Nghiên cứu chất màu tự nhiên từ cây bụp giấm (hibiscus sabdariffa l ) tại việt nam

II-NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: -Khảo sát quy trình và điều kiện trích ly anthocyanin từ đài hoa bụp giấm Hibiscus Sabdariffa L., họ Malvaceae tại Việt Nam -Khảo sát độ bền màu của anthocyanin

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

_oOo _

ĐỖ TƯỜNG HẠ

NGHIÊN CỨU CHẤT MÀU TỰ NHIÊN TỪ

CÂY BỤP GIẤM (Hibiscus Sabdariffa L.)

TẠI VIỆT NAM (PHỤ LỤC)

CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ HÓA HỮU CƠ

LUẬN VĂN THẠC SĨ

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ và tên học viên: ĐỖ TƯỜNG HẠ Phái: Nữ

Ngày, tháng, năm sinh: 24 / 5/ 1978 Nơi sinh: Long An

Chuyên ngành: Công Nghệ Hóa Học

I-TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu chất màu anthocyanin từ cây bụp giấm (Hibiscus

Sabdariffa L.) tại Việt Nam

II-NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

-Khảo sát quy trình và điều kiện trích ly anthocyanin từ đài hoa bụp giấm

Hibiscus Sabdariffa L., họ Malvaceae tại Việt Nam

-Khảo sát độ bền màu của anthocyanin

-Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của hợp chất anthocyanin

-Xác định cấu trúc của anthocyanin cô lập được

IV-NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: / /2002

V-HỌ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS.TS Trần Thị Việt Hoa

TS Phạm Thành Quân

VI- HỌ TÊN CÁN BỘ CHẤM NHẬN XÉT 1:

VII- HỌ TÊN CÁN BỘ CHẤM NHẬN XÉT 2:

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CÁN BỘ NHẬN XÉT 1 CÁN BỘ NHẬN XÉT 2

Nội dung và đề cương Luận văn thạc sĩ đã được Hội đồng chuyên ngành thông qua

Ngày tháng năm

TRƯỞNG PHÒNG ĐÀO TẠO SĐH CHỦ NHIỆM NGÀNH

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

-

Độc Lập- Tự Do- Hạnh Phúc -

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH

Cán bộ hướng dẫn khoa học:

PGS TS TRẦN THỊ VIỆT HOA

TS PHẠM THÀNH QUÂN

Cán bộ chấm nhận xét 1:

Cán bộ chấm nhận xét 2:

Luận văn được bảo vệ tại HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ngày …… tháng …… năm 2003

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn:

-Cô Trần Thị Việt Hoa, thầy Phạm Thành Quân đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm bổ ích trong quá trình học tập và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt thời gian thực hiện luận văn này

- Các thầy cô trong Hội đồng Bảo vệ Luận văn đã đóng góp những nhận xét chân thành cho kết quả đạt được của Luận văn

- Các thầy cô trong Khoa Công Nghệ Hóa Học & Dầu Khí, trường Đại Học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh đã giảng dạy, truyền đạt những kiến thức quí báu trong thời gian em làm luận văn cũng như trong những năm qua

- Các thầy cô và các bạn đồng nghiệp Khoa Khoa học ứng dụng Trường Đại học Bán công Tôn Đức Thắng đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện tốt đề tài

- Trung Tâm Dịch Vụ Phân Tích & Thí Nghiệm, Phòng Thí nghiệm Hóa Phân Tích, Trường Đại Học Bách khoa Tp HCM, Viện công nghệ Hóa học đã giúp đỡ tôi trong quá trình phân tích sản phẩm

-Các thầy cô phòng Quản Lý Khoa Học- Sau Đại Học đã giúp đỡ tôi về vấn đề học vụ, thủ tục trong thời gian học

-Sinh viên Đỗ Thị Thu Thủy đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình tiến hành thực nghiệm

-Bạn Châu Thanh Tâm, và các bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ và hỗ trợ nhiệt tình trong quá trình thực hiện luận án

TÓM TẮT

Anthocyanin là chất màu tự nhiên được trích từ hoa bụp giấm Hibiscus Sabdariffa L.,

trồng tại Việt Nam Anthocyanin có màu đỏ trong môi trường acid, không độc hại và có nhiều hoạt tính sinh học Anthocyanin được ứng dụng nhiều trong thực phẩm, được phẩm và mỹ phẩm

Kết quả của luận văn:

- Quy trình trích ly anthocyanin từ bột đài hoa bụp giấm tiến hành trong dung môi etanol 70% – HCOOH 1% (85:15 v/v) ở nhiệt độ sôi, với tỉ lệ khối lượng nguyên liệu và thể tích dung môi là 1:8 (g:ml) trong 1 giờ

- Anthocyannin được cô lập bằng phương pháp sắc ký cột và xác định cấu trúc bằng các phương pháp phân tích hóa lý : UV – VIS, LC – MS

- Độ bền của anthocyanin :

Độ bền màu của anthocyanin theo pH được khảo sát với 3 hệ dung môi trích ly : EtOH – CH3COOH, EtOH – HCOOH, EtOH – HCl

Ở cả 3 hệ dung môi khảo sát, khi pH thay đổi màu sắc của anthocyanin cũng thay đổi : đỏ ở pH acid (pH < 2), đỏ nâu ở pH trung gian (pH 4-5), nâu nhạt ở pH cao (pH >5) Trong các hệ dung môi trích ly, dung dịch anthocyanin có độ hấp thu A và cường độ màu cao nhất ở pH 1 – 2 và dung dịch anthocyanin bền theo thời gian và nhiệt độ

Khi tăng pH từ 2 – 4 thì độ hấp thu A giảm mạnh Ở pH >4 thì dung dịch không còn màu đỏ

Cần có phương pháp bền hóa hợp chất màu anthocyanin để có thể dùng trong công nghiệp thay thế các chất màu tổng hợp, cũng là xu hướng mới hiện nay

ABSTRACT

Anthocyanin is a natural color extracted from sepal of Hibiscus Sabdariffa L

which is grown in Vietnam Anthocyanin is red color in acid medium, harmless and has many bio-activities It is applied in foodstuff, medicine and comestics

The results of thesis:

- The process to extract anthocyanin from sepal of Hibiscus Sabdariffa L is

conducted on ethanol 70% -HCOOH 1% (85:15 v/v) at boiling point, with liquor ratio is 1:8 (g:ml) for 1 hour

- Anthocyanin is isolated by column chromatgraphy and determined structures by physical chemistry analysis methods: UV-VIS, LC-MS

The stability of anthocyanin from sepal of Hibiscus Sabdariffa L was tested by

3 extract solvent compounds: EtOH – CH3COOH, EtOH – HCOOH, EtOH – HCl With 3 extract compounds, when pH changes the color of anthocyanin also change: red in acid pH, purple in intermediate pH (pH 4-5) , light brown in high pH (pH > 5) In 3 extract compounds, the anthocyanin solution has its highest absorbance and color power at pH 1-2 and it stabalises with time and temperature When increased the pH from 2-4 the absorbance decreased sharply When pH

>4 the solution is colorless

It is required a method to stablise anthocyanin which can be applied in industry

to replace synthesis color The uses of natural color are new trend nowadays

MỤC LỤC

Trang NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

LỜI CẢM ƠN

TÓM TẮT

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ, HÌNH

MỞ ĐẦU 1

PHẦN 1: TỔNG QUAN I.1 GIỚI THIỆU CÂY BỤP GIẤM 2

I.1.1 Tên gọi 2

I.1.2 Đặc điểm thực vật 2

I.1.3 Phân loại 4

I.1.4 Phân bố và thời vụ 4

I.1.5 Thành phần hóa học 4

I.2 ĐẠI CƯƠNG VỀ FLAVONOID 6

I.2.1 Định nghĩa 6

I.2.2 Phân bố trong tự nhiên 6

I.2.3 Phân loại flavonoid 7

I.3 HỢP CHẤT ANTHOCYANIN 9

I.3.1 Công thức cấu tạo 9

I.3.2 Sự phân bố 9

I.3.3 Cấu trúc chuyển hóa 10

I.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến độ bền màu của anthocyanin 11

I.3.5 Tính chất hóa học 18

I.4 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU, ỨNG DỤNG CỦA ANTHOCYANIN 20

PHẦN II : PHƯƠNG PHÁP & KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU 32

II.1 XỬ LÝ VÀ ĐÁNH GIÁ NGUYÊN LIỆU 34

II.1.1 Xử lý nguyên liệu 34

II.1.2 Xác định độ ẩm 34

II.1.3 Xác định các thành phần có hoạt tính sinh học trong đài hoa bụp giấm

ANTHOCYANIN 36

II.2.1 Khảo sát dung môi trích ly 36

II.2.1.1 Khảo sát sự thay đổi nồng độ dung môi 36

II.2.1.2 Khảo sát tỉ lệ thể tích dung môi/ khối lượng nguyên liệu 42

II.2.2 Khảo sát thời gian trích ly 45

II.2.3 Khảo sát nhiệt độ trích ly 48

II.3 KHẢO SÁT ĐỘ BỀN MÀU CỦA ANTHOCYANIN 54

II.3.1 Khảo sát độ bền của anthocyanin theo pH 55

II.3.2 Khảo sát độ bền của anthocyanin theo thời gian 66

II.3.3 Khảo sát độ bền của anthocyanin theo nhiệt độ 80

II.4 TINH CHẾ, CÔ LẬP VÀ NHẬN DANH ANTHOCYANIN 89

II.4.1 Tinh chế anthocyanin qua sắc ký cột 89

II.4.1.1 Hệ dung môi khai triển sắc ký cột : n-BuOH-AcOH-H 2 O (4:1:1) 89

II.4.1.2 Hệ dung môi khai triển sắc ký cột : acid formic 5%-EtOH 80%-H 2 O 91

II.4.1.3 Hệ dung môi khai triển sắc ký cột : acid acetic 5%-EtOH 80%-H 2 O 93

II.4.2 Kết quả nhận danh bằng phổ LC – MS 94

II.5 KHẢO SÁT SƠ BỘ HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA ANTHOCYANIN 97

PHẦN III THỰC NGHIỆM III.1 XỬ LÝ VÀ ĐÁNH GIÁ NGUYÊN LIỆU 100

III.1.1 Xử lý nguyên liệu 100

III.1.2 Xác định độ ẩm 100

III.1.3 Xác định các thành phần có hoạt tính sinh học trong đài hoa bụp giấm bằng phương pháp hóa sơ bộ thực vật 100

III.2 NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP VÀ ĐIỀU KIỆN TÁCH CHIẾT ANTHOCYANIN 106

III.2.1 Hệ thống trích ly anthocyanin 106

III.2.2 Khảo sát dung môi trích ly 107

III.2.2.1 Khảo sát sự thay đổi nồng độ dung môi 107

III.2.2.2 Khảo sát sự thay đổi tỉ lệ thể tích dung môi/ khối lượng nguyên liệu 107

III.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hàm lượng màu 108

III.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến hàm lượng màu 108

III.3 KHẢO SÁT ĐỘ BỀN MÀU CỦA ANTHOCYANIN 109

III.3.1 Khảo sát độ bền màu của anthocyanin theo pH 109

III.3.1.1 Cách pha dung dịch đệm 109

III.4 TINH CHẾ , CÔ LẬP VÀ NHẬN DANH ANTHOCYANIN 111

III.4.1 Tinh chế cô lập anthocyanin qua sắc ký cột 111

III.4.2 Nhận danh anthocyanin 112

III.4.2.1 Phản ứng màu 112

III.4.2.2 Sắc ký lớp mỏng 112

III.4.2.3 Đo phổ hấp thu UV – VIS 112

III.4.3 Nhận danh bằng phổ LC – MS 112

III.5 KHẢO SÁT SƠ BỘ HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA ANTHOCYANIN 113

PHẦN 4 : KẾT LUẬN 114

TÀI LIỆU THAM KHẢO 117

TÓM TẮT LÝ LỊCH TRÍCH NGANG

Đồ thị 1: Đồ thị biểu diễn sự biến đổi độ hấp thu A theo nồng độ CoSO 4 7H 2 O

ở bước sóng λ = 535nm 39

Đồ thị 2:Khảo sát độ hấp thu A của dung dịch anthocyanin theo sự thay đổi nồng độ dung môi trích ly 40

Đồ thị 2’:Khảo sát độ hấp thu A của dung dịch anthocyanin theo sự thay đổi nồng độ dung môi trích ly 41

Đồ thị 3: Khảo sát hàm lượng màu theo nồng độ cồn trong dịch trích 41

Đồ thị 4: Khảo sát sự thay đổi độ hấp thu A theo tỷ lệ thể tích dung môi / khối lượng nguyên liệu 43

Đồ thị 4’: Khảo sát sự thay đổi độ hấp thu A theo tỷ lệ thể tích dung môi /khối lượng nguyên liệu 44

Đồ thị 5: Khảo sát hàm lượng màu theo tỷ lệ thể tích dung môi /khối lượng nguyên liệu 44

Đồ thị 6: Khảo sát độ hấp thu A theo thời gian trích ly anthocyanin 46

Đồ thị 6’: Khảo sát độ hấp thu A theo thời gian trích ly anthocyanin 47

Đồ thị 7: Khảo sát hàm lượng màu trong dung dịch theo thời gian trích ly 47

Đồ thị 8: Khảo sát nhiệt độ trích ly anthocyanin 49

Đồ thị 8’: Khảo sát nhiệt độ trích ly anthocyanin 50

Đồ thị 9: Khảo sát hàm lượng màu theo nhiệt độ trích ly 50

Đồ thị 10: So sánh độ hấp thu A của dịch trích anthocyanin với các hệ dung môi trích ly khác nhau 52

Đồ thị 11: So sánh hàm lượng màu của dịch trích anthocyanin với các hệ dung môi trích ly khác nhau 52

Đồ thị 12: Sự biến đổi độ hấp thu A của dung dịch anthocyanin theo pH – hệ dung môi trích ly EtOH - CH 3 COOH 56

Đồ thị 13: Sự biến đổi độ hấp thu A của dung dịch anthocyanin theo pH – hệ dung môi trích ly EtOH - HCOOH 57

Đồ thị 14: Sự biến đổi độ hấp thu A của dung dịch anthocyanin theo pH – hệ dung môi trích ly EtOH - HCl 58

Đồ thị 15: So sánh sự biến đổi độ hấp thu của dung dịch anthocyanin theo pH, tại λmax với các hệ dung môi trích ly khác nhau 62

Đồ thị 16: Sự biến đổi cường độ màu của dung dịch anthocyanin theo pH ở các hệ dung môi EtOH - HCOOH và EtOH – HCl 63

Đồ thị 17: Khảo sát độ bền màu của các dung dịch anthocyanin ở các pH khác nhau theo thời gian hệ dung môi EtOH - CH 3 COOH 66

Đồ thị 18: Khảo sát độ bền màu của các dung dịch anthocyanin ở các pH khác nhau theo thời gian – hệ dung môi EtOH - HCOOH 67

Đồ thị 19: Sự biến đổi cường độ màu của dung dịch anthocyanin ở các pH khác nhau theo thời gian – hệ dung môi EtOH - HCOOH 69

nhau theo thời gian – hệ dung môi EtOH - HCl 73

Đồ thị 22: Sự biến đổi độ hấp thu A của dung dịch anthocyanin theo thời gian

bán hủy ; hệ dung môi trích ly EtOH – HCOOH 75

Đồ thị 23: Sự biến đổi cường độ màu của dung dịch anthocyanin theo thời gian

bán hủy – hệ dung môi EtOH - HCOOH 76

Đồ thị 24: Khảo sát độ bền màu của các dung dịch anthocyanin theo thời gian

bán hủy – hệ dung môi EtOH - HCl 77

Đồ thị 25: Sự biến đổi cường độ màu của dung dịch anthocyanin theo thời gian

bán hủy – hệ dung môi EtOH - HCl 78

Đồ thị 26: Sự biến đổi độ hấp thu A của dung dịch anthocyanin theo nhiệt độ –

hệ dung môi EtOH - CH 3 COOH 81

Đồ thị 27: Sự biến đổi độ hấp thu A của dung dịch anthocyanin theo nhiệt độ –

hệ dung môi EtOH - HCOOH 82

Đồ thị 28: Sự biến đổi độ hấp thu A của dung dịch anthocyanin theo nhiệt độ –

hệ dung môi EtOH - HCl 84

Đồ thị 29: Sự biến đổi độ hấp thu A theo nhiệt độ của dung dịch anthocyanin ở

các dung môi trích ly khác nhau 85

Đồ thị 30: Sự biến đổi màu sắc theo nhiệt độ của dung dịch anthocyanin ở các

dung môi trích ly khác nhau 86

Đồ thị 29’: Sự biến đổi độ hấp thu A theo nhiệt độ của dung dịch anthocyanin ở

các dung môi trích ly khác nhau 87

Đồ thị 31: Khảo sát độ hấp thu theo bước sóng của các phân đoạn I,II sau khi

qua sắc ký cột 90

Đồ thị 32: Khảo sát độ hấp thu theo bước sóng của phân đoạn III (sau khi

gộp phân đoạn 10+11) sau khi qua sắc ký cột 90

Đồ thị 33 : Khảo sát độ hấp thu A theo bước sóng của hai phân đoạn nhỏ 5,6

sau khi qua cột 91

Đồ thị 34: % oxy hóa acid linoleic với sự có mặt của anthocyanin ở các nồng

độ khác nhau theo phương pháp thiocyanat, ngày thứ 10 99

Trang

Sơ đồ 1 : Sơ đồ nghiên cứu 33

Sơ đồ 2 : Qui trình trích ly anthocyanin 37

Sơ đồ 3: Khảo sát độ bền màu của dung dịch anthocyanin theo pH 55

Sơ đồ 4: Khảo sát độ bền màu của dung dịch anthocyanin theo nhiệt độ 80

Sơ đồ 5: Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của anthocyanin 97

Hình 1 : Cây bụp giấm Hibiscus Sabdariffa L 3

Hình 2 : Đài hoa bụp giấm Hibiscus Sabdariffa L 3

Hình 3 : Cation flavylium 9

Hình 4: Cấu trúc chuyển hóa của anthocyanin trong nước 11

Hình 5: Sự biến tính nhiệt của anthocyanin 3,5 – diglucosid ở pH = 3,7 14

Hình 6: Sự chuyển hóa malvin thành malvon với điều kiện có H 2 O 2 15

Hình 7 : Sự biến tính của anthocyanin với phản ứng oxy hóa catechol 16

Hình 8 : Phản ứng ngưng tụ của cyanidin và furfural 17

Hình 9: Phản ứng của anthocyanin như là chất khử cực catod trong đồ hộp thiếc 17 Hình 10: Không gian hệ màu CIELCH 54

Hình 11: Cấu trúc chuyển hóa của anthocyanin trong môi trường acid hoặc trung tính 61

Hình 12: Kết quả phân tích sắc ký lớp mỏng của các phân đoạn qua sắc ký cột với hệ dung môi n-BuOH – AcOH – H 2 O (4:1:1) 89

Hình 13: Kết quả phân tích sắc ký lớp mỏng của các phân đoạn sắc ký cột với hệ dung môi giải ly CH 3 COOH 5% - EtOH 80% - H 2 O 94

Hình 14 : Thiết bị trích ly – đun hoàn lưu 106

Bảng 1: Các anthocyanin tồn tại trong tự nhiên 10

Bảng 2: Ảnh hưởng của cấu trúc lên tính bền của một số pigment điển hình ở 250C, pH =2.8 13

Bảng 3: Aûnh hưởng của Ethrel lên màu sắc (CIRG index), hàm lượng anthocyanin tổng (mg/ 100 gfw) và % anthocyanin thành phần từ kết quả xử lý với CEPA 22

Bảng 4: Aûnh hưởng của paclobutrazol trên màu sắc (CIRG), hàm lượng anthocyanin tổng (mg/ 100gfw) và % các anthocyanin thành phần 23

Bảng 5 : Kết quả xác định độ ẩm nguyên liệu 34

Bảng 6: Kết quả phân tích sơ bộ hóa thực vật 35

Bảng 7: Kết quả khảo sát sự thay đổi độ hấp thu A của dung dịch anthocyanin theo nồng độ EtOH trong dung môi trích ly 39

Bảng 8: Kết quả khảo sát hàm lượng màu trong dung dịch anthocyanin theo sự thay đổi nồng độ EtOH 40

Bảng 9: Khảo sát sự thay đổi theo tỷ lệ thể tích dung môi /khối lượng nguyên liệu 42

Bảng 10: Kết quả khảo sát hàm lượng màu theo tỉ lệ thể tích dung môi/ khối lượng nguyên liệu 43

Bảng 11: Kết quả khảo sát độ hấp thu A theo thời gian trích ly anthocyanin 45

Bảng 12: Khảo sát hàm lượng màu trong dung dịch theo thời gian trích ly 46

Bảng 13 : Kết quả khảo sát sự thay đổi độ hấp thu A theo nhiệt độ trích ly 48

Bảng 14: Kết quả khảo sát hàm lượng màu trong dung dịch theo nhiệt độ trích ly 49

Bảng 15: Độ hấp thu A và hàm lượng màu C của dịch trích anthocyanin với các hệ dung môi trích ly khác nhau 51

Bảng 16: Kết quả khảo sát độ hấp thu A của dung dịch anthocyanin tại các pH khác nhau, với λmax = 520 nm - hệ dung môi trích ly EtOH - CH 3 COOH 56

Bảng 17: Kết quả khảo sát độ hấp thu A của dung dịch anthocyanin tại các pH khác nhau, với λmax = 520 nm - hệ dung môi trích ly EtOH – HCOOH 57

Bảng 18: Sự biến đổi màu sắc của dung dịch anthocyanin theo pH – hệ dung

khác nhau, với λmax = 520 nm – hệ dung môi trích ly EtOH - HCl 59

Bảng 20: Sự biến đổi màu sắc của dung dịch anthocyanin theo pH – hệ dung

môi EtOH - HCl 59

Bảng 21: Sự biến đổi độ hấp thu A của dung dịch anthocyanin theo pH, tại λmax

520nm – với các hệ dung môi trích ly khác nhau 62

Bảng 22: Sự biến đổi cường độ màu của dung dịch anthocyanin theo pH ở các

hệ dung môi EtOH - HCOOH và EtOH – HCl 63

Bảng 23: Kết quả khảo sát độ hấp thu A của dung dịch anthocyanin theo thời

gian tại các pH khác nhau, với λmax = 520 nm – hệ dung môi EtOH

- CH 3 COOH 65

Bảng 24: Kết quả khảo sát độ hấp thu A của dung dịch anthocyanin theo thời

gian tại các pH khác nhau, với λmax = 515 nm, hệ dung môi EtOH - HCOOH 67

Bảng 25: Sự biến đổi màu sắc của dung dịch anthocyanin ở các pH khác nhau

theo thời gian – hệ dung môi EtOH - HCOOH 68

Bảng 26: Kết quả khảo sát độ hấp thu A của dung dịch anthocyanin theo thời

gian tại các pH khác nhau, với λmax = 520 nm, hệ dung môi EtOH - HCl 70

Bảng 27: Sự biến đổi màu sắc của dung dịch anthocyanin ở các pH khác nhau

theo thời gian – hệ dung môi EtOH - HCl 71

Bảng 28: Kết quả khảo sát độ hấp thu A của dung dịch anthocyanin theo thời

gian tại pH 1 và pH 3, với λmax = 520 nm, hệ dung môi EtOH - HCOOH 75

Bảng 29: Sự biến đổi màu sắc của dung dịch anthocyanin theo thời gian bán

hủy – hệ dung môi EtOH - HCOOH 76

Bảng 30: Kết quả khảo sát độ hấp thu A của dung dịch anthocyanin theo thời

gian tại các pH khác nhau, với λmax = 520 nm, hệ dung môi EtOH - HCl 77

Bảng 31: Sự biến đổi màu sắc của dung dịch anthocyanin theo thời gian bán

hủy – hệ dung môi EtOH - HCl 78

Bảng 32: Sự biến đổi độ hấp thu A (tại λmax = 535nm) theo nhiệt độ của dung

dịch anthocyanin – hệ dung môi EtOH - CH 3 COOH 81

Bảng 33: Sự biến đổi màu sắc của dung dịch anthocyanin theo nhiệt độ – hệ

dung môi EtOH - CH 3 COOH 82

Bảng 34: Sự biến đổi độ hấp thu A (tại λmax = 535nm) theo nhiệt độ của dung

dung môi EtOH - HCOOH 83

Bảng 36: Sự biến đổi độ hấp thu A (tại λmax = 535nm) theo nhiệt độ của dung

dịch anthocyanin – hệ dung môi EtOH - HCl 84

Bảng 37: Sự biến đổi màu sắc của dung dịch anthocyanin theo nhiệt độ – hệ

dung môi EtOH - HCl 84

Bảng 38: Sự biến đổi độ hấp thu A theo nhiệt độ của dung dịch anthocyanin ở

các dung môi trích ly khác nhau 85

Bảng 39: Sự biến đổi màu sắc theo nhiệt độ của dung dịch anthocyanin ở các

dung môi trích ly khác nhau 86

Bảng 40: Kết quả tinh chế anthocyanin qua sắc ký cột với hệ dung môi

n-BuOH – AcOH – H 2 O (4:1:1) 89

Bảng 41: Kết quả tinh chế anthocyanin qua sắc ký cột hệ acid formic 5%-

EtOH 80 0 – H 2 O 91

Bảng 42: Kết quả khảo sát độ hấp thu ở các bước sóng cực đại, hàm lượng

màu của các phân đoạn sau khi qua sắc ký cột với hai hệ dung môi n-BuOH:AcOH:H 2 O và acid formic 5%- EtOH 80 0 – H 2 O 92

Bảng 43: Kết quả tinh chế anthocyanin qua sắc ký cột hệ acid acetic 5% -

EtOH 80 0 – H 2 O 93

Bảng 44: Sự thay đổi độ hấp thu tại bước sóng 485 nm theo thời gian oxy hóa

acid linoleic với anthocyanin có các hàm lượng khác nhau theo phương pháp thiocyanat 98

Bảng 45: Hoạt tính kháng oxy hóa của anthocyanin ở các nồng độ khác nhau

sau 10 ngày oxy hóa acid linoleic theo phương pháp thiocyanat 98

MỞ ĐẦU

Trong lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm, màu sắc làm cho sản phẩm đa dạng và cũng là yếu tố hấp dẫn người tiêu dùng Tuy nhiên trong những năm gần đây có nhiều nghiên cứu cho thấy các chất màu tổng hợp – vốn được sử dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp do màu sắc tươi và bền với các điều kiện gia công chế biến – có nhiều tác dụng phụ có hại cho cơ thể khi sử dụng Chính vì thế mà hiện nay trên thế giới có xu hướng quay trở lại sử dụng nguồn chất màu tự nhiên

Việc sử dụng chất màu tự nhiên mang lại nhiều ưu điểm Bên cạnh ưu điểm về kinh tế do sử dụng nguồn nguyên liệu dồi dào, rẻ tiền thì việc sử dụng chất màu tự nhiên còn có tác động tích cực đến môi trường do tính chất dễ phân hủy sinh học của chúng Chất màu tự nhiên không những không gây tác dụng độc hại mà còn có thể có những tác dụng sinh học có lợi cho cơ thể Tuy nhiên chất màu tự nhiên có điểm hạn chế là không bền, dễ bị biến đổi dưới tác động của môi trường

Việt Nam thuộc khu vực nhiệt đới, có nguồn tài nguyên thực vật vô cùng phong phú, nhưng việc khai thác chủ yếu chỉ tập trung vào dịch trích hoặc dược liệu khô trong chế biến thức ăn hoặc làm thuốc chữa bệnh Vấn đề của chúng ta hiện nay là đẩy mạnh việc nghiên cứu khoa học nhằm phát hiện, sàng lọc và sử dụng hiệu quả hơn nguồn thực vật giá trị hiện có ở nước ta

Đối tượng nghiên cứu là cây bụp giấm (Hibiscus Sabdariffa L.) tại Việt Nam Trong đài hoa bụp giấm có chứa màu đỏ anthocyanin có hàm lượng khá lớn Ngoài tác dụng tạo màu, anthocyanin còn có những tác dụng sinh học rất tốt Với đề tài này chúng tôi sẽ nghiên cứu quy trình trích ly, tinh chế anthocyanin, khảo sát độ bền màu và hoạt tính kháng oxy hóa của anthocyanin nhằm có thể có những phương pháp bền hóa chúng nhằm khai thác và sử dụng chất màu đạt hiệu quả hơn

I.1 GIỚI THIỆU CÂY BỤP GIẤM :

I.1.1 Tên gọi :[4,11,32]

Cây bụp giấm có tên khoa học là: Hibiscus Sabdariffa.L, thuộc họ bông

Malvaceae Còn gọi là cây giấm, cây đay Nhật hay cây khế rừng, cùng họ với họ bông bụp

I.1.2 Đặc điểm thực vật :[4,11,32]

Cây sống một năm, cao 1,5-2m, phân nhánh gần gốc, thân bóng, màu tím nhạt Lá ở thấp có hình oval, lá ở cao hơn có hình chân vịt, có dạng thùy, nguyên, mép có răng, không có lông

Hoa đơn độc mọc ở nách hoặc ở cuối cành, gần như không cuống Tiểu đài

8-12, hình sợi, phần dưới hợp, có lông nhỏ Đài hợp, có lông nhỏ, phiến nhọn đều, nửa dưới màu tím nhạt Tràng màu vàng, hồng hay tía, có khi trắng

Quả nang, hình trứng, có lông thô, mang đài màu đỏ sáng tồn tại bao quanh quả

Ra hoa từ tháng 7 đến tháng12 Mỗi vụ kéo dài 4-5 tháng

Bộ phận dùng: Lá, hạt, đài hoa (Folium, Semen et Calyx Hibisci)

Gốc ở Tây Phi, được trồng để lấy đọt và đài hoa dùng làm rau chua

Ở nước ta cây sống chủ yếu trên các vùng cao nhiều nắng, trên các gò, ruộng Người dân cũng dùng đọt, lá và đài hoa để nấu canh chua

Đài hoa phơi khô dùng để hãm nước uống như trà, bảo quản được lâu, sau khi ngâm nước trở lại trạng thái tươi

Hình 1 : Cây bụp giấm Hibiscus Sabdariffa L

Hình 2 : Đài hoa bụp giấm Hibiscus Sabdariffa L

I.1.3 Phân loại :[4,32]

Có hơn 300 loài cây thuộc họ Hibiscus trên thế giới, chủ yếu được trồng ở vùng nhiệt đới hoặc cận nhiệt đới Cây bụp giấm Hibiscus Sabdariffa L có nhiều tên gọi

khác nhau như : Jamaican Sorrel, Roselle, Cabitutu, Vinuela, Oseille de Guinée, và

Karkade Hầu hết các loài cây Hibiscus được trồng làm cây trang trí, nhưng đài hoa màu đỏ của loại Sabdariffa được dùng để sấy khô và ủ trà, cũng có thể sử dụng đài hoa bụp giấm Sabdariffa trong quá trình chế biến nước trái cây, nước quả nấu đông,

mứt, kem hoặc làm hương vị Hạt dùng để lấy dầu và thân cây còn có thể dùng làm thuốc Ở Tây Phi, lá và bột của hạt có thể ăn được

I.1.4 Phân bố và thời vụ : [4,11]

Cho đến nay cây chỉ trồng bằng cách gieo hạt Lợi dụng mùa mưa đến là người

ta gieo hạt để khỏi tốn công tưới Trước khi gieo đất cũng được cày xới và bón phân trước Cứ mỗi hè đến người ta lấy hạt gieo và đến tháng 10 thu hoạch

I.1.5 Thành phần hóa học : [4,9,10,32]

I.1.5.1 Quả bụp giấm :

Mỗi 100 gam, quả chứa 49 calori, 84,5% H2O ; 1,9% protein ; 0,1% chất béo ; 12,3% carbohydrat toàn phần ; 2,3% sợi ; 1,2% tro ; 1,72%o Ca ; 57%o P ; 2,9%o Fe ; 300μg β - caroten cân bằng và 14%o acid ascorbic Quả sấy khô cũng chứa vitamin C và canxi oxalat ; cánh hoa sấy khô có chứa flavonol glucosid hibiscitrin

I.1.5.2 Lá bụp giấm :

100g lá chứa 43 calori ; 85,6% H2O ; 3,3% protein ; 0,3% chất béo ; 9,2% carbohydrat toàn phần ; 1,6% sợi ; 1,6% tro ; 213%o Ca ; 93%o P ; 4,8%o Fe ; 4135μg

β - caroten cân bằng; 0,17%o thiamin ; 0,45%o riboflavin ; 1,2%o niacin ; và 54%o

acid ascorbic Lá non chứa: 3,3% protein; 9,2% bột đường; 213%o calorin; 93%o

photpho; 4,8 %o sắt; 4,135% beta caroten; 0,17 %o sinh tố B1

Rễ chứa saponin và acid tartaric

I.1.5.3 Hoa bụp giấm :

Trên 100 gam cụm hoa bụp giấm có chứa 44 calori ; 86,2% H2O ; 1,6% protein ; 0,1% chất béo ; 11,1% carbohydrat toàn phần ; 2,5% sợi ; 1,0% tro ; 160%o Ca ; 60%o P ; 3,8%o Fe ; 285μg β - caroten cân bằng; 0,04%o thiamin ; 0,6%o riboflavin ; 0,5%o niacin ; và 14%o acid ascorbic

Karkade (hoa đã sấy không có bầu nhụy hoa) có chứa 13,0% hỗn hợp acid citric và malic ; hai anthocyanin gossipetin (hydroxyflavon) và hibiscitrin ; và 0,004 – 0,005% acid ascorbic Cánh hoa có chứa flavonal glucosid hibiscritin, tạo thành tinh

có chứa 15,3% acid hibiscic (C6H6O7) Đài hoa có chứa 6,7% protein tính trên hàm lượng tươi và 7,9% tính trên hàm lượng khô

Đài hoa có vị rất chua, chứa các acid hữu cơ :12-17% acid citric ; 2-3% acid malic, một ít acid tartric Đài hoa chứa vitamin C và hai sắc tố anthocyanin : gossipetin và hibiscin

I.1.5.4 Hạt bụp giấm :

Hỗn hợp acid có trong lipid hạt : 2,1% miristic- ; 35,2% palmitic- ; 2,0% palmitoleic- ; 3,4% stearic- ; 34,0% oleic- ; 14,4% linoleic- ; và đặc biệt 3 acid béo phản ứng với HBr (cis-12, 13-epoxy-cis-9-octadecenoic(12,13-epoxoleic) 4,5% ; sterculic, 2,9% ; và malvalic, 1,3%); hàm lượng các sterol trong dầu hạt : 61,3% β - sitosterol ; 16,5% campasterol ; 5,1% cholesterol ; và 3,2% ergosterol

Hạt có những tính chất tương tự như dầu hạt cotton, và được dùng thay thế cho dầu hương hải ly Hạt chứa 7,6% hơi ẩm ; 24,0% protein thô ; 22,3% chất béo ; 15,3% sợi ; 23,8% nitơ tự do ; 7,0% tro ; 2,3% dầu; 24% protein; 5% chất xơ; 7% chất khoáng (0.3% calcium; 0,6% photpho; 0,4% lưu huỳnh) Hạt chiết với ete chứa : 0,7% chất béo ; 29,0% protein ; và 32,9% nitơ tự do ;

Ngoài ra cây bụp giấm còn chứa: quercetin, phytosterol X, β-caroten tiền sinh tố A, Vitamin C, B1, E, F, …

Theo tất cả các tài liệu tham khảo thì toàn bộ cây bụp giấm Hibiscus Sabdariffa

L chứa nhiều hợp chất hóa học, đặc biệt là các hợp chất có hoạt tính sinh học Do đó

cần có những nghiên cứu sâu hơn nhằm khai thác triệt để nguồn dược liệu quý giá này bên cạnh việc khai thác chất màu thực phẩm

I.2 ĐẠI CƯƠNG VỀ FLAVONOID :

I.2.1 Định nghĩa :[1,5,8,52]

Flavonoid là những chất màu thực vật, có cấu trúc cơ bản kiểu C6 – C3 – C6, trong đó mỗi C6 là một vòng benzen gắn với C3 Cấu trúc có thể là vòng kín hoặc hở Tại các vòng có đính một hoặc nhiều nhóm hydroxy tự do hoặc đã thay thế một phần,

vì vậy về bản chất chúng là các polyphenol có tính axit

O

O

123456

5'6'

4'

3'2'

Các polyphenol có thể phản ứng lẫn nhau qua các nhóm hydroxy để tạo thành các phân tử phức tạp hơn hoặc có thể liên kết với các hợp chất khác trong cây như các oza (dạng glycozit), hoặc protein

Trong đa số trường hợp thì mạch 3 cacbon đóng vòng với vòng A và tạo nên dị vòng có oxy C Dị vòng C có thể là:

I.2.2 Phân bố trong tự nhiên :

Flavonoid là một trong những nhóm hợp chất phân bố rộng nhất trong thiên nhiên, ước tính đã có khoảng 2000 flavonoid đã biết rõ cấu trúc (Harbone, 1975) Nói chung, flavonoid không có ở các tảo và nấm Flavonoid đặc trưng cho các thực vật bậc cao, song song với axit hydroxinamic và lignin trong cây Nó có mặt trong hầu hết bộ phận của cây: hoa quả, lá, rễ, gỗ, … và khu trú ở các tế bào Nó tham gia vào sự tạo màu sắc của cây, nhất là hoa Đó chính là một trong những chức năng sinh

Dihydro pyran γ-Pyron Dihydro-γ-pyron Pylium

I.2.3 Phân loại flavonoid :[1,5]

Flavonoid được phân loại dựa vào vị trí của gốc aryl (vòng B) và mức độ oxy hóa của mạch 3 cacbon :

- Euflavonoid là các flavonoid có gốc aryl ở vị trí C2

- Isoflavonoid là các flavonoid có gốc aryl ở vị trí C3

- Neoflavonoid là các flavonoid có gốc aryl ở vị trí C4

Ngoàira còn có :

- Biflavonoid là những flavonoid dimer

- Triflavonoid cấu tạo bởi 3 monomer flavonoid

- Flavonligan là những flavonoid mà phân tử có một phần cấu trúc ligan

TT Phân loại Đặc điểm Cấu tạo

1 Flavon

Vòng B gắn vào vòng C

5

1 2 3 4 6

2'

CAO

4' 3' 5' 6'

3 Flavanon

Thiếu dây nối đôi ơÛ C2 và

C3 Tất cả flavanon thường có nhóm OH ơÛ vòng A hoặc B

O

O

4 Flavanol Không có nối đôi ở C2 –

C3, có thêm nhóm OH ở C3

O

3

5 Chalcon LaØ Flavonoid vòng mở, 2

nhân thơm kết hợp mhau qua 1 dãy carbon α, β không bão hòa

α β

I.3 HỢP CHẤT ANTHOCYANIN :

I.3.1 Công thức cấu tạo :[1,8,20]

Anthocyanin là hợp chất glycosid của các dẫn xuất polyhydroxy và polymetoxy của 2 – phenylbenzopyrylium hoặc muối flavilium (Hình 3) Sự khác nhau giữa các anthocyanin là số và vị trí các nhóm hydroxyl trong phân tử, mức độ metyl hóa của nhóm hydroxyl, bản chất và số nhóm đường gắn vào phân tử

R1, R2 là OH, H hoặc OCH3

R3 là H hay glycosyl

R4 là OH hay glycosyl Sự khác nhau giữa các anthocyanin là số và vị trí của nhóm hydroxyl, bản chất và số nhóm đường gắn vào phân tử, vị trí gắn chúng, bản chất và số nhóm acid mạch thẳng hay vòng gắn vào phân tử Các anthocyanin khi mất hết nhóm đường được gọi là anthocyanidin hay aglycon

Mỗi anthocyanidin có thể bị glycoxyl hóa và acylat bởi các loại đường và các acid khác nhau tại các vị trí khác nhau Vì thế lượng anthocyanin lớn hơn anthocyanidin từ 15-20 lần

Các loại đường thông thường nhất liên kết với anthocyanidin là: glucose, galacose, rhamnose, arabinose và di hoặc tri sacharid được tạo thành từ 4 loại đường đơn này Trong nhiều trường hợp các gốc đường bị acyl hóa bởi acid: p-coumaric, cafferic, ferulic, sinapic, p-hydroxybenzonic, oxalic, sucinic hoặc acid acetic

I.3.2 Sự phân bố :[1,8,20]

Các anthocyanin có rất nhiều trong tự nhiên, chúng phân bố nhiều trong thực vật hoa, quả, rễ và củ : Vitaceae (nho), Rosaceae (cherry, dâu táo, đậu, bắp cải đỏ ), gạo nếp than (Oryza Sativa Tanaka), đặc biệt chúng có nhiều trong đài hoa

bụp giấm Hibiscus Sabdariffa L

Nhóm thế Màu Tên

3 5 6 7 3’ 4’ 5’

Auratinidin OH OH OH OH H OH H Cam

Bảng 1: Các anthocyanin tồn tại trong tự nhiên

I.3.3 Cấu trúc chuyển hóa :[1,8,20,45,47]

Trong môi trường nước, hầu hết các anthocyanin tự nhiên giống như chất chỉ thị

pH :

+ Đỏ ở pH thấp (giống giấy quì ở môi trường acid)

+ Đỏ xanh ở pH trung gian

Trong môi trường acid hoặc trung tính anthocyanin có 4 cấu trúc cùng tồn tại như :

- H +

Nhanh Nhanh - H +

Với R là - H, -CH3, -glycosyl

Hình 4 : Cấu trúc chuyển hóa của anthocyanin trong nước

Ở pH < 2 anthocyanin tồn tại ở dạng (1) có màu hầu như đỏ khi R3 = O-Gl, có màu vàng khi R3 = H Khi pH tăng, sự mất proton xảy ra nhanh chóng anthocyanin

chuyển sang màu xanh dương hoặc đỏ

Dạng quinon thường tồn tại như là một hỗn hợp vì pKa của các nhóm OH ở vị trí 4’,7, 5 (nếu có) là tương tự như nhau Khi để yên, sự chuyển hóa xảy ra: có sự hydrat hóa của cation flavilium cho ra dạng carbinol không màu hay pseudo base (hemiacetal) Dạng này cân bằng với dạng chalcon vòng mở không màu

I.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến độ bền màu của anthocyanin :

I.3.4.1 Cấu trúc hóa học của anthocyanin : [8,20,25,39,40,41]

Các nhóm hydroxyl, metoxyl, đường và các đường được acyl hóa có ảnh hưởng lên cường độ màu và độ bền của anthocyanin

Khi nhóm OH trong vòng B tăng lên thì cực đại hấp thu của vùng ánh sáng thấy

được (VIS) chuyển về phía bước sóng dài hơn và màu thay đổi từ cam đến xanh

nm (cam) đối với pelargonidin ; 535 nm (đỏ cam) đối với cyanidin ; 545 nm (đỏ xanh) đối với delphinidin Khi nhóm metoxyl thế nhóm hydroxyl thì cho kết quả ngược lại

Nhóm hydroxyl ở C3 có ý nghĩa quan trọng vì dung dịch anthocyanin chuyển từ cam vàng đến đỏ Điều này giải thích sự khác nhau giữa các anthocyanin có màu đỏ trong khi đó 3-deoxyanthocyanin: apigenidin, luteolinidin, và tricetinidin có màu vàng, nhưng 3-deoxyanthocyanin bền hơn các anthocyanin khác

Sự có mặt của các nhóm OH ở vị trí C5 và nhóm thế ở C4 làm bền hóa dạng có màu do chúng ngăn cản các phản ứng hydrat hóa dẫn đến sự tạo thành dạng không màu

Quá trình glycoxyl hóa cũng ảnh hưởng đến độ bền màu của anthocyanin Ví dụ như thời gian bán hủy (t1/2) của cyanidin 3-rutinosid là 65 ngày tại nhiệt độ phòng trong dung dịch acid citric 0,01M, pH 2.8, còn thời gian bán hủy của anthocyanin tự

do là 12 ngày

Cùng một anthocyanin thì các diglucosid bền nhiệt và ánh sáng hơn các monoglucosid Độ bền của anthocyanin 3,5-diglucosid của nho tăng cùng với sự tăng mức độ metoxyl hóa và giảm với sự tăng mức độ hydroxyl hóa của aglycon Sự có mặt của nhóm OH ở vị trí 4’ và 7 trong phân tử làm bền hóa đáng kể các pigment trong khi đó quá trình metoxyl hóa các nhóm OH làm giảm độ bền

Anthocyanin chứa 2 hoặc nhiều nhóm acyl (ternatin, platyconin, cinerarin, gentiodenphin và zebrinin) bền trong môi trường trung tính hoặc acid yếu do liên kết hydro giữa các nhóm OH của các nhân phenolic trong anthocyanin và các acid vòng thơm Các anthocyanin diacylat hóa được bền hóa bởi sự liên kết chặt chẽ kiểu sandwich nhờ tương tác giữa vòng anthocyanin và 2 nhóm acyl vòng thơm

Bảng 2: Ảnh hưởng của cấu trúc lên tính bền của một số pigment điển hình ở 25 0 C, pH

=2.8

I.3.4.2 Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến độ bền màu của anthocyanin :

a pH :[8,33,39]

pH không những ảnh hưởng đáng kể đến màu sắc của anthocyanin mà còn ảnh

hưởng đến tính ổn định của chúng Trong môi trường acid, anthocyanin ổn định hơn

so với trong môi trường trung tính hay kiềm

Khi pH thay đổi, màu sắc của dung dịch anthocyanin cũng thay đổi theo Ở pH

thấp hơn 2, dung dịch anthocyanin có màu hầu như đỏ (R3 = O – Gl) Khi pH của

dung dịch tăng, màu của chúng nhạt dần, và tại pH 4 đến pH 6 hầu hết các dung dịch

anthocyanin ở dạng không màu Tiếp tục tăng pH > 6, dung dịch anthocyanin có màu

tím hoặc xanh dương Khi để yên hoặc xử lý nhiệt các màu này có thể chuyển sang

vàng

b Nhiệt độ :[8,19,20,25,39,40,41]

Trong quá trình chế biến và bảo quản thực phẩm, anthocyanin dễ dàng bị biến

tính dưới tác dụng của nhiệt độ Trong suốt quá trình bảo quản dâu tây ở 1000C trong

một giờ thì có 50% dịch anthocyanin bị phân hủy và thời gian bán hủy ở 1000C là 1

giờ Suốt quá trình tồn trữ ở 380C thời gian bán hủy của anthocyanin là 10 ngày, ở

200C là 54 ngày, ở 00C là 11 tháng

Hợp chất λmax (nm) Thời gian bán hủy t(ngày) 1/2

Về cơ chế của quá trình biến tính anthocyanin trong dịch nước này, các nhà nghiên cứu cho rằng sự mở vòng dị thể và tạo thành chalcon là bước khởi đầu cho sự biến tính Các anthocyanin được đun nóng ở pH = 2-4 thì liên kết glucosid ở vị trí 3 bị phân hủy, chuyển aglycon (anthocyanin) thành chalcon và sau đó tạo thành α-diceton Nếu quá trình biến tính cứ tiếp tục thì tạo thành hợp chất sẫm màu, đặc biệt là khi có mặt oxi.[8,41]

Khi theo dõi sự nhạt màu của 3,5 diglucosid ở pH =3-7 của cyanidin, peonidin, dephinidin, petunidin và malvidin, các nhà nghiên cứu đã nhận danh 3,5 di-(O-β-D–glucosyl)-7-hydroxy coumarin là sản phẩm biến tính thông dụng của các pigment này và đề nghị ra cơ chế mà theo đó dạng flavylium (I) chuyển thành quinon (II) và một vài cấu trúc trung gian khác sẽ chuyển thành coumarin (III) và sản phẩm tương ứng với vòng B của anthocyanin Sự biến tính không bị ảnh hưởng của O2 nhưng nó tăng nhanh bởi sự gia tăng nhiệt độ.[8,40,41]

+ O

R1OH

R2O

R2

O

O - Gl O - GlHO

Hình 5: Sự biến tính nhiệt của anthocyanin 3,5 – diglucosid ở pH = 3,7

Năm 1980 , Timberlake và Brouillard cho rằng phản ứng cân bằng của cấu trúc anthocyanin từ trái sang phải đều là phản ứng thu nhiệt.[8,25]

Quinonoid

xanh dương

Flavyliumđỏ

Carbinol basekhông màu

Chalconkhông màuQuá trình gia nhiệt chuyển theo hướng chalcon đạt cân bằng Quá trình chuyển ngược từ chalcon thành flavylium là chậm Cần khoảng 12 giờ để chalcon tạo thành 3,5-diglucosid và 6 giờ để tạo thành 3- glucosid để đạt cân bằng dạng flavylium ở

c Oxy :[8,39]

Ở cùng khoảng pH khi có mặt oxy thì quá trình biến tính xảy ra mãnh liệt Khi đun nóng với sự có mặt của oxy thì quá trình oxy hóa xảy ra mãnh liệt Oxy và nhiệt độ là hai tác nhân đặc biệt gây biến tính anthocyanin trong nước ép quả mọng xanh, cherry và các loại quả nho

d Vitamin C ( acid ascorbic) :[8,39]

Nhiều nhà khảo sát cho rằng khi có mặt đồng thời các acid ascorbic và anthocyanin trong nước ép trái cây thì hai chất này có thể tương tác với nhau Với điều kiện có oxy, acid ascorbic bị oxy hóa thành H2O2 và H2O2 khử màu anthocyanin Điều đó có nghĩa là acid accorbic chỉ đóng vai trò làm chất trung gian mà anthocyanin bị biến tính là do H2O2

+O

O

Hình 6: Sự chuyển hóa malvin thành malvon với điều kiện có H 2 O 2

Các nhà nghiên cứu đã tìm thấy khi có mặt các ion thiếc và các flavonoid (quercelin và quecetrin) làm giảm sự phân hủy các acid ascorbic và anthocyanin khi chúng xuất hiện đồng thời

e SO 2 :[8,25,39]

Anthocyanin bị mất màu khi thêm SO2 Sự khử anthocyanin bởi SO2 thường gặp trong công nghiệp Quá trình khử có thể là thuận nghịch hay bất thuận nghịch Trái cây và nước trái cây ép được xử lý bởi lượng trung bình SO2 (500 – 2000 ppm) làm mất màu các anthocyanin của chúng, trước khi chế biến hơn nữa chúng được desulfit hóa và màu anthocyanin được phục hồi Sơ đồ phản ứng thuận nghịch giữa

SO2 và anthocyanin mà theo đó flavylium có màu phản ứng với ion bisulphat để tạo thành chromen – 2 – ( hoặc 4 - ) – sulphonic acid

Trước khi quá trình tiến xa hơn chúng được desunfit hóa và màu anthocyanin được phục hồi

+

Hợp chất AHSO+

2 phân ly trở lại cho ta AH+ và SO2 tự do dưới dạng acyl hóa

ở pH 1

f Enzym :[8]

Anthocyanas (Fugal glucosid) thủy phân liên kết glucosid của anthocyanin và tạo thành anthocyanidin hay còn gọi là aglycon Các aglycon này kém bền và mất màu rất nhanh khi có mặt của catechol

Người ta đã phân lập được enzym anthocyanin glycosid từ Apergillusniger và chỉ ra ảnh hưởng xúc tác của nó trong quá trình thủy phân liên kết glucosid của anthocyanin

O2

OHOH

H2O

Anthocyanin biến tínhNon - enzym

AnthocyaninO

OEnzym

Hình 7 : Sự biến tính của anthocyanin với phản ứng oxy hóa catechol

h Sự ngưng tụ :[8]

Các anthocyanin dễ dàng ngưng tụ với nhau và ngưng tụ với các hợp chất hữu

cơ khác làm tăng khả năng hấp thu Trong quá trình sản xuất thực phẩm thường tạo

ra các hợp chất phức có màu, tuy nhiên các hợp chất phức này không bền khi các anthocyanin không ngưng tụ hoàn toàn

i Đường và các sản phẩm biến tính của chúng :[8]

Nhiều nhà nghiên cứu cho rằng các phân tử đường ảnh hưởng mạnh đến quá trình biến tính của anthocyanin của các quả dâu Fructose, arabinose, galactose và sorbose có ảnh hưởng đến anthocyanin hơn là sucrose, glucose và maltose Khi có mặt oxy thì làm tăng sự tác động phân hủy các phân tử đường Trong quá trình chế biến và tồn trữ thực phẩm cùng với sự biến tính của các anthocyanin, các sản phẩm biến tính như furfural, 5-hydroxymetyl-furfural và acetaldehyd được tạo thành từ các

Cyanidin cation

+

+O

Furfural

+OHO

CHO

O

O

Hình 8 : Phản ứng ngưng tụ của cyanidin và furfural

j Các ion kim loại :[8,39]

Các ion kim loại cũng tiếp xúc với anthocyanin hoặc là trong quá trình chế biến rau quả hoặc là cho thêm vào các muối phụ gia vào thực phẩm Một số ion đa hóa trị có thể tương tác với anthocyanin có nhóm OH ở vị trí orto gây ra hiệu ứng sâu màu

Sự mất màu của những trái cây có chứa anthocyanin bởi phản ứng với thiếc của đồ hộp được biết từ lâu trong công nghệ đồ hộp Trong phản ứng giữa thiếc với anthocyanin, anthocyanin đóng vai trò là chất khử cực catod hoặc anod Là chất khử cực catod chúng có thể bị khử bởi hydro mới sinh ra từ phản ứng giữa kim loại và acid Còn chất khử cực anod thường là các anthocyanin có ít nhất hai nhóm hydroxyl

ở vị trí orto

+O

O - Gl

+

OHHO

O-Gl

H

+ HCl

OHOH

Hình 9: Phản ứng của anthocyanin như là chất khử cực catod trong đồ hộp thiếc

I.3.5 Tính chất hóa học :

a Phản ứng thủy phân:

+

O - Gl

O

OH OH HO

O - Gl

+ O

HO

+ AgNO3+ NH 4 OH

O - Gl

O - Gl

O

O + Ag

c Phản ứng ghép đôi với muối diazoni:

+

O - Gl

O

OH OH HO

O - Gl

N = N SO3Na +

O - Gl

O

OH OH HO

O - Gl

H2N SO3H NaNO2 + HCl

O - Gl

+ Pb2+

Pb+

O - Gl

O

OOHO

O - Gl

O - Gl

O

OH OH HO

O Gl

g Phản ứng với NaOH đặc và đun nóng:

+

O - Gl

O

OHOHHO

O - Gl

NaOH

ONaONaNaOOC

ONaNaO

O - Gl

+ CH3COONa

+

I.4 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG CỦA ANTHOCYANIN:

* 2001: Guido Kleibohmer, Iduna Matzit, Christoph Benedikt Heiduk (Germany) đã thành công trong việc kết hợp chất chỉ thị pH anthocyanin vào trong những chất liệu polymer đóng gói thực phẩm nhằm kiểm tra độ tươi của thực phẩm, đặc biệt là các loại nước ép trái cây Các màu chỉ thị pH (các anthocyanin ) có pH thay đổi từ 2-4 Khi pH giảm, các chỉ thị pH trong các chất liệu đóng gói sẽ thay đổi

màu sắc [9]

* Nghiên cứu của Phùng Đức Hữu và Đào Kim Nhung, trường Đại học Khoa

học tự nhiên- Đại học Quốc Gia Hà Nội : [9,10]

+ Ở nồng độ thích hợp, hoạt tính chống oxy hóa của chế phẩm flavonoid

(chiết xuất từ đài hoa Hibiscus Sabdariffa L theo qui trình B.C.Tali) thể hiện sự kềm

hãm cao đối với peroxydase ở tất cả các nhóm máu người; hiệu lực kềm hãm giảm dần theo thứ tự A> AB> B> O

+ Chế phẩm flavonoid có khả năng kháng vi sinh vật trên phổ rộng (bao gồm vi khuẩn gram (+), gram (-) và vi nấm)

+ Chế phẩm thể hiện rõ tác dụng bảo vệ tế bào gan, chống lại sự hủy hoại của CCl4 trên động vật thực nghiệm

+ Hoạt tính chống ung thư của chế phẩm flavonoid được thể hiện qua những thí nghiệm in vitro trên tế bào ung thư Sarcoma-180 và in vitro trên chuột nhắt trắng BAL b/c gây mô hình u báng bằng chủng tế bào ung thư Sarcoma-180

1 Cây giấm trị bệnh tim mạch : [2]

Cây giấm hay cây chua có tên khoa học là Hibiscus Sabdariffa L., một cây rất

quen thuộc với những người đi kinh tế mới Hoa và lá có tính thanh nhiệt, giải khát, thông tiểu, làm mát gan, tăng tiết mật

Cả cây có nhiều polysacchrid trong chất nhày 1992: Muler và Franz đã tách polysacchrid tan trong nước ra ba loại HIB; trong đó HIB3 có khả năng ức chế ung bướu Chất nhày ngoại hấp cholesterol(chất nhày của cây giấm phụ trị cholesterol-huyết)

1962: Sharaf xác nhận các dược tính chống co thắt, hạ huyết áp, kháng khuẩn của hoa bụp giấm

1979: Gargrade nhận thấy thành phần không xà phòng hóa của dầu hạt giấm có tính kháng khuẩn

1995: Joe.A Vinson cho rằng flavonoid và cyanidin bảo vệ thành mạch máu, có tính chống oxy hóa, ngăn ngừa các bệnh về tim mạch và ung thư, giảm cholesterol và triglycerid trong máu

2 Các bài thuốc dân gian từ cây bụp giấm Hibiscus Sabdariffa L : [32]

Được sử dụng như là một chất khử trùng, chất làm se, chất làm dịu chứng viêm, thuốc lợi tiểu, chất làm mềm, thuốc xổ, chất làm đông, thuốc tiêu độc, thuốc an thần, giảm đau, thuốc tiêu và thuốc bổ

Bụp giấm Roselle là một phương pháp chữa bệnh nhiều mật, bị apxe, ung thư,

ho, suy nhược, khó tiêu, bí tiểu, sốt, giải rượu, đau tim, tămg huyết áp, loạn thần kinh chức năng, bệnh scorburt (bệnh của máu do thiếu vitamin C trong thức ăn hàng ngày) Đài hoa bụp giấm nấu trong nước là phương thuốc dân gian chữa bệnh ung thư Theo y học, lá là chất làm mềm và được dùng nhiều ở Guinea như là thuốc lợi tiểu, thuốc an thần giảm đau ; quả chống scorburt ; lá, hạt và đài hoa trưởng thành là thuốc lợi tiểu và chống scorburt ; đài hoa nấu trong nước được sử dụng như là thức uống chống bệnh nhiều mật

Hoa chứa gossypetin, anthocyanin, glucosid hibiscin là thuốc lợi tiểu và cholesterol, làm giảm huyết áp cao và kích thích nhu động ruột

Tại Miến Điện, hạt được dùng để chữa suy nhược, lá là thuốc làm mềm

Ở Đài Loan, hạt được sử dụng như là thuốc lợi tiểu, nhuận tràng và thuốc bổ

Ở Philippin sử dụng rễ đắng như là vị thuốc chữa nhuận tràng và thuốc bổ

3 Nghiên cứu độ bền và sự bền hóa chất màu thực phẩm tự nhiên anthocyanin:[8]

Nghiên cứu độ bền của các dịch trích anthocyanin thương mại và từ các nguồn

như gạo nếp than (Oryza sativa L Glutinosa Tanaka) và tế bào nuôi cấy nho (Vitis

Quá trình copigment bằng polyphenol được xem là một trong những quá trình hiệu quả nhất cho phép đạt được độ bền màu trên cơ thể sống Phương pháp phổ biến thứ hai là encapsul hóa anthocyanin với các cyclodextrin

5 Aûnh hưởng của etylen và antigibberellin trên hàm lượng anthocyanin của nho

Cv Don Mariano [13]

Don Mariano là một loại nho đỏ rất phổ biến ở vùng Murcia ( Tây Ban Nha ), rất có giá trị về mùi vị và năng suất Một trong những yếu tố làm giới hạn giá trị kinh tế của sản phẩm này là tính thiếu đồng đều trong dạng pigment của nó Sự biến đổi này bắt nguồn từ việc hạn chế quá trình sinh tổng hợp của anthocyanin, đó là lý do làm cho quả nho không đạt được màu đỏ hoặc tím như yêu cầu, mà vẫn duy trì sự khác nhau về sắc độ đỏ, tím hay hồng

Người ta giải quyết vấn đề này bằng cách nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến màu sắc của quả, và các kết quả sau khi xử lý với etylen và antigibberellin Từ 2-chloroetyl phosphonic acid (CEPA), tên thương mại là Ethrel, sau khi phân ly sinh ra etylen Người ta sử dụng etylen 20% phun thành cụm với dung dịch CEPA

Paclobutrazol là chất ức chế gibberellin Sản phẩm được áp dụng trực tiếp bằng cách tưới lên vùng có quả sắp mọc, với hàm lượng 1ml của chất có hoạt tính trên cây Màu sắc của vỏ quả xác định bằng phương pháp đo phổ phản xạ, giống như CIRG index (Carreno et al., 1995) Pigment đươc trích từ vỏ quả đã làm khô với metanol – HCl (2%) Hàm lượng anthocyanin tổng được xác định hệ số ε = 28000 Các anthocyanin thành phần được phân tích bằng HPLC ( Fernández – López et al 1992)

Bảng 3: Aûnh hưởng của Ethrel lên màu sắc (CIRG index), hàm lượng

anthocyanin tổng (mg/ 100 gfw) và % anthocyanin thành phần từ kết quả xử lý với CEPA

Anthocyanin được biểu diễn dưới dạng tổng các dạng glucosid và ester

Khi áp dụng etylen nhằm làm tăng màu sắc vỏ quả nho và hàm lượng anthocyanin ; nồng độ tốt nhất là 600 ppm Etylen làm tăng hàm lượng peonidin và làm giảm hàm lượng malvidin, và do đó đã tạo ra sự chuyển biến về thành phần cấu tạo anthocyanin cũng như tính đa dạng của sản phẩm

Bảng 4: Aûnh hưởng của paclobutrazol trên màu sắc (CIRG), hàm lượng

anthocyanin tổng (mg/ 100gfw) và% các anthocyanin thành phần

Hiệu quả tính theo màu sắc và hàm lượng anthocyanin rất thấp, và sự khác biệt

giữa các pigment riêng biệt là không quan trọng Sự tăng nhẹ hàm lượng malvidin,

pigment cuối cùng được tạo thành theo con đường sinh tổng hợp, kết hợp với sự giảm

hàm lượng peonidin, là quá trình rất có giá trị Triazol (3 nitơ), chặn đứng sự tổng

hợp của gibberellin, làm giảm sự dinh dưỡng, cải thiện sự phản chiếu, do đó làm

tăng lượng chất chuyển hóa quang hợp tương ứng

6 Các yếu tố ảnh hưởng đến anthocyanin : pH, sunfur dioxid & hydrogen

peroxid, kim loại, nhiệt độ, cấu trúc & tính tan của anthocyanin [39]

* Aûnh hưởng của pH đến anthocyanin :

Ghi chú : anthocyanin từ quả cây cranberry (cây việt quất) được trích chiết với

dung môi là nước, và pH của dung dịch được điều chỉnh từ 1 – 13

Màu sắc và độ bền của anthocyanin trong dung dịch phụ thuộc nhiều vào pH Anthocyanin có độ bền cao nhất, tông màu cao nhất ở các giá trị pH thấp, và màu sắc sẽ dần dần mất đi khi pH tăng lên Ở tại pH 4 – 5, anthocyanin gần như không màu Khi acid hóa, tông màu đỏ của dung dịch sẽ dần dần xuất hiện trở lại Đặc điểm này làm giới hạn phạm vi ứng dụng của anthocyanin trong thực phẩm : đó là chỉ có thể sử dụng với pH thấp mà thôi

Khi pH tăng, màu sắc của dung dịch bị mất, điều này có thể được kiểm tra bằng phương pháp đo độ hấp thu của pigment, sử dụng phương pháp phổ quang kế Có sự giảm độ hấp thu tại peak 515 nm, cho thấy rằng tông màu đỏ bị mất Có sự mất màu đỏ khi tăng pH là do có sự cân bằng giữa hai dạng anthocyanin, đó là dạng cation flavylium màu đỏ và dạng carbinol không màu Cation flavylium, như tên gọi, có một điện tích dương liên kết với nó, trong khi dạng carbinol base là một dạng anthocyanin bị hydrat hóa

Có một lượng nhỏ quinoid base hoặc chalcon tồn tại ở bất kỳ pH nào Cũng vì lý do đó, tại những giá trị pH cao, có thể tồn tại cân bằng thuận nghịch của các dạng cấu trúc anthocyanin là nguyên nhân làm mất tông màu đỏ thường xuyên, ngay cả ở

pH acid

* Sunfur dioxid & hydrogen peroxid :

Bất kỳ một liên kết đôi nào của hệ thống liên kết đôi trong anthocyanin bị phá vỡ cũng gây nên hiện tượng mất màu dung dịch anthocyanin Sự hiện diện của ion dương oxonium gần vị trí C-2 làm cho anthocyanin dễ bị ảnh hưởng bởi hợp chất có tính ái nhân như sunfur dioxid hoặc hydrogen peroxid

Anthocyanin tạo thành một phức không màu với SO2 là do có sự hình thành hợp chất flaven-4-sulfonic acid Phức cộng hợp này – trong điều kiện pH thấp (pH 1) có thể bị chuyển hóa trở về dạng anthocyanin có màu Trong khi hiện tượng làm mất màu này không được mong đợi trong nhiều loại thực phẩm, SO2 thường được sử dụng để khử màu đỏ anh đào trong quá trình gia công rượu anh đào

SO2 thường được dùng làm chất bảo quản thực phẩm Nó rất hiệu quả trong việc

Raspberry

Sodium metabisulfit

Flaven – 4 – sulfonic acid