Đây là lý do nhóm nghiên cứu đặt mục tiêu kết hợp combretastatin, một hợp chất kháng ung thư, và celecoxib, một chất kháng viêm theo cơ chế COX2, là các chất bắt nguồn ch[r]
Trang 1CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-
NGUYỄN THỊ THÚY HẰNG
NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM, KHÁNG UNG THƯ CÁC HỢP CHẤT LAI COXIB – COMBRETASTATIN
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC
Người hướng dẫn khoa học: 1.PGS TS Ngô Quốc Anh
2 PGS.TS Vũ Đình Hoàng
HÀ NỘI - 2020
Trang 2Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS TS Ngô Quốc Anh PGS TS Vũ Đình Hoàng
Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3:
Luận án sẽ được bảo vệ tại hội đồng chấm luận án cấp Nhà nước tại Học Viện Khoa học và Công nghệ
Vào hồi
Có thể tìm thấy luận án tại:
- Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ
- Thư viện Quốc gia
Trang 3MỞ ĐẦU
1 Tính cấp thiết của luận án
Ung thư là một nhóm các bệnh liên quan đến việc phân chia tế bào một cách vô tổ chức và những tế bào đó có khả năng xâm lấn những mô khác bằng cách phát triển trực tiếp vào mô lân cận hoặc di chuyển đến nhiều vị trí khác nhau (di căn) Theo thống kê của tổ chức Ung thư toàn cầu GLOBOCAN năm
2018 hiện cả nước có hơn 300.000 người sống chung với ung thư, có 164.671
ca mới, 114.871 người tử vong do bệnh này Toàn cầu hiện có khoảng 23 triệu người mắc, trong đó mỗi năm có hơn 14 triệu người mắc mới và 8 triệu 2 trăm nghìn người tử vong Tổ chức Y tế thế giới (WHO) xếp Việt Nam nằm trong 50 nước thuộc top 2 của bản đồ ung thư
Việc nghiên cứu tìm ra thuốc điều trị ung thư lại ít tác dụng phụ là một trong những hướng luôn được giới khoa học quan tâm Trong số các phương pháp điều trị hiện nay, hóa trị liệu là một phương pháp điều trị ung thư sử dụng một hoặc nhiều thuốc kháng ung thư - gây độc tế bào Một trong các loại thuốc chống ung thư, được sử dụng ngày nay trong hóa trị liệu, tác động đến chu kỳ tế bào để ức chế sự phát triển của tế bào ung thư và sau đó gây ra sự chết tế bào theo chương trình (apoptosis)
Các hướng dẫn điều trị triển vọng thường khuyến nghị kết hợp nhiều loại thuốc chống ung thư hoạt động trên nhiều cơ chế khác nhau Ngày nay, nghiên cứu khám phá ra các loại thuốc nhắm vào nhiều mục tiêu đang được chú ý, với mong muốn kết hợp các mục tiêu phân tử khác nhau trên duy nhất một tác nhân hóa học Những ưu điểm của phân tử lai so với sự kết hợp của nhiều loại thuốc
có thể cải thiện các hạn chế về kỹ thuật, phản ứng phụ và sự kháng thuốc của một mục tiêu riêng lẻ [1] Một trong những nhóm chất chống ung thư quan trọng nhất là các phân tử liên kết tubulin Mặc dù một số loại thuốc nhắm mục
Trang 4tiêu vi ống đã được sử dụng trong lâm sàng, nhưng vẫn cần tìm kiếm các tác nhân mới có thể khắc phục những hạn chế về sự kháng thuốc và các tác dụng phụ không mong muốn của các liệu pháp hiện tại [3]
2 Mục tiêu của luận án
1 Thiết kế được cấu trúc các hợp chất lai coxib - combretastatin
2 Tổng hợp được các hợp chất lai coxib - combretastatin
3 Sàng lọc được các hoạt tính kháng ung và kháng viêm của các hợp chất lai
4 Xác định được cơ chế kháng viêm và kháng ung thư của các hợp chất lai
5 Tiến hành docking phân tử hợp chất lai coxib - combretastatin với hai đích tác dụng COX2 và tubulin
3 Những nội dung nghiên cứu chủ yếu của luận án
- Nghiên cứu tổng hợp các hợp chất dị vòng lai hóa combretastatin và celecoxib
- Nghiên cứu tổng hợp các hợp chất dị vòng 4 aza- podophyllotoxin
Trang 5CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
Tổng quan trình bày chung về các hợp chất kháng ung thư theo cơ chế ức chế tubulin, sơ lược về cơ chế tubulin Nhóm các hợp chất theo cơ chế tubulin vẫn luôn là đề tài đáng được quan tâm trong lĩnh vực nghiên cứu thuốc chống ung thư Các hợp chất combretastatin có những hoạt tính sinh học phong phú đã được ứng dụng trong điều trị một số căn bệnh ung thư, chúng được biết đến với hoạt tính gây độc tế bào theo cơ chế ức chế trùng hợp tubulin tại vị trí colchicin [2] Cho đến nay những hợp chất điều trị ung thư theo cơ chế này vẫn đang được ứng dụng rộng rãi và luôn là một hướng nghiên cứu nhận được nhiều sự quan tâm
- Tổng quan về các hợp chất combretastatin, thuộc lớp chất cis-stilben,
một nguồn phong phú của các hợp chất dẫn đường trong việc tìm kiếm các loại thuốc mới, các hợp chất điển hình như resveratrol và combretastatin A-4 phosphat hiện đang được thử nghiệm để điều trị bệnh Alzheimer và ung thư trên lâm sàng Các stilben mới được phân lập gần đây đã cho thấy có nhiều hoạt tính sinh học đa dạng, bao gồm tính chống oxy hóa, kháng khuẩn, chống sốt rét, gây độc tế bào, bảo vệ gan và chống viêm Combretastatin A-4 (CA4) cũng được xem là tác nhân gây độc tế bào tiềm năng do ức chế mạnh sự trùng hợp vi ống bằng cách gắn vào điểm gắn kết của colchicin trên tubulin CA-4 có độc tính cao trên nhiều mô hình tế bào ung thư, do vậy nó là một cấu trúc mục tiêu hiện đang rất được quan tâm
- Tổng quan về Pyrazol là các dị vòng có năm cạnh tạo thành một nhóm các hợp chất đặc biệt hữu ích trong tổng hợp hữu cơ Chúng là một trong những nhóm hợp chất được nghiên cứu nhiều nhất trong họ azol Pyrazol được báo cáo qua các tài liệu hiện có và SAR cho thấy, nó là cần thiết cho việc thiết kế các chất ức chế chọn lọc COX2 Một trong các hợp chất quan trọng và thông dụng
Trang 6nhất trong các hợp chát pyrazole được ứng dụng trong thương mại đó là celecoxib, một chất được biết đến với hoạt tính kháng viêm mạnh, là thuốc ức chế chọn lọc COX2 thông qua hoạt động của prostaglandin gây ra trong quá trình viêm và đau mà không tác dụng lên các prostaglandin COX1 có tác dụng bảo vệ đường tiêu hóa Hơn nữa Celecoxib ức chế cả sự tăng sinh trên mô hình
in vitro tế bào ung thư vú ở người như MCF7 và MDAMB-231 Một số nghiên
cứu chỉ ra rằng celecoxib và các hợp chất liên quan có thể gây ra sự bắt giữ chu
kỳ tế bào ở giai đoạn G0 /G1 dẫn đến tế bào chết theo chu trình apotosis, ức chế
sự phát triển của khối u và ngăn chặn sự hình thành mạch của khối u khi không
có sự hiện diện của COX2
Qua đó có thể thấy các hợp chất lai hóa combretastatin celecoxib là những lớp chất đầy hứa hẹn vẫn còn mới về mặt phát triển cấu trúc cũng như hoạt tính sinh học góp phần xây dựng chung cho những công trình nghiên cứu mới tìm kiếm các loại thuốc kháng ung thư trong ngành hóa dược
Trang 7CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1 Hóa chất và thiết bị
2.1.1 Hóa chất và dung môi
2.1.2 Thiết bị nghiên cứu
2.2 Các phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Phương pháp tổng hợp hữu cơ
2.2.3 Phương pháp thử hoạt tính sinh học
2.3 Tổng hợp các hợp chất lai coxib- combrestatin
2.3.1 Tổng hợp các dẫn chất este của chất lai este coxib - combretastatin
Hình 2.2 Tổng hợp dẫn chất este của hợp chất lai hóa coxib - combrestatin
(i) Kiềm: t-BuOLi (3 mmol, 3 eq), đun hồi lưu, (ii) Ethyl chlorooxoacetate (1 mmol, 1 eq) (77), 5 ml THF; (iii) HCl (4 mmol); đun hồi lưu, 5 ml C2H5OH khan; phenylhydrazin (1 mmol, 1 eq) (78)
Tổng hợp được 20 chất lai dang lai hóa dạng este của coxib - combretastatin là các chất từ 79 đến 98
2.3.2 Tổng hợp hợp chất lai coxib - combrestastatin chứa nhóm CF 3
Hình 2.5 Tổng hợp hợp lai hóa coxib - combretastatin chứa nhóm CF3(a) 100 (1.0 mmol), 99 etyl trifluoroacetat (1,2 eq) và NaH (2,5 eq) trong THF (5 mL), 6 h (b), EtOH (5 mL), axit (1.0 eq); arylhydrazin hydrochlorid 78 (1.0 mmol) được thêm liên
tiếp vào cặn và hồi lưu trong 6 giờ Chất 102 được phân lập qua sắc ký cột
Trang 82.3.3 Tổng hợp các dẫn chất axit của hợp chất lai hóa coxib - combrestatin
Hình 2.8 Tổng hợp khung lai ghép combretastatin và coxib dạng axit
(i) Kiềm: t-BuOLi (3 mmol, 3 eq), đun hồi lưu, (ii) Ethyl chlorooxoacetate (1 mmol, 1 eq), 5 ml THF; (iii) HCl (4 mmol); đun hồi lưu, 5 ml C2H5OH khan;
phenylhydrazin (1 mmol, 1 eq) (78) Sản phẩm thu được sau phân lập qua sắc
ký cột được hòa tan trong hệ dung môi THF/MeOH/H2O = 3:1:1, sau đó NaH (1,2 eq) được thêm vào hỗn hợp Thực hiện phản ứng trong 3h thu được chất lai
hóa dạng axit 103-122
Tổng thành công 20 chất lai dang lai hóa dạng axit của combretastatin-coxib là
các chất từ 103-122
2.5 Thử nghiệm hoạt tính sinh học các hợp chất nghiên cứu
Các hợp chất đã tổng hợp được tiến hành sàng lọc hoạt tính kháng ung thư vú MCF7, ung thư đại tràng HT-29, ung thư biểu mô gan Hep-G2 và ức chế sản sinh NO
Trang 9CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Những ưu điểm của việc sử dụng một phân tử lai so với việc đồng thời kết hợp nhiều loại thuốc riêng lẻ có thể cải thiện các hạn chế về phản ứng phụ
và sự kháng thuốc [107] Tuy có hoạt tính nổi trội, nhưng combretastatin vẫn còn nhiều những tác dụng không mong muốn Đây là lý do nhóm nghiên cứu đặt mục tiêu kết hợp combretastatin, một hợp chất kháng ung thư, và celecoxib, một chất kháng viêm theo cơ chế COX2, là các chất bắt nguồn cho các hợp chất lai mới với hy vọng tìm ra những chất mang các đặc điểm hoạt tính sinh học lý thú như kháng ung thư và kháng viêm của chất gốc đồng thời
ít gây tác dụng phụ
3.1 Thiết kế cấu trúc và hoạt tính sinh học của phân tử lai
3.1.1 Thiết kế cấu trúc phân tử lai
Nghiên cứu đã áp dụng chiến lược lai ghép để lai hóa các nhóm dược lý quan trọng của hai hợp chất gốc celecoxib và CA4 trong một phân tử duy nhất Vòng pyrazole được thay thế bởi 1,2-diphenyl của khung celecoxib như một
cấu trúc tương tự như cis-1,2-diphenylethylene trong CA4 Sự thay thế liên kết
đôi bằng vòng 5 đã được khẳng định về mặt hoạt tính gây độc tế bào và ức chế
tubulin [108] Các hợp chất bị khóa dạng cấu hình cis này thể hiện một số lợi ích như ngăn chặn quá trình đồng phân hóa từ dạng cis thành trans, giúp tăng
độ đặc hiệu của hoạt chất này với các mục tiêu tế bào và cải thiện tiềm năng điều trị của nó Sự hiện diện của các nhóm trimethoxybenzene của CA4 cũng là cần thiết cho hoạt tính độc tế bào [76] Chúng tôi đặc biệt quan tâm đến việc duy trì nhóm sulfonamid hoặc các đặc điểm liên quan đến celecoxib vì điều này dường như dẫn đến việc bảo tồn được tính chọn lọc COX2 của chất lai thu được [109] Tác dụng ức chế COX2 nếu có sẽ góp phần vào tổng thể hoạt động chống khối u của các phân tử lai mới
Trang 10Hình 3.1 Cấu trúc của celecoxib, Combretastatin A4 và hợp
chất lai combretastatin – coxib
3.1.2 Thiết kế hoạt tính sinh học phân tử lai
Tác dụng gây độc tế bào của những hợp chất này chống lại ba dòng thế bào ung thư ở người HT-29, Hep-G2, MCF-7 cũng như ức chế sản sinh NO bằng cách kích hoạt lipopolysaccharide (LPS) tế bào đại thực bào RAW 264.7 Vai trò của NO trong khối u rất phức tạp, nó có vai trò kích thích hoặc ức chế quá trình tế bào tùy thuộc vào điều kiện, vì vậy sự ức chế sản sinh NO không liên quan trực tiếp đến độc tính tế bào Nhưng NO thể hiện một loạt các đặc tính dược lý có ích tương tự như prostaglandin trên hệ tim mạch bao gồm sự giãn mạch, sự ức chế kết tập tiểu cầu và sự điều hòa các mảng bám của bạch cầu vào thành mạch [110] Hơn nữa, việc sử dụng celecoxib trong phòng chống ung thư vú và các khối u ác tính đã bị hạn chế bởi các tác dụng phụ của nó, đặc biệt là nguy cơ biến chứng của tim mạch liên quan chủ yếu đến khả năng giảm sản sinh prostacyclin PGI2 [111] Nhờ đó có thể thấy sự duy trì sản sinh NO cùng với những đặc tính ức chế COX2 của celecoxib có thể giúp tránh nguy cơ biến chứng tim mạch, do vậy một chiến lược nhằm thiết kế một loạt phân tử đa
Trang 11đích bằng cách kết hợp ức chế chọn lọc COX2 với các hoạt động phụ thuộc nitric oxide (NO) đã được triển khai [112-114]
Trong quá trình viêm nhiễm, các tế bào miễn dịch được kích hoạt như đại thực bào tiết ra một số chất trung gian gây viêm như cytokine tiền viêm, oxit nitric (NO) và prostaglandin E2 (PGE2) Hơn nữa, có một mối liên quan rõ ràng giữa mức độ prostaglandin trong các khối u vú ở người với sự phát triển của di căn và khả năng sống sót [115] Prostaglandin E2 tồn tại với nồng độ cao trong các khối u vú và ở những thể trạng ung thư di căn, khi thiếu thụ thể estrogen và progesterone [116-117] Do đó, khả năng ức chế sản xuất PGE2 có thể được coi là một chiến lược tốt trong việc thiết kế các chất chống ung thư Tuy nhiên, các tế bào ung thư vú MCF7 sản sinh mức PGE2 rất thấp theo báo cáo khác [109] Do đó, hiệu lực hoạt tính của các hợp chất lai đã được thử nghiệm đáp ứng viêm gây ra bởi LPS thay bằng ức chế PGE2 trên MCF7 [118]
Do vậy, các dòng tế bào ung thư HT-29, Hep-G2, MCF-7 và khả năng ức chế sản sinh NO được lựa chọn là các công cụ bước đầu sàng lọc hoạt tính kháng viêm của lớp chất nghiên cứu Và để xác định được cơ chế kháng viêm
và kháng ung thư của các chất lai, nghiên cứu hoạt tính ức chế sản sinh PGE2, các phương pháp phân tích chu kỳ tế bào, các phương pháp nghiên cứu hoạt tính gây apoptosis nhờ nhuộm nhân tế bào với Hoechst 33342, nghiên cứu hoạt tính gây apotosis bằng chỉ thị caspase ‑ 3, nghiên cứu cảm ứng apoptosis bằng phương pháp trắc lưu tế bào nhuộm FITC-anexin V và PI Sau cùng, các chất
đã được chọn lọc và nghiên cứu cơ chế sinh học sẽ được thử nghiệm tương tác với các đích tác dụng tubulin và COX2 bằng phương pháp docking phân tử để
khẳng định độ chính xác hoạt tính sinh học của mô hình in vitro
3.2 Tổng hợp các hợp chất lai coxib - combretastatin
Trang 12Phương pháp một bình phản ứng đã được áp dụng để điều chế các dẫn chất etyl 1,4,5-triaryl-1H pyrazole-3-cacboxylat từ ethyl oxalyl chlorid, 1,2-
diarylethanon và ethyl oxalyl chlorid arylhydrazin hydrochlorid (Hình 2.1,
Hình 2.2, Hình 2.7, Hình 2.8) [109] Phản ứng ngưng tụ Claisen giữa hai thành
phần 1,2-diarylethanon và ethyl oxalyl chloride với tác nhân kiềm sử dụng là
tert-BuOLi, thu được sản phẩm trung gian muối lithium của ethyl
2,4-dioxo-3,4-diarylbutanoat, phản ứng được tiếp tục với arylhydrazin hydrochlorid thông qua phản ứng Knorr được xúc tác bởi axit clohydric để tạo ra triarylpyrazole-3-
cacboxylat (hợp chất lai 79 đến 98) và (hợp chất lai 103 đến 122) Một chu
trình điều chế dạng dẫn chất của celecoxib cũng được áp dụng (Hình 2.4, Hình
2.5) 3,4,5-trimethoxyphenyl - 1,1,1-trifluoro-2,4-butanedion (43, 102) thu được
từ sự ngưng tụ Claisen giữa các dẫn xuất acetophenon và etyl trifluoroacetat sau
đó tiếp tục phản ứng với muối halogenua 4-sulfamidophenyl hydrazin để tạo thành 3,4,5-trimethoxyphenyl, một chất có cấu trúc tương tự celecoxib
Theo các quy trình phản ứng được mô tả trong Hình 2.1, Hình 2.2, 20 hợp
chất lai coxib - combretastatin –đã được tổng hợp thành công với hiệu suất từ
64 – 83% (Bảng 3.1) 02 hợp chất chứa nhóm CF3 với hiệu suất lần lượt là 95% 78% (bảng 3.2) 20 hợp chất dạng axit của chất lai coxib - combretastatin với
hiệu suất từ 54 – 74 % ( bảng 3.3); các chất được xác định cấu trúc bằng các
phương pháp tinh chế và phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR 1D, 2D
Trong số các hợp chất lai thu được, các chất 79 đến 98 và 102 đến 122 lần
đầu tiên được tổng hợp và chưa từng được công bố trước đây Và 01 hợp chất
đã được công bố và cũng được dùng như một chất so sánh là celecoxib (43)
được biết đến với nhiều công trình nghiên cứu [78-79]
3.3 Hoạt tính sinh học các hợp chất lai coxib - combretastatin
Trang 133.3.1 Sàng lọc hoạt tính sinh học các hợp chất lai coxib - combretastatin
Sàng lọc hoạt tính của 20 hợp chất lai hóa coxib - combretastatin dạng este
và 02 chất lai chứa nhóm CF 3
Độc tính tế bào của 20 hợp chất lai hóa coxib dạng este và 02 hợp chất chứa nhóm CF3 đã được đánh giá về tỷ lệ ức chế sự phát triển tế bào trên ba
dòng HT-29, Hep-G2 và MCF-7 bằng phương pháp được phát triển bởi Monks
và cộng sự [120] Kết quả được tóm tắt trong Bảng 3.4 theo hoạt tính giảm dần
Các hoạt tính chống tăng sinh của celecoxib thể hiện trên các tế bào ung thư ở người như ung thư vú (MCF-7), ung thư gan (Hep-G2) ung thư trực tràng (HT-29) đã được công bố [121-123] Trong phạm vi công trình nghiên cứu này 12
hợp chất lai hóa mới 102, 96, 81, 82, 94, 93, 91, 92, 89, 90, 97, 85 thể hiện độc tính tế bào trên các dòng MCF-7 mạnh hơn celecoxib và năm hợp chất 102, 96,
81, 82, 94 có IC50 < 10 µM Trong đó một số các hợp chất như 102, 96, 94, 93
và 97 cũng có độc tính Hep-G2 tương đương với chất gốc celecoxib (65) Hơn
nữa, 05 hợp chất lai 96, 94, 90, 97, 80 cho thấy khả năng chống lại tế bào
HT-29 mạnh hơn 3-6 lần so với chất gốc celecoxib và hợp chất 90 có IC50 10 µM Qua đó có thể khẳng định, sự hiện diện của các nhóm thế chứa nitơ, halogen tại
vị trí para- của cả hai vòng phenyl liền kề 96, 93, 91, 92, 97 góp phần làm tăng độc tính tế bào Hợp chất 102 mang đầy đủ các đặc điểm cấu trúc của khung
celecoxib và CA4 cho thấy hoạt tính gây độc tế bào nổi trội với dòng MCF-7
21 hợp chất và celecoxib (65) cũng được thử tác dụng ức chế oxit nitric (NO)
khi kích hoạt lipopolysaccharide (LPS) trên đại thực bào RAW 264.7 [124]
Điều thú vị là, ngoại trừ các hợp chất 102 và 98 có hoạt tính kép mạnh nổi trội
đối với việc ức chế sản xuất NO cũng như hoạt động gây độc tế bào trên dòng
tế bào ung thư MCF-7, các hợp chất khác trong nhóm này thể hiện hoạt động ức