Nghiên cứu quy trình kỹ thuật nuôi cấy tế bào gốc mô mỡ trên nền màng polymer sinh học PHB

Nghiên cứu quy trình kỹ thuật nuôi cấy tế bào gốc mô mỡ trên nền màng polymer sinh học PHB Nghiên cứu quy trình kỹ thuật nuôi cấy tế bào gốc mô mỡ trên nền màng polymer sinh học PHB Nghiên cứu quy trình kỹ thuật nuôi cấy tế bào gốc mô mỡ trên nền màng polymer sinh học PHB luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Chuyên ngành: công nghệ sinh học

LUẬN VĂN THẠC SỸ KỸ THUẬT

CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 TS Đỗ Minh Trung – Học viện Quân y

2 TS Đặng Minh Hiếu – Đại học Bách Khoa Hà Nội

HÀ NỘI – 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi in c n n u n n này à công nh ch nh ôi nghiên c u – Học iên Nguy n Thị H ng, chuyên ngành Th c s Công nghệ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học à Công nghệ Th c h , T ƣ ng Đ i học B ch h Hà Nội

h àn hành ƣ i s hƣ ng n c Đ i úy TS Đỗ Minh Trung – Học iện Quân y

và TS Đặng Minh Hiếu – Đ i học B ch Kh Hà Nội Mộ số nhiệ nghiên

c u à hành u c hể à ƣ c c c ồng s ch h s ng C c số iệu, ế u nh ày ng u n n à ung h c à chƣ ƣ c công ố ng c c

u n n h c

T c gi u n n

Nguyễn Thị Hằng

LỜI CẢM ƠN

Trung – Họ v ệ Q Y v ặ H - Tr ờ ạ Họ Bá K o H

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ii

LỜI CẢM ƠN iii

DANH MỤC CÁC CHỮ, KÍ HIỆU VIẾT TẮT vi

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC HÌNH ix

DANH MỤC BIỂU ĐỒ x

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1 1 BỎNG DA VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐIỀU TRỊ 3

1.1.1 Da 3

1 2 TẾ BÀO GỐC 7

1 2 1 Kh i niệ 7

1 2 2 Phân i ế à gốc 8

1 2 3 Đặc iể c TBG 10

1 2 4 Ứng ng c ế à gốc 10

1 2 5 Tế à gốc ừ ô ỡ à ng ng TBG ừ ô ỡ 12

1 3 POLY β – HYDROXYBUTYRATE (PHB) 16

1 3 1 Cấu úc hó học c PHB: 17

1 3 2 C c ặc nh hó ý c PHB 18

1 3 4 C c nghiên c u ng ng PHB 21

PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2 1 V iệu nghiên c u 25

2.2 Phương h nghiên c u 26

2.2.1 Nuôi cấy ế à 26

2.2.3 Phương h àng PHB 27

2.2.4 Phương h h ch ng c àng PHB 27

2 2 5 Phương h nghiên c u hiệu u gh àng ế à iều ị ế hương h c nghiệ 28

2 2 6 X ý à hân ch số iệu 35

2 2 7 Đị iể nghiên c u 35

2 2 8 Đ c nghiên c u 35

PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37

3 1 Kế u àng, h ộ ch ng c àng PHB à h s c c iều iện nuôi cấy àng ế à gốc ô ỡ ên nền àng PHB 37

3 1 1 Kế u àng PHB 37

3.1.2 Kế u c ịnh ộ ch ng c àng PHB ên hỏ 37

3 1 3 Kế u nuôi cấy ng sinh ế à gốc ô ỡ 40

3 1 4 Nuôi cấy TBG ô ỡ ên nền àng PHB 41

3 1 5 Kế u h s c c iều iện nuôi cấy àng ế à gốc ên nền àng y e sinh học PHB 42

3 2 Đ nh gi hiệu u àng ế à ên nền àng PHB iều ị ế hương ỏng ên ộng h c nghiệ 52

3.2.1 Kế u h y ổi ộ số chỉ số àn hân 52

3.2.2 Th y ổi ế u ộ số nghiệ c chuộ ng gh ế à 53

3.2.3 Ảnh hưởng c gh ế à i iền ế hương 55

3.2.4 Vi hu n học ế hương ỏng h c nghiệ 60

KẾT LUẬN 66

KIẾN NGHỊ 68

TÀI LIỆU THAM KHẢO 69

DANH MỤC CÁC CHỮ, KÍ HIỆU VIẾT TẮT

MSCs Mesenchymal stem cells: Tế à gốc ung ô

Phosphate-buffered saline: Đệ uối hố h

Platelet Rich Plasma: Huyế ƣơng giầu iểu cầu

DANH MỤC BẢNG

B ng 1 1 Mộ số nghiên c u ng ng TBG ừ ỗ ỡ ng iều ị 13

B ng1 2 S s nh ộ ài ặc nh giữ PHB à nh PP 18

B ng1 3 C c ch ng hu n h gi s n uấ PHB uy ô công nghiệ 20

B ng 3 1 Kế u nh gi c ộ ch ng c àng PHB s u 4 gi ắ àng 37 B ng 3 2 Kế u nh gi c ộ ch ng c àng PHBs u 24 gi ắ àng 38 B ng 3 3 Kế u nh gi c ộ ch ng c àng PHBs u 48 gi ắ àng 38 B ng 3 4 Kế u nh gi c ộ ch ng c àng PHBs u 72 gi ắ àng 39 B ng 3 5 M ộ ế à gốc ô ỡ ên nền PHB ở c c nồng ộ ổ àngPHB h c nhau 43

B ng 3 6 Kế u số ư ng ế à nuôi trên màng PHB 1% h s ở c c hể ch h c nhau 46

B ng 3 7 Kh s h i gi n nuôi TB trên màng PHB 1% - 7ml 48

B ng 3 8 Kế u ng sinh TBG ô ỡ ên nền àng PHB 1% - 7ml i c c ộ TBG n ầu h c nh u 49

B ng 3.9 Th y ổi ọng ư ng c chuộ cống nghiên c u(XFD: T ọng ư ng n ầu c chuộ – D0: Th i iể gây ỏng – D5: Th iể 5 ngày s u gây ỏng – D10: Th i iể 10 ngày s u gây ỏng) 52

B ng 3 10 Th y ổi c c chỉ số huyế học c chuộ nghiên c u 53

B ng 3 11 Th y ổi c c chỉ số g uc se à c e inin c chuộ nghiên c u 54

B ng 3 12 Th y ổi h ộ enzy GOT, GPT huyế h nhc chuộ nghiên c u 54

B ng 3 13 Di n iến â sàng ế hương ỏng h c nghiệ 55

B ng 3 14 Th y ổi iện ch ế hương ỏng 56

B ng 3 15 Tốc ộ iền ế hương 56

B ng 3 16 Liên u n h i gi n à số ế hương iền h àn àn 56

B ng 3 17 Đặc iể h nh h i cấu úc ô ế hương i c c h i iể 58

B ng 3 18 Th y ổi số ư ng ế à iê i ô ế hương 58

B ng 3 19 Th y ổi số ư ng nguyên à s i i ô ế hương 59

B ng 3 20 Th y ổi số ư ng ế à s i i ô ế hương 59

B ng 3 21 Th y ổi số ư ng ân ch i chỗ ế hương 59

B ng 3 22 Tỷ ệ ế hương cấy hu n ương nh 60

B ng 3 23 Tỷ ệ uấ hiện c c ch ng i hu n ngày D0 61

B ng 3 24 Tỷ ệ uấ hiện c c ch ng i hu n ngày D7 62

B ng 3 25 Tỷ ệ nhi hối h c c i i hu n ên cùng ộ ế hương D0 62

B ng 3 26 Tỷ ệ nhi hối h c c i i hu n ên cùng ộ ế hương D7 63

B ng 3 27 Th y ổi ộ số ư ng i hu n ế hương 64

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 1 Cấu úc 3

H nh 1 2 Tế à gốc 8

H nh 1 3 Công h c cấu ổng u c PHA 16

H nh 1 4 Cấu úc hó học c PHB 17

H nh 2 1 Gây ỏng ch chuộ cống 29

H nh 2 2 H nh nh chuộ ư c gây ỏng (A) à Vế gây ỏng c chuộ (B) 30

H nh 2 3 Cắ ọc ỏ h i 31

H nh 2 4 H nh nh ề cấy hu n 33

Hình 3.1 Màng PHB 37

H nh 3 2 H nh nh h h n ng ch ng c àng PHB ên hỏ 39

H nh 3 3 H nh nh TBG ô ỡ 40

H nh 3 4 Nuôi cấy TBG ên nền àng PHB 41

H nh 3 5 H nh nh ề àng PHB (A) à Màng ế à ên nền PHB ư c nhuộ ng Gie s (B) ư c s ng ng h nghiệ 42

H nh 3 6 H nh nh nhuộ ế à gốc ô ỡ nuôi cấy ên nền PHB ở c c nồng ộ khác nhau 44

H nh 3 7 H nh nh nuôi cấy àng TBG ô ỡ ên nền àng PHB 1% ư c nhuộ ng Gie s 52

H nh 3 8 Vế ỏng sâu ngày h 5 s u ỏng ư c cắ ọc s ch h i , chu n ị gh ế à Vùng nghiên c u à ùng ối ch ng ương ương nh u ề iện ch 57

H nh 3 9 Vế ỏng ngày h 7 s u gh ế à , ùng A có ấu hiệu iểu ô hó , ùng B có ấu hiệu iê à ung huyế ế hương 57

Hình 3.10 H nh h i cấu úc ô ế hương 60

Hình 3.11 H nh nh nuôi cấy i hu n hân ừ ế hương ùng A à ùng B c chuộ số 1, ở ngày nghiên c u h 7 s u gh ế à 61

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu ồ 3 1 X c ịnh ộ ế à gốc ô ỡ ên nền PHB ở c c nồng ộ ổ

àng PHB h c nh u (ĐC: nuôi TBG c iế ên e) 43

Biểu ồ 3 2 Kế u c ịnh ộ ế à gốc ô ỡ h s àng ế à ở hể ch PHB 1% h c nh u 46

Biểu ồ 3 3 Kh s h i gi n nuôi TB ên àng PHB 1% - 7ml 48

Biểu ồ 3 4 T ng sinh TBG ô ỡ ên nền PHB 1% - 7ml 50

i ộ TB n ầu I 1,5 105 ± 0,7.105 (TB/ ml) 50

Biểu ồ 3 5 T ng sinh TBG ô ỡ ên nền PHB 1% - 7ml 50

i ộ TB n ầu II 0,50 105 ± 0,25.105(TB/ ml) 50

Biểu ồ 3 6 T ng sinh TBG ô ỡ ên nền PHB 1% - 7ml 51

i ộ TB n ầu III 0,40 105 ± 0,14.105 (TB/ ml) 51

Biểu ồ 3 7 T ng sinh TBG ô ỡ ên nền PHB 1% - 7ml 51

i ộ TB n ầu IV 0,2 105 ± 0,08.105(TB/ ml) 51

Biểu ồ 3 8 T ng sinh TBG ô ỡ ên nền PHB 1% - 7ml 51

i c c ộ TB n ầu I, II, III, IV 51

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bỏng à ệnh ng i h hư ng gặ c c c nhân như nhiệ ộ, h chấ , iện n ng, c … gây Trong ệnh ỏng, ổn hương cơ n à ổn hương da Việc iều ị ành có ý ngh u n ọng ề ặ ch c n ng à hầ ỹ Có nhiều

hư ng nghiên c u ng ư c y nh à h iển ng ng ng iều ị ế hương, ế ỏng ngoài da, t ng ó có công nghệ ế à gốc Những nghiên c u gần ây ch hấy iệc s ng ế à gốc (TBG) ưởng hành có nhiều iề n ng

ng ng ng y học i nhấ à s ng ng iều ị ỏng , ỏng à ổn hương ề gi c c, c c ị iểu ô…Do ặc nh TBG có hể iệt hóa thành nhiều i ế à h c nh u, có nh sinh i n ịch hấ , chống iê , à húc y

nh nh u nh iền ế hương ng c ch ng u nh iểu ô hó [2] Hiện nay,

TBG ưởng hành có hể ấy ở nhiều nguồn h c nh u, ng ó hổ iến nhấ à ấy

ừ y ương à ô ỡ Tuy nhiên, ô ỡ ư c c i à nguồn có nhiều ưu iể ,

h c hiện, số ư ng ế à nhiều và TBG ừ ô ỡ ư c ng ng nhiều ng iều ị [11]

Để iều ị ế hương, ế ỏng hiệu u , ên c nh iệc nguồn à ng

ng ế à gốc h iệc ế h i iệu như ộ gi hể ( àng sinh học) cũng

ô cùng u n ọng Gi hể ừ à iệu ể ế à sinh ưởng à h iển ên

ó à hành àng ế à ền chắc, àng s ng à che h ế hương Hiện n y, PHB ( yhy y u y e) ư c iế ến như ộ nguồn cung cấ iệu sinh học có nhiều iề n ng ư c ng ng, ởi có những ặc iể ng uốn như nh ương h ch sinh học, hân h y sinh học à hông gây ộc T nh

ương h ch sinh học c PHB ư c c ịnh in vitro ở c c ôi ư ng nuôi cấy

h c nh u i c c òng ế à như nguyên à s i, ế à gốc ung ô, ế à

ương, ế à y ương, ế à s n, ế à iểu ô, ế à cơ ơn (R s y et al.,

1990) D y, PHB ư c ng ng ng nhiều nh c h c nh u như óng gói,

ư c h à iệu che h … Những ặc nh ng uốn này ở iề n ng

ng ộng i…C c s n h ừ PHB nh n ư c giấy ch ng nh n ộc nh

c Viện ỹ hu Y Kh (Bộ Y ế, Liên ng Ng ) (số 388-99, 24.12.1999) ch ng

nh n PHB ch h ƣ c ng ng à y ế nhƣ iệu ƣơng h ch sinh học à hông ộc h i h ch h ch cấy gh ô ở ngƣ i…[1]

Xuấ h ừ yêu cầu h c i n à ừ cơ sở ý u n h học ên, chúng ôi

iến hành nghiên c u ề ài: ‘‘Nghiên cứu Quy trình kỹ thuật nuôi cấy tế bào gốc

mô mỡ trên nền màng polymer sinh học PHB” i c c c iêu s u:

Mục tiêu nghiên cứu:

1 Tạo màng tế bào gốc mô mỡ nuôi trên nền màng polymer sinh học PHB

2 Đánh giá màng tế bào gốc mô mỡ trên nền màng polymer sinh học PHB ứng dụng trong điều trị vết thương vết bỏng da

PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 BỎNG DA VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐIỀU TRỊ

1.1.1 Da

D à cơ u n c hệ ài iế , gồ cấu úc ch nh: iểu , ung , h Ng ài còn có c c cấu úc h ên ( ông, óng, c c uyến)

à c c ch, ây hần inh hân ố ng

- L iểu : à hần ên c , có ộ ày nhỏ nhấ ng uy nhiên

i giữ i ò u n ọng nhấ Gồ ốn : sừng, ế à h , ế à gai, ế à y Giữ iểu à ung ng n c ch i nh u ởi àng y

- L ung : n s ng y ư i iểu , à ộ ng ư i c c s i iên ế ,

có nhiệ nâng ỡ à nuôi ưỡng Là ùng có ch c c ây hần inh, ch

u, ch ch huyế , n ng ông, uyến nh n à c c uyến, ồ hôi

- L h : n ư i chân , có ch nư c, c c ô iên ế à ô ỡ

L h óng i ò à ệ giữ à cơ hể [6]

Hình 1.1 Cấu trúc da ( ồ : http://likespa.com.vn)

D à ộ ng c c cơ u n n nhấ , h ộng nhiều nhấ à có i ò ô cùng u n ọng ối i cơ hể D ọc cơ hể ệ c c cơ u n ng cơ hể hỏi c c c h i ởi c c yếu ố cơ học, ý học, hó học, i sinh gây h i, chống

ấ nư c, giú ổn ịnh hân nhiệ D còn có ch c n ng ch nh ng iều hò

ổi chấ , ch c n ng c gi c, ổng h i in B, D à có i ò à ẹ

Khi ị ỏng, à ộ h n ị ổn hương nhấ Khi ó, hông còn giữ

ư c i ò ệ cơ hể à ch ệnh nhân có c gi c u Nếu ế ỏng hông ư c ý ị h i, có hể gây nhi ùng huyế , n ộng h i sẽ n

ến ng h ặc à ng iện ch sẹ à i ch ng sẹ s u này

1.1.2 Phương pháp điều trị bỏng da

Ngay khi ị ổn hương ỏng, hàng c c ấn ề h c h ắ ầu

i n : c c ế à i n ịch ị ôi i ùng hương ổn, ô ệ i ư c sinh ởi nguyên à s i, iế he à i iểu ô hó ế à sừng nhiệ à cuối cùng à s i hân ố ch c ế hương [36] Qu nh iền

ế hương h c này ư c ch h ch à iể s ởi c c cy ine à c c yếu ố ng ưởng h c nh u [26] K ch hư c ế hương à yếu ố ch ch iểu ô hó [42] Nếu ỏng nhẹ, chấn hương chỉ ng nh chấ c c ộ có hể hỏi Tuy nhiên, ổn hương ỏng ên iện ộng à ế hương sâu ư i sẽ gây

ọi ối n ệnh ý ng ệnh ỏng, hông những ể i c c i ch ng nặng nề ch

cơ hể ( iến ng, àn hế, gi ch c n ng h ộng) à còn gây chấn hương

â ý ch ngư i ị ỏng Không những hế, chấn hương ỏng còn gây ỉ ệ

ng c ch ngư i ệnh The Tổ ch c y ế hế gi i (WHO), ỏng gây gần

300 000 ư ng h ng hàng n ên hế gi i à à nguyên nhân ng hàng

h ch n ng số c c nguyên nhân hàng ầu gây nên g nh nặng ệnh à chấn hương àn cầu Phần n ỏng y ở c c nư c ng h iển T i Việ N ,

ỗi n có ến hàng ngh n ngư i ị ỏng ở c c c ộ h c nh u à n sau luôn

c hơn n ư c Thống ê c 100 ngư i ị ỏng có 3 – 5 ngư i ng à có hơn 30 ngư i ị i ch ng ề s u (Số iệu c iện Bỏng Quốc gi ) [4] Hơn nữ , ngư i ị ỏng à gi nh c họ còn h i chịu g nh nặng ài ch nh hông hề nhỏ như chi h iều ị ài ngày, ấ s c ộng, ấ iền ương ừ ó nh hưởng i inh ế à hội

Điều trị bỏng:

Điều ị ệnh nhân ỏng cần ế h iều ị nội h à ng i h

Điều trị nội khoa: B gồ iều ị cấ c u àn ng ệnh nhân à iều ị

i chỗ ế ỏng ng huốc nh nh nh chóng i ỏ ô h i , c chế s h iển c i hu n, ch h ch u nh i à iểu ô hó , h n chế i

ch ng, Gồ có huốc iều ị i chỗ ổn hương ỏng như thuốc h ng hu n h ặc

c chế i hu n, huốc à se hô àng, huốc à ng h i , huốc có tác

ng ch h ch u nh i à iểu ô hó Bên c nh ó, còn s ng c c iệu sinh học có c ng che h h i ế ỏng Điều ị nội h ơn huần

ng nh chấ iều iện hu n i ể ế ỏng có hể iền Tuy nhiên, ng

c c ư ng h ế ỏng sâu ấ hế c c c , hông còn h n ng iền

ế hương h ặc ổ ch c h i à ngưng s iền ế hương h h u hu ỏng

sẽ gi i uyế những ấn ề này

Điều trị ngoại khoa: Ph u hu cắ ỏ h i ỏng - ối i ỏng sâu là

nguồn gốc gây nhi hu n, nhi ộc, suy òn, h ch ng L i ừ s

h i ỏng cùng i iệc che h ế hương sẽ iều iện ố ch iệc iều ị

àn hân à i chỗ Có hể h c hiện h u hu cắ ỏ h i ỏng nhưng cũng có

hể chỉ cần s ng huốc ôi à ng h i

1.1.3 Vật liệu sinh học trong điều trị bỏng

T ng ư ng h ổn hương iện ch ộng, c c ế à có ch c n ng iền ế hương c ệnh nhân hông h n ng à ành ổn hương à cần h i gh hân nhưng nguồn hân cũng hông h i ô h n nên gh hân cũng chỉ c u ư c những ệnh nhân ỏng sâu 50% iện ch cơ hể à ch yếu V y, yếu ố u n ọng ng iều ị ế hương ị ấ , ổn hương ỏng cần hiế h i s ng c c i àng che h h ặc h y hế ùng ị ấ L àng giú ế hương h n chế nhi ùng, giữ ư c ộ h ch h , gi ấ nư c à chấ iện gi i ề ặ … ừ ó giú ú ngắn ư c h i gi n iều ị C c iệu sinh học ó có hể à c c àng ổng h , n ổng h h y có nguồn gốc sinh học giống

h ặc hông giống ề cấu úc nhưng có c ng h y hế c c ch c n ng c

ộ c ch h i h y âu ài

C c ặc nh cần h i có ở ộ iệu sinh học h y hế : nh bám dính

nh nh à ền ên ặ ế hương; cấu úc ch h i chuyển, ng sinh, ng

cư ng c c ế à c iểu ô i; ng n c n s hâ nh c c i hu n ng i sinh,

gi s ấ nư c, ấ iện gi i, P ; hông h ng nguyên, hông gây ị ng; có tính inh ộng, ộ c gi n c nhưng n ệ ư c ế hương, hông gây u n; hông gây ộc, có hể vô ùng ư c; có hể h n chế s nhi ùng; gi hiểu s sẹ ; giú iền nh nh ế hương; có h n ng hấ , ch c c chấ s

hu n; h n ng h c hồi ch c n ng s u chữ ị; u n à u n ư c âu; gi hành ẻ…

Hiện n y, có nhiều công trình nghiên c u ên hế gi i chế ư c c c iệu sinh học ể à àng che h h i h y c c àng nhân V iệu có hai thành phần ch nh nên iệu ương ương à hành hần huôn à hành hần ế à Thành hần huôn h y ư c s ng à c gen,

ci hy u nic, y e ổng h h ặc sinh ổng h Thành hần ế à

gồ c c ế à như nguyên à s i, ế à sừng ây là hai i ế à hay

ư c s ng, ngoài ra c c àng sinh học cũng ư c s ng ng iều ị ế hương ế ỏng C c àng sinh học có ên hị ư ng như: allograf ( ồng ài), epicraf, democraft (nguyên à s i uy ầu cấy ư i yglactin), intergraf (C gen ò chấ nền như ung , si ic n ỏng ương ương iểu ), xenograft - trung bì da n, ếch, i ne ( ư i ni n ư c ng si ic n ỏng) …gó hần iều ị ổn hương ỏng hiện n y ên hế gi i [7]

Ở nư c cũng có nhiều công nh nghiên c u he hư ng hiế ế iệu

ng iều ị ỏng N 2006, GS Võ Huy Dâng à cộng s nghiên c u chế hành công àng GA có h n ng n à h i huốc, có c ng ố ng iều

ị ỏng ên chuộ h nghiệ , hông những hế nó còn ng n c n s â nhi ( ặc

iệ à i hu n Staphylococcus aureus và Escherichia coli), gi iê , y nh nh

u nh ành hó ế hương Màng GA hối h i hỗn h inh ầu à à h chấ ec ss chiế uấ ừ u có c ng ố nhấ ng c c nhó iều ị à

có hể s n uấ công nghiệ ng ng iều ị ỏng Tuy nhiên, àng GA chỉ ặc

iệ có hiệu u ở ng ỏng hô

Viện Bỏng Quốc Gi hiện n y nuôi cấy hành công nguyên à s i à ế

à sừng ên ấ iệu ể iều ị ế hương à ế ỏng, iệu có n chấ à

yu e h n ( eg e ) à iệu y e có ng c gen Tuy nhiên, việc nuôi cấy ế à hân hông ng ị nhu cầu â sàng uy nh cần h i gi n

ài, iệc nuôi cấy c c ế à ồng ài ng ị h i ề ặ h i gi n nhưng

gặ h i ấn ề h i gh [4]

Ở nư c c c công nh nghiên c u hư ng hiế ế iệu sinh học giú che

h ế hương ư c n còn , h n chế D ó, hần n c c àng iều ị ỏng

ều h i u ừ c c h ng nư c ng ài nên chi h iều ị ch ệnh nhân cũng ó

à ng c Bên c nh ó, xuấ h ừ h n chế ề nguồn ồng ài hiếu ề số

ư ng à chấ ư ng nguồn cung cấ c c iệu h y hế h c như ếch,

n những nguồn này chỉ s ng ng nh che h h i trong khi ch gh

da à hông có h n ng à iền ế hương ỏng [3], [13], [19] Mặ h c, c c ối

n ề ein, h y ổi hệ hống i n ịch à ch ế hương ở nên ch ành h y ấ hó lành [10], [20] Từ ó, ộ ng những hư ng nghiên c u i

ng iều ị ế hương, ế ỏng à s ng ế à gốc Đặc iệ ế à gốc ưởng hành hân hù h ề i n ịch có iề n ng ấ n ng iều ị C c hương

h ị iệu TBG có hể nâng c chấ ư ng chữ ành ế hương ỏng, à gi

s h nh hành c c ế sẹ à hiế ch c n ng nh hư ng c [24, 31]

1.2 TẾ BÀO GỐC

1.2.1 Khái niệm

Tế à gốc à ế à chư có ch c n ng chuyên iệ , có h n ng thay i

và có hể iệ hó hành ộ số i ế à h c nhau ể h y hế c c ế à do già

à chế nhiên h y chấn hương nhiều nguyên nhân h c nh u [16]

Hình 1.2 Tế bào gốc

(N ồ http://idnavietnam.com)

1.2.2 Phân loại tế bào gốc [16]

1.2.2.1 Phân loại theo đặc tính hay tiềm năng biệt hóa

The iề n ng iệ hó có hể ế TBG hành 4 i: Tế à gốc àn n ng, TBG n iề n ng, TBG iề n ng, TBG ơn n ng

Tế bào gốc toàn năng (Totipotent stem cell):

Là những ế à có h n ng iệ hó hành ấ c c c i ế à cơ hể ừ

ộ ế à n ầu Tế à àn n ng có h n ng h iển hành h i nhi, 1

cơ hể sinh h àn chỉnh S u hi ng ƣ c h inh (h ), c c ế à ƣ c hân chi (gi i n 2-4 ế à – các blastosomer) ây à c c ế à gốc àn n ng, TBG àn n ng có kh n ng hân chi à iệ hó hành ấ c c c òng ế à ể

cơ hể sinh h àn chỉnh

Tế bào gốc vạn tiềm năng (Pluripotent stem cell):

Là hối ế à ên ng c B s cys Là ế à có h n ng iệ h hành

ấ c c c ế à ng i ừ ế à hôi

Tế bào gốc đa tiềm năng (Multipotent stem cells):

Là những ế à có h n ng iệ hó hành ộ số i ế à khác nhau

T ng cơ hể ngƣ i, c c ế à gốc n ng có ặ ở nhiều ô h c nh u nhƣ àng

ƣơng, u, y ƣơng, cuống ốn, ô ỡ… C c ế à ƣ c hành n ng

ộ hệ ế à có iên u n hiế , chỉ nên c c ế à u ( gồ hồng cầu, ch cầu, iểu cầu, y h …) h ặc chỉ nên c c ế à c hệ hống

c c cơ u n có nguồn gốc ừ ung ô h i hôi h i nhƣ ƣơng, s n, cơ, h , hần inh, ỡ

TBG đơn năng (Mono/unipotential cells)

TBG ơn n ng còn gọi à ế à ịnh hƣ ng ơn òng h y ế à ầu òng ( geni ce s), à những TBG chỉ có h n ng iệ hó he ộ òng V

u iểu cầu, ế à ịnh hƣ ng òng y h , ế à ịnh hƣ ng òng hồng cầu, òng ch cầu… T ng iều iện nh hƣ ng, c c TBG ƣởng hành ng nhiều

ô iệ hó nh ơn n ng à có hể iệ hó hành chỉ ộ òng ế à Kh

n ng iệ hó he òng này ch h uy ng h i sẵn sàng i ô, h y

hế c c ế à ô chế già cỗi ng c c ế à ô i

1.2.2.2 Phân loại theo dựa theo nguồn gốc phân lập

The gi i n h iển hôi h i có hể hân TBG à 4 i: TBG hôi, ế

à ầ hôi, TBG h i, TBG ƣởng hành

TBG phôi (Embryonic stem cells):

Tế à gốc hôi à TBG n n ng ƣ c ấy ừ hôi gi i n s (4-7 ngày uổi) Ở gi i n này hôi có h nh cầu à ƣ c gọi à hôi úi ( s cys )

B s cys có cấu úc gồ 3 hành hần: Mộ ế à ên ng ài ( h s ),

TBG thai (Foetal stem cells):

Là c c ế à n n ng h ặc n ng ư c hân ừ u h i s u n h

h i h ặc ừ u cuống ốn s u hi sinh Nhều ngư i ch ng, TBG h i huộc i TBG ưởng hành ở gi i n iệ hó hấ

TBG trưởng thành (Adult stem cells/Somatic stem cells)

Còn gọi à TBG hân Là c c ế à chư iệ hó ư c hấy i ộ

ư ng c c ô ngư i ưởng hành ( u ng i i, ô n , ô , ô cơ…) Đặc

iệ ng cơ hể, i ò ch yếu c c c TBG ưởng hành à uy à s chữ

ô à ở ó chúng ư c TBG ưởng hành ư c ch à có nh n ng, chúng có hể h iển hành nhó c c ế à có u n hệ hiế i nh u ng cùng ô Mộ số i TBG ưởng hành có hể có nh n n ng, h ặc nhấ có h

n ng iệ hó hành nhiều i ế à h c nh u

1.2.3 Đặc điểm của TBG [4]

Tế à gốc à những ế à chư có ch c n ng chuyên iệ , chúng có iề

n ng iệ hó hành nhiều i ế à h c nh u à có h n ng h y i Đây à

c c ế à còn chư h y ấ iệ h nên chúng có h n ng iệ h he nhiều

hư ng à nhiều i ế à h c nh u Ng ài , chúng cũng có h n ng

h y i c c ế à giống hệ nó Thông hư ng c c ế à hân chi he hương h c nhân ôi ối ng (Symetric) h i ế à giống hệ nh u ề c

ộ iệ h Tế à gốc hân chi hông ối ng (Asymetric) hành h i ế à h c

nh u, ng ó ộ ế à giữ nguyên c ộ iệ h cũng như giữ nguyên i ò

à ế à gốc à ộ ế à h h i iệ h hơn, chúng sẽ iế c iệ h hành

c c ế à iền hân ể s u ó h iển hành ế à chuyên iệ h gi à cấu

u n ị ổn hương TBG có hể hân ư c ừ nhiều nguồn h c nh u Tuy nhiên

hi hân TBG cần c c chỉ iêu ề số ư ng à chấ ư ng ế à , hế hiện n y

hổ iến nhấ ngư i hân ở h i ị ó à y ương à ô ỡ Ng ài ngư i có hể hân ừ c c nguồn h c như u ng i i, àng ối h y àng

ây ốn…[2,17]

V i những ặc iể và tính ưu iệ c TBG, TBG ch hấy ây à nguồn cung cấ có nhiều iề n ng à ng ng ng iều ị TBG ên â sàng ư c

ng ng ng iều ị c c ệnh như ung hư, ệnh P ins n, i h ư ng uýp

I, chấn hương cộ sống, ộ uỵ, ệnh i , ệnh hổi ắc nghẽn n nh (COPD)

à ệnh h i hó h [16]

Về ng ng TBG ng y học hiện n y, TBG ưởng hành là nguồn h y

ư c s ng à có nhiều ng ng hơn c TBG ưởng hành ư c cung cấ ừ nhiều nguồn à có nhiều i TBG h c nh u như TBG ung ô, TBG iểu ô, TBG u TBG ư c ng ng ng ộ số ệnh như:

- TBG u ư c ấy ừ c c nguồn như y ương, u ây ốn, u

ng i i TBG u hư ng ư c ng ng ng iều ị c c ệnh ề u

- TBG trung mô (MSC): Nhóm này có hể ấy ừ y ương, ô ỡ, ô ung , ô cơ, ô ây ốn, àng ây ốn, ô nh u h i…Nhó MSC iệ hó hành c c ế à “ ộ hung” c cơ hể chúng như ương, s n, cơ, c c ổ

ch c c TBG ung ô hiện n y ư c ng ng nhiều ng iều ị như: i

h ư ng uý I, chấn hương cộ sống, ộ uỵ, ệnh hổi ắc nghẽn n nh (COPD) à ệnh h i hó h

- TBG iểu ô: Nhó TBG này có ở c c ô h cơ hể chúng như , ông óc, niê c ư ng iêu hó , hô hấ , àng u ng c c ống n ng cơ hể như ống y/ /niệu …Nhó TBG này có hể ch, nuôi cấy ừ ô , ùng

gi c c, niê c iệng, àng ây ốn à àng ối

Công nghệ TBG à ộ ng công nghệ i c hế Kỷ 21, i iề n ng à

ng ng n c TBG, ở ộ iển ọng n iều ị c c ệnh n n y như ung

hư, iểu ư ng, h i hó hần inh…Giú ch nâng c chấ ư ng cuộc sống, à

ch hó

Ngoài các ng ng c iế TBG, hiện nay trong nghiên c u và ng ng TBG còn ư c hối h i huyế ương giàu iểu cầu dùng trong iều ị và ế h i các

iệu khác – s d ng nhƣ ộ giá ỡ (Scaffold) làm nền nuôi cấy ế bào ể ng ng trong các hƣ ng nghiên c u và iều ị khác nhau

1.2.5 Tế bào gốc từ mô mỡ và ứng dụng TBG từ mô mỡ

1.2.5.1 Tế bào gốc từ mô mỡ

Tế à gốc ung ô ( esenchy s e ce s – MSC) à c c ế à gốc

n ng, có hể iệ hó hành nhiều i ế à h c nh u nhƣ ế à ƣơng, s n, cơ,

mỡ, hần inh à ế à ê y [6,9]

MSC à nguồn ế à gốc ng ƣ c ung nghiên c u nhiều nhấ hiện

n y ên cơ sở nguồn hân à iề n ng c nó MSC ƣ c phân ừ nhiều nguồn khác nhau nhƣ y ƣơng [31], mô ỡ, máu cuống ốn, dây ốn, Wharton's jelly, nhau thai và y ng [26] Ng i ừ c c ƣ ng h gh ế à gốc ung ô ồng i ốn sẵn có nguồn ế à ấ ẻ nhƣ ế à gốc ung ô ừ àng ối, ây ốn à u cuống ốn h ối i c c ƣ ng h gh ế à gốc ung

ô hân hƣ ng có hể ấy ừ hai nguồn ch nh à y ƣơng à ô ỡ

Tế bào gốc ừ mô ỡ (Adipose derived stem cells - ADSC) ƣ c phát hiện

ầu tiên vào n 1980 N 2001, P ici Zu à nhó nghiên c u c i học

C if ni (Mỹ) công ố hu nh n ƣ c ế à ừ ô ỡ ỡ [41] Mỡ s u hi khi

hu nh n ƣ c i ung ịch PBS và hân ế à ch i c gen se 0,075% S u hi hân hu ƣ c hân n nền ch u (Stromal vascular fraction-SVF) có ch ế à nhƣ MSC, ế à gốc u à c c ế à hông

h i ế à gốc nhƣ ế à nội ch Để hân ế à gốc ung mô chỉ hu nh n

ƣ c ng cách nuôi cấy h ặc c c ộ sinh h chuyên iệ

Theo nhiều nghiên c u, số ƣ ng MSC thu ƣ c ừ mô ỡ ƣơng ƣơng hay nhiều hơn số ƣ ng MSC thu ƣ c ừ y ƣơng (De Ugarte, Morizono và cs, 2003; Dragoo, Choi và cs, 2003; Devlin và cs, 2004) V i 30ml y ƣơng thu h ng 1x105 ế bào MSC (Bruder và cs, 1997), trong khi i 21 ml ỡ hút ƣ i ƣơng bánh chè có hể thu ƣ c 5,5x106 ế bào MSC (Gragoo và cs, 2003) Quần hể MSC

thu ừ mô ỡ có hể ƣ c duy trì trong iều iện in vitro trong h i gian dài i h

n ng ng sinh ổn ịnh và h n ng iệ hóa thành các ng ế bào khác nhau Hơn

nữ , mô ỡ hổ iến, có nhiều trong cơ hể ngƣ i, dàng thu nh n qui trình thu

nh n không h c nhƣ quy trình thu nh n TBG ừ y ƣơng Lƣ ng TBG thu

nh n ừ mô ỡ ể cấy ghép ngay sau khi phân mà không cần qua ƣ c nuôi cấy [46] Mô ỡ là nguồn ế bào ồi ắ và quan ọng sau khi thu nh n mô ỡ

có hể phân TBG và s ng ngay cho iều ị nhƣ là nguồn TBG thân Vì

v y TBG ừ mô ỡ là nguồn thu nh n ế bào gốc trung mô có nhiều ƣu iể và

ƣ c ng ng nhiều trong iều ị hiện nay

Nguồn

tế bào

Liều điều trị Thời

gian theo dõi

Hiệu quả điều trị

Tài liệu tham khảo

cs G2:

24

thân 20x106 ế à ,

nếu ỗ ò hông óng à uần h

Hiện nay, có nhiều nghiên c u ng ng c TBG trung mô trong iều

ị Nhiều h nghiệ â sàng h nghiệ thành công ng ó có s ng TBG trung mô ng iều ị ệnh nhân i h ư ng y e I, ệnh nhân hiếu u c c

ộ, i iến ch u n à nh c nghiên c u ng ng TBG ng iều ị ổn hương ỏng (Koenen và cs) [35] Nhiều công nh nghiên c u ch ng inh TBG

ung ô có hể iệ hó hành ế à sừng i ế hương c ên in vitro và in vivo

TBG ung ô húc y nh nh u nh iền ế hương ng c ch ng u nh iểu ô hó Mộ ặc iể u n ọng c c ế à gốc ung ô ư c h hiện

à s nh iện h ng nguyên HLA I à hông nh iện h ng nguyên HLA II ên ề ặ ế à Tế à gốc ung ô sở hữu ặc nh iều iến i n

ịch à chống iê ở c in vitro và in vivo Ch nh ặc iể này iều iện ch

iệc gh TBG t ung ô ng iều ị ồng loài ộ số ệnh h c nh u ng ó có iều ị ỏng

The c c c c Shu à cs (2003), ộ ng những c gi s ng ế

à gốc ung ô có nguồn gốc ừ y ương (BMSC) ng iệc à ành ế hương ỏng à s s nh chúng i c c nguyên à s i [37] C c nghiên c u ư c h c hiện ên chuộ ế u ch hấy s h nh hành ô h nh nh hơn s i nhó s ng nguyên bào

s i à nhó hông s ng ế à [37] Nghiên c u này à ộ ng những nghiên c u có

ấu ốc ng iệc nghiên c u chữ ế hương ỏng ng iệc s ng c c ế à gốc

N 2004, R su à cs công ố ế u s ng ế à gốc ung ô ừ y ương ngư i ên ộ ệnh nhân nữ ị ỏng iện ộng (30% iện ch ề ặ cơ hể)

ng c ch s ng ế à gốc ng ên ề ặ ế ỏng Việc ng c c ế à gốc

ch hấy iệc chữ ành ế hương i n nh nh hơn à ch c c hơn [46] Nghiên c u

c R su cũng s ng ô h nh chuộ ể nh gi hiệu u iều ị TBG

ung ô Kế u cũng ch hấy có s gi hâ nhi ế à à s ng sinh

ch u à ô h ở ổn hương [39]

Nhiên c u c Shu à cs (2003) s ng TG ung ô iều ị ổn hương ỏng ên chuộ Kế u ch hấy u nh iền ế hương iến iển nh nh hơn à ô h ư c nh n hấy ng c c ế hương ỏng c chuộ [37]

N 2012, Ricc n à cs nghiên c u i ò c TBG ô ỡ có nguồn gốc hân có h n ng à iền ế hương ỏng c hơn nguồn gốc ị ài [4]

T c gi Xue à cs nghiên c u s c ộng c TBG ung ô ề s c i hiện chữ ế hương ỏng ên ô h nh chuộ Họ h hiện ng s chữ ành

ế hương ề ặ ư c ng ốc ng ể, à ọng ư ng cũng như h ộng

ư c hồi h c ở những c n chuộ ư c iều ị ng TBG ung ô [4]

Theo Hyoju Kim và cs (2012) nghiên c u iều ị ng se công suấ

hấ i cấy gh TBG ô ỡ ên chuộ h y i n ịch Nhó c gi ch ng s

ế h này ng cư ng h n ng c ế à ề iểu hiện gen à s ài iế c c c yếu ố ng ưởng à h iển ế à hông u àng y hể, giú ng ng ể số

ư ng n ng ông à uyến nh n [4]

Sheng-Ping Huang và cs n 2013, nghiên c u ên chuộ S

gue-D w ey ị gây ng chù i iện s u ó ư c iều ị ng gh TBG ô

ỡ K ch hư c ế hương s u hi iều ị nhỏ hơn ng ể s u 3 uần T c gi ch

ng ế à gốc ỡ có iên u n i s h iển c c c ch u i Như y,

s ng ế à gốc ung ô ừ ô ỡ như ộ nhân ố ung gi n ng iệc ch

h iệu sinh học giú iền c c ế hâu h u hu [4]

Tháng 9/2014 Xu W và cs iệ hó ế à gốc ung ô ừ ô ỡ hành ế

à ng nguyên à s i ể iều ị ế hương ở h nh u n [30]

Có nhiều nghiên c u s ng TBG trung mô ng iều ị, ỗi ộ nghiên

c u có c ch h c à hương h khác nhau V y hiệu u c c ần gh TBG trung mô trong iều ị ế hương cũng h c nh u, có c gi ùng hối ế à iê

à ế hương, có c gi hun hỗn ịch ế à ên ế hương nhưng cũng có c

gi nuôi cấy ế à gốc ung ô ên gi ỡ à gh à ề ặ ế hương Mặc ù

y c c nghiên c u ề ch ế u hấy õ hiệu u c iệc ng TBG trung mô

ng iều ị ế hương [4]

1.3 POLY β – HYDROXYBUTYRATE (PHB)

T ng những n gần ây, c c y e sinh học ư c ng ng ộng i

ng i sống chúng có nhiều ưu iể hơn s i y e ừ hó ầu: hông chỉ

ng ư c nhu cầu c n ngư i à còn hân hiện i ôi ư ng có h n ng hân h y sinh học hông s n h gây ộc Số ư ng y e sinh học ư c

s n uấ ngày càng nhiều à chúng i ừ nhiều nguồn nguyên iệu h c nh u Có

hể ể ến c c ng như yes e ư c s n sinh ừ i sinh , ys cc i nhiên,

y e sinh học ổng h ặc iệ à c c yes e Cơ chế hân h y c c y e này ch yếu c ộng c enzy e à i sinh ch s n h cuối cùng à CO2,

h e n, nư c, c c h chấ ô cơ h ặc sinh hối Cơ chế này ư c ng c c

h nghiệ chu n ng h i gi n c ịnh h n nh iều iện hân h y [12]

T ng số c c y e sinh học ư c ổng h ừ i sinh thì PHA (poly

hy y n e) à c c ng c nó ư c iế ến nhiều nhấ PHA ư c h hiện ởi Beijerinck (1888) s u hi u n s ư i nh hiển i PHA là polyester ị hân h y ồng hân, có c c c c ơn hân hy y n ic ci , ch nh nh i công h c cấu ổng u à

Hình 1.3 Công thức cấu tạo tổng quát của PHA

(nguồn http://www.rheothing.com)

Phân PHA iển h nh có x = 1000 – 30 000 ơn ị ặ i i n = 1 PHA

ư c ch ũy ng ế à c nhiều ài i hu n G ương à G â như là nguồn ữ c n à n ng ư ng hi gặ iều iện môi ư ng sống ư hừ

nguồn c n à hiếu ộ ài nguyên ố inh ƣỡng nhƣ ygen, ni gen, phosphorus, sulfur, magnesium PHA ồn i ƣ i ng c c h iêng iệ ng ế

à , có h ng 5 -13 h ng ộ ế à , ỗi h có ch hƣ c h ng ừ 0,2 – 0,5 µ S u hi ƣ c ch chiế hỏi ế à , c c PHA hể hiện c c nh chấ chung ặc ƣng nhƣ hông ộc h i, hông n ng nƣ c, ƣơng h ch sinh học c ,

có h n ng hân h y, à những nh ƣ nhiệ có hể i s ng [1]

PHA ị hân h y h àn àn ởi c c c nhân sinh học nhƣ i hu n, nấ , enzyme Qúa trình hân h y PHA y ng c c iều iện hiếu h h ặc yế h , hân cắ y e hành c c ơn hân, s u ó iế c chuyển hó ởi hệ enzy e c

i sinh s n h cuối cùng à CO2 và H2O

V i c c ặc nh ƣơng nh uyển hống à ƣu hế: có hể s n uấ số

ƣ ng n ừ c c iệu i chế, cung cấ n ng ƣ ng ch nhu cầu c ế à , nh hân h y sinh học, PHA ƣ c ng ng nhiểu ng y học, nông nghiệ và công nghiệ

Có h ng 150 i PHA h c nh u ƣ c ghi nh n, ng ó, ng chú ý nhấ

à PHB ( y β – hydroxybutyrate) PHB ƣ c hấy ần ầu iên ở Bacillus

megaterium ởi Lemoigne (1923) Từ ây, c c nghiên c u ung à PHB ần

ƣ c u n â , nhấ à ề c c nghiên c u ề c c ch c n ng c nó [47]

1.3.1 Cấu trúc hóa học của PHB:

PHB có c c ơn hân à β - hy y u y ic ci nối i nh u ng iên ế

es e giữ nhó hy y c ơn hân này i nhó c y c ơn hân ế

iế V i công h c hó học (C4H6O2)n, công h c cấu chung c PHB nhƣ s u:

Hình 1.4 Cấu trúc hóa học của PHB

1.3.2 Các đặc tính hóa lý của PHB

Phân ƣ ng ung nh c PHB ộng ừ 100 000 - 800.000 Da PHB hông n ng nƣ c Đây ch nh à iể h c iệ c PHB s i c c i polyme sinh học h c, hầu hế ị n ng nƣ c h ặc nh y i ộ

Kh n ng huếch n y ƣơng ối , ây ch nh à ộ ƣu hế ể s ng PHB à ng h c h , h n chế s y hó gây hƣ hối h c h

PHB hông ị h h y cấu úc ởi i UV nhƣng i n ng ung ôi hữu cơ nhƣ ch f , e hy ene ch i e, 1,2 - dichloroethane

Có nh ƣơng h ch sinh học c , hông gây ộc ch cơ hể ở ng y e cũng nhƣ ng ơn hân D ó, PHB ấ h ch h ể ng ng ng nh c y học

PHB có nh chịu nhiệt i nhiệ ộ nóng ch y à 1750C à nhiệ ộ h y inh hóa là 150C PHB có ộ ền c , có hể chịu c c ng h ng 40M , ƣơng ƣơng

S s nh ộ ài ặc nh giữ PHB à PP – ộ i nh ổng h ừ ầu

hỏ ư c s ng ộng i T ng hầu hế c c ặc nh h PHB ều ố ng h ặc ố hơn c c i nh ư c ổng h ng hó học Tuy nhiên, i ặc nh hân h y

h àn àn ởi c c c nhân sinh học s u ộ h i gi n ngắn, s n h cuối cùng hông gây ộc cho ôi ư ng, c n ngư i nên PHB ng hu hú nhiều s u n â như ộ i iệu i ể h y hế những s n h ng ng hữu ch

1.3.3 Nguồn thu nhận PHB

PHB ư c h hiện ần ầu iên ở i hu n Bacillus megaterium ởi

Lemoigne và cs n 1923 Tuy nhiên ối u n â ặc iệ ề PHA à PHB chỉ

h s ắ ầu ch i hi M c e à Wi ins n (1958) u n s hấy ch ng B

megaterium s n sinh PHB nh nh ng ôi ư ng ch ỷ ệ g uc se à ni gen

c à hân h y nh nh hi ôi ư ng hiếu inh ưỡng Ch ến n y PHB ư c

iế ến có hể ổng h ởi nhiều i sinh h c nh u ên nhiều ối ư ng h c nhau

C c nhó i hu n nhiên iển h nh có hể ổng h PHB như Rastonia

eutropha, Azotobacter vinelandil, Protomonas extorquens, Pseudomonas oleovorans, T ng ó, Rastonia eutropha ư c nghiên c u nhiều ề u nh ổng

h PHB có h n ng s ng nhiều nguồn c n h c nh u ( ừ g uc se) Hiệu

suấ ổng h PHB trên ch ng h ng i Rastonia eutropha H16 c nhấ ên

ôi ư ng có nguồn c n à f uc se Tuy nhiên, hi ư à s n uấ , iệc s

ng nguồn nguyên iệu à f uc se à ch gi hành c s n h ấ c

Để ng hiệu suấ ổng PHB, c c nghiên c u iế he hành công ng

iệc iến ổi gen ch ng ộ iến như Rastonia eutropha NCIMB 11599,

Rastonia eutropha SH - 69 (ATCC 17697), Alcaligenes sp AK201, Rastonia eutropha NCIMB 11599 hiện ư c s ng à nguồn i sinh s n uấ PHB

hương i h n ng s ng g uc se ể s n uấ PHB, ch ũy PHB ên i 76% sinh hối, gi chi h s n uấ gi hành g uc se ẻ hơn f uc se

Đ số c c ch ng h ng i ng nhiên có chu nh sống ài nên h i

gi n nuôi cấy ể hu nh n s n h PHB âu T ng c c ch ng h ng i hư ng có

u nh hân h y PHB nhiên y ồng h i h c hệ enzy e c ế à vi

hu n h c hiện à gi hiệu suấ ổng h PHB Tấ c c c yếu ố ên à ch iệc hu nh n PHB ừ c c ch ng h ng i hiệu u D ó, s ng c c ch ng

i hu n i ổ h ng gen ổng h PHB i ỉ ệ c ồng h i không có quá

nh hân h y PHB nhiên ng ế à à ộ gi i h gi ng hiệu suấ hu

nh n PHB Nhƣ ch ng Rastonia eutropha i ổ h ng e n iểu hiện gen

h C, h A, h B có hể ng hiệu suấ ổng h PHB ên ến 33 - 40% sinh hối ế

bào, ch ng Alcaligenes latus ƣ c chuyển gen h C có hể ng hiệu suấ ổng h

lên 50 - 65% sinh hối ế à Tuy nhiên, ể hắc h c ấn ề hó y gi i ế à

ng hu nh n s n h , c c nhà h học nhiều ch ng E.coli i ổ h

ng gen ổng h PHB ừ Rastonia eutropha, ồng h i ch ng i ổ h E.coli

cũng hông mang gen hân h y PHB nên h n chế ƣ c u nh hân gi i PHB

nhiên Có hể ể i ch ng E coli XL1-B ue ổng h 88,8g/ PHB (81% sinh hối)

ng 42h, ch ng E.coli IM109 ổng h 85% sinh hối…

Bảng1.3 Các chủng khuẩn tham gia sản xuất PHB quy mô công nghiệp [28]

Ng ài s ng i hu n, c c nhà nghiên c u còn c c ài sinh c

c có hể ổng h PHB ng i ổ h gen nhƣ Saccharomyces cerevisiae, h c

, côn ùng Tuy hiệu suấ ch ũy PHB chƣ c nhƣng ch hấy có h n ng hu PHB ừ những ối ƣ ng này

Để ế à E coli i ổ h có h n ng ổng h PHB, i ƣ c hiế

ế ể iến n à ế à h i ng ấ c c c gen c chu nh PHB T ng hi ó,

ở nấ en Saccharomyces cerevisiae n ghi nh n có s ổng h PHB i

s i ƣ c hiế ế chỉ gắn hê gen PHB syn h se (phaC) ừ Rastonia eutropha

Tuy hiệu suấ ổng h còn hấ ( 0,5% s i sinh hối hô), iều này ƣ c ý

gi i có hể h nh yếu c h i enzy e β-ketothiolase và acetoatyl – CoA-

e uc se nội sinh c ế à nấ en C c nghiên c u ng ƣơng i sẽ ung

gi ng h nh c h i enzy e nội sinh này ể nâng c hiệu suấ ổng h PHB

ừ nấ en

S iểu hiện gen phaC c Rastonia eutropha hi ƣ c chuyển n à ế

à côn ùng ƣ c ghi nh n ên nhiều ài sâu c ắ c i s u 60 gi i

i u h có h ng 50% ein ng ế à à PHB syn h se

Th c ng à ối ƣ ng ƣ c chú ý ể chuyển gen hể iến n có h

n ng ổng h PHB Nếu hành công h ừ nguồn nguyên iệu à CO2, H2O à n ng

ƣ ng ặ i, h c có hế ồng hó à ổng h PHB D ó, gi hành c s n

h sẽ gi i ng ể Hiện n y, gen PHB ƣ c nghiên c u iểu hiện rên mô

hình cây Arabidopsis thaliana à ộ số cây nông nghiệ h c

1.3.4 Các nghiên cứu ứng dụng PHB

V i các ặc nh ƣu hế nhƣ: có h n ng hân h y nh nh ởi c c c nhân sinh học, chịu nhiệ c à u nh h y hân c c ơn hân (D) - 3 – hyd y u y ic ci , PHB ch yếu ƣ c ng ng ng 3 nh c: y ƣ c, nông nghiệ à công nghiệ s n uấ Tuy nhiên, gi hành s n h còn h

PHB còn ư c ùng như nguồn ci hữu cơ iề n ng ng ch n nuôi Những chuỗi ci ngắn (SCFAs) ư c s ng như chấ h ng hu n à iể

s sinh học i ng ch n nuôi β-hydroxy-SCFA huộc PHB ư c nh n hấy hân gi i ch ng ô iển à ci này h ộng như à c nhân iể s sinh học chống i ệnh [23]

S ương h ch sinh học c PHB có hể ng ng ng s n h ch sóc

da [5]

Mộ số ng ng h c c PHB ng y ư c ó à: à ỏ ọc những i huốc cần ùng i iều ư ng h y ổi ừ ừ ng cơ hể nó có h n ng iêu h y

ần ần ng cơ hể; à g c, chỉ h u hu iêu, h y hế h nối ng iều ị

g y ương, ng ch u… [26] V i c ch iể h n ng c ô ế

à ộng hi ùng chỉ y học à ừ PHB so i h n ng c ơ à chỉ c gu

Kế u ch hấy chỉ này hông gây ng i n ịch i ô gh [38]

Đặc iệ ng ỹ hu ô, iệu ư c ừ PHB có nhiều ưu iể hơn

s i si ic ne - ộ y e uyền hống ư c ch ng gây ệnh ung hư d a trên 5 iểm chính: có nh ương h ch sinh học c ối i cơ hể ngư i như ặc

iể h nh ng, cấu úc ề ặ , hó học c iệu, ương h ch i ôi ư ng

mô, ng ưởng và liên kết tế bào, giúp tế à ng ưởng , th m thấu chất dinh ưỡng, phân h y sinh học hông ộc, nên ư c nghiên c u ng d ng ng h u

T nh ương h ch sinh học c PHB ng in vitro ư c c ịnh ở c c ôi

ư ng nuôi cấy h c nh u i c c òng ế à nguyên à s i, TBG trung ô, ế

à ương, ế à y ương, ế à ương h s n, ế à iểu ô, ế à cơ ơn,

ế à g n… N 1990, R s y à công s iến hành iể nh ương h ch sinh học c PHB i ế à h n hỉ AGMK à FRLK4 h iển ên àng PHB trong 3-60 ngày Kế u ch hấy PHB hông nh hưởng ến s h iển à s

sống só c c c ế à ng suố u nh nuôi cấy ế à C c ế à hông hơi nhi i ấ ỳ yếu ố h huộc y e nà gồ c c s n h c u nh hân h y y e Độc nh ừ àng PHB ng cùng iều iện nuôi cấy cũng

ư c iể Bổ sung PHB à ôi ư ng nuôi cấy cũng hông nh hưởng ến

s h iển và ng sinh c ế à Chỉ số ộc nh ư c nh n à h ng 0,84

ch hấy ng PHB hông ộc h i V y, PHB à có nh chấ ương h ch sinh học

à ơ ề ặ sinh học ch iệc nuôi cấy ế à in vitro [25,49]

T nh ương h ch sinh học c PHB in vivo ư c c ịnh u iệc cấy àng

PHB à ư i Ph n ng ô i c c àng PHB có ọng ư ng hân h c

nh u (300, 450, 1000, 150 D ) cấy ư i ương ối hấ à hông có h c iệ

i c c ấ h y inh ( h n ng ư i ) Ch hấy ộ ương h ch sinh học c c màng PHB in vivo, ế u này ư c ô ng nhiều ài o [49]

Ngày 24.12.1999, viện ỹ hu Y Kh (Bộ Y ế, Liên ng Ng ) cấ giấy ch ng nh n ộc nh (số 388-99) ch ng nh n PHB à c c s n h ừ nó trong các ng ng à y ế như iệu ương h ch sinh học à hông ộc h i,

hể iê ư c Điều này cũng ư c hẳng ịnh ng ộ nghiên c u h c gần

ây, ng ó ế à gốc ỡ có h n ng nh, ng ưởng à ng sinh ố ên gi

ỡ c gen y I ốn à nguyên iệu có iểu hiện nh ương h ế à uyệ i à

có hể ư c s ng như ư c ng công nghệ ô Việc nuôi cấy in i c c ế

à gốc ỡ ên ệ àng ối i ỏ ế à à gi ỡ ci hy u nic iên ế

ch cũng ư c ô C c ế à ế nh ên ệ àng ối ư c húc y h

n ng ng sinh à h n ng sống, ng h ó, c c ế à hông ế nh ng ge

ci hy u nic iên ế ch i ng h n ng iệ hó A n à cộng s ô

c ch nuôi cấy ế à gốc ỡ ên gi ỡ Fi i à Chi s n à ch hấy c c ế à

gốc ỡ ngư i cấy ên c c ng gi ỡ này có c ng húc y u nh iền ế hương à chúng ng iệ hó hành nguyên à s i, ế à nội ô à ế à iểu

ô c ô ư c hôi h c Hiện i, chư hấy ài iệu nà công ố ến ấn ề nuôi cấy TBG ô ỡ ên nền PHB [4]

T ên cơ sở ó PHB h hẹn có hể ế h cùng TBG ô ỡ ở hành ộ nguyên iệu i u n ọng ng hỗ iều ị ặc iệ ng iều ị ỏng

PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

 Đối tượng nghiên cứu:

- TBG ung ô ừ ô ỡ có số BV103-37 ư c cung cấ ừ Trung tâm Nghiên c u Y Dư c học Quân S , Học iện Quân y à s n h c ề ài số: 21/2012/HĐ-ĐTĐL Học iện Quân y ch ư c s ng à ối ư ng h nghiệ nuôi cấy ên àng PHB

- Bộ y e sinh học PHB à s n h ề ài số: ĐTĐL2012 G/35 ư c

s ng làm nguồn iệu ể àng PBH nuôi cấy ế à

 Động vật thí nghiệm:

Chuộ cống ắng hỏe nh, iêu chu n h nghiệ , ọng ư ng 150-200g do

B n ch n nuôi, Phòng T ng ị ỹ hu , Học iện Quân y cung cấ

Thỏ ch ng Orytolagus cuniculus, hỏe nh, iêu chu n h nghiệ , ọng

ư ng 1,8-2,2 g, ông ư , ắ ng, h u ôn hô, i i h ộng nh hư ng, iện Vệ Sinh Dịch T T ung Ương cung cấ

Động s ng ng nghiên c u ư c nuôi ưỡng ng iều iện hòng

h nghiệ 5 ngày ư c hi ư c h nghiệ , chuộ ư c n h c n theo tiêu chu n h c n ch ộng nghiên c u

 Hóa chất sinh phẩm, vật tư tiêu hao và thiết bị nghiên cứu:

H : ôi ư ng nuôi cấy ế à gốc ý hiệu MSC (do Trung

â Nghiên c u Y Dư c học Quân s , Học iện Quân y cung cấ ), kháng sinh, Trypsin-EDTA 0,25%, FBS, nư c cấ , PBS 1X (Gibco-Invitrogen, Mỹ), ung ịch nhuộ ế à Trypan blue, Giemsa, Cồn 96, Focmandehit (Sigma, Mỹ), e i

nh 100 20 , P e 6, 12, 24 giếng (C ning, Mỹ) và c c hó chấ ư iêu hao khác

ều ư c cung cấ ừ c c h ng có uy n, iêu chu n hân ch

Dụ ụ í dụ ro : T ấ CO2 (Nui i ),

hú Bi i , nh hiển i ngư c O y us IX83 (O y us, Nh B n), nh hiển

i ngư c (Leic , Đ c), nh -80, -20, 4oC, ể ổn nhiệ , cân iện , máy xét

nghiệ sinh h ộng (Bi sys e s 350, Tây n Nh ), y ế hồng, ch cầu ộng (Swe h , Th y iển), ộ ng c ổ ộng cỡ nhỏ (E e es , P is n),

ơ i iê (iBalance 211, Mỹ), máy ly tâm (Hettich- Đ c), ng c gây ỏng

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Nuôi cấy tế bào

Để nguồn ế à số ư ng à nuôi cấy ư c ế à ên nền àng PHB

M u ế à gốc có ý hiệu BV103-37 ư c nuôi cấy ng nh có ôi ư ng MSC (do Trung tâm Nghiên c u Y Dư c học Quân s , Học iện Quân y cung cấ )

ư c ổ sung 10% FBS, 1% h ng sinh, nuôi cấy ở nhiệ ộ 37C, 5% CO2 C c ế

à ư c gi i ông h ặc s u hi ế à ng sinh à che h h ng 80% iện ch

ề ặ nuôi cấy, iến hành cấy chuyển nuôi cấy ng sinh iế à ộ hần ư c nuôi cấy ên àng PHB ( àng PHB ư c hấ ô ùng ở 1210C, h i gi n15 hú )

sẽ ư c iến hành h nghiệ à gi hể nuôi TBG ô ỡ ể àng PHB 1% ở hể ch nà ch ế u ng sinh TBG ô ỡ ố nhấ à ộ hần ư c

2.2.3 Phương pháp tạo màng PHB

PHB ộ ư c, ư c h s ở c c ỷ ệ, nồng ộ h c nh u T ư c hế

ổ ch f à nh ịnh c úng ch Chuyển ch f à chai Schott (yêu cầu nhẹ nhàng nh ổ ung ịch ng ài) Ch c ừ à ng chai Schott, ồng h i ổ sung PHB, s u ó huấy ở ốc ộ 500 / à nhiệ ộ 70oC trong vòng

30 hú Khi hấy PHB n h ổ sung hê PHB à à iế c huấy ở ốc ộ

500 / ở 70oC ng 40 hú Tiế he n huấy ung ịch à ể nguội ở nhiệ ộ hòng ến hi nhiệ ộ h ng 30oC ến 35oC iế c huấy gi nhiệ ở 70oC trong òng 30 hú , ồi ể nguội ung ịch ng nhiệ ộ hòng ến h ng 30oC ến

35oC Đổ ung ịch ng chai Schott u à ng eche Bỏ c ừ à à huấy nhẹ, ổ ung ịch à ống ng ến hể ch cần h nghiệ Đổ ung ịch

ng ống ng à e i S u hi ổ ng y nắ i Ch y hơi chlorofo nh, nh chuyển ộng ng úc ể y hơi ( nh ể ị sh c nhiệ ) Thu ư c àng PHB

0-4 iể M c ối c h ng iể à 0-4

Đ nh gi ế u : S u hi ch iể c ộ ổn hương (A à B) Lấy ung

nh c 2 iể này (Ký hiệu C) Nêu C ừ 0 - 2 h u h yêu cầu Nếu C>2

h u h hông yêu cầu

2.2.5 Phương pháp nghiên cứu hiệu quả ghép màng tế bào điều trị vết thương thực nghiệm

2.2.5.1 Quy trình nghiên cứu thực nghiệm

Chuộ Cống ắng 12 c n:

Dùng àng nghiên c u (n=12): ư c gây ỏng, cắ ọc h i chi hành 2 vùng : Vùng A ( ên i): ắ àng TBG - PHB, vùng B (bên ph i) ắ àng PHB không có TBG

 Thiế ế nghiên c u ên uy nh hổ iến iều ị ỏng ên ngư i hiện

+ Đ nh gi nh ng chung: nh gi nh ng àn hân, cân nặng chuộ ,

c c nghiệ công h c u, sinh hó u: AST (GOT), ALT (GPT), C e inin, glucose

+ Đ nh gi i chỗ: Nh n nh ng chung c ế hương, ch hư c

ế hương, ấy u cấy hu n, ấy u ô à iêu n, ch nh nghiên c u

Ngày h 10 (D5), ngày h 15 (D10), ngày h 20 (D15), c c h hu , c c

ỹ hu à c c công iệc ặ i như D0

Khi ế hương hỏi: iế c nuôi chuộ ể nh gi nh ng sẹ

2.2.5.2 Phương pháp gây bỏng thực nghiệm

Đặ y nh à ùng chu n ị ên chuộ , h i gi n 10 giây

S u hi gây ỏng, ùng ổn hương có àu ắng c, ung u nh ế ỏng ung huyế àu hồng nh

Vị ỏng: ỗi chuộ gây 2 ế hương ỏng ở ùng ưng, uy ư c à ùng

A ế hương ên h i ể nghiên c u gh ấ àng ế à , ùng B ế hương ên

i ể ối ch ng ắ àng PHB hông có ế à

Hình 2.2 Hình ảnh chuột đã được gây bỏng (A) và Vết gây bỏng của chuột (B)

2.2.5.3 Thay băng chăm sóc vết thương

Th y ng ý ế hương ư c iến hành hàng ngày he uy nh

- Gây ê chuộ ng Ke ine iê ắ iều

- Cắ ọc ổ ch c h i , ấy ỏ c c ị , ịch chiế , ịch

- R ế hương nhiều ần ng nư c uối sinh ý 0,9%, ec e in 1%

- S ùng ành u nh ế hương ng Be ine 10%, ch 5 hú ,

ế hương ần cuối ng nư c uối sinh ý 0,9%

- Thấ hô ế hương, ch nh nghiên c u

- Từ ngày h nhấ ến ngày h n , ắ huốc chống nhi hu n

si i in c 2 ùng A à B

- Từ ngày h 5 (D0) gh ấ ế à ên ùng A, ắ àng PHB hông có

ế à ên ùng B