở nách lá, gồm nhiều hoa màu trắng Mùa hoa tháng 4 –

6, quả 7 – 9 Quả tạo thành chùm, quả đậu dẹt màu xanh lục khi còn non, màu nâu nhạt khi đã già, dài 13 – 14cm, rộng 15mm, đầu quả có mỏ nhọn Mỗi quả có 15 – 20 hạt, hạt

dẹt, lúc non màu lục, khi già màu nâu nhạt, cứng, nhẵn Hạt khi còn xanh có thể ăn được

và hạt chín thường dùng làm thuốc trục giun, bột dinh dưỡng cho người và gia súc Keo dậu có nguồn gốc từ ở Nam Bắc Mỹ và Trung Mỹ, phân bố từ Texas (Hoa Kỳ) tới Peru

với 24 loài cây thân gỗ và cây bụi Sau khi người châu Âu phát hiện ra châu Mỹ, các

loài cây trong chi Keo dậu được giới thiệu rộng rải sang các châu lục khác và hiện nay

chúng được xếp vào nhóm 100 loài thực vật xâm lấn mạnh mẻ nhất Với nhiều mục đích

sử dụng, cây keo dậu được các đế quốc châu Âu ngày xưa giới thiệu sang các thuộc địa của họ ở châu Phi, châu Á và châu Úc và hiện nay là keo dậu được xếp vào loài cây xâm

lấn toàn cầu Ở Đông Nam Á, cây keo dậu do người Tây Ban Nha du nhập vào Philipine

từ giữa thế kỷ 19, đến cuối thế kỷ 19 nó lan rộng khắp Đông Nam Á và Austraylia Cây Keo giậu phát triển ở hầu hết các vùng sinh thái của Việt Nam, nhưng nhiều ở nam Trung Bộ, như ở Khánh Hòa Keo giậu sinh trưởng tốt trên đất thoát nước, ít chua, có thể thích ứng với đất mặn vừa ven biển Keo giậu chịu khô hạn rất tốt nhưng không chịu

úng đặc biệt là khi còn non [69], [70]

1.2.2 Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng của hạt keo dậu

Thành phần hóa học cơ bản của hạt keo dậu được trình bày trong Bảng 1.1 Kết quả phân tích cho thấy trong hạt có chứa hàm lượng protein và carbohydrates là chủ yếu; chứa tannin và axit oxalic [17], [52]; hạt có chứa khoảng 17 – 20% tinh dầu [44] Ngoài ra, trong hạt còn chứa một lượng độc tố mimosine Các thành phần hóa học cơ bản còn lại thường ít được quan tâm chắc có lẽ bởi vì hàm lượng chúng thấp

Bảng 1.5 Thành phần hóa học cơ bản của hạt keo dậu

1.3.1 Cơ sở của quá trình tách chiết

Quá trình tách chiết là quá trình các chất hữu cơ hòa tan ra khỏi nguyên liệu nhưng vẫn giữ được đầy đủ thành phần và bản chất của nó

Trong quá trình tách chiết sẽ xảy ra 3 quá trình là: quá trình hòa tan, quá trình thẩm thấu và quá trình khuếch tán Đầu tiên dung môi thấm ướt lên bề mặt nguyên liệu sau đó thấm vào bên trong do quá trinh thẩm thấu tạo ra dung dịch chứa các hợp chất Tiếp theo dung môi tiếp tục hòa tan các chất trên bề mặt bằng cách đẩy các bọt khí chiếm đầy trong các khe vách trống của tế bào Sau đó dung môi tiếp tục hòa tan các hoạt chất trong ống mao dẫn của nguyên liệu nhờ vào dung môi đã thấm sâu vào các lớp bên trong

Ba quá trình này thực hiện liên tục cho đến khi quá trình chiết kết thúc Nguyên liệu phải được xay nhở để dung môi có thể dễ dàng tiếp xúc với các tế bào, thúc đẩy quá trình chiết xảy ra nhanh chóng và hiệu quả [58]

1.3.2 Các phương pháp tách chiết bằng dung mô

1.3.2.1 Phương pháp ngấm kiệt (Percolation)

Phương pháp ngấm kiệt hay còn gọi là phương pháp ngâm nhỏ giọt – là một trong những phương pháp đơn giản và phổ biến nhất hiện nay, vì nó không đòi hỏi nhiều kỹ năng cũng như thời gian Đây là quá trình chiết liên tục, dung môi mới luôn được thêm vào để thay cho lớp dung môi cũa đã hòa tan được dược chất Lớp dung môi mới có nhiệm vụ hòa tan các hoạt chất còn lại trong tế bào Quá trình tiếp diễn cho đến khi không thêm dung môi nữa [68] Như vây, dược liệu luôn được tiếp xúc với lớp dung môi mới nên co thể chiết kiệt hoạt chất

1.3.2.2 Phương pháp ngâm dầm (Marceration)

Phương pháp ngâm dầm không hiệu quả hơn so với phương pháp ngấm kiệt Mẫu được ngâm trong một bình chứa thủy tinh hoặc thép không rỉ có nắp đậy, cho mẫu ngập đầy trong dung môi và để ở nhiệt độ phòng Dung môi sẽ ngấm dần vào nguyên liệu để hòa tan các hợp chất tự nhiên, có thể gia tăng hiệu quả chiết bằng cách khuấy hoặc lắc nhẹ hỗn hợp chiết [61]

1.3.2.3 Phương pháp chiết soxhlet

Chiết Soxhlet là một kiểu chiết liên tục, được thực hiện nhờ cấu tạo đặc biệt của dụng cụ chiết Kiểu chiết này cũng như là kiểu chiết lỏng – lỏng nên về bản chất của quá trình tuân theo quy luật phân bố chất trong hai pha không trộn lẫn vào nhau Trong đó pha rắn nằm trong mẫu sẽ được hòa tan bởi pha lỏng (dung môi) [61]

Phương pháp này tiết kiệm được dung môi và mang lại hiệu quả chiết cao Tuy nhiên, kích thước của dụng cụ chiết Soxhlet làm hạn chế lượng nguyên liệu ta cần chiết,

vì vậy muốn chiết lượng lớn thì phải lặp lại nhiều lần chiết, gây mất nhiều thời gian

1.3.2.4 Phương pháp lôi cuốn hơi nước

Đây là phương pháp đặc biệt để trích ly tinh dầu và những hợp chất dễ bay hơi

có trong nguyên liệu Dụng cụ gồm một bình cầu lớn để cung cấp hơi nước Sau đó, hơi nước sẽ được dẫn sục vào bình chứa có mẫu, hơi nước xuyên thấm qua màng tế bào nguyên liệu và lôi theo những cấu tử dễ bay hơi, hơi nước tiếp tục bay hơi và ngưng tụ bởi một ống sinh hàn, ta thu được hợp chất tinh dầu Dùng êt dầu hỏa hoặc ether ethylic

để trích ly tinh dầu ra khỏi hỗn hợp trên hoặc để yên một thời gian trong bình sẽ có sự phân tách giữa hai pha tinh dầu và nước [61]

1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình tách chiết

Trong suốt quá trình chiết, hiệu suất chiết và chất lượng chiết của mẫu nguyên liệu chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như: dung môi chiết, thời gian chiết, nhiệt độ chiết,

độ mịn của nguyên liệu, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu, độ ẩm nguyên liệu… (Rydberg, 2004) [57]

1.3.3.1 Dung môi chiết

Dung môi là một trong những yếu tố quan trọng quyết định hiệu suất của quá trình chiết Qua nhiều nghiên cứu cho thấy, khi chiết những hợp chất khác nhau thì ta còn chọn những loại dung môi chiết khác nhau cho phù hợp với đặc điểm và tính chất của hợp chất đó Các yếu tố của dung môi ảnh hưởng đến quá trình chiết là:

- Độ phân cực: Dung môi ít hoặc không phân cực dễ hòa tan các chất không phân cực và khó hòa tan các chất không phân cực

- Độ nhớt và sức căng bề mặt: Dung môi có độ nhớt và sức căng bề mặt càng thấp thì càng dễ thấm vào dược liệu, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chiết suất và ngược lại

1.3.3.2 Nhiệt độ chiết

Theo công thức tính hệ số khuếch tán của Einstein, khi nhiệt độ tăng thì hệ số khuếch tán cũng tăng, do đó theo định luật Fick, lượng chất khuếch tán cũng tăng lên Mặc khác, khi nhiệt độ tăng thì độ nhớt của dung môi giảm tạo điều kiện thuận lợi cho

quá trình chiết Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng sẽ gây bất lợi cho quá trình chiết suất trong các trường hợp sau:

- Đối với những hợp chất kém bền ở nhiệt độ cao: Nhiệt độ tăng cao sẽ gây phá hủy một số hoạt chất như vitamin, alkaloid…

- Đối với tạp chất: Khi nhiệt độ tăng, độ tan của tạp chất tăng, dẫn tới dịch chiết

sẽ bị lẫn nhiều tạp chất Nhất là đối với một số tạp như gôm, chất nhầy… khi nhiệt độ tăng sẽ bị trương nở, tinh bột bị hồ hóa, độ nhớt của dịch chiết sẽ bị tăng gây khó khăn trong quá trình chiết suất, tinh chế

- Đối với dung môi dễ bay hơi có nhiệt độ sôi thấp: Khi tăng nhiệt độ thì dung môi dễ bị hao hụt

- Đối với một số chất đặt biệt có quá trình hòa tan tỏa nhiệt: Khi nhiệt độ tăng, độ tan của chúng giảm Do đó, để tăng độ tan thì cần giảm nhiệt độ

vậy tùy từng trường hợp mà ta lựa chọn nhiệt độ chiết cho phù hợp để đạt được hiệu suất chiết là cao nhất

1.3.3.3 Thời gian chiết

Khi bắt đầu chiết, các chất có phân tử lượng nhỏ thường là hoạt chất sẽ được hòa tan và khuếch tán vào dung môi trươc, sau đó mới đến các chất có phân tử lượng lớn hơn như các tạp chất Do đó, nếu thời gian chiết ngắn thì dược liệu sẽ không kịp hòa tan hết vào dung môi, nhưng nếu thời gian chiết quá dài thì dịch chiết sẽ bị lẫn nhiều tạp, gây bất lợi cho quá trình tinh chế và bảo quản Tóm lại cần phải lựa chon thời gian chiết

xuất sao cho phù hợp với thành phần dược liệu, dung môi và phương pháp chiết suất…

1.3.3.4 Độ mịn của nguyên liệu

Khi kích thước nguyên liệu thô quá, dung môi khó khăn thấm ướt vào nguyên liệu, hoạt chất khó hòa tan vào dung môi Khi độ mịn nguyên liệu tăng lên, bề mặt tiếp xúc giữa nguyên liệu và dung môi tăng lên, theo định luật Fick, lượng chất khuếch tán vào dung môi sẽ tăng lên, do đó thời gian chiết suất sẽ nhanh hơn

Tuy nhiên, trong thực tế nếu xay nguyên liệu quá mịn sẽ gây ra bất lợi cho quá trình chiết như:

- Bột nguyên liệu sẽ bị dính bết vào nhau khi ngâm vào dung môi, tạo tành dạng bột nhão, vón cục nên khi rút dịch chiết, dịch chiết bị chảy chậm hoặc không chảy

- Khi bột dược liệu quá mịn, nhiều tế bào thực vật bị phá hủy, dịch chiết bị lẫn nhiều tạp, gây khó khăn cho quá trình tinh chế, bảo quản

Vì vậy tùy từng trường hợp, tùy vào nguyên liệu, dung môi, phương pháp chiết xuất… mà ta chọn độ mịn nguyên liệu sao cho phù hợp:

- Đối với nguyên liệu mỏng như hoa, lá, cây cỏ… hoặc đối với những nguyên liệu chứa nhiều chất nhầy, chất nhựa, chất keo… thì không nên say nguyên liệu quá mịn Đối với nguyên liệu rắn chắc như: hạt, rễ, thân gỗ… cần phải xay mịn hơn

- Nếu dùng dung môi dễ hòa tan tạp chất thì không nên xay nguyên liệu quá mịn

- Đối với trường hợp chiết xuất ở nhiệt độ cao, cũng không nên xay mịn để tránh đưa nhiều tạp chất vào dịch chiết

1.3.3.5 Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu

Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu có ảnh hưởng đến điều kiện khuếch tán các chất từ trong tế bào ra ngoài dung môi Nếu tỷ lệ dung môi/nguyên liệu thấp thì tốc độ khuếch tán của các chất nhanh nhưng hiệu suất chiết chậm Ngược lại, thì hiệu suất chiết cao nhưng sẽ gặp khó khăn trong quá trình thu hồi dung môi và tốn dung môi

1.3.3.6 Độ ẩm của nguyên liệu

Nếu độ ẩm trong nguyên liệu cao thì phần nước trong nguyên liệu sẽ tác dụng với các protein háo nước khác, ngăn cản sự dịch chuyển của dung môi thấm sâu vào tế bào nguyên liệu làm cho sụ khuếch tán diễn ra chậm, từ đó làm chậm quá trình chiết tách

1.4 Tổng quan tình hình nghiên cứu liên quan đến nội dung đề tài

1.4.1 Nghiên cứu nước ngoài

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về khả năng ức chế enzyme tyrosinase trên đối tượng rong biển và các loài thực vật trên cạn, và thử nghiệm sử dụng dịch chiết từ các đối tượng này để bảo quan tôm nguyên liệu Ví dụ, Kang và cộng sự (2004) đã nghiên cứu khả năng ức chế enzyme tyrosinase và sự hình thành melanin của kurarinol,

kuraridinol và trifolirhizin từ rong Sophora flavescens Kết quả của nghiên cứu này cho

ba hợp chất này tinh sạch từ phân đoạn dịch chiết ethyl acetate có thể ức chế hoạt động

mạnh hoạt động của enzyme tyrosinase; với giá trị IC50 lần lượt là 8,60, 0,88 và 506,77

𝜇M Ba hợp chất này cũng được thử nghiệm khả năng ức chế tế bào ung thư da Trong các tế bào u ác tính B16, ở nồng độ 50 𝜇M các hợp chất ức chế đáng kể (> 50%) quá trình tổng hợp melanin [35] Chang và cộng sự (2016) đã nghiên khả năng ức chế

enzyme tyrosinase của rong đỏ Eucheuma cottonii Kết quả cho thấy, dịch chiết giàu

polyphenol từ loài rong này có khả nắng ức chế enzyme tyrosinase, với giá trị IC50 đạt

234,33 μg/ml Tác giả kết luận dịch chiết từ E cottonii có thể là nguồn nguyên liệu tự

nhiên tiềm năng sử dụng làm chất ức chế tyrosinase Ở các đối tượng thực vật trên cạn, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng dịch chiết từ lá trà xanh có tác dụng hạn chế sự hình thành biến đen ở tôm [45], [46], [47], [48] Nalan và Pinar (2008) cũng đã báo cáo sử dụng dịch chiết từ hạt nho có thể hạn chế sự biến đen ở tôm Angel và cộng sự (2011)

đã thành công trong việc sử dụng dịch chiết từ nấm ăn để hạn chế sự hình thành đốm đen trong tôm Kuruma

Một số nghiên cứu trên đối tượng cây keo dậu L leucocephala cũng đã được thực

hiện Li và cộng sự (2012) đã đánh giá khả năng chống oxy hóa và ức chế enzyme tyrosinase của một số hợp chất tinh sạch từ lá hạt keo dậu trồng tại Đài Loan Kết quả nghiên cứu cho thấy hợp chất pheophorbide a methyl ester tinh sạch từ dịch chiết methanol có khả năng ức chế tyrosinase tương đương với acid kojic [39] Nirmal và Benjakul (2011) đã tinh sạch một hợp chất acid min (Mimosine) từ cây keo dậu trồng tại Thái Lan Hợp chất này có khả năng ức chế mạnh enzyme tyrosinase và hạn chế sự biến đen của tôm [49] Như vậy, đã có một số nghiên cứu tách và tinh sách một số hợp chất có khả năng ức chế enzyme tyrosinase từ cây keo dậu Nhưng hầu hết nghiên cứu tập trung vào tinh sạch hợp chất Các chất tinh sạch có hàm lượng nhỏ, do vậy, việc ứng dụng để bảo quản thủy sản sẽ rất hạn chế

1.4.2 Nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, một số nghiên cứu đã thử nghiệm sử dụng các chất tổng hợp cũng như dịch chiết từ nguyên liệu tự nhiên để ức chế enzyme tyrosinase và hạn chế sự biến đen của tôm nguyên liệu trong quá trình bảo quản Một số công nghệ cũng đã được thử nghiệm để hạn chế sự biến đen của tôm Ngô Bá Thành (1986) đã triển khai nghiên cứu hỗn hợp hóa chất bảo quản tôm tươi, tác giả đã thực nghiệm trên một số lượng lớn tôm bảo quản với chất CPA gồm: S bisulfil (HSO3), NaHSO3 (32%), S tripolyphosphate

Na6P3O10 (15%), glutamate (5%) và acid citric (48%) Nồng độ hóa chất CPA (0,5%) nhúng tôm đã bỏ đầu bảo quản sau 5 ngày kết quả tôm không bị đen quá 15%, còn tôm

để đầu thì đen không quá 30% Nguyễn Việt Dũng và Huỳnh Nguyễn Duy Bảo (1996)

đã nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ và pH lên hoạt độ của enzyme polyphenoloxydase

từ tôm sú [11] Nguyễn Việt Dũng và Nguyễn Tiến Thơm (1997) đã nghiên cứu sử dụng công nghệ lạnh chuẩn everfresh để ngăn chặn sự biến đen ở tôm sú trong quá trình bảo quản bằng nước đá Nghiên cứu này nhằm xác định điều kiện thích hợp để chiết tách chất chống oxy hóa từ nấm rơm [12] Nguyễn Tường Vy và cộng sự (2012) đã nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme Tyrosinase của cây Mần tưới Kết quả: Từ dịch chiết cây mần tưới, hai hợp chất đã được phân lập là acid o-coumaric và patriscabratin Hợp chất acid o-coumaric có tác dụng ức chế hoạt tính tyrosinase với giá trị IC50 là 2,8 mM [9] Lê Thanh Hải và cộng sự (2013) nghiên cứu dịch nấm rơm có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất khi chiết tách ở 95°C trong 60 phút với tỷ lệ nguyên liệu/dung môi chiết (nước) là 1/10 Kết quả nghiên cứu cho thấy dịch chiết nấm rơm thu được có chứa 5,013 mg/ml ergothioniene có khả năng ức chế enzyme polyphenoloxydase [3] Nguyễn Xuân Duy và Nguyễn Anh Tuấn (2013) đã nghiên cứu sàng lọc thực vật có hoạt tính chống oxi hóa và ức chế enzyme tyrosinase để ứng dụng trong bảo quản nguyên liệu thủy sản Dịch chiết từ lá ổi thể hiện khả năng hạn chế sự hình thành đốm đen trên tôm và oxi hóa chất béo của thịt cá trong quá trình bảo quản lạnh Kết quả nghiên cứu này có thể được xem như những công bố đầu tiên về tác dụng của dịch chiết lá ổi trong việc hạn chế biến đen trên tôm và oxi hóa chất béo cơ thịt cá trong quá trình bảo quản lạnh, mở ra tiềm năng có thể sử dụng dịch chiết từ lá ổi trong bảo quản nguyên liệu thủy sản sau thu hoạch [13]

Qua tổng quan cho thấy một số loài thực vật và nấm ăn trồng ở Việt Nam đã được nghiên cứu khả năng ức chế enzyme tyrosinase làm tiền đề cho ứng dụng bảo quản tôm Tuy nhiên, cho đến nay chưa có công trình nghiên cứu nào công bố về việc sử dụng dịch chiết từ cây keo dậu trồng tại Việt Nam trong việc bảo quản tôm Hầu hết các nghiên cứu chỉ ra rằng polyphenol trong thực vật là thành phần chính có khả năng ức chế enzyme tyrosinase và hạn chế sự biến đen trên tôm và thực vật Do vậy, nghiên cứu này được thực hiện nhằm thu nhận phân đoạn dịch chiết giàu polyphenol từ cây keo dậu và thử nghiệm khả năng hạn chế sự biến đen trên đối tượng tôm thẻ chân trắng bảo quản

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Tôm thẻ chân trắng

Tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) sử dụng trong nghiên cứu này có kích

cỡ từ 60 – 80 con/kg được mua tại chợ Bầu, Tp Nha Trang Tất cả các mẫu đều còn sống, không chọn những con bị tổn thương, có màu sắc lạ hay có biểu hiện bị bệnh Tôm được bảo quản sống và vận chuyển về phòng thí nghiệm Công nghệ Chế biến – Trường Đại học Nha Trang để làm thí nghiệm

2.1.2 Hạt keo dậu

Hạt keo dậu (Leucaena leucocephala) sử dụng trong nghiên cứu này được thu

hoạch tại dọc đường Đèo Lương Sơn, Tp Nha Trang, Khánh Hòa Chọn và sử dụng hạt

đã già, màu nâu bóng, khô, chắc và có kích thước đồng đều

được cung cấp bởi các công ty sản xuất hóa chất Trung Quốc

2.3 Dụng cụ và thiết bị

Hệ thống phân tích hình ảnh gồm: Camera kỹ thuật số Panasonic DMC 10 Mp, buồng chụp hình (không có ánh bên ngoài chiếu vào, được lắp 04 đèn huỳnh quang ở 04

đỉnh của buồng), laptop có phần mềm phân tích hình ảnh ImageJ (phần mềm này được cung cấp miễn phí bởi Viện Sức khỏe Quốc gia Hoa Kỳ, Bethesda, MD) Một số thiết bị khác:

Bể ổn nhiệt, máy ly tâm, máy xay, máy quang phổ UV – 1600PC SHIMADZU…

2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm

2.4.1 Quy trình bố trí thí nghiệm tổng quát

Hình 2.2 Sơ đồ quy trình nghiên cứu tổng quát

Nguyên liệu quả keo dậu

Phơi khô

Nước cất

Ly tâm Chiết Xay nhỏ

Làm sạch Hạt khô

Dịch chiết

Bố trí thí nghiệm áp dụng dịch chiết hạt keo dậu hạn chế sự biến đen ở tôm thẻ chân trắng

Bố trí thí nghiệm xác định hàm lượng polyphenol tổng số

Tách cách phân đoạn

có dung môi phân cực khác nhau

Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của điều kiện chiết (nồng

độ dung môi, nhiệt độ, thời gian) đến hàm lượng polyphenol tổng

số

Bảo quản dịch chiết giàu polyphenol

Giải thích quy trình:

Quả keo dậu sau khi được thu hoạch từ dọc đường Đèo Lương Sơn, Tp Nha Trang, Tỉnh Khánh Hòa Sau đó, chọn các quả có kích thước đồng đều, loại bỏ các quả non hoặc có hạt quá nhỏ, đưa đi phơi khô tự nhiên dưới ánh nắng mặt trời đến độ ẩm 10 – 20% Mục đích của việc phơi khô là làm giảm hàm lượng nước từ đó ngăn chặn sự phát triển của các vi sinh vật, ức chế các quá trình chuyển hóa bên trong hạt Đồng thời, khi hàm lượng ẩm trong nguyên liệu giảm, tốc độ trích ly tăng lên vì nước tác dụng với protein và các chất háo nước khác ngăn cản sự dịch chuyển của dung môi thấm sâu vào trong nguyên liệu, làm chậm quá trình khuếch tán Quả sau khi đã khô thì tước lấy hạt, chọn những hạt to đồng đều về độ khô, màu sắc và độ chắc của hạt nhằm tạo sự đồng nhất cho nguyên liệu cũng như chất lượng nguyên liệu đảm bảo hơn

Xay hạt: Dùng máy xay sinh tố (cối xay tiêu) để xay nhỏ hạt vì lá nhỏ sẽ làm tăng diện tích tiếp xúc giữa hạt với dung môi, góp phần phá vỡ cấu trúc tế bào hạt, tạo điều kiện thuận lợi cho các chất hòa tan trong dung môi Dùng rây để thu phần bột mịn, bột nguyên liệu khô được bao gói chân không trong bao bì PA và bảo quản ở nhiệt độ -20oC cho đến khi tiến hành thí nghiệm

Chiết: Hàm lượng polyphenol bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố trong quá trình chiết như nồng độ dung môi, nhiệt độ, thời gian Do đó, tại công đoạn chiết này sẽ tiến hành

bố trí các thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố trên để tìm ra điều kiện chiết cho hoạt tính mong muốn cao

Ly tâm: Mẫu sau khi chiết sẽ được ly tâm để thu dịch có chứa hợp chất cần thiết, loại bỏ những tạp chất không tan như cặn và bã hạt

Dịch chiết thu được sẽ được đem đi bố trí các thí nghiệm xác định hàm lượng polyphenol tổng số

Sau khi xác định được điều kiện chiết thích hợp cho hàm lượng polyphenol cao thì tiến hành bố trí thí nghiệm áp dụng dịch chiết hạt keo dậu để hạn chế sự biến đen trên tôm thẻ chân trắng bảo quản lạnh

2.4.2 Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của tỷ lệ NL/DM (w/v) đến hàm lượng polyphenol tổng số

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của tỷ lệ NL/DM đến hàm lượng polyphenol tổng số của dịch chiết hạt keo dậu

Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ NL/DM đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết hạt keo dậu được mô tả ở Hình 2.3 Cân 1 g nguyên liệu bột hạt keo dậu và cho vào bình tam giác dung tích 250

ml Bột hạt keo dậu nguyên liệu được chiết với dung môi là nước cất với các tỷ lệ NL/DM (w/v): 1/10, 1/20, 1/30, 1/40, 1/50

Hạt keo dậu khô (đã xay mịn)

Chiết

NL/DM

(1/10)

NL/DM 1/20

NL/DM 1/40

NL/DM 1/50

NL/DM 1/30

Ly tâm

Dịch chiết

Chọn tỷ lệ NL/DM thích hợp Xác định hàm lượng polyphenol tổng số

Trong thí nghiệm này, nhiệt độ chiết là 60oC và thời gian chiết là 60 phút, được giữ cố định Quá trình chiết được thực hiện trong bể ổn nhiệt (Elma, S300H, Elmasonic, Germany) Sau khi kết thúc quá trình chiết, hỗn hợp được ly tâm bằng máy ly tâm Toàn

bộ dịch chiết thu được sau khi ly tâm được bổ sung cùng loại dung môi đến thể tích cuối cùng là 50ml Sau đó được đem đi xác định hàm lượng polyphenol tổng số

2.4.3 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng polyphenol tổng

số của dịch chiết hạt keo dậu

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng

polyphenol tổng số của dịch chiết hạt keo dậu

Hạt keo dậu khô (đã xay mịn)

Xác định hàm lượng polyphenol

tổng số

90oC

80oC