Khảo sát sự sinh trưởng của nấm men Saccharomyces sp

Khảo sát sự sinh trưởng của nấm men Saccharomyces sp. trên môi trường cám gạo, rỉ đường và một số yếu tố ảnh hưởng tới khả năng sống của chúng trong chế phẩm (71 trang)

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT SỰ SINH TRƯỞNG CỦA SACCHAROMYCES SP

TRÊN MÔI TRƯỜNG CÁM GẠO, RỈ ĐƯỜNG

VÀ MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỨC SỐNG CỦA CHÚNG

TRONG CHẾ PHẨM

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Niên khoá: 2003-2007 Sinh viên thực hiện: VƯƠNG THỊ HỒNG VI

Thành Phố Hồ Chí Minh

-09/2007-BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT SỰ SINH TRƯỞNG CỦA SACCHAROMYCES SP

TRÊN MÔI TRƯỜNG CÁM GẠO, RỈ ĐƯỜNG

VÀ MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỨC SỐNG CỦA CHÚNG

TRONG CHẾ PHẨM

Thành Phố Hồ Chí Minh

-09/2007-

Với tất cả lòng kính trọng, em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tại trường

Em xin chân thành cảm ơn Ts Nguyễn Ngọc Hải đã hết lòng hướng dẫn dạy

dỗ, động viên, quan tâm, ủng hộ em hoàn thành khoá luận

Em xin chân thành cảm ơn Ts Lê Anh Phụng, BSTY Nguyễn Thị Kim

Loan đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình hoàn thành

Sinh viên thực hiện

Vương Thị Hồng Vi

Đề tài “Khảo sát sự sinh trưởng của nấm men Saccharomyces sp trên môi

trường cám gạo, rỉ đường và một số yếu tố ảnh hưởng tới khả năng sống của chúng trong chế phẩm” được tiến hành tại phòng Thực Tập Vi Sinh khoa Chăn Nuôi Thú

Y Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM, thời gian từ tháng 3 đến tháng 8 năm

2007 Đề tài được thực hiện với mục đích tìm hiểu một số điều kiện trong quy trình

sản xuất sinh khối của nấm men Saccharomyces sp nhằm ứng dụng để sản xuất chế

phẩm sinh học sử dụng cho gia súc, gia cầm

Kết quả chúng tôi ghi nhận được:

Chúng tôi phân lập được từ dịch quả nho chủng nấm men thuộc loài

S cerevisiae và từ chế phẩm sinh học chủng nấm men thuộc loài S boulardii Cả 2

chủng đều có khả năng sinh trưởng tốt trên môi trường rỉ đường 60B và môi trường cám gạo Tuy nhiên, môi trường cám gạo thích hợp cho sự sinh trưởng của loài

S boulardii hơn môi trường rỉ đường 60B Thu hoạch S boulardii vào thời điểm 60

giờ sau khi nuôi cấy sẽ cho kết quả số lượng tế bào còn sống trong chế phẩm nhiều

hơn ở 36 giờ và 48 giờ Ngược lại, loài S cerevisiae sinh trưởng trên môi trường rỉ

đường 60B mạnh hơn trên môi trường cám gạo Và thời điểm thu hoạch

S cerevisiae thích hợp nhất là 36 giờ sau khi nuôi cấy

Vitamin C và chất nền (cám gạo, bột mì) không ảnh hưởng đến sức sống của nấm men trong chế phẩm (sau 22 ngày sản xuất) Việc nuôi cấy chung vi khuẩn

sB subtilis không ảnh hưởng đến số lượng tế bào nấm men S cerevisiae

The study on the growth of Saccharomyces sp on rice bran medium, sugar

cane molasses medium and some factors influence on their vitality power for the purpose of producing probiotic Our topic is done from March to August, 2007 at Microbiology - Infectious Diseases Department, Husbandry and Veterinary Faculty, Nong Lam University, Ho Chi Minh city

S boulardii was isolated from probiotic and S cerevisiae was isolated from

grapes They grew well both on rice bran medium and sugar cane molasses medium

Experimental results showed S boulardii grew better on rice bran than on sugar cane molasses medium The best time for harvesting S boulardii biomass was

60 hours after culturing But, S cerevisiae grew better on sugar cane molasses

medium and the best time for harvesting their biomass was 36 hours after culturing

The rate acid ascorbic and background substance (wheat flour or rice bran) didn’t show the influence to yeast vitality

No considerable oscillations of S cerevisiae biomass occurred in co-culture with Bacillus subtilis

CHƯƠNG TRANG Trang tựa

Chương 1 PHẦN MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích đề tài 2

1.3 Yêu cầu đề tài 2

Chương 2 TỔNG QUAN 3

2.1 Đặc điểm chung của nấm men 3

2.2 Vai trò của nấm men 4

2.3 Các hình thức sinh sản của nấm men 5

2.3.1 Sinh sản vô tính 5

2.3.1.1 Sinh sản vô tính bằng hình thức nảy chồi 5

2.3.1.2 Sinh sản vô tính bằng hình thức phân chia tế bào 5

2.3.2 Sinh sản hữu tính 6

2.3.2.1 Sinh sản hữu tính bằng bào tử túi (ascospore) 6

2.3.2.2 Sinh sản hữu tính bằng bào tử bắn (ballistospore) 6

2.4 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của nấm men 7

2.5 Đặc điểm của giống Saccharomyces 9

2.5.1 Saccharomyces cerevisiae 10

2.5.2 Saccharomyces boulardii 10

2.6 Sự sinh trưởng và phát triển của nấm men 11

2.6.1 Giai đoạn thích nghi 11

2.6.2 Giai đoạn logarit 11

2.6.3 Giai đoạn ổn định 12

2.6.4 Giai đoạn thoái hóa 12

2.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của nấm men trong điều kiện nuôi cấy thu sinh khối tế bào 12

2.7.1 Môi trường nuôi cấy 12

2.7.2 Nhiệt độ 14

2.7.3 pH của môi trường 14

2.9 Những nghiên cứu và ứng dụng nấm men trong chăn nuôi 18

2.9.1 Ở nước ngoài 18

2.9.2 Ở trong nước 19

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 21

3.1.1 Thời gian 21

3.1.2 Địa điểm 21

3.2 Vật liệu thí nghiệm 21

3.2.1 Mẫu khảo sát 21

3.2.2 Thiết bị và dụng cụ 21

3.2.3 Hóa chất 21

3.2.4 Môi trường nuôi cấy 21

3.3 Nội dung nghiên cứu 22

3.4 Phương pháp nghiên cứu 22

3.4.1 Phân lập nấm men 22

3.4.1.1 Mẫu chế phẩm sinh học và men bánh mì 22

3.4.1.2 Mẫu đu đủ và nho 22

3.4.2 Thí nghiệm 1: Khảo sát sự phát triển của các chủng phân lập được trong môi trường rỉ đường 60B 23

3.4.2.1 Mục đích 23

3.4.2.2 Thông số cố định 23

3.4.2.3 Chỉ tiêu theo dõi 23

3.4.2.4 Bố trí thí nghiệm 23

3.4.3 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy và thời gian thu hoạch lên sự sinh trưởng của nấm men Saccharomyces 24

3.4.3.1 Mục đích 24

3.4.3.2 Thông số cố định 24

3.4.3.3 Chỉ tiêu theo dõi 24

3.4.3.4 Bố trí thí nghiệm 25

3.4.4 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của acid ascorbic (vitamin C) và chất nền lên thời gian sống của nấm men trong chế phẩm 25

3.4.4.1 Mục đích 25

3.4.4.2 Thông số cố định 25

3.4.4.3 Chỉ tiêu theo dõi 26

3.4.5 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy, chất nền và thời gian thu hoạch lên sức sống của nấm men trong chế phẩm 26

3.4.6 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của vi khuẩn Bacillus subtilis lên sự sinh trưởng của nấm men Saccharomyces cerevisiae trong điều kiện nuôi cấy chung 26

3.4.6.1 Mục đích 26

3.4.6.2 Thông số cố định 26

3.4.7 Phương pháp đếm số tế bào nấm men bằng buồng đếm hồng cầu 27

3.4.8 Phương pháp đếm số tế bào sống ( số khuẩn lạc trên đĩa thạch) 28

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát sự sinh trưởng của các chủng đã phân lập trong môi trường rỉ đường 60B 30

4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy và thời gian thu hoạch lên sự sinh trưởng của nấm men Saccharomyces 33

4.2.1 Saccharomyces boulardii 33

4.2.2 Saccharomyces cerevisiae 35

4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của acid ascorbic (vitamin C) và chất nền lên sức sống của nấm men trong chế phẩm 37

4.3.1 Saccharomyces boulardii 38

4.3.2 Saccharomyces cerevisiae 38

4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy, chất nền và thời gian thu hoạch lên sức sống của nấm men trong chế phẩm 39

4.4.1 Saccharomyces boulardii 39

4.4.2 Saccharomyces cerevisiae 42

4.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của vi khuẩn Bacillus subtilis lên sự sinh trưởng của nấm men Saccharomyces cerevisiae trong điều kiện nuôi cấy chung 43

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 47

5.1 Kết luận 47

5.2 Đề nghị 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49

PHỤ LỤC 51

HÌNH TRANG Hình 4.1: Phân lập nấm men từ chế phẩm sinh học Ultra Levure 31

Hình 7.2: Khuẩn lạc Saccharomyces sp trên môi trường Sabouraud 51

Hình 7.3: Chế phẩm sinh học chứa nấm men Saccharomyces 51

BẢNG TRANG

Bảng 4.1: Số lƣợng tế bào nấm men trong 1 ml dịch nuôi cấy 30

Bảng 4.2: Số lƣợng tế bào S boulardii trong 1 ml dịch nuôi cấy 33

Bảng 4.3: Số lƣợng tế bào S boulardii trong 1 g chế phẩm 34

Bảng 4.4: Số lƣợng tế bào S cerevisiae trong 1 ml dịch nuôi cấy 35

Bảng 4.5: Số lƣợng tế bào S cerevisiae trong 1 g chế phẩm 36

Bảng 4.6: Số lƣợng tế bào S boulardii trong 1 g chế phẩm 38

Bảng 4.7: Số lƣợng tế bào S cerevisiae trong 1 g chế phẩm 38

Bảng 4.8: Số lƣợng tế bào S boulardii trong 1 g chế phẩm 41

Bảng 4.9: Số lƣợng tế bào S cerevisiae trong 1 g chế phẩm 41

Bảng 4.10: Số lƣợng tế bào S cerevisiae trong 1 ml dịch nuôi cấy 43

Bảng 4.11: Số lƣợng tế bào S cerevisiae trong 1 g chế phẩm 44 Bảng 7.1: Số lƣợng tế bào nấm men trong 1 ml dịch nuôi cấy 48

Bảng 7.2: Số lƣợng tế bào S boulardii trong 1 ml dịch nuôi cấy 48

Bảng 7.3: Số lƣợng tế bào S boulardii trong 1 g chế phẩm 48

Bảng 7.4: Số lƣợng tế bào S cerevisiae trong 1 ml dịch nuôi cấy 49

Bảng 7.5: Số lƣợng tế bào S cerevisiae trong 1 g chế phẩm 49

Bảng 7.6: Số lƣợng tế bào S boulardii trong 1 g chế phẩm 50

Bảng 7.7: Số lƣợng tế bào S cerevisiae trong 1 g chế phẩm 50

Bảng 7.8: Số lƣợng tế bào S cerevisiae trong 1 ml dịch nuôi cấy 51

Bảng 7.9: Số lƣợng tế bào S cerevisiae trong 1 g chế phẩm 51

Chương 1 PHẦN MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Trong giới vi sinh vật, khi nhắc đến những ứng dụng của nấm men trong chế

biến thực phẩm thì Saccharomyces được xem là một trong những ứng cử viên sáng

giá nhất Từ rất lâu, chúng đã được sử dụng trong chế biến thực phẩm cho người như lên men rượu, bia, sản xuất men bánh mì, nước giải khát có cồn… Và trong vài thập kỷ gần đây nó đã được sử dụng nhiều cho chăn nuôi như chế biến thức ăn giàu tinh bột từ các phế phụ phẩm công nông nghiệp, sản xuất sinh khối giàu protein và vitamin từ các nguồn nguyên liệu phong phú, rẻ tiền hoặc sử dụng trong sản xuất các chế phẩm sinh học dùng làm thức ăn bổ sung cho vật nuôi Việc nghiên cứu sản xuất ở qui mô nhỏ và vừa các chế phẩm sinh học từ nấm men giúp phòng bệnh và kích thích sinh trưởng cho gia súc, gia cầm phù hợp với thực tiễn nước ta đã và đang được triển khai nghiên cứu ứng dụng

Với xu hướng đó, việc nghiên cứu khả năng sinh trưởng và phát triển giống

nấm men Saccharomyces trên các loại môi trường khác nhau nhằm thu được lượng

sinh khối cao với chi phí nuôi cấy thấp là công việc quan trọng và cần thiết Tuy nhiên, chúng ta cũng cần quan tâm đến thời gian thu hoạch và phương pháp bảo

quản khả năng sống của chúng trong chế phẩm Sở dĩ Saccharomyces được sử dụng

phổ biến để bổ sung vào thức ăn cho vật nuôi vì chúng thuộc loại nấm đơn bào, chứa nguồn protein phong phú, hàm lượng vitamin cao (đặc biệt là vitamin nhóm B) mà thời gian chúng sinh sản nhanh lại dễ nuôi cấy và thu hoạch

Được sự đồng ý của Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học và sự giúp đỡ của Khoa Chăn Nuôi Thú Y Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh cùng với sự hướng dẫn tận tình của Ts Nguyễn Ngọc Hải, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài

“Khảo sát sự sinh trưởng của nấm men Saccharomyces sp trên môi trường cám

gạo, rỉ đường và một số yếu tố ảnh hưởng tới khả năng sống của chúng trong chế phẩm”

1.2 Mục đích đề tài

Tìm hiểu một số điều kiện trong quy trình sản xuất sinh khối nấm men

Saccharomyces sp nhằm ứng dụng để sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng cho gia

súc, gia cầm

1.3 Yêu cầu đề tài

Phân lập các chủng nấm men từ 4 nguồn mẫu chế phẩm sinh học, men bánh

mì, đu đủ và nho

Đánh giá khả năng sinh trưởng của nấm men Saccharomyces sp trên môi

trường cám gạo và môi trường rỉ đường mía

Khảo sát, tìm hiểu thời gian thích hợp để thu hoạch nấm men

Đánh giá ảnh hưởng của acid ascorbic (vitamin C) và chất nền (cám gạo, bột

mì) lên sức sống của Saccharomyces sp trong chế phẩm

Đánh giá ảnh hưởng của vi khuẩn Bacillus subtilis lên sự sinh trưởng của nấm men Saccharomyces cerevisiae trong điều kiện nuôi cấy chung

Chương 2 TỔNG QUAN

2.1 Đặc điểm chung của nấm men

Nấm men là tên chung để chỉ những nhóm nấm có cấu tạo đơn bào, sống riêng lẻ hoặc sống thành từng đám, không di động và sinh sản vô tính chủ yếu bằng hình thức nảy chồi

Chúng phân bố rộng rãi trong thiên nhiên như trong đất, nước, lương thực thực phẩm…, đặc biệt có nhiều trong các loại hoa quả chín, ngọt

Hình dạng và kích thước nấm men thay đổi tùy theo loài, giống, điều kiện dinh dưỡng và nhiều yếu tố khác

Nấm men thường có dạng hình trứng, hình bầu dục (Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces ellipsoideus…), hình tròn (Candida utilis), hình ống dài (Pichia), hình quả dưa chuột (Saccharomyces pastorianus), hình một đầu nhọn (Brettanomyces), hình tam giác (Trigonopsis) và một số hình đặc biệt khác

Một số nấm men có tế bào hình dài, nối tiếp nhau thành những dạng sợi gọi

là khuẩn ty (mycelium) hoặc khuẩn ty giả (pseudomycelium) Ở khuẩn ty giả, các tế bào không nối liền nhau một cách chặt chẽ như ở khuẩn ty Khuẩn ty và khuẩn ty

giả thường quan sát thấy ở các giống Endomycopsis, Candida, Trichosporon…,

nhiều loài nấm chỉ sinh khuẩn ty giả khi không được cung cấp đủ oxy

Hình dạng nấm men không ổn định, nó còn phụ thuộc vào tuổi giống và điều

kiện ngoại cảnh Ví dụ, Saccharomyces thường có hình bầu dục trong môi trường

nuôi cấy giàu dinh dưỡng Trong điều kiện yếm khí thường có hình tròn, trong điều kiện hiếu khí tế bào có hình dài hơn

Kích thước tế bào nấm men thay đổi rất nhiều tùy theo giống, loài và từng giai đoạn phát triển Nhìn chung, tế bào nấm men to hơn tế bào vi khuẩn một cách

rõ rệt, kích thước trung bình 3 – 5 * 10 – 12 µm Kích thước chiều ngang tế bào

nấm men giống Torulopsis là 5 – 8 µm, ở một số loại men rượu là 10 – 11 µm, men

bia là 6 – 8 µm, nấm men gia súc thường nhỏ hơn

Để quan sát hình thái và đo kích thước tế bào nấm men, người ta thường sử dụng môi trường mạch nha dịch thể với nồng độ đường khoảng 10 – 150B (độ Baumé, đơn vị thường sử dụng để tính hàm lượng đường) hoặc môi trường thạch mạch nha, thời gian nuôi cấy là 3 ngày ở 25 – 300

C

Nấm men là sinh vật có nhân thật, cấu tạo tế bào có màng tế bào, nguyên sinh chất, nhân, ty thể, ribosome, không bào, một số thể vùi (glycogen, lipit, volutin…)

2.2 Vai trò của nấm men

Nấm men có khả năng sinh sản nhanh chóng, sinh khối của chúng rất giàu protein, lipid và vitamin (đặc biệt là vitamin B) Chúng có khả năng lên men các loại đường để tạo thành rượu trong điều kiện yếm khí, còn trong điều kiện hiếu khí thì chúng có khả năng tăng nhanh lượng sinh khối tế bào

Trong quá trình trao đổi chất của hầu hết giống nấm men đều không sinh ra chất độc gây hại cho sức khoẻ của người và vật nuôi nên chúng được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp chế biến thực phẩm như sản xuất rượu, bia, nước giải khát có cồn, làm men bánh mì, chế biến các thực phẩm sữa lên men kefir, johur … cho người và thức ăn gia súc

Người ta còn sử dụng nấm men để sản xuất protein đơn bào, sản xuất

vitamin, enzyme… và đặc biệt loài Saccharomyces cerevisiae đang được sử dụng

như một công cụ đắc lực để mang các DNA tái tổ hợp phục vụ cho việc sản xuất các sản phẩm thế hệ mới của ngành công nghệ sinh học hiện đại

Tuy nhiên, cũng có một số nấm men gây bệnh cho người và gia súc như

Candida albican, Cryptoccocus neoforman… và gây hư hỏng thực phẩm như Endomycopsis fiibuligera, Saccharomyces bisporus…

2.3 Các hình thức sinh sản của nấm men

Nấm men sinh sản dưới 2 hình thức sinh sản vô tính và sinh sản hữu tính

2.3.1 Sinh sản vô tính

2.3.1.1 Sinh sản vô tính bằng hình thức nảy chồi

Ở một giai đoạn nhất định nào đó, trên tế bào mẹ xuất hiện chồi và sau đó phát triển thành tế bào con Tế bào con lớn dần, khi đã đạt đến kích thước của tế bào

mẹ thì nhờ sự chuyển động của chất lỏng trong môi trường, nó tách khỏi tế bào mẹ Trước lúc tách ra, giữa 2 tế bào này có mối liên kết bên trong rất khắng khít Tế bào

mẹ và tế bào con khác nhau về phẩm chất, chức năng nên tốc độ sinh sản của chúng cũng không giống nhau

Nhưng cũng có trường hợp tế bào con không tách khỏi tế bào mẹ mà tạo thành những chồi nhỏ liên kết với nhau ngay cả khi chúng trưởng thành, do đó tạo thành chuỗi tế bào, gọi là khuẩn ty giả

Hình thức nảy chồi là hình thức sinh sản phổ biến nhất ở nấm men, thường

gặp ở giống Saccharomyces, Candida, Torulopsis

2.3.1.2 Sinh sản vô tính bằng hình thức phân chia tế bào

Một số loài phân đôi tế bào tạo thành 2 tế bào con bằng nhau, giống như ở đa

số các vi khuẩn Lúc đầu chất nhân chia làm 2 phần, sau đó ở phần giữa tế bào xuất hiện vách tế bào, vách này lớn dần lên và chia tế bào mẹ thành 2 tế bào con Mỗi tế bào con chứa nửa chất nhân và dần dần 2 tế bào tách khỏi nhau thành 2 tế bào độc lập

Hình thức sinh sản này thường gặp ở nấm men có dạng sợi dài như giống

Schizosaccharomyces, Endomyces

2.3.2 Sinh sản hữu tính

2.3.2.1 Sinh sản hữu tính bằng bào tử túi (ascospore)

Trong quá trình nuôi cấy nấm men chuyển đột ngột từ môi trường giàu sang môi trường nghèo dinh dưỡng, trong khi đó vẫn giữ nguyên độ ẩm, tích tụ các hợp chất trung gian, đủ oxy của không khí thì tế bào sẽ sinh bào tử nằm trong các túi, được gọi là bào tử túi Bào tử túi bền với tác nhân bên ngoài như nhiệt độ cao, khô hạn, nhưng kém bền nhiệt hơn so với bào tử vi khuẩn Chúng thường chết ở 600C, còn bào tử vi khuẩn chết ở 1200C

Bào tử túi thường được sinh ra trong những cái túi nhỏ gọi là nang hay túi (ascus) mỗi túi chứa 1 – 8 bào tử túi (ascospore), thường là 1 – 4 Bào tử túi có kích thước và hình dạng khác nhau tùy từng loại nấm men; có thể hình bầu dục, bán cầu, hình thoi…

Túi có thể được sinh ra theo 1 trong 3 phương thức sau:

Tiếp hợp đẳng giao (conjugation isogamic): do 2 tế bào nấm men có hình dạng và kích thước giống nhau tiếp hợp với nhau tạo thành Gặp ở nhiều loài trong

giống Schizosaccharomyces, Zygosaccharomyces, Debaryomyces

Tiếp hợp dị giao (conjugation heterogamic): do 2 tế bào có hình dạng và kích thước không giống nhau tiếp hợp với nhau tạo thành Gặp ở 1 số loài trong giống

Zygopichia, Nadsodia

Sinh sản đơn tính (pathenogenesis): đó là quá trình hình thành bào tử trực tiếp từ 1 tế bào riêng lẻ không thông qua tiếp hợp Gặp ở nhiều loài trong giống

Schiwanniomyces, Pichia

Các bào tử túi sau khi ra khỏi túi gặp điều kiện thuận lợi sẽ phát triển thành

tế bào nấm men mới Tế bào này lại sinh sản theo lối nảy chồi

2.3.2.2 Sinh sản hữu tính bằng bào tử bắn (ballistospore)

Là loại bào tử chỉ thấy ở các loài trong giống Brullera, Spodiobolus, Sporoliomyces, Aessaspora Sau khi hình thành, bào tử này có thể bắn mạnh ra phía

đối diện

2.4 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của nấm men

Nấm men là vi sinh vật hiếu khí tùy nghi, chúng hô hấp như một cơ thể hiếu khí bậc cao, khi môi trường hết oxy phân tử chúng chuyển sang hô hấp kỵ khí, gọi

là quá trình lên men Khi phản ứng lên men bắt đầu phát triển, tốc độ sinh sản của tế bào nấm men bị kìm hãm và đến một giai đoạn nhất định hầu như không còn nữa

Về cơ chế sinh học, đây là một quá trình sử dụng không hết năng lượng những chất dinh dưỡng của môi trường Vì quá trình phân hủy 1 phân tử gam đường bằng cách lên men chỉ tiết ra khoảng 28 kcal, trong khi đó nếu oxy hóa hoàn toàn 1 phân tử gam đường ta sẽ có 674 kcal Quá trình lên men tạm gọi là quá trình phosphoryl

hóa Vì trong khi lên men, các hợp chất ATP, ADP tham gia vào 1 cách tích cực

Nấm men tiếp nhận thức ăn bằng con đường hấp thụ chọn lọc trên bề mặt của tế bào và sau đó khuếch tán vào bên trong Màng và lớp bao bọc nguyên sinh chất của tế bào đóng vai trò màng bán thấm ngăn cách, điều hoà các chất dinh dưỡng vào tế bào và thải các sản phẩm trao đổi chất ra ngoài Các chất dinh dưỡng sau khi được hấp thụ vào trong tế bào sẽ xảy ra những phản ứng hóa học để chuyển hóa thành các hợp chất như protein, glucid, lipid…

Dinh dưỡng cacbon:

Trước hết phải kể đến các loại đường, đường glucose được tất cả các loài nấm men sử dụng Các loài nấm men dùng sản xuất men gia súc thuộc giống

Candida, Torulopsis có thể đồng hóa được đường pentose Vì vậy, các men này có

thể nuôi cấy ở dịch thủy phân từ gỗ hoặc các nguồn giàu hemicellulose Những disacarit (maltose và saccarose) trước khi được nấm men sử dụng phải qua thủy phân sơ bộ thành đường đơn nhờ enzyme tương ứng của nấm men

Như là một qui luật, trong môi trường có một hỗn hợp các nguồn cacbon dinh dưỡng thì nguồn nào cung cấp cho nấm men sinh trưởng tốt sẽ được sử dụng trước Đường glucose và fructose được sử dụng trước hết, kế tiếp là các acid béo (phụ thuộc vào chủng loài nấm men và thành phần của acid này), những hợp chất có nhiều C trong phân tử được sử dụng sau cùng

Các acid hữu cơ chiếm một vị trí quan trọng trong trao đổi chất của nấm men Chúng có thể kích thích hoặc ức chế sinh trưởng nấm men Chúng có thể là nguồn dinh dưỡng cacbon và năng lượng duy nhất

Sử dụng hydrocacbon từ dầu mỏ và khí đốt làm nguồn cacbon nuôi cấy nấm men rất được quan tâm trong vài thập kỷ gần đây Trong đó, parafin có thể là nguồn

cacbon dinh dưỡng dễ dàng đối với một số chủng của giống Candida và Torulopsis

Dinh dưỡng nitơ:

Nấm men có khả năng tổng hợp được tất cả các acid amin, thành phần protein trực tiếp từ các hợp chất đạm vô cơ và cacbon hữu cơ

Đa số nấm men không đồng hóa được nitrate (trừ giống Hasenula và Pichia)

Nguồn nitơ vô cơ được nấm men sử dụng tốt là các muối amoni của acid vô

cơ cũng như hữu cơ Đó là amoni sulfate, phosphate rồi đến các muối acetate, lactate, malate… Trong môi trường có muối amoni, đặc biệt là sulfate, thì nấm men

sử dụng gốc amoni trước, gốc acid còn lại sẽ sử dụng sau hoặc ít sử dụng và sẽ làm môi trường acid hóa, giảm pH

Các nguồn nitơ hữu cơ thường là hỗn hợp các acid amin, peptit, nucleotit… Trong thực tế, người ta hay dùng cao ngô, cao nấm men, dịch thủy phân đậu tương làm nguồn nitơ hữu cơ nấm men tiêu hóa rất tốt các acid amin, còn peptone kém hơn và hoàn toàn không sử dụng được protein Các muối amon được nấm men sử dụng tốt hơn các acid amin Trong quá trình nuôi cấy nấm men, các acid amin vừa

là nguồn nitơ vừa là nguồn cacbon dinh dưỡng Tuy nhiên, nấm men chỉ sử dụng được acid amin ở dạng L-acid amin

Để thu sinh khối Saccharomyces được tốt, trong môi trường nuôi cấy nên có

mặt cả nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ

Dinh dưỡng các nguyên tố vô cơ:

Trong các nguyên tố vô cơ sử dụng nuôi cấy nấm men, phospho được quan tâm trước hết, sau đó là kali, magiê, lưu huỳnh…

Phospho tham gia vào thành phần quan trọng của tế bào (nucleoproteit, acid nucleic, phospholipit…) Các hợp chất phospho đóng vai trò xác định trong các

phản ứng sinh hóa, đặc biệt là trong trao đổi chất hydrocacbon và vận chuyển năng lượng

Trong phòng thí nghiệm vi sinh, người ta thường dùng muối KH2PO4 và

K2HPO4 làm nguồn P và K còn trong sản xuất, thường dùng dịch chiết từ supephosphat làm nguồn P

Dinh dưỡng các chất kích thích sinh trưởng:

Để cho nấm men phát triển và lên men được bình thường cần phải có các vitamin làm cofacto trong nhiều enzyme của tế bào nấm men Nấm men có thể tổng hợp được tất cả các vitamin trong chừng mực nào đó, ngoại trừ biotin Vì vậy, trong môi trường nuôi cấy cần phải bổ sung vitamin này

Những nhân tố sinh trưởng cơ bản đối với nấm men không có sắc tố là 6 vitamin nhóm B: inozit (vit B8), biotin (vit B7), acid pantotenic (vit B3), tiamin (vit

B1), pyridoxyn (vit B6), acid nicotinic (vit B5)

Trong công nghiệp, thường dùng các nguồn vitamin là cao ngô, cao nấm men, nước chiết cám, dịch thủy phân đậu tương, rỉ đường Trong các thí nghiệm nuôi cấy ở qui mô nhỏ có thể dùng các dịch chiết từ giá đậu, rau cải, cà chua, cà rốt, khoai tây… làm nguồn vitamin bổ sung vào môi trường

2.5 Đặc điểm của giống Saccharomyces

Một số loài nấm men có khả năng lên men rượu và bia lần đầu tiên đã được

Meyen gộp thành 1 giống gọi là Saccharomyces vào năm 1939 Đây là giống có bào

tử túi, thường có 1 – 4 bào tử, có khi đến 8 bào tử Tế bào của chúng có hình cầu, dài, elip , nảy chồi nhiều phía, không có khuẩn ty, không tạo bào tử bắn, không tạo váng, khuẩn lạc có dạng bột nhão, hơi bóng

Đây là một trong số những giống nấm men được ứng dụng rộng rãi, phổ biến nhất

2.5.1 Saccharomyces cerevisiae

Được Meyen mô tả vào năm 1938, tế bào có dạng hình trứng, bầu dục…, kích thước trung bình 3 – 6 * 5 – 12 µm, sinh sản bằng hình thức nảy chồi không theo qui luật, có thể xuất hiện từng cái một, từng đôi hoặc một chuỗi

Khuẩn lạc có màu trắng nhạt, rìa tròn, lồi lên, bề mặt sáng lấp lánh, đường

kính 1 – 2 mm vào ngày thứ ba

Phát triển tối ưu ở 33 – 350C trong môi trường chứa 10 – 30% glucose Nhiệt

độ tối thiểu là 40C trong 10% glucose và 130C trong 50% glucose, nhiệt độ tối đa là

38 – 390C (Jermini and Schmidt-Lorenz, 1987, trích từ Lê Nguyễn Bảo Trân, 2005)

Có khả năng phát triển ở pH = 1,6 trong HCl; pH = 1,7 trong H3PO4 và

pH = 1,8 – 2 trong acid hữu cơ, có sức chịu đựng lớn nhất đối với acid benzoic

100 mg/kg ở pH = 2,5 – 4 và acid sorbic 200 mg/kg ở pH = 4 (Juven et al, 1978,

trích từ Lê Nguyễn Bảo Trân, 2005)

Có khả năng lên men đường glucose, galactose, maltose, saccharose, rafinose

và các dextrin đơn giản, không lên men lactose, manitol, không đồng hóa nitrate,

không phân giải tinh bột

Là loài nấm men hay được sử dụng làm men bánh mì, lên men rượu, bia và hiện còn được sử dụng làm probiotic phục vụ cho chăn nuôi gia súc và nuôi trồng thủy sản nhờ có khả năng chịu được acid dạ dày và muối mật tốt, đề kháng tự nhiên

với kháng sinh

2.5.2 Saccharomyces boulardii

Được Herry Boulard phát hiện vào năm 1923 trong vỏ trái cây chín, tế bào

có dạng hình tròn, bầu dục, kích thước 4 – 6 * 6 – 9 µm, sinh sản bằng hình thức nảy chồi và tạo bào tử túi, hô hấp hiếu khí tùy nghi

Có khả năng lên men đường glucose, saccharose, rafinose, xylose; không lên men lactose, manitol, maltose…, không hình thành hợp chất phân giải tinh bột

Là loài nấm men không mang mầm bệnh, được sử dụng như một chất

biotherapeutic để ngăn cản bệnh tiêu chảy (Surawicz et al.,1989 and 2000, trích từ

Lê Nguyễn Bảo Trân, 2005)

Ngoài khả năng giúp cân bằng hệ vi khuẩn đường ruột tương tự vi khuẩn

lactic, Saccharomyces boulardii còn có một ưu điểm vượt trội là khả năng đề kháng

với kháng sinh và sulfamide (trừ kháng sinh kháng nấm)

Có khả năng tiết ra protease tiêu giải độc tố của Clostridium difficile, vi khuẩn gây viêm ruột kết tràng giả cũng như trung hoà được nội độc tố của E coli và

Vibrio cholera nên có thể dùng trong dự phòng tiêu chảy cấp tính

2.6 Sự sinh trưởng và phát triển của nấm men

Sự sinh trưởng và phát triển của nấm men diễn biến qua 4 giai đoạn

2.6.1 Giai đoạn thích nghi

Là giai đoạn từ lúc cấy nấm men vào môi trường đến lúc chúng bắt đầu sinh sản Ở giai đoạn này, chúng còn phải thích nghi với điều kiện môi trường mới

Trong giai đoạn này, tế bào nấm men trải qua những biến đổi lớn về hình thái và sinh lý, kích thước tăng lên đáng kể và chúng trở nên nhạy cảm với những tác động bên ngoài Số lượng tế bào nấm men ở giai đoạn này là không tăng hoặc tăng không đáng kể

2.6.2 Giai đoạn logarit

Số lượng và sinh khối tế bào trong giai đoạn này tăng theo cấp số nhân Khả năng thích ứng với những điều kiện không thuận lợi của môi trường ngoài tăng lên

rõ rệt, đồng thời xuất hiện chức năng lên men rượu

Giai đoạn này thuận tiện để xác định năng lượng sinh sản, thời gian nảy chồi, nhưng không nên đánh giá kích thước của tế bào cũng như những dấu hiệu khác của khuẩn lạc Do trong thời kỳ đầu của giai đoạn này, tốc độ sinh sản của tế bào thường nhanh hơn tốc độ tạo thành tế bào chất nên kích thước của tế bào có phần nhỏ đi

2.6.3 Giai đoạn ổn định

Số lượng tế bào trong giai đoạn này không tăng nữa, có thể là do sự cân bằng giữa số sinh ra và chết đi Song kích thước tế bào tăng lên rõ rệt Quá trình lên men rượu cũng bắt đầu

2.6.4 Giai đoạn thoái hóa

Số lượng tế bào giảm xuống do có hiện tượng tiêu hủy Lượng protein và acid nucleic giảm xuống, glycogen và treganose hoàn toàn tiêu biến

Như vậy có thể thấy số lượng tế bào nấm men đạt cao nhất ở giai đoạn logarit, song sinh khối tế bào lại đạt cao nhất ở giai đoạn ổn định vì khối lượng tế bào ở giai đoạn này lớn

2.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của nấm men trong điều kiện nuôi cấy thu sinh khối tế bào

2.7.1 Môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy thích hợp nhất cho nấm men cần có nguồn hydratcarbon, nguồn nitơ, phospho, một số nguyên tố vi lượng như K, Na, Mg, Ca

và vitamin

Dùng ngũ cốc làm nguồn nguyên liệu sản xuất sinh khối nấm men rất tốt Bột hoặc tinh bột các loại dùng vào mục đích này trước tiên phải thủy phân bằng acid hoặc enzyme của mầm mạ, của vi sinh vật để biến các polysacarit thành các

dạng đường mà nấm men đồng hóa được

Saccharomyces cerevisiae có khả năng phát triển trên môi trường mà nguồn

carbon duy nhất là tinh bột, phát triển dễ hơn trên môi trường đường với nguồn nguyên liệu được nấu chín thì tốt hơn Một số giống nấm men phân lập từ men thuốc bắc có khả năng sử dụng cả môi trường đường và môi trường tinh bột hoặc

cấy trực tiếp vào thức ăn sống mà vẫn phát triển tốt

Sau 48 giờ nuôi cấy trên môi trường cám, số lượng nấm men có thể đạt hàng chục triệu tế bào/ml dịch nuôi cấy (“Nấm men dùng trong chăn nuôi lợn”, 1970)

Môi trường rỉ đường hoặc dung dịch đường được acid hóa với pH = 4, bổ sung thành phần dinh dưỡng và duy trì nhiệt độ 25 – 300C, lượng sinh khối thu được khoảng 25 – 50 g/l (Trần Minh Tâm, 2002, trích từ Nguyễn Thị Hồng Phương, 2006)

Theo phòng vi sinh thuộc Viện Công Nghiệp Thực Phẩm, từ 1 m3 nước bã

rượu nuôi nấm men có thể thu được 10 – 15 kg men khô

Môi trường nước chiết giá đậu cũng được sử dụng để nuôi cấy nấm men do trong đậu chứa hàm lượng protein cao, là nguồn thức ăn tốt cho nấm men Ngoài ra, còn có các vitamin A1, B1, B2, C, E, K và các chất kích thích tố tăng trưởng khác Tuy nhiên, vitamin C trong nước chiết giá đậu có thể làm hạn chế sự phát triển của nấm men

Ngoài ra, môi trường thủy phân từ cellulose thực vật (gỗ, vỏ bào, rơm rạ, lõi

ngô, bã mía…), hay parafin từ dầu mỏ cũng có thể sử dụng để nuôi cấy nấm men

Đặc biệt, nấm men có khả năng sử dụng được môi trường dịch kiềm sulfit (chất thải của nhà máy giấy), thành phần chủ yếu là đường pentose Người ta tính được rằng, khoảng 5 tấn bột cellulose dùng sản xuất giấy sẽ thải một lượng dịch kiềm sulfit chứa khoảng 180 kg đường Dịch này hấp thụ nhiều oxy nên khi nuôi cấy nấm men có thể giảm mức cung cấp oxy tới 60% so với bình thường (Lương Đức Phẩm, 2006)

Hiện nay, môi trường được sử dụng để nuôi cấy nấm men phổ biến nhất vẫn

là môi trường rỉ đường 90% lượng sinh khối nấm men dùng bổ sung vào thức ăn chăn nuôi trên thế giới được sản xuất từ rỉ đường mía và củ cải đường Thành phần chính của loại nguyên liệu này là saccharose, khoảng 35 – 40% Trong đường mía chứa các chất sinh trưởng (biotin, acid pantotenic, inozit) với hàm lượng lớn, nhưng lại nghèo chất khoáng và các acid amin Vì vậy, khi sử dụng đường mía làm nguồn carbon nuôi cấy nấm men cần phải loại bỏ một phần các chất sinh trưởng, đồng thời

bổ sung các muối khoáng cần thiết và có thể phải thêm hỗn hợp các acid amin dạng protein thủy phân vào giai đoạn nhân giống Lượng đường trong môi trường khoảng

2 – 3%, không nên nhiều hơn hay ít hơn Nếu lượng đường cao sẽ vừa lãng phí và

vừa tạo ra những sản phẩm trao đổi chất khác, gây ức chế ngược đến quá trình tạo sinh khối Nếu lượng đường quá nhỏ sẽ không đủ nguồn carbon cần thiết cho sự tạo sinh khối Một điểm đáng lưu ý là hệ keo và các chất màu có trong mật rỉ Hệ keo

có trong mật rỉ được hình thành bởi protein và pectin, nó thường có độ nhớt cao và làm cản trở quá trình trao đổi chất của tế bào, gây ra hiện tượng thoái hóa, tế bào sẽ phát triển và sinh sản kém, dẫn đến hiệu suất sinh khối thu được thấp Các chất màu

có trong rỉ đường như hợp chất caramen, melanin…sẽ làm sinh khối nấm men có màu sẫm, ảnh hưởng đến cảm quan Vì thế, đặc biệt trong sản xuất men bánh mì

người ta phải xử lý rỉ đường trước khi nuôi cấy

2.7.2 Nhiệt độ

Mỗi vi sinh vật đều có khoảng nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng và phát

triển của chúng Với Saccharomyces cerevisiae, nhiệt độ tối ưu là 28 – 300C, trên

430C và dưới 280C thì sự sinh sản của nấm men chậm hoặc ngừng hẳn

Ở 300C, nấm men hoang dại phát triển nhanh hơn S cerevisiae 2 – 3 lần, ở

35 – 380C chúng phát triển nhanh hơn 6 – 8 lần

Ở nhiệt độ cao, hoạt tính của nấm men giảm nhanh; còn ở nhiệt độ thấp khoảng 20 – 230C, hạn chế được mức độ tạp nhiễm và khả năng lên men cao, kéo

dài hơn

2.7.3 pH của môi trường

pH tối ưu cho nấm men khoảng 4,5 – 5,6 Ở pH = 4, tốc độ tích luỹ sinh khối giảm, pH = 3 – 3,5 thì sự sinh sản của nấm men ngừng lại Mức độ hấp thụ chất dinh dưỡng vào tế bào, hoạt động của hệ thống enzyme, sự sinh tổng hợp protein đều bị ảnh hưởng bởi pH nên chất lượng của nấm men sẽ giảm đi nếu pH môi trường nằm ngoài khoảng 4,5 – 5,6

2.7.4 Tốc độ sục khí và khuấy trộn

Trong quá trình nuôi cấy, cần giữ cho dịch men liên tục bão hoà oxy hoà tan Ngừng cung cấp oxy trong 15 giây sẽ gây nên tác động âm trên hoạt động sống của

tế bào nấm men Oxy không khí di chuyển vào tế bào nấm men qua 2 giai đoạn: đầu tiên oxy được hoà tan vào môi trường nuôi cấy sau đó nấm men mới hấp thụ oxy vào trong tế bào

Về lý thuyết, cần 1,066 kg (0,764 m3) oxy để oxy hóa 1 kg đường, nhưng thực tế chỉ 1 phần nhỏ oxy bơm vào là được nấm men sử dụng, phần còn lại bị mất

đi do các quá trình tiếp xúc, nhiệt độ, nồng độ, độ nhớt của môi trường (Lao Thị Nga, 1987)

Khi nuôi cấy nấm men ở qui mô công nghiệp, kích thước của thiết bị nuôi cấy nấm men là tiền đề cần thiết, ảnh hưởng gián tiếp lên sự tăng trưởng của nấm

men

2.8 Cơ sở của việc sử dụng nấm men trong sản xuất và chế biến thức ăn

Nấm men có rất nhiều chủng loại khác nhau, đa dạng trong chuyển hóa và tổng hợp các chất hữu cơ, phạm vi phân bố và điều kiện sống như nhiệt độ, ẩm độ, ánh sáng, không khí… rộng nên dễ dàng chọn được các chủng có khả năng thích hợp với qui trình sản xuất và đáp ứng được yêu cầu đòi hỏi của thị trường

Có tốc độ phát triển nhanh, để tăng gấp đôi khối lượng cơ thể thì nấm men cần 1 – 2 giờ, vi khuẩn từ 20 – 60 phút, tảo từ 2 – 6 giờ, nấm sợi từ 4 – 12 giờ trong khi đó gà con cần 200 giờ, heo con cần 600 giờ, bê, nghé cần 1500 giờ (Nguyễn Lân Dũng, 1992)

Có khả năng phát triển trên nhiều nguồn dinh dưỡng khác nhau cho phép người ta sử dụng các nguồn dinh dưỡng sẵn có, rẻ tiền để sản xuất nhằm tăng sản lượng và giảm giá thành sản phẩm (Nguyễn Khắc Tuấn, 1996)

Không như nấm mốc, hầu hết nấm men không sinh độc tố trong môi trường

tự nhiên và môi trường nhân tạo, trừ 1 số loài gây bệnh như Candida albican

(Nguyễn Văn Hưng, 1990) Ngoài ra, khi lên men nấm men còn tạo mùi thơm đặc trưng cho rượu, bia

Nấm men cũng như vi sinh vật dễ gây đột biến bằng các tác nhân vật lý, hóa học, do đó có thể dùng kỹ thuật di truyền để biến đổi đặc điểm sinh học của nấm men theo hướng có lợi

Giá trị dinh dưỡng của nấm men rất lớn, đặc biệt là hàm lượng protein, acid amin và vitamin nhóm B trong nấm men rất cao, dễ tiêu hóa và hấp thụ

Với đặc điểm sinh lý của nấm men dễ dàng thiết lập dây chuyền công nghệ cao để khai thác các sản phẩm từ nấm men nhằm phục vụ nhu cầu thực tiễn

Trong 24 giờ 1 con bò nặng 300 kg được chăm sóc tốt cũng chỉ tăng trung bình khoảng 1,1 – 1,2 kg, trong đó có khoảng 120 g protein Nếu lấy 300 kg nấm men giống nuôi trong hệ thống lên men trong 24 giờ thì tạo 25.000 – 30.000 kg sinh khối, trong đó có khoảng 11.000 – 13.000 kg protein Rõ ràng ta thấy sự tích luỹ protein ở nấm men cao hơn nhiều so với ở heo, bò, gà vài nghìn lần và tương tự gấp vài trăm lần ở cây đậu, ngũ cốc (“Nấm men dùng trong chăn nuôi lợn”, 1970)

Trong nấm men có 1 số men tiêu hóa (amylase, protease…) và vitamin (đặc biệt là vitamin B) xúc tiến nhanh quá trình trao đổi chất, kích thích sự thèm ăn của gia súc Nhờ đó, công tác chăn nuôi thu được lợi nhuận cao

Tuy nhiên, sinh khối tế bào nấm men có nhược điểm là mặc dù hàm lượng protein cao khoảng 55 – 60%, nhưng đồng thời nó cũng chứa lượng acid nucleic quá cao (10%), điều này ảnh hưởng tới sức khoẻ con người Do đó, cần có các biện pháp làm giảm lượng acid nucleic này Ngoài ra, màng tế bào nấm men khá vững chắc nên cần có biện pháp thích hợp để phá vỡ màng khi thu protein

Bảng 2.1: Thành phần hóa học của nấm men (“Nấm men dùng trong chăn nuôi lợn”, 1970)

Bảng 2.2: Thành phần acid amin của nấm men (“Nấm men dùng trong chăn nuôi lợn”, 1970)

Bảng 2.3: Thành phần khóang của nấm men (“Nấm men dùng trong chăn nuôi lợn”, 1970)

bã dừa, vỏ chuối, bã mía…(Schoch JJ, 1982, trích từ Nguyễn Khắc Tuấn, 1996) Trước đây, người ta đã sử dụng nấm sợi để lên men song do vấn đề sinh độc tố

mycotoxin làm các nhà chăn nuôi e ngại Do đó, họ chú ý đến nấm men và 1 số vi khuẩn lên men truyền thống như vi khuẩn lactic (Rose A.H, 1981, trích từ Nguyễn Khắc Tuấn, 1996)

Chế phẩm ezyme vi sinh vật ngày nay được sản xuất ở qui mô công nghiệp các chế phẩm này ngày càng được sử dụng rộng rãi, trong chăn nuôi ezyme được dùng để sơ chế thức ăn, phân hủy các hợp chất phức tạp, làm tăng khả năng tiêu hóa cho gia súc

Gần đây, hãng dược Biocodex-Montronge (Pháp) cho ra sản phẩm men tiêu

hóa có tên Bioflor 250 có chứa 250mg tế bào nấm men S boulardii dùng để phòng

trị tiêu chảy, rối loạn tiêu hóa

2.9.2 Ở trong nước

Công tác nghiên cứu và ứng dụng nấm men trong chăn nuôi ở nước ta có thể nói được bắt đầu từ 1960 trở lại đây Bao gồm các lĩnh vực sản xuất sinh khối tế bào, lên men thức ăn bột đường và sản xuất chế phẩm sinh học

Năm 1975, Trần Đức Trân và Nguyễn Công Xuân đã sử dụng sinh khối nấm men được sản xuất từ rỉ đường của nhà máy đường Vạn Điểm để chăn nuôi heo với

tỷ lệ bổ sung 3 – 4% trong khẩu phần của heo 2 – 5 tháng tuổi đạt kết quả tốt (Nguyễn Khắc Tuấn, 1996)

Để tạo ra giống nấm men vừa có khả năng đường hóa cao vừa có khả năng tạo sinh khối lớn, Viện Kỹ Thuật Sinh Học thuộc Trung Tâm Khoa Học và Công Nghệ Quốc Gia Việt Nam đã nghiên cứu cấy chuyển gen amylase được tách từ

chủng Endomycopsis fibuligera và gây biến nạp cho Saccharomyces cerevisiae làm

cho nó có 2 đặc tính đường hóa cao và sinh tổng hợp protein cao dùng trong chế biến thức ăn (Trương Nam Hải, 1994, trích từ Nguyễn Khắc Tuấn, 1996)

Hiện nay, các nhà chăn nuôi khá quan tâm đến việc sử dụng chế phẩm sinh học bổ sung vào khẩu phần thức ăn cho gia súc, gia cầm Đặc trưng của các chế phẩm sinh học này là sự kết hợp của nhiều chủng loại vi sinh vật có ích như

Bacillus spp, Lactobacillus spp, Saccharomyces spp, các enzyme amylase,

protease…

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài

3.2.4 Môi trường nuôi cấy

Môi trường phân lập và giữ giống nấm men là môi trường Sabouraud

Môi trường khảo sát nuôi cấy là môi trường cám gạo, môi trường rỉ đường mía, môi trường nước chiết giá đậu

3.3 Nội dung nghiên cứu

Phân lập nấm men từ chế phẩm sinh học, men bánh mì, đu đủ, nho

Khảo sát sự phát triển của các chủng được phân lập từ 4 mẫu trên trong môi trường rỉ đường 60

B

Khảo sát sự phát triển của nấm men trong các loại môi trường nuôi cấy khác nhau

Khảo sát thời gian thu nhận sinh khối nấm men trong các loại môi trường trên

Khảo sát sự phối hợp nuôi cấy Saccharomyces cerevisiae và vi khuẩn Bacillus subtilis trên môi trường cám gạo và môi trường rỉ đường mía

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Phân lập nấm men

3.4.1.1 Mẫu chế phẩm sinh học và men bánh mì

Pha mẫu với 1 ít nước muối sinh lý 90/00 rồi đem cấy ria trên mặt thạch Sabouraud

Để ở nhiệt độ phòng trong vòng 24 – 48 giờ

Chọn những khuẩn lạc nghi ngờ có màu trắng đục, nhẵn bóng, đường kính khoảng 2 – 3 mm, bề mặt hơi lồi, rìa tròn, mọc rời đem nhuộm đơn để xem hình thái

3.4.1.2 Mẫu đu đủ và nho

Chọn những chỗ bị dập, hơi có mùi rượu rồi cấy ria trên mặt thạch Sabourand

Để ở nhiệt độ phòng trong 24 – 48 giờ

Chọn những khuẩn lạc nghi ngờ có màu trắng đục, nhẵn bóng, bề mặt hơi lồi, rìa tròn, mọc rời đem nhuộm đơn để xem hình thái

Sau khi xác định được đó là chủng nấm men thuộc giống Saccharomyces thì

đem cấy chuyền sang môi trường thạch nghiêng Sabouraud để tăng sinh

3.4.2 Thí nghiệm 1: Khảo sát sự phát triển của các chủng phân lập được trong môi trường rỉ đường 6 0 B

3.4.2.1 Mục đích

Từ các chủng của 4 nguồn mẫu trên, chọn chủng có khả năng sinh trưởng và phát triển mạnh để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo

3.4.2.2 Thông số cố định

Môi trường nuôi cấy: môi trường mật rỉ đường mía 60B

Thể tích môi trường nuôi cấy: 100ml

Nhiệt độ nuôi cấy: nhiệt độ phòng

Thời gian nuôi cấy: 36 giờ

Số lượng mẫu ban đầu

Có sục khí

3.4.2.3 Chỉ tiêu theo dõi

Số lượng tế bào nấm men trong 1 ml dịch nuôi cấy bằng phương pháp đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu

3.4.2.4 Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm bố trí 1 yếu tố, lặp lại 2 lần với 4 nghiệm thức

Mẫu phẩm Chế

Men bánh mì Đu đủ Nho Lần 1

Lần 2

3.4.3 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy và thời gian

thu hoạch lên sự sinh trưởng của nấm men Saccharomyces

Từ kết quả thí nghiệm 1, chúng tôi chọn 2 chủng có khả năng sinh trưởng tốt nhất làm đối tượng nghiên cứu cho thí nghiệm 2

3.4.3.1 Mục đích

Tìm ra môi trường nuôi cấy và thời gian thu hoạch thích hợp cho số lượng tế bào nấm men lớn nhất

3.4.3.2 Thông số cố định

Thể tích môi trường nuôi cấy: 300ml

Nhiệt độ nuôi cấy: nhiệt độ phòng

Số lượng mẫu ban đầu

Có sục khí

3.4.3.3 Chỉ tiêu theo dõi

Số lượng tế bào nấm men trong 1 ml bằng phương pháp đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu, đơn vị tính tb/ml

Số lượng tế bào nấm men sống trong 1g chế phẩm sau 22 ngày bảo quản ở nhiệt độ phòng bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trên môi trường thạch Sabouraud, đơn vị tính là cfu/g

Phương pháp đếm tế bào trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu chỉ cho biết tổng

số tế bào trong dịch nuôi cấy (bao gồm cả số tế bào sống và tế bào chết) Với mục đích nuôi cấy nấm men dùng làm chế phẩm sinh học nên yêu cầu số lượng tế bào sống trong chế phẩm phải cao Phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa cho phép xác định số lượng tế bào nấm men sống trong chế phẩm, từ đó ta có thể đánh giá các yếu tố ảnh hưởng đến sức sống của nấm men trong chế phẩm