Thông tin tóm tắt về những đóng góp mới của luận án tiến sĩ: Nghiên cứu cải thiện khả năng mang thuốc chống ung thư cisplatin của chất mang nano dendrimer

- Các hệ chất mang và các phức PAMAM dendrimer G3.5-Cisplatin, G3.5- PNIPAM-Cisplatin-5FU và G4.0-PAA-Cisplatin thể hiện khả năng giảm độc tính của thuốc chống ung thư Cisplatin đồng th[r]

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ

CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

NGUYỄN NGỌC HÒA

NGHIÊN CỨU CẢI THIỆN KHẢ NĂNG MANG THUỐC CHỐNG UNG THƯ CISPLATIN CỦA

CHẤT MANG NANO DENDRIMER

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHOA HỌC VẬT LIỆU

TP HỒ CHÍ MINH – 2020

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ

CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHOA HỌC VẬT LIỆU

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

1 GS TS NGUYỄN CỬU KHOA

2 PGS TS TRẦN NGỌC QUYỂN

TP HỒ CHÍ MINH – 2020

LỜI CAM ĐOAN

Công trình được thực hiện tại phòng Vật liệu Hóa dược - Viện Khoa học Vật liệu ứng dụng - Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam tại Thành phố Hồ Chí Minh và phòng thí nghiệm Trung tâm Công nghệ Việt Đức - trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm Thành phố Hồ Chí Minh Tôi xin cam đoan đây

là công trình nghiên cứu của tôi và được sự hướng dẫn khoa học của GS TS Nguyễn Cửu Khoa và PGS TS Trần Ngọc Quyển Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực, được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi và các kết quả của nghiên cứu này chưa được dùng cho bất cứ luận văn cùng cấp nào khác

Tác giả luận án

Nguyễn Ngọc Hòa

LỜI CÁM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Nguyễn Cửu Khoa và PGS

TS Trần Ngọc Quyển, đã dành cho tôi sự động viên giúp đỡ tận tình và những định hướng khoa học hiệu quả trong suốt quá trình thực hiện luận án này

Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi của Học viện Khoa học và Công nghệ, Khoa Khoa học vật liệu và Năng lượng, Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng đối với tôi trong quá trình thực hiện luận án

Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi của trường Đại học Công Nghiệp Thực phẩm TP Hồ Chí Minh đối với tôi trong quá trình thực hiện luận án

Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ tận tình của bạn bè, sự động viên, tạo điều kiện của những người thân trong gia đình trong suốt quá trình tôi hoàn thành luận án này

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Mục tiêu của luận án 2

Ý nghĩa khoa học của luận án 3

Đóng góp mới của luận án 4

Chương 1 TỔNG QUAN 6

1.1 Giới thiệu dendrimer 6

1.1.1 Khái niệm và phân loại 6

1.1.2 Tính tương hợp sinh học của dendrimer 10

1.1.2.1 Độc tính tế bào in vitro của dendrimer 11

1.1.2.2 Độc tính tế bào in vivo của dendrimer 12

1.1.3 Phương pháp tổng hợp dendrimer 12

1.1.3.1 Các phương pháp tổng hợp 13

1.1.3.2 Tổng hợp dendrimer polyamidoamine 14

1.1.4 Các phương pháp xác định tính chất của dendrimer 17

1.1.5 Ứng dụng của dendrimer trong trị liệu 18

1.1.5.1 Hoạt tính trị liệu của dendrimer 18

1.1.5.2 Cải thiện độ hòa tan của thuốc 19

1.1.5.3 Dendrimer dùng vận chuyển thuốc qua da 20

1.1.5.4 Dendrimer dùng vận chuyển thuốc uống 20

1.1.5.6 Dendrimer vận chuyển gen 21

1.1.5.7 Dendrimer vận chuyển vaccine 22

1.2 Thuốc chống ung thư chứa Platin 22

1.2.1 Cisplatin 22

1.2.1.1 Tính chất của Cisplatin 22

1.2.1.2 Cơ chế tác động của Cisplatin đối với tế bào 24

1.2.1.3 Cơ chế kháng thuốc Cisplatin 27

1.2.1.4 Độc tính của Cisplatin 28

1.2.2 Sử dụng Cisplatin để điều trị ung thư 29

1.2.3 Các thuốc chống ung thư khác có chứa Platin 31

1.2.4 Điều trị kết hợp Cisplatin với các thuốc ung thư khác 32

1.2.5 Các hệ chất mang thuốc Cisplatin 33

1.2.5.1 Liposome mang thuốc Cisplatin 35

1.2.5.2 Viên nang nano chứa phức Cisplatin phủ lipid 36

1.2.5.3 Các polymer mang các thuốc chứa platin 37

1.2.5.4 Ống nano carbon mang thuốc Cisplatin 38

1.2.5.5 Polymer mixen mang thuốc platin 39

1.2.5.6 Hệ chất mang dendrimer - platin 41

1.3 Polymer nhạy nhiệt - poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) 45

1.4 Polymer nhạy pH - Poly Acrylic Acid (PAA) 46

Chương 2 NGHIÊN CỨU 48

2.1 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 48

2.1.1 Nội dung nghiên cứu 48

2.1.2 Phương pháp nghiên cứu 48

2.2 Thực nghiệm 50

2.2.1 Hóa chất 50

2.2.2 Dụng cụ và thiết bị 51

2.3 Phương pháp thực nghiệm 53

2.3.1 Tổng hợp PAMAM dendrimer đến thế hệ G4.5 từ tâm ethylenediamine

(EDA) 53

2.3.2 Tổng hợp phức PAMAM dendrimer G3.0, G4.0 với Cisplatin 56

2.3.3 Tổng hợp phức PAMAM dendrimer G2.5, G3,5, G 4.5 với Cisplatin 57

2.3.4 Tổng hợp phức PAMAM dendrimer G2.5, G3,5, G 4.5-Cisplatin SA (có sử dụng siêu âm) 58

2.3.5 Tổng hợp PAMAM dendrimer G 3.0 biến tính với PNIPAM 59

2.3.6 Tổng hợp PAMAM dendrimer G 3.5 biến tính với PNIPAM 60

2.3.7 Tổng hợp phức PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM với Cisplatin 61

2.3.8 Tổng hợp PAMAM dendrimer G3.0 biến tính với PAA 63

2.3.9 Tổng hợp PAMAM dendrimer G4.0 biến tính với PAA 64

2.3.10 Tổng hợp phức PAMAM dendrimer G3.0-PAA, PAMAM dendrimer G4.0-PAA với Cisplatin 64

2.3.11 Thử nghiệm khả năng mang thuốc 5-FU của phức PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM-Cisplatin 65

2.3.12 Xác định hàm lượng Pt bằng phương pháp ICP-MS 66

2.3.13 Khảo sát giải phóng thuốc in vitro 67

2.3.14 Nang hóa và giải phóng thuốc 5-FU 67

2.3.15 Động học và dược động học giải phóng thuốc 68

2.3.16 Kiểm tra độc tố tế bào 70

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 72

3.1 Tổng hợp PAMAM Dendrimer các thế hệ G-0.5 đến G4.5 72

3.1.1 Xác định cấu trúc các dendrimer PAMAM dựa vào phổ khối lượng MS 72 3.1.2 Xác định cấu trúc các dendrimer PAMAM dựa vào phổ 1H-NMR 73

3.2 Phổ FTIR các sản phẩm phức của PAMAM dendrimer với Cisplatin 80

3.2.1 Phổ FTIR PAMAM Dendrimer G2.5, G3.5, G4.5 và phức G2.5-CisPt,

G3.5-CisPt, G4.5-CisPt 80

3.2.2 Phổ FTIR của phức PAMAM Dendrimer G3.0-Cisplatin, G4.0-Cisplatin 83 3.3 Phổ FTIR của phức G3.0-PAA với Cisplatin 85

3.4 Phổ FTIR của phức G4.0-PAA-Cisplatin 86

3.5 Kết quả phổ 1H-NMR PAMAM G3.0 và G 3.5 biến tính với PNIPAM 87

3.6 Kết quả 1H-NMR PAMAM G3.0 biến tính với PAA 90

3.7 Kết quả 1H-NMR PAMAM G4.0 biến tính với PAA 91

3.8 Kết quả đo hàm lượng Pt 92

3.8.1 Kết quả đo hàm lượng Pt của phức PAMAM dendrimer thế hệ chẵn-Cisplatin 93

3.8.2 Kết quả đo hàm lượng Pt của phức PAMAM dendrimer thế hệ lẻ– Cisplatin (không thủy phân) 93

3.8.3 Kết quả đo hàm lượng Pt của phức PAMAM thế hệ lẻ– Cisplatin (thủy phân) 94

3.8.4 Kết quả đo hàm lượng Pt của các phức G3.0-PAA-Cisplatin và G4.0-PAA-Cisplatin (thủy phân) có sử dụng siêu âm 96

3.9 So sánh khả năng mang thuốc Cisplatin của các hệ chất mang trong điều kiện không thủy phân và có thủy phân Cisplatin 96

3.10 Thử nghiệm khả năng mang đồng thời hai thuốc 5-FU và Cisplatin của hệ chất mang PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM 98

3.11 Kết quả đo TEM, DLS và thế zeta 100

3.12 Kết quả và bàn luận khả năng giải phóng thuốc in vitro 106

3.12.1 Khả năng giải phóng thuốc của phức PAMAM thế hệ lẻ - Cisplatin (thủy phân) 106

3.12.2 Khả năng giải phóng thuốc 5-FU và Cisplatin của hệ chất mang hai thuốc G3.5-PNIPAM-Cispaltin – 5FU 109

3.12.3 Khả năng giải phóng thuốc Cisplatin của hệ chất mang PAMAM dendrimer

G4.0-PAA 111

3.13 Động học quá trình giải phóng thuốc Cisplatin 112

3.14 Dự đoán mô hình dược động học của các hệ mang thuốc 115

3.15 Kết quả và bàn luận khả năng gây độc tế bào 117

3.15.1 Kết quả và bàn luận khả năng gây độc tế bào ung thư phổi NCI-H460 của hệ chất mang PAMAM G4.5 117

3.15.2 Kết quả và bàn luận khả năng gây độc tế bào của hệ chất mang G4.0-PAA 117

3.15.3 Kết quả và bàn luận khả năng gây độc tế bào của hệ chất mang PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM mang hai thuốc cispaltin và 5-FU 122

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 124

KẾT LUẬN 124

KIẾN NGHỊ 126 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 Độc tính gây ra do điện tích bề mặt dendrimer [6] 12

Bảng 1.2 Điều trị phối hợp Cisplatin và các loại thuốc ung thư khác [35] 33

Bảng 1.3 Các hệ chất mang liposome – platin [60] 35

Bảng 2.1 Các hóa chất tinh khiết dùng trong nghiên cứu thực nghiệm 51

Bảng 3.1 Khối lượng phân tử các dendrimer PAMAM dựa vào phổ MS 73

Bảng 3.2 Kết quả tính toán KLPT Dendrimer theo 1H-NMR 80

Bảng 3.3 Phổ FTIR PAMAM Dendrimer G2.5, G3.5, G4.5 và phức G2.5-CisPt, G3.5-CisPt, G4.5-CisPt 82

Bảng 3.4 Kết quả phổ FTIR của PAMAM dendrimer G3.0, G4.0 và phức G3.0-Cisplatin, G4.0-Cisplatin 83

Bảng 3.5 Phổ FTIR của G3.0-PAA và phức G3.0-PAA-Cisplatin 85

Bảng 3.6 Phổ FTIR của G4.0-PAA và phức G4.0-PAA-Cisplatin 86

Bảng 3.7 Số nhóm PNIPAM gắn vào G3.0 và ước lượng KLPT 89

Bảng 3.8 Hàm lượng Pt phức PAMAM thế hệ chẵn - Cisplatin (không thủy phân) 93

Bảng 3.9 Hàm lượng Pt phức PAMAM thế hệ lẻ - Cisplatin (không thủy phân) 93

Bảng 3.10 Hàm lượng Pt trong phức G2.5-Cisplatin, G3.5-Cisplatin và G4.5-Cisplatin 94

Bảng 3.11 Hàm lượng Pt trong phức G3.0-PAA-Cisplatin (thủy phân) và G4.0-PAA-Cisplatin (thủy phân) 96

Bảng 3.12 Khả năng mang thuốc Cisplatin (không thủy phân) của các hệ chất mang PAMAM dendrimer 97

Bảng 3.13 Khả năng mang thuốc Cisplatin (thủy phân) của các hệ chất mang PAMAM dendrimer 98

Bảng 3.14 Kết quả nang hóa 5-FU vào phức G3.5-PNIPAM-Cisplatin 99

Bảng 3.15 Kết quả giải phóng thuốc in vitro của các phức PAMAM dendrimer:

G2.5-Cisplatin, G3.5-Cisplatin và G4.5 - Cisplatin 107Bảng 3.16 Khảo sát khả năng giải phóng thuốc 5FU của hệ chất mang G3.5-PNIPAM-CisPt và PNIPAM-CisPt 110Bảng 3.17 Kết quả giải phóng thuốc Cisplatin của hệ chất mang PAMAM dendrimer G4.0-PAA 111Bảng 3.18 Giá trị AIC và R2

hc theo từng mô hình động học của các hệ mang thuốc Cisplatin tại pH 5,5 và pH 7,4 113Bảng 3.19 Các thông số dược động học của các hệ mang thuốc Cisplatin 116

Bảng 3.20 Độc tính tế bào in vitro của Carboxylate PAMAM dendrimer G4.5,

Cisplatin và phức chất PAMAM G4.5-Cisplatin 117

Bảng 3.21 Độc tính tế bào in vitro của PAMAM G4.0-PAA, Cisplatin và phức

chất PAMAM G4.0-PAA-Cisplatin 118Bảng 3.22 Tỷ lệ (%) gây độc tế bào ung thư vú MCF-7 của các mẫu 122

Bảng 3.23 Độc tính tế bào in vitro của PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM, 5-FU

và PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM-CisPt-5FU 123

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu tạo phân tử Dendrimer 6

Hình 1.2 Cấu trúc phân tử của Random Hyperbranched, dendrigraft, dendron và dendrimer 7

Hình 1.4 Dendrimer cầu nối N và dendrimer cầu nối aryl 8

Hình 1.5 Dendrimer với tâm NH3 (a) và tâm BDA (b) 9

Hình 1.6 Tổng hợp divergent theo mô hình tạo nhánh 1→2 9

Hình 1.7 Tổng hợp divergent theo mô hình tạo nhánh 1→3 10

Hình 1.8 Tương tác sinh học giữa tế bào với dendrimer có điện tích bề mặt khác nhau [9] 10

Hình 1.9 Sơ đồ tổng hợp dendrimer theo phương pháp divergent 13

Hình 1.10 Tổng hợp dendrimer bằng phương pháp covergent 14

Hình 1.11 Tổng hợp dendrimer bằng phương pháp tăng lũy thừa hai 14

Hình 1.12 Công thức phân tử của G3.0 PAMAM dendrimer 15

Hình 1.13 Phản ứng tổng hợp dendrimer PAMAM G -0.5 16

Hình 1.14 Phản ứng tổng hợp dendrimer PAMAM G 0 16

Hình 1.15 PAMAM dendrimer G 1.0 16

Hình 1.16 PAMAM dendrimer G 2.0 17

Hình 1.17 Các phương pháp xác định tính chất của dendrimer 18

Hình 1.18 Cấu trúc của dendrimer SPL7013 (MW 16.581 Da) 19

Hình 1.19 Dendrimer vận chyển DNA tới màng tế bào 21

Hình 1.20 Cấu tạo của Cisplatin 22

Hình 1.21 Một số loại thuốc chống ung thư Platin đã được chấp thuận đưa vào sử dụng 24

Hình 1.22 Quá trình hình thành và tác động của phức Pt-DNA đối với tế bào 25

Hình 1.23 Sơ đồ tạo phức và tác động của phức Pt-DNA đối với tế bào 26

Hình 1.24 A-Cisplatin; B-Carboplatin; C-Oxaliplatin; D-Ormaplatin; 31

E-Enloplatin 31

Hình 1.25 Các hệ chất mang khác nhau hiện đang được phát triển tiền lâm sàng và lâm sàng 34

Hình 1.26 Các hệ liên hợp thuốc polymer - platin 38

Hình 1.27 Hệ chất mang polymer mixen mang thuốc platin 39

Hình 1.28 Sơ đồ tổng hợp phức PAMAM dendrimer thế hệ chẵn – Pt2+ 43

Hình 1.29 Sơ đồ phản ứng tổng hợp phức PAMAM G 3.5-Cisplatin 43

Hình 1.30 Công thức cấu tạo của PNIPAM-COOH 45

Hình 1.31 Các polymer nhạy pH có chứa các nhóm acid 47

Hình 2.1 Sơ đồ tổng hợp PAMAM dendrimer 53

Hình 2.2 Sơ đồ qui trình tổng hợp các PAMAM dendrimer thế hệ lẻ 54

Hình 2.3 Sơ qui trình tổng hợp các PAMAM dendrimer thế hệ chẵn 56

Hình 2.4 Sơ đồ tổng hợp phức PAMAM G3.0-Cisplatin và PAMAM G4.0-Cisplatin 57

Hình 2.5 Sơ đồ qui trình tổng hợp phức PAMAM dendrimer G2.5, G3.5, G4.5-Cisplatin có và không sử dụng siêu âm 59

Hình 2.6 Sơ đồ quy trình tổng hợp G3.0-PNIPAM 60

Hình 2.7 Sơ đồ quy trình tổng hợp PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM 61

Hình 2.8 Sơ đồ quy trình tổng hợp phức PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM-CisPt 62

Hình 2.9 Sơ đồ qui trình tổng hợp PAMAM dendrimer G3.0-PAA và G4.0-PAA 63

Hình 2.10 Sơ đồ qui trình tổng hợp phức PAMAM dendrimer G3.0-PAA-Cisplatin và PAMAM dendrimer G4.0-PAA-G3.0-PAA-Cisplatin 65

Hình 3.1 Cấu trúc PAMAM Dendrimer các thế hệ 72

Hình 3.2 Phổ 1H-NMR của PAMAM Dendrimer các thế hệ từ G-0.5 đến G4.5 79 Hình 3.3 Phổ FTIR của PAMAM dendrimer G2.5, G3.5, G4.5 và phức G2.5-Cisplatin, G3.5-G2.5-Cisplatin, G4.5-Cisplatin 81

Hình 3.4 Phổ FTIR của PAMAM dendrimer G3.0, G4.0 và phức G3.0-Cisplatin, G4.0-Cisplatin 84

Hình 3.5 Phổ FTIR của G3.0-PAA và phức G3.0-PAA-Cisplatin 85

Hình 3.6 Phổ FTIR của G4.0-PAA và phức G4.0-PAA-Cisplatin 86

Hình 3.7 Phổ 1H-NMR của chất mang nano G3.0-PNIPAM (tỉ lệ mol 1:8) 87

Hình 3.8 Kết quả GPC của G3.0-PINIPAM (1:8) 89

Hình 3.9 Phổ 1H-NMR của G3.5-PNIPAM 90

Hình 3.10 Phổ 1H-NMR PAMAM dendrimer G3.0 biến tính với PAA (tỉ lệ mol 1:12) 90

Hình 3.11 Phổ 1H-NMR PAMAM dendrimer G 4.0 biến tính với PAA (tỉ lệ mol 1:16) 92

Hình 3.12 Đường chuẩn xác định hàm lượng Pt 93

Hình 3.13 Ảnh TEM phức PAMAM dendrimer thế hệ lẻ - Cisplatin 100

Hình 3.14 Ảnh TEM mẫu PAMAM dendrimer G3.0, PAMAM dendrimer G3.0-PNIPAM và DLS mẫu PAMAM dendrimer G3.0-G3.0-PNIPAM 101

Hình 3.15 Ảnh TEM của mẫu PNIPAM-Cisplatin và DLS mẫu G3.5-PNIPAM-Cisplatin và mẫu G3.5-PNIPAM-Cisplatin 102

Hình 3.16 Ảnh TEM của PAMAM dendrimer G4.0 (A), G4.0-PAA (C) và DLS của PAMAM dendrimer G4.0 (B), G4.0-PAA (D) 102

Hình 3.17 Ảnh TEM của hệ PAMAM dendrimer G3.0-PAA-Cisplatin và PAMAM dendrimer G4.0-PAA-Cisplatin 103

Hình 3.18 Thế zeta của hệ chất mang G3.0-PAA (tỉ lệ mol 1:12) tại các giá trị pH khác nhau: a pH 7,4; b pH 7,0 và c pH 5,5 104

Hình 3.19 Thế zeta của hệ chất mang G4.0-PAA (tỉ lệ mol 1:16) thay đổi theo pH:

a pH 7,4; b pH 7,0 và c pH 5,5 105Hình 3.20 Thế zeta của hệ chất mang G4.0-PAA (tỉ lệ mol 1:8) thay đổi theo pH:

a pH 7,4; b pH 7,0 và c pH 5,5 105Hình 3.21 Độ tan của các hệ chất mang phụ thuộc vào pH dung dịch 106

Hình 3.22 Khảo sát giải phóng thuốc Cisplatin in vitro của hệ chất mang PAMAM

G2.5, PAMAM G3.5 và PAMAM G4.5 trong môi trường đệm PBS pH 7,4 và đệm ABS pH 5,5 107Hình 3.23 Lượng Cisplatin giải phóng theo thời gian khỏi các hệ chất mang PAMAM dendrimer trong môi trường đệm pH 5,5 và pH 7,4 108Hình 3.24 Biểu đồ giải phóng thuốc 5-Flourouracil (5-FU) ở môi trường pH 7,4

và pH 5,5 tại nhiệt độ 37oC 111Hình 3.25 Biểu đồ giải phóng thuốc Cisplatin ở môi trường pH 7,4 và pH 5,5 112Hình 3.26 Mô hình giải phóng thuốc Korsmeyer-Peppas của các hệ mang thuốc Cisplatin tại pH 5,5 và pH 7,4 114Hình 3.27 Nồng độ Cisplatin (dự đoán) trong plamsa 115

Hình 3.28 Thử nghiệm in vitro độc tế bào trên dòng tế bào MCF-7 với các chất

mang khác nhau (PAMAM G4.0, PAMAM G4.5 và G4.0-PAA) (A) Đánh giá khả năng sống của tế bào MCF-7 khi thêm PAMAM dendrimer G4.0, PAMAM dendrimer G4.5, G4.0-PAA và DMEM nồng độ 100 ppm trong 48 giờ, bằng kính hiển vi huỳnh quang (B) Nhuộm kép (AO/EB) đã được áp dụng để xác định các

tế bào sống, chết theo chương trình apoptosis sớm (E)/muộn (L) (tương ứng màu xanh lá cây và màu cam/vàng) và hoại tử (N, màu đỏ) 119Hình 3.29 Tỷ lệ sống sót của nguyên bào sợi người khi xử lý với các hệ mang thuốc PAMAM dendrimer G4.0, PAMAM dendrimer G4.5, PAMAM dendrimer G4.0-PAA, Camptothecin (kiểm soát dương tính) và PBS 1X (kiểm soát âm tính)

ở cùng nồng độ (100 ppm) 120

Hình 3.30 Hình ảnh huỳnh quang thu được từ kính hiển vi đồng tiêu huỳnh quang

- các nguyên bào sợi được nhuộm bằng acridine cam (AO) và ethidium bromide (EB) 121

DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

1H-NMR Proton Nuclear Magnetic

ABS Acetate Buffer Solution Dung dịch đệm acetate

AIC Akaike Information Criterion Tiêu chuẩn thông tin Akaike ATP Adenosine triphosphate Adenosine triphosphate

AUC Area Under Curve Diện tích dưới đường cong

Diaminocyclohexane) Platinum (II)

DL% % Drug loading

Hàm lượng thuốc được nang hóa trong tổng trọng lượng chất mang

EDC

dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride

dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride

1-ethyl-3-(3-EE% % drug entrapment

Hàm lượng thuốc được nang hóa so với lượng thuốc tiền sử dụng

FTIR Fourier transform infrared

spectroscopy

Phương pháp quang phổ hồng ngoại

Chromatography

Phương pháp sắc ký thẩm thấu gel

GPX Glutathione Peroxidase Glutathione Peroxidase

HPLC High Performance Liquid

Chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HSDB Hazardous Substances Data

Bank

Ngân hàng dữ liệu các chất độc hại

ICP-MS Inductively coupled plasma

MWCO Molecular weight cut-off Molecular weight cut-off NCI-H460 NCI-H460 Human Lung

Carcinoma

Tế bào ung thư phổi của người

NER Nucleotide Excision Repair Sửa chữa DNA theo hình thức

cắt bỏ NHS N-hydroxy succinimide N-hydroxy succinimide

PAA Acid Poly acrylic Acid Poly acrylic

PAMAM

G2.0

Polyamidoamine generation 2.0

Polyamidoamine generation 2.0

PAMAM

G3.0

Polyamidoamine generation 3.0

Polyamidoamine generation 3.0

PAMAM

G4.0

Polyamidoamine generation 4.0

Polyamidoamine generation 4.0

PAMAM

G5.0

Polyamidoamine generation 5.0

Polyamidoamine generation 5.0

PBS Phosphate Buffered Saline Dung dịch muối đệm photphat PNIPAM Poly N-isopropylacrylamide Poly N-isopropylacrylamide PPI Poly propyleneimine Poly propyleneimine

ROS Radical oxygen species Dạng oxy hoạt động

SCLCs Small Cell Lung Cancers Ung thư phổi tế bào nhỏ

SEM Scanning Electron Microscope Kính hiển vi điện tử quét

SOD Superoxide Dismutase Superoxide Dismutase

TEM Transmission Electrons

Microscope Kính hiển vi điện tử truyền qua

UCST Upper Critical Solution

Temperature

Dung dịch có nhiệt độ tới hạn cao

UPLC Ultra Performance Liquid

Chromatography Sắc ký lỏng siêu hiệu năng

MỞ ĐẦU

Các polymer tự nhiên cũng như polymer tổng hợp luôn là đối tượng thu hút các nhà khoa học trong các lĩnh vực nghiên cứu hiện đại Các vật liệu nano polymer sinh học đang được tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện để ứng dụng trong lĩnh vực dược phẩm và y sinh học Trong số các vật liệu này, các dendrimer đã nổi lên như

là một trong những chất mang nano polymer đầy triển vọng dùng để mang các loại thuốc điều trị

Dendrimer lần đầu tiên được tổng hợp từ năm 1970-1990 bởi hai nhóm khác nhau (Buhleier và cộng sự; Tomalia và cộng sự) Ngược lại với các polymer cao phân tử mạch nhánh và thẳng thông thường, các dendrimer được kiểm soát rất chặt chẽ về cấu trúc và có các nhóm chức bề mặt có thể biến tính rất dễ dàng tùy thuộc vào mục đích sử dụng [1], [2]

Hiện nay, số lượng các công trình nghiên cứu về dendrimer được công bố ngày càng nhiều, tập trung vào khảo sát khả năng của dendrimer trong việc vận chuyển các hoạt chất sinh học khác nhau, ví dụ như: thuốc, oligonucleotide, enzyme và vaccine [3] Các dendrimer được thiết kế để vận chuyển thuốc nhằm gia tăng dược động học và phân phối sinh học của thuốc cũng như tăng cường khả năng hướng đích của thuốc Dendrimer tương tác với các phân tử thuốc bằng cách hấp phụ trên bề mặt, bằng các tương tác tĩnh điện hoặc liên kết với các nhóm chức

bề bằng liên kết hóa trị hoặc bằng cách bao gói thuốc vào các khoang trống của dendrimer Các khoang trống bên trong thường có tính chất kỵ nước, cho phép tương tác với các loại thuốc hòa tan kém Sự tồn tại của các nguyên tử nitơ và oxy trong cấu trúc bên trong của dendrimer cho phép tương tác bởi liên kết hydro với thuốc Với số lượng lớn các nhóm chức trên bề mặt của dendrimer (như amine -

NH2 và nhóm cacboxylate -COO-) cho phép gắn lượng lớn các loại thuốc khác nhau bằng tương tác tĩnh điện và vận chuyển chúng đến đích [4]

Cisplatin từ lâu được dùng trong điều trị lâm sàng các loại bệnh ung thư do khả năng gây chết tế bào ung thư của thuốc Tùy thuộc vào loại tế bào và nồng độ Cisplatin sẽ gây độc tế bào Ngoài ra, Cisplatin làm tổn thương các khối u thông qua việc tác động lên hiệu ứng gây chết tế bào apoptosis theo các phương thức

khác nhau [4], [5] Mặt khác, các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng Cisplatin gây ra nhiều tác dụng phụ như thần kinh, độc tính với thận hoặc ức chế tủy xương Hơn nữa, Cisplatin liên kết với protein và enzyme có thể gây ra việc điều chỉnh cơ chế sinh hóa của chúng Quá trình điều trị ung thư bằng Cisplatin cũng dẫn tới các tế bào ung thư có thể trở nên kháng Cisplatin và làm giảm khả năng điều trị của thuốc [5] Nhiều cơ chế kháng Cisplatin đã được nghiên cứu bao gồm những thay đổi trong sự hấp thụ tế bào, tràn dịch thuốc, tăng giải độc, ức chế quá trình chết tế bào apoptosis và tăng sửa chữa DNA

Để giảm thiểu việc kháng thuốc Cisplatin cũng như giảm độ gây độc tế bào của Cisplatin, liệu pháp tổ hợp đã được phát triển và đã chứng minh hiệu quả hơn trong điều trị bệnh ung thư Một trong các giải pháp đó là việc sử dụng các PAMAM dendrimer làm chất mang thuốc Cisplatin

Trong luận án này, chúng tôi sẽ tiếp tục cải thiện khả năng mang thuốc Cisplatin của PAMAM dendrimer trên cơ sở tăng cường nhóm chức bề mặt của dendrimer nhằm tăng khả năng mang thuốc Cisplatin của hệ chất mang này

Mục tiêu của luận án

Tổng hợp hệ vật liệu nano mang thuốc trên nền dendrimer (PAMAM) biến tính với PNIPAM và PAA tương hợp sinh học nhằm cải thiện hiệu quả mang thuốc Cisplatin

Hình 1 Cơ chế mang thuốc của PAMAM dendrimer thế hệ lẻ [6]

P

Hình 2: Cơ chế mang thuốc của hệ G4.0-PAA-Cisplatin [6]

Hình 3 Cơ chế mang thuốc của hệ G3.5-PNIPAM-Cisplatin

Ý nghĩa khoa học của luận án

Kết quả nghiên cứu của luận án cho thấy một số kết luận có ý nghĩa khoa học sau:

- Sử dụng polymer nhạy nhiệt (PNIPAM), polymer nhạy pH (PAA) làm tác nhân hướng đích trên cơ sở nhiệt độ và pH của tế bào để biến tính Dendrimer tạo

hệ chất vận chuyển thuốc đến tế bào ung thư Đặc điểm hình thái của các tế bào ung thư tạo ra khoảng không gian giữa các tế bào rộng hơn so với các mô bình thường Các phức hợp chất mang thuốc sau khi đã đi vào các khe hở tế bào này sẽ

bị giữ lại khi các tế bào ung thư phát triển Thêm vào đó, do không có hệ bạch huyết cần thiết, tốc độ đào thải các phức hợp này ra khỏi mô ung thư là rất hạn chế

Hình 4 Định hướng thụ động theo cơ chế EPR [7], [8]

- Thủy phân Cisplatin bằng AgNO3 trước khi thực hiện phản ứng tạo phức

và kết hợp sóng siêu âm trong quá trình tổng hợp phức dendrimer G2.5-Cisplatin, PAMAM dendrimer G3.5-Cisplatin, PAMAM dendrimer G4.5-Cisplatin, G3.0-PAA-Cisplatin và G4.0-PAA-Cisplatin làm tăng khả năng mang thuốc Cisplatin của các hệ chất mang

- Các hệ chất mang carboxylate PAMAM dendrimer G2.5, G3,5, G4.5, G3.5-PNIPAM và G4PAA cho thấy khả năng nhả thuốc Cisplatin chậm và ổn định

trong điều kiện in vitro

- Bước đầu thử nghiệm cho thấy hệ chất mang G3.5-PNIPAM có khả năng mang đồng thời hai thuốc chống ung thư 5-FU (20,43%) và Cisplatin (35,22%) và cũng có thể áp dụng để mang các loại thuốc khác

- Các hệ chất mang và các phức PAMAM dendrimer Cisplatin, PNIPAM-Cisplatin-5FU và G4.0-PAA-Cisplatin thể hiện khả năng giảm độc tính của thuốc chống ung thư Cisplatin đồng thời vẫn thể hiện hoạt tính ức chế hiệu quả đối với sự phát triển của tế bào ung thư và có khả năng nhả thuốc tốt hơn trong môi trường acid pH 5,5

G3.5-Đóng góp mới của luận án

- Đã tổng hợp thành công các phức PAMAM dendrimer G3.0-Cisplatin và PAMAM dendrimer G4.0-Cisplatin

pH = 7,4

pH = 5,5

- Đã tổng hợp thành công các phức PAMAM dendrimer G2.5-Cisplatin, PAMAM dendrimer G3.5-Cisplatin và PAMAM dendrimer G4.5-Cisplatin có và không có sử dụng sóng siêu âm Phương pháp tổng hợp có thủy phân Cisplatin bằng AgNO3 trước khi thực hiện phản ứng tạo phức với các nhóm carboxylate trên

bề mặt của PAMAM dendrimer thế hệ lẻ kết hợp với siêu âm làm tăng đáng kể hàm lượng Pt trong sản phẩm so với phương pháp không thủy phân Cisplatin

- Đã biến tính thành công PAMAM dendrimer G3.0 với Poly isopropylacrylamide (PNIPAM-COOH) với các tỉ lệ mol khác nhau và tổng hợp thành công hệ chất mang G3.5-PNIPAM Đã tính toán được số nhóm PNIPAM gắn vào PAMAM dendrimer G3.0 và tính KPLPT của sản phẩm dựa trên phổ 1H-NMR Bước đầu thử nghiệm cho thấy hệ chất mang G3.5-PNIPAM cho thấy khả năng mang đồng thời hai thuốc chống ung thư 5-FU (20,43%) và Cisplatin (35,22%) và cũng có thể áp dụng để mang các loại thuốc khác

N Đã biến tính thành công PAMAM dendrimer G3.0 và G4.0 với acid poly acrylic (PAA) với các tỉ lệ mol khác nhau Tính toán được số nhóm PAA gắn vào PAMAM dendrimer và tính KPLT của sản phẩm dựa trên phổ 1H-NMR Hệ chất mang G4.0-PAA với số nhóm PAA gắn lên bề mặt PAMAM dendrimer G4.0 là

15 nhóm thể hiện khả năng mang thuốc Cisplatin tốt nhất (40,44%) Phức PAA-Cisplatin có độc tố giảm so với Cisplatin tự do (có IC50 cao gấp 3 lần Cisplatin tự do) khi thử nghiệm trên dòng tế bào ung thư phổi NCI-H460 nhưng vẫn thể hiện hoạt tính ức chế hiệu quả đối với sự phát triển của tế bào ung thư và thể hiện khả năng nhả thuốc tốt trong môi trường acid pH 5,5

G4.0 Các hệ chất mang carboxylate PAMAM dendrimer G2.5, G3,5, G4.5, G3.5-PNIPAM và G4PAA cho thấy khả năng nhả thuốc chậm và ổn định trong

điều kiện in vitro

- Các hệ chất mang và các phức PAMAM dendrimer Cisplatin, PNIPAM-Cisplatin-5FU thể hiện khả năng giảm độc tính của thuốc chống ung thư Cisplatin đồng thời vẫn thể hiện hoạt tính ức chế hiệu quả đối với sự phát triển của

G3.5-tế bào ung thư

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu dendrimer

1.1.1 Khái niệm và phân loại

Khái niệm dendrimer được Donald A Tomalia và cộng sự đưa ra đầu tiên vào năm 1985 [1] Dendrimer được bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp “Dendron”, có nghĩa

là nhánh cây Từ đó đến nay có rất nhiều công trình nghiên cứu về cấu trúc, tính chất, phương pháp tổng hợp và ứng dụng của dendrimer trong nhiều lĩnh vực khác nhau [3], [9], [10], [11], [12], [13]

Dendrimer là một nanopolymer có dạng hình cầu, cấu trúc nhánh, có nhiều tính chất ưu việt hơn so với polymer mạch thẳng

Cấu tạo phân tử dendrimer gồm ba phần (hình 1.1)

Hình 1.1 Cấu tạo phân tử Dendrimer

- Một lõi (nhân hoặc core) ở trung tâm của dendrimer bao gồm (i) một nguyên tử hoặc một phân tử có ít nhất hai nhóm chức giống nhau; (ii) nhánh, phát

ra từ lõi, được lặp đi lặp lại và có nhiệm vụ liên kết nhóm ngoài cùng với nhân; và (iii) nhiều nhóm bên ngoài (nhóm anion, cation, nhóm trung tính, các nhóm ưa nước hay kỵ nước) còn gọi là nhóm bề mặt hoạt động Những nhóm bề mặt này rất quan trọng trong việc xác định các tính chất của các cao phân tử dendrimer

Các dendrimer được phân loại theo các tiêu chí sau:

(a) Theo cấu trúc hình học [3], [7], [14]

Theo cấu trúc hình học, dendrimer được phân chia thành các dạng sau: dendrgraft; dendron; dendrimer (hình 1.2)

(b) Theo nguyên tử tạo nhánh khác nhau

Theo nguyên tử tạo nhánh khác nhau thì được phân chia và gọi tên khác nhau (hình 1.3): nhánh N; nhánh aryl; nhánh C; nhánh Si; nhánh Saccharide; nhánh P;

Hình 1.2 Cấu trúc phân tử của Random Hyperbranched, dendrigraft, dendron và

dendrimer

Hình 1.3 Cấu trúc phân tử của dendrimer có nguyên tử tạo nhánh khác nhau

(c) Theo loại kết nối

Theo loại kết nối (connectivity) sẽ phân chia và gọi tên theo các loại liên kết hóa học tại vị trí kết nối (hình 1.4): cầu nối aryl; cầu nối amide; cầu nối este; cầu nối ether; cầu nối N; cầu nối O; cầu nối Si; cầu nối urea; cầu nối alkyl; cầu nối alken; cầu nối alkyn; …

(d) Theo thành phần tâm khác nhau

CN CN NC

(C 6 H 13 ) 2 N

CNCNNC CN N(C 6 H 13 ) 2

CN CN

CN

CN N(C6H13)2

CN NC CN N(C 6 H 13 ) 2

CNCNNC CN N(C 6 H 13 ) 2

NC NC CN

CN N(C6H13)2

CN NC CN N(C 6 H 13 ) 2

NC CN NC

N(C 6 H 13 ) 2

NC NC CN

CN N(C 6 H 13 ) 2

CN CN NC

(C 6 H 13 ) 2 N

NC CN NC

N(C 6 H 13 ) 2

CN CN

CN

CN (C6H13)2N

N N N

Dendrimer được phân chia theo thành phần tâm khác nhau: ví dụ tâm là

NH3, ethylenediamine (EDA), butylenediamine (BDA), Aryl, … Do các tâm có kích thước khác nhau nên các phản ứng tạo ra dendrimer sẽ bị ảnh hưởng không

gian khác nhau và do tâm có độ phân cực khác nhau nên phần không gian bên trong phân tử dendrimer cũng có độ phân cực khác nhau, do đó ảnh hưởng tới khả năng nang hóa các hoạt chất có độ phân cực khác nhau (hình 1.5)

(e) Theo mối nối tạo nhánh 1→2 và 1→3

Mô hình tạo nhánh 1→2: Đó là mô hình từ một nhánh của thế hệ trước sẽ tạo ra hai nhánh của thế hệ sau (tổng hợp divergent) Ví dụ từ nguyên tử X sẽ tách

ra thành hai nhánh Z, từ mỗi Z sẽ tiếp tục tách ra thành hai nhánh Z ở thế hệ tiếp theo (hình 1.6)

Hình 1.5 Dendrimer với tâm NH3 (a) và tâm BDA (b)

Hình 1.6 Tổng hợp divergent theo mô hình tạo nhánh 1→2

Mô hình tạo nhánh 1→3: Đó là mô hình từ một nhánh của thế hệ trước sẽ tạo ra ba nhánh của thế hệ sau Ví dụ từ nguyên tử X sẽ tách ra thành ba nhánh Y,

từ mỗi nhánh Y sẽ tiếp tục được tách ra thành ba nhánh Z ở thế hệ tiếp theo (hình 1.7)

Hình 1.7 Tổng hợp divergent theo mô hình tạo nhánh 1→3

1.1.2 Tính tương hợp sinh học của dendrimer

Các dendrimer đã được xem như là chất mang thông minh do chúng có khả năng mang thuốc vào nội bào, vượt qua các rào cản sinh học, lưu thông trong cơ thể trong thời gian cần thiết để gây ra một hiệu ứng lâm sàng và nhắm tới các mục tiêu cụ thể Độc tính của dendrimer chủ yếu gây ra bởi nhóm bề mặt của nó (hình Hình 1.8 Tương tác sinh học giữa tế bào với dendrimer có điện tích bề mặt khác

nhau [9]

1.8) Nhóm amine (-NH2) bề mặt của PAMAM và PPI dendrimer gây độc tính và chứng huyết tan (hemolysis) tùy theo nồng độ của chúng trong khi nhóm ngoài cùng là các nhóm trung tính hoặc anion có độc tính thấp hơn hoặc không độc [9]

Khả năng gây độc tế bào của dendrimer cation được gây ra bởi sự tương tác giữa các màng tế bào tích điện âm và bề mặt dendrimer tích điện dương, làm cho các dendrimer này bám vào và làm hỏng màng tế bào, gây giảm lượng tế bào Trong khi việc che các nhóm cation bề mặt hoặc chuyển đổi các nhóm bề mặt thành các nhóm trung tính hoặc anion làm cho các dendrimer có độc tính thấp hơn

hoặc thậm chí là không có độc tính trong cả nghiên cứu in vitro và in vivo, điển

hình như dendrimer trung tính: polyester, polyether và các dendrimer biến tính bề mặt: dendrimer glycosylate, PEGylate

Các tính chất sinh học của dendrimer phụ thuộc rất nhiều vào kích thước của dendrimer và các nhóm chức trên bề mặt của dendrimer và ít phụ thuộc vào cấu trúc bên trong của dendrimer Với các nhóm chức bề mặt, dendrimer có thể được biến tính để tạo ra các tính chất sinh học đặc biệt

1.1.2.1 Độc tính tế bào in vitro của dendrimer

Dendrimer có nhiều nhóm chức bề mặt và chúng cũng tích điện khác nhau Dendrimer với nhóm chức amine (-NH2) tích điện dương sẽ dính với phần âm của

bề mặt tế bào bởi tương tác tĩnh điện tạo thành “lỗ thủng” làm cho màng tế bào mất tác dụng ngăn cản và tế bào bị dung giải (coi như đã bị phá hủy) hoặc hình thành hiện tượng nhập bào (endocytosis): sẽ cho phép dendrimer thâm nhập qua màng tế bào (thông qua ẩm bào – pinocytosis) vào tế bào và phá vỡ tế bào từ bên trong

Dendrimer với nhóm chức không phân cực ví dụ nhân thơm hoặc dãy lipid trên bề mặt dendrimer cũng có khả năng làm cho tế bào bị dung giải Do lúc này lipid của dendrimer sẽ tương tác ái dầu với lớp lipid của màng tế bào và gây nên

sự phá hủy màng tế bào

Muốn giảm độc tính của dendrimer, cần thiết phải bao bọc (encapsulation) hoặc “tiêu diệt” (quenching) điện tích của nhóm amine bề mặt của dendrimer bằng

các phản ứng alkyl hóa hoặc amit hóa các nhóm amine Độ độc của dendrimer phụ thuộc nhóm chức bề mặt theo trình tự sau [6]:

-NH3+ > -Guanidyl+ > -SO3- > -PO3- > OH- > -COO- > PEG Bảng 1.1 Độc tính gây ra do điện tích bề mặt dendrimer [6]

Bề mặt dendrimer dương điện

Bề mặt dendrimer

âm điện

Bề mặt dendrimer trung tính không mang điện

Bề mặt dendrimer phân cực không mang điện

1.1.2.2 Độc tính tế bào in vivo của dendrimer

PAMAM dendrimer có nhóm amine bề mặt hoặc dẫn xuất của chúng thế hệ

G ≤ 5.0 không cho thấy dấu hiệu độc tính in vivo Tuy nhiên, PAMAM dendrimer

G7.0 có nhóm amine bề mặt gây chết 20% chuột thí nghiệm sau 24 giờ ở liều 45mg/kg Các PAMAM dendrimer G > 6.0 không được khuyến khích sử dụng trong sinh học vì độ độc cao của chúng

Nghiên cứu in vivo với dendrimer melamine cho thấy với liều lượng 160

mg/kg sẽ làm chết 100% chuột thí nghiệm sau khi tiêm 6-12 giờ

Dendrimer trên cơ sở polysine chứa nhóm bề mặt Sulfonat hoặc Carboxylat

cho thấy khả năng diệt mạnh Herpes simplex virut (HSV) và trong thử nghiệm in

vivo cho thấy không độc với nồng độ sử dụng là 10 mg/mL

Dendrimer ở thế hệ chẵn (nhóm amine bề mặt) có độc tính với tế bào (in

vivo) cao hơn so với dendrimer thế hệ lẻ (nhóm ester trên bề mặt) [6]

1.1.3 Phương pháp tổng hợp dendrimer

1.1.3.1 Các phương pháp tổng hợp

Dendrimer có thể tổng hợp bằng nhiều phương pháp như phương pháp

“tổng hợp phân kỳ” (devergent), “tổng hợp hội tụ” (convergent), “tổng hợp tăng lũy thừa hai” (double exponential), …

a Phương pháp “tổng hợp phân kỳ” (divergent) [11], [14]

Phương pháp tổng hợp dendrimer đầu tiên được biết đến là phương pháp phân kỳ Tên gọi này xuất phát từ cách thức phát triển của dendrimer từ tâm ra bên ngoài và phân nhánh vào không gian Bắt đầu từ một tâm phản ứng, một thế hệ được phát triển và sau đó là ngoại vi mới của phân tử được hoạt hóa để phản ứng với các monomer khác Qui trình trên được lặp lại cho nhiều thế hệ dendrimer khác nhau, chúng được xây dựng từ lớp này sang lớp khác (hình 1.9)

Ưu điểm của phương pháp này là có thể tổng hợp được dendrimer ở thế hệ cao Nhược điểm lớn nhất của phương pháp này là thường hay xảy ra nhiều phản ứng phụ và sản phẩm sinh ra có nhiều khuyết tật Tổng hợp các thế hệ càng cao,

số lượng phản ứng càng tăng thì khiếm khuyết của dendrimer càng nhiều Nếu phản ứng phụ xảy ra nhiều thì điều đó gây trở ngại cho việc tinh chế sản phẩm sau cùng

b Phương pháp “tổng hợp hội tụ” (convergent) [11], [14]

Phương pháp hội tụ được phát triển như là một phản ứng tổng hợp những điểm khuyết của phương pháp phân kỳ Quá trình tổng hợp theo phương pháp convergent bắt đầu từ những đơn vị bề mặt của dendrimer, cấu trúc bên trong dần dần liên kết với các đơn vị bề mặt Quá trình tổng hợp này cũng gồm hai bước: hoạt hóa và phát triển nhánh Khi các nhánh phát triển đủ lớn, một số được gắn vào tâm để được một dendrimer hoàn chỉnh (hình 1.10) Việc tinh chế các sản phẩm mong muốn tương đối dễ dàng và sự xuất hiện của các khuyết tật trong cấu trúc cuối cùng cũng được giảm thiểu Phương pháp hội tụ không cho phép hình

Hình 1.9 Sơ đồ tổng hợp dendrimer theo phương pháp divergent

thành thế hệ dendrimer cao vì các vấn đề về hiệu ứng không gian xảy ra trong các phản ứng của dendron và tâm phân tử

Hình 1.10 Tổng hợp dendrimer bằng phương pháp covergent

c Phương pháp “tổng hợp tăng lũy thừa hai” (double exponential)

Gần đây nhất bước đột phá trong việc tổng hợp dendrimer là phương pháp tăng trưởng theo cấp số nhân (hình 1.11) Trong thực tế, tăng trưởng theo cấp số nhân là quá nhanh, nó có thể được lặp đi lặp lại có lẽ chỉ có hai hoặc ba lần trước khi tiếp tục tăng trưởng Các phương pháp này cung cấp một phương tiện nhờ đó

mà một đoạn hình cây có thể được kéo dài theo hướng hội tụ hay phân kỳ theo hướng khác nhau tùy theo yêu cầu Bằng cách này, những khía cạnh tích cực của

cả hai phương pháp trên có thể được áp dụng mà không cần thiết để ý đến nhược điểm của chúng

Hình 1.11 Tổng hợp dendrimer bằng phương pháp tăng lũy thừa hai

Polyamidoamine được tổng hợp từ tâm (core) khác nhau với tác nhân tạo mạch nhánh methylacrylate (MA) và ethylenediamine (EDA) Sản phẩm bắt đầu

từ tâm (ví dụ như NH3 hay EDA), qua hai phản ứng amide hóa và phản ứng Michael Nhóm -NH2 sẽ thực hiện phản ứng Michael với methylacrylate, phản ứng amide hóa xảy ra giữa nhóm –COO- trên phân tử methylacrylate vừa gắn vào sẽ phản ứng với nhóm -NH2 của phân tử EDA tiếp đó và đưa đến hình thành một thế

hệ dendrimer

PAMAM dendrimer được quan tâm nhiều vì có các nhóm chức bề mặt là

-NH2 hay -COO- rất hoạt động Do đó PAMAM dễ tan trong nhiều loại dung môi phân cực và kém phân cực, dễ biến tính tạo ra các hợp chất mới với cấu trúc đa dạng và các tính chất mới vô cùng phong phú

Hình 1.12 Công thức phân tử của G3.0 PAMAM dendrimer

Trong tổng hợp dendrimer PAMAM có thể sử dụng nhiều tâm khác nhau: EDA, BDA, hexylenediamine (HAD), hay NH3 Với các tâm khác nhau, có kích thước khác nhau và độ phân cực khác nhau nên sẽ được sử dụng để mang các loại thuốc hoặc các hoạt chất khác nhau

PAMAM dendrimer với tâm EDA được tổng hợp theo sơ đồ như sau:

Tiếp tục thực hiện quá trình tổng hợp như trên sẽ thu được PAMAM dendrimer các thế hệ G 0.5; G 1.5; G 2.5; G 3.0; G3.5; G 4.0

Hình 1.14 Phản ứng tổng hợp dendrimer PAMAM G 0 Hình 1.13 Phản ứng tổng hợp dendrimer PAMAM G -0.5

Hình 1.15 PAMAM dendrimer G 1.0

1.1.4 Các phương pháp xác định tính chất của dendrimer

Các dendrimer ở các thế hệ khác nhau với các nhóm chức bề mặt như: OH, -NH2, -COCH3, -COOH, -CN) cũng như các dendrimer biến tính bề mặt với: folate, PEG, Glycosylated, v.v.) đã được tách và xác định bằng phương pháp phân tích như sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC, UPLC), NMR, Quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-Visible), nhiễu xạ tia X (XRD)… Các phương pháp phổ hồng ngoại (IR), NMR, phổ quang điện tử tia X (XPS) cũng được sử dụng để xác định nhóm chức bề mặt của dendrimer Kính hiển vi điện tử quét (SEM) và kính hiển vi điện

tử truyền qua (TEM) được dùng để kích thước, hình dạng, hình thái bề mặt của dendrimer, khối phổ MALDI-TOF-MS được dùng để xác định khối lượng của dendrimer (hình 1.22) [15], [16]

2

2 2

2

2 2

2

2

Hình 1.16 PAMAM dendrimer G 2.0

Kolhatkar và cộng sự [17] đã sử dụng phổ MALDI-TOF-MS xác định khối lượng phân tử dendrimer PAMAM (G2.0, G4.0) và các dẫn xuất của chúng Độ

sai lệch khối lượng nằm trong khoảng 0-6% khi so sánh với giá trị khối lượng mol tính toán theo lý thuyết và xác định bằng MALDI-TOF-MS

Hiện tại, nhóm nghiên cứu tại Viện Khoa học Vật liệu ứng dụng đã sử dụng phổ 1H-NMR để tính toán khối lượng phân tử của dendrimer và tính toán mức độ chuyển hóa của dẫn xuất dendrimer với các tác nhân khác nhau phương pháp này

có độ chính xác tương đương MALDI-TOF-MS [18], [19]

Ngoài ra, việc sử dụng TEM, SEM cũng giúp theo dõi được hình thái và kích thước nano của các hạt dendrimer tạo thành

1.1.5 Ứng dụng của dendrimer trong trị liệu

Dendrimer với kích thước nano và cấu trúc không gian rỗng bên trong phân

tử có thể là nơi chứa thuốc lý tưởng và các nhóm chức bề mặt có thể kết nối với thuốc hoặc các nhóm chức khác như nhóm hướng đích, nhóm quang hoạt

(fluorescent) giúp các nhà khoa học theo dõi được hướng đi, đường đi, vị trí của

thuốc sau khi đưa vào cơ thể Cách tiếp cận này đặc biệt hiệu quả trong điều trị các rối loạn gây tử vong như ung thư và các bệnh do ký sinh trùng gây ra [20]

1.1.5.1 Hoạt tính trị liệu của dendrimer

TEM; SEM SEC hoặc

GPC

NMR; Điện hóa; Điện di

DSC

UV; IR; NIR; MS, Huỳnh quang; XRD

Xác định tính chất Dendrimer

Hình 1.17 Các phương pháp xác định tính chất của dendrimer

Các nghiên cứu cho thấy dendrimer - polylysine thể hiện khả năng kháng virut herpes simplex (HSV), các kết quả các thử nghiệm lâm sàng Pha II cho thấy hiệu quả của hợp chất này đối với nhiễm trùng âm đạo

Sản phẩm SPL7013 Gel (VivaGel®) do Starpharma Pty Ltd (Melbourne, Australia) phát triển là một chất diệt vi khuẩn âm đạo để ngăn ngừa nhiễm HIV và HSV Thành công của VivaGel® (Starpharma) làm tiền đề cho việc phát triển các thuốc trị liệu khác của dendrimer [21]

Hình 1.18 Cấu trúc của dendrimer SPL7013 (MW 16.581 Da)

Wang và cộng sự [22] đánh giá cơ chế của hoạt tính kháng khuẩn của PAMAM dendrimer trên lợn Guinea mắc bệnh viêm màng ối gây ra bởi

Escherichia coli làm nhiễm trùng tử cung Các tác giả cho rằng hoạt tính chống vi

khuẩn là do sự tương tác của các dendrimer polycation với lipolisaccharide

polyanion có trong E coli Một nghiên cứu khác cho thấy PAMAM G3.5

dendrimer glycosyl hoá với glucosamine có hoạt tính chống viêm Với đặc tính này các dendrimer glycosyl hóa có thể được ứng dụng trong điều trị các bệnh ác tính, bệnh viêm và các bệnh truyền nhiễm [23]

1.1.5.2 Cải thiện độ hòa tan của thuốc

Độ hòa tan kém của thuốc có liên quan đến tính kỵ nước của hầu hết các phân tử thuốc và do đó làm hạn chế ứng dụng của chúng Các nghiên cứu cho thấy dendrimer kết hợp với các loại thuốc giúp cải thiện độ hòa tan các loại thuốc khác nhau như thuốc chống ung thư, chống sốt rét, chống vi rút, chống lao, kháng khuẩn,

chống viêm không steroid (NSAID) và chống tăng huyết áp, [12], [24] Sự hòa tan thuốc qua trung gian dendrimer phụ thuộc các yếu tố như kích thước các thế

hệ, nồng độ của dendrimer, pH, lõi, các đơn vị phân nhánh bên trong, các nhóm bề mặt cũng như nhiệt độ Hiệu quả hòa tan của dendrimer có thể dễ dàng thay đổi bằng cách điều chỉnh lõi, các đơn vị phân nhánh và nhóm bề mặt hoặc biến tính bề mặt bằng các phân tử ưa nước [25], [26], [20], [27] Nghiên cứu của F.E Koç và cộng sự [28] cho thấy dendrimer là chất tăng cường khả năng hòa tan hiệu quả cho các thuốc NSAID như Ketoprofen, Ibuprofen and Diflunisa Nghiên cứu của Dib

và cộng sự [29] cho thấy PAMAM dendrimer và PPI dendrimer làm tăng khả năng

hòa tan trong nước của thuốc 7-bromo-2-hydroxy-phenazine N 5 , N 10-dioxide

1.1.5.3 Dendrimer dùng vận chuyển thuốc qua da

Gần đây các khảo sát về việc vận chuyển thuốc qua da của dendrimer được tiến hành do hai yếu tố: (i) sự hiện diện của các phần kỵ nước trong hầu hết các thuốc dẫn đến khả năng tan trong nước kém gây hạn chế sự xâm nhập của thuốc vào trong khoang sinh học, và (ii) khả năng hòa tan trong nước và khả năng tương thích sinh học của hầu hết các dendrimer [12], [20]

Chauhan và cộng sự [30] đã khảo sát việc vận chuyển thuốc Indomethacin qua da của các dendrimer PAMAM G4.0 với nhóm bề mặt là amino và hydroxyl

và PAMAM dendrimer G4.5 Các nghiên cứu dược động học và động lực học in

vivo với chuột Wistar, cho thấy sự gia tăng đáng kể nồng độ Indomethacin trong

máu của các hệ chất mang này so với việc dùng riêng lẻ Indomethacin Cheng và cộng sự đã phát triển hệ chất mang PAMAM dendrimer G5.0 liên hợp Ketoprofen

và Diflunalu Trong các nghiên cứu in vitro về tính thấm qua da chuột cho thấy

phức chất dendrimer-Ketoprofen và dendrimer-Diflunisal có độ thấm qua da cao gấp 3,4 và 3,2 lần so với Ketoprofen và Diflunisal phân tán trong nước muối [31]

1.1.5.4 Dendrimer dùng vận chuyển thuốc uống

Các thuốc chống ung thư dùng qua đường uống được ưu tiên hơn vì thuận tiện cho bệnh nhân, đòi hỏi phải giảm chi phí điều trị và cũng tạo thuận lợi cho việc sử dụng các phác đồ điều trị mãn tính hơn Nhưng những vấn đề của thuốc như độ tan trong dung dịch nước thấp và tính thẩm thấu kém qua màng sinh học

hạn chế việc sử dụng qua đường uống Dendrimer đã được khảo sát để vận chuyển các loại thuốc uống khác nhau với kết quả đầy hứa hẹn Các chất dendrimer biến tính bề mặt đã được tìm thấy làm tăng tính thấm qua biểu mô Nghiên cứu của Jevprasesphant và cộng sự cho thấy các PAMAM dendrimer và các dendrimer biến tính bề mặt với các nhóm lauroyl có thể đi qua các đơn lớp biểu mô thông qua các con đường cạnh tế bào (paracellular) và xuyên qua tế bào (transcellular) [32]

Các dendrimer gắn folate (FA) trên bề mặt có thể dễ dàng vận chuyển các hoạt chất chống ung thư tới vị trí các khối u Nghiên cứu của Kukowska-Latallo

và cộng sự cho thấy PAMAM dendrimer – Folic acid mang thuốc chống ung thư Methotrexate (MTX) có sự tích tụ MTX cao gấp ba lần trong các tế bào khối u sau

24 giờ so với các hệ chất mang không gắn acid folic [33] Jain và đồng nghiệp đã tổng hợp thành công các dendrimer PPI liên hợp 2 phối tử mannosyl và acid sialic nhằm mục đích mang thuốc kháng HIV Ziovudine hướng đích và tăng khả năng tương hợp sinh học [34]

1.1.5.6 Dendrimer vận chuyển gen

Các nhà khoa học đã sử dụng dendrimer làm tác nhân vận chuyển gen Szoka và Baker cho PAMAM dendrimer tạo phức với plasmid DNA có khả năng vận chuyển các tế bào CV-1, HeLa, HepG2, Rat Hepatocyte, K562, EL-4 và Jukart

Hình 1.19 Dendrimer vận chyển DNA tới màng tế bào