Nghiên cứu quy trình tinh sạch và xác định hàm lượng enzyme superoxide dismutase chứa đồng, kẽm (cu, zn sod) từ hồng cầu người hiến máu tại bệnh viện nhân dân gia định

Hóa sinh là một trong những ngành khoa học đó, với những tiến bộ khoa học kỹ thuật các nhà khoa học đã tiếp cận và tìm hiểu kỹ các đặc tính của Enzyme đồng thời đã có nhiều ứng dụng của

Đại Học Quốc Gia Tp Hồ Chí Minh

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

-

HỌC VIÊN : NGUYỄN THỊ THU THỦY MÃ SỐ : CNTP 12 - 028

TÊN ĐỀ TÀI :

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TINH SẠCH

VÀ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG

ENZYME SUPEROXIDE DISMUTASE CHỨA ĐỒNG, KẼM (Cu,Zn-SOD)

TỪ HỒNG CẦU NGƯỜI HIẾN MÁU TẠI BVND GIA ĐỊNH

CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

MÃ SỐ NGÀNH : 2 11 00

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH , Tháng 7 năm 2003

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH

Cán bộ hướng dẫn khoa học:

TS ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO

Cán bộ chấm nhận xét 1:

PGS TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG

Cán bộ chấm nhận xét 2:

PGS TS ĐỒNG THỊ THANH THU

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại:

HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA, Ngày _tháng _ năm 2003

- -

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ và tên học viên: NGUYỄN THỊ THU THỦY Giới tính: Nữ

Ngày tháng năm sinh: 09 – 08 – 1977 Nơi sinh: Thanh Hóa

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

I - TÊN ĐỀ TÀI:

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ENZYME SUPEROXIDE DISMUTASE CHỨA ĐỒNG KẼM TỪ

TẾ BÀO HỒNG CẦU CỦA NGƯỜI HIẾN MÁU TẠI BỆNH VIỆN NHÂN

DÂN GIA ĐỊNH

II - NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH HÀM

LƯỢNG ENZYME SUPEROXIDE DISMUTASE CHỨA ĐỒNG KẼM TRONG TẾ

BÀO HỒNG CẦU NGƯỜI HIẾN MÁU TẠI BỆNH VIỆN NHÂN DÂN GIA ĐỊNH

III - NGÀY GIAO NHIỆM VỤ:

20- 2- 2003

IV - NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ:

30- 7- 2003

V - HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN:

TS ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO

VI - HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ CHẤM NHẬN XÉT 1:

PGS TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG

VII - HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ CHẤM NHẬN XÉT 2:

PGS TS ĐỒNG THỊ THANH THU CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CÁN BỘ NHẬN XÉT 1 CÁN BỘ NHẬN XÉT 2

Nội dung và đề cương luận văn thạc sĩ đã được Hội Đồng Chuyên Ngành thông qua

Ngày…… tháng…….năm 2003 TRƯỞNG PHÒNG QLKH- SĐH CHỦ NHIỆM NGÀNH

LỜI CÁM ƠN

Để có được bài báo cáo này, chúng tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ của rất nhiều đơn vị và cá nhân Chính vì thế chúng tôi muốn gởi nơi đây lòng chân thành cám ơn đến tất cả những người đã tân tình giúp đỡ chúng tôi trong suốt quá trình thực hiện

Chúng tôi xin chân thành cám ơn Cô giáo hướng dẫn của chúng tôi là

TS Đống Thị Anh Đào người đã tận tâm hướng dẫn và trao cho chúng tôi rất nhiều kiến thức về lĩnh vực nghiên cứu Cô đã theo sát chúng tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và cho chúng tôi nhiều lời khuyên bổ ích

Chúng tôi chân thành cám ơn qúy Thầy Cô Khoa Công Nghệ Thực Phẩm là những người đã trang bị cho chúng tôi những kiến thức cơ bản để thực hiện nghiên cứu này

Chúng tôi xin cám ơn Ban Lãnh Đạo cùng toàn thể cán bộ công chức khoa Xét Nghiệm và khoa Vi Sinh BVND Gia Định đã giúp đỡ chúng tôi rất nhiều trong việc thu thập và xử lý mẫu

Chúng tôi cũng xin thành thật gởi lời cám ơn đến các đơn vị đã giúp đỡ cho chúng tôi sử dụng những máy móc thiết bị thí nghiệm như Khoa Vi Sinh BVND Gia Định, Khoa xét nghiệm thuộc Đội Vệ Sinh Phòng Dịch Tân Bình, Phòng Thí Nghiệm Hóa Sinh Khoa Công Nghệ Thực Phẩm Trường Đại Học Bách Khoa TP HCM

Cuối cùng chúng tôi xin gởi lời cám ơn chân thành đến tất cả các bạn đồng liêu đã tận tình góp ý, đây là một nguồn động viên tinh thần rất lớn đối với chúng tôi trong quá trình nghiên cứu

TP Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2003

Nguyễn Khánh Hoàng và Nguyễn Thị Thu Thủy

Dong Thi Anh Dao, Nguyen Khanh Hoang, Nguyen Thi Thu Thuy

Dept Food Tech., Ho Chi Minh City National University, Technology University

Abstract

Cu, Zn-superoxide dismutase (Cu, Zn-SOD) is an enzyme that catalizes the decomposition reaction of free radicals produced in the respiratory process of living cells We study the procedure to collect Cu, Zn-SOD from the red blood cells of blood donors at Gia Dinh Hospital and introduce the content of Cu, Zn-SOD in the blood of healthy people Initially, we find that the average content is about 1,352 mg/mL of red blood cells or about 0,548 mg/mL of whole blood Besides we also study a number of pathogenic cases with positive diagnosis and find that in most cases, there is an increase in the content of Cu, Zn- SOD

Introduction

Superoxide dismutase is an enzyme

which was firstly discovered in 1969 by

J.McCord and I Fridovich [2] These

enzymes catalyse the dismutation reaction:

2 O2- + 2H + H2O2 + O2

The superoxide free radicals are an

important toxin by product of oxygen

metabolism in living cells The scientists

have discovered three kind of SOD:

Cu, Zn-containing superoxide dismutase

(Cu, Zn-SOD); Mn-containing superoxide

dismutase (Mn-SOD); Iron-containing

superoxide dismutase ( Fe-SOD)

The human red cells human has

Cu, Zn-SOD Our study has found out the

index of concentration Cu, Zn-SOD in red

cells of the blood donors at Gia Dinh

hospital

Materials and Methods

Materials are blood of donors at

Gia Dinh hospital Copper, zinc superoxide

dismutase was collected from 511 blood

samples of healthy human, blood samples

has been mixed with EDTA solution,

stored in tube at 4oC

Chemicals: Cu, Zn-SOD;

Mn-SOD; Cytocrom C; Xanthine oxydase;

Xanthine purchased from Sigma Co.,

(Germany) Acetone; Ethanol; Cloroform;

KH2PO4; Na2HPO4 was purchased from

Merck Co., Total protein TF was

purchased from Diagnostic Co.,

- The protein enzyme concentrations of

Cu, Zn-SOD were determined by method UV-Vis (at 265nm) [4, 5]

- The metal content of enzyme was determined by atomic absorption spectroscopy

Experimental process [2]

The red cells were collected from whole blood by centrifugation, then resuspended and washed in 0.9% NaCl solution two times by centrifugation Exactly 0.2 mL of packed cells were lysed

by the addition of an equal volume of water Hemoglobine was then precipitated from hemolysate by an adaptation of the Cloroform-Ethanol This mixture was allowed to stir for 5 min, and became brown Then the precipitate was removed

by centrifugation The supernatant contained Cu, Zn-SOD Exactly 0.1 mL of supernatant diluted mixed in 2.9mL phosphate buffer pH 7.8, was measured the absorbance at 265nm, and measured total protein concentration continuely The supernalant was purified by method cold Aceton The supernatant was allowed to warm to room temperature, and solid of

KH2PO4 were added, resulting in the separation of two liquid phase A brownish

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4

mg/mlRc mg/mlWb

centrifuged The dilution was cooled to 4 C

and added with cold Aceton to precipitate

the superoxide dismutase The blue

pricipitate was dissolved in water, then the

dilution was measured the absorbance at

265nm, and measured protein

concentrations

Result

- We found that protein enzyme

concentration of Cu, Zn-SOD in human

about 1.352 mg/mL red cells, or 0,548

mg/mL whole blood (Table 1 and Fig 1)

Sex OD mg/mL

Rc* mg/mL Wb*

Male 0,5029 1.352 0.5483

Female 0,5031 1,352 0.5480

Table 1 Protein concetrations SOD in red

cells and whole of blood

(*) Rc: Red cells; (*) Wb: whole blood

Fig 1 Protein concentrations of Cu,

Zn-SOD in red cells and whole blood of male

and female donors

- We found that the protein enzyme

concentrations of Cu, Zn-SOD in red cells

of female is larger than in male, but the

hematocrit of female is less than male, but

the concentrations in whole blood in both

sex are similar (Table 1 and Fig 1)

- Protein concentrations of Cu, Zn-SOD

are similar in different groups of blood

(Table 2 and Fig 2)

AB 1.3561 0.5502

B 1.3559 0.5513

O 1.3341 0.5431 Table 2 Protein concentration of Cu, Zn- SOD in different groups of blood

Fig 2 Protein concentrations of Cu, SOD in different groups of blood

Zn The line of standard was found by the relationship between the absorbances at 265nm and total proteins of dilutions So

we gave out the standard line of concentration of Cu, Zn-SOD We chose the step best purification to give out the standard line It has equation: (Fig 3)

Y= 23.618*X +0.1454

Fig 3 The standard line of protein concentration of Cu, Zn-SOD

- Besides, we also study a number

of pathogenic cases with positive diagnostic and has found that in most cases, there is an increase in the concentration of Cu, Zn-SOD (Table 3 and Fig 4)

y = 23.618x + 0.1454

0 0.5 1 1.5 2 2.5

0 0.05 mg/mL 0.1

OD

Table 3 Concentrations of Cu, Zn-SOD

with a number of diagnostic

Fig 4 Concentrations of Cu, Zn-SOD with

a number of diagnostic

- We also found that the store time of

samples effects on protein enzyme

concentrate of materials.The concentrate

may be decrease greater than 50% when

the store time greater than 2 weeks So we

must experience as soon as possible

(Fig 5)

Fig 5 Protein concentrations of Cu, Zn-

SOD decrease with the stored time of

samples

Protein (mg/ mL)

Yield (%) Hemolysate 10.5766667 100 Supernatant 0.06842299 6.47 Aceton

precipitate disolved in water

0.0238796 2.26

Table 4 The ratio yield of protein after purification

Discussion

- We saw that the concentrations of

Cu, Zn-SOD in most cases has pathogenic possive are increased that, may be when body has not balance (some injured) they need more protection reagent to help them

- Total protein concentration in each step purification show that it has a relation between concentration of protein and purification level of Cu, Zn-SOD

- We have charts of the relation between the protein concentrations and the absorbances of the dilution measured in each step purification We chose the best purication step The next chart showed that low purification level of the dilution acetone precipitate disolved in water non- centrifugation

Fig 6 The standard line of dilutied acetone precipitate disolved in water with non- centrifugation

The standard line of dilution acetone

i i

step to purify, so it will be hard to apply in hospital We need reseach process more simple than it to apply easily in hospital In addition, we known that there is a relation between EC-SOD (Extracellular SOD)

[4, 5] and a number of diseases as cancer, heart deseases, renal deseases, liver deseases and diabetes Those has a higher level than in normal healthy people

In next study we will use method of

T Adachi [5] to find out the concentration

of EC-Cu, Zn-SOD to apply for hospital

Trang LỜI CẢM ƠN

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1

I 1.GIỚI THIỆU SUPEROXYDE DISMUTASE 1

I.1.1 LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN 1

I.1.2 CẤU TRÚC CỦA SOD 1

I.1.2.1 Cu,Zn-SOD 3

EC-SOD 3

Cu,Zn-SOD 4

I.1.2.2 Mn-SOD; Fe-SOD 6

I.1.3 CƠ CHẾ XÚC TÁC CỦA SUPEROXYDE DISMUTASE 7

I.1.3.1.ĐẶC TÍNH CỦA Cu,Zn-SOD 7

I.1.3.2 ĐẶC TÍNH CỦA Mn-SOD VÀ Fe-SOD 7

I.1.4 CƠ CHẤT O 2- CỦA SOD 7

I.1.4.1 SỰ HÌNH THÀNH DẠNG OXY HOẠT ĐỘNG 7

I.1.4.2 TÍNH TÍCH CỰC VÀ TIÊU CỰC CỦA O -2 9

I.1.5 MỘT SỐ BỆNH LÝ LIÊN QUAN ĐẾN SOD VÀ O -2 9

I.1.6 NGUYÊN LIỆU MÁU 10

I.1.6.1 TÍNH CHẤT VÀ CHỨC NĂNG CỦA MÁU 10

I.1.6.2 HỒNG CẦU 12

I.1.7 CÁC PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN VÀ TINH SẠCH PROTEIN 19

I.1.7.1 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁ VỠ TẾ BÀO 19

I.1.7.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP TINH SẠCH PROTEIN 20

CHƯƠNG II: NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

II.1 NGUYÊN LIỆU 27

II.1.1 NGUỒN THU NHẬN 27

II.1.2 CÁC CHỈ SỐ YÊU CẦU CỦA NGUYÊN LIỆU 28

II.2 HÓA CHẤT THÍ NGHIỆM 31

II.3 THIẾT BỊ THÍ NGHIỆM 31

II.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32

II.4.1 PHÂN TÍCH PROTEIN 32

II.4.2 KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM SÀNG LỌC 33

II.4.3.(4) PHÂN TÍCH KIM LOẠI, KHỐI LƯỢNG PHÂN TƯ Û37 II.4.5 XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG SOD 37

II.4 6 XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME 38

II 4 7 QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ 40

THUYẾT MINH QUY TRÌNH 41

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 44

III 1 2 HOẠT ĐỘ CỦA DUNG DỊCH TINH SẠCH 47

III 1 3 TỈ LỆ THU NHẬN PROTEIN 48

III 1 4 HÀM LƯỢNG KIM LOẠI 50

III 1 5 XÁC ĐỊNH KHỐI LƯỢNG 51

III 1 5 1 SẮC KÝ ĐIỆN DI SDS 51

III 1 5 2 SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ( LC-MS) 52

III 2 XÁC ĐỊNH ĐƯỜNG CHUẨN 53

III 3 XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTEIN ENZYME 57

III 4 HÀM LƯỢNG SOD THEO CHẨN ĐOÁN BỆNH 64

III 5 HÀM LƯỢNG SOD THEO THỜI GIAN LƯU MẪU 66

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬNVÀ KIẾN NGHỊ 69

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC ( SỐ LIỆU THÍ NGHIỆM)

DANH MỤC BẢNG BIỂU Trang

BẢNG 1: Một số tính chất của enzyme SOD 2

BẢNG 2: Thành phần acide amine trong những phân tử enzyme SOD được phân lập từ những nguồn khác nhau 2

BẢNG 3: Thành phần các chất có trong hồng cầu 13

BẢNG 4: Hàm lượng các chất vô cơ có trong hồng cầu 14

BẢNG 5, 7: Thành phần và số lượng mẫu máu người bình thường 27

BẢNG 6, 8: Thành phần và số lượng mẫu máu theo chẩn đoán 27

BẢNG 9: Hoạt độ tổng và hoạt độ riêng của dung dịch bước 1 và 2 47

BẢNG 10: Tỉ lệ thu hồi protein ở các bước tinh sạch 49

BẢNG 11: Hàm lượng kim loại Cu ,Zn có trong dung dịch bước 1 và 2 50

BẢNG 12: Hàm lượng enzyme SOD trong máu và hồng cầu của người bình thường 57

BẢNG 13: Hàm lượng enzyme SOD theo giới tính 57

BẢNG 14: Hàm lượng SOD chung cho các nhóm máu 58

BẢNG 15:Hàm lượng SOD của Nam giới theo nhóm máu 59

BẢNG 16: Hàm lượng SOD của Nữ giới theo nhóm máu 59

BẢNG 17: Hàm lượng SOD trong máu của Nam giới độ tuổi từ 18-30 61

BẢNG 18: Hàm lượng SOD trong máu của Nam giới độ tuổi từ 30-60 61

BẢNG 19: Hàm lượng SOD trong máu của Nữ giới độ tuổi từ 18-30 61

BẢNG 20: Hàm lượng SOD trong máu của Nữ giới độ tuổi từ 30-60 62

BẢNG 21: Hàm lượng SOD theo chẩn đoán bệnh 64

BẢNG 22: Hàm lượng SOD theo thời gian lưu mẫu 66

DANH MỤC HÌNH ẢNH HÌNH 1: Cấu trúc cầu nối giữa phân tử Cu và Zn thông qua phân tử Histidine 4

HÌNH 2: Cấu trúc của Hemoglobin 17

HÌNH 3: Quy trình công nghệ 40

HÌNH 4: Độ hấp thu của dung dịch bước 1 tại bước sóng 265 nm 45

HÌNH 5: Độ hấp thu của dung dịch bước 2 tại bước sóng 265 nm 46 HÌNH 6: Hình ảnh kết hợp độ hấp thu của dung dịch bước 1&2 tại bước sóng

HÌNH 8: Hoạt độ dung dịch bước 2 48

HÌNH 9: Hoạt độ dung dịch bước 1&2 48

HÌNH 10: Hình ảnh sắc ký điện di SDS của dung dịch bước 2 51

HÌNH 11: Hình ảnh sắc ký đồ LC-MS của dung dịch bước 2 52

HÌNH 12: Đường chuẩn xác định hàm lượng SOD theo độ hấp thu của dung dịch tinh sạch bước 2 nhóm máu A (không ly tâm) .54

HÌNH 13: Đường chuẩn xác định hàm lượng SOD theo độ hấp thu của dung dịch tinh sạch bước 2 nhóm máu B (không ly tâm) 54

HÌNH 14: Đường chuẩn xác định hàm lượng SOD theo độ hấp thu của dung dịch tinh sạch bước 2 nhóm máu AB(khôngly tâm) 55

HÌNH 15: Đường chuẩn xác định hàm lượng SOD theo độ hấp thu của dung dịch tinh sạch bước 2 nhóm máu O (không ly tâm) .55

HÌNH 16: Đường chuẩn xác định hàm lượng SOD theo độ hấp thu của dung dịch tinh sạch bước 2 Chung các nhóm máu(không ly tâm) 56

HÌNH 17: Đường chuẩn xác định hàm lượng SOD theo độ hấp thu của dung dịch tinh sạch bước 2 (có ly tâm) .56

HÌNH 18:Hàm lượng SOD trong hồng cầu chung cho các nhóm máu 58

HÌNH 19: Hàm lượng SOD trong hồng cầu của Nam và Nữ theo nhóm máu 59

HÌNH 20: Hàm lượng SOD trong máu toàn phần củaNam và Nữ theo nhóm máu 60

HÌNH 21:Hàm lượng SOD trong hồng cầu Nam giới theo hai độ tuổi 62

HÌNH 22: Hàm lượng SOD trong máu toàn phần Nam giới theo độ tuổi 62

HÌNH 23: Hàm lượng SOD trong hồng cầu Nữ giới theo độ tuổi 63

HÌNH 24: Hàm lượng SOD trong máu toàn phần Nữ giới theo độ tuổi 63

HÌNH 25:Hàm lượng SOD trong hồng cầu người bình thường và người có chẩn đoán bướu , ung thư 65

HÌNH 26: Hàm lượng SOD trong hồng cầu người bình thường và trẻ sơ sinh 65

HÌNH 27: Hàm lượng SOD trong hồng cầu người bình thường và phụ nữ có thai 66

HÌNH 28:Hàm lượng SOD theo thời gian lưu mẫu 67

Trong thế kỷ XX các ngành khoa học đã có những bước phát triển to lớn Hóa sinh là một trong những ngành khoa học đó, với những tiến bộ khoa học kỹ thuật các nhà khoa học đã tiếp cận và tìm hiểu kỹ các đặc tính của Enzyme đồng thời đã có nhiều ứng dụng của emzyme được áp dụng vào thực tế nhằm mục đích nâng cao chất lượng cuộc sống của con người

Ở những sinh vật có chuyển hoá oxy trong chuỗi hô hấp của tế bào đều có quá trình tạo ra gốc tự do Superoxide( O-

2) [1], [2], [3], [9],[17], [33] đây là nhân tố tạo ra các dạng gốc tự do có tác hại cho tế bào như . OH, và 1

O2 ( gốc tự do OH và oxy đơn phân tử) Tế bào có một hệ thống Enzyme nhằm loại trừ những tác hại này[24], [26] Enzyme SOD xúc tác phản ứng tạo H2O2 , sau đó H2O2 lại được xúc tác bởi enzyme Catalase để tạo thành

H2O và O2 Phản ứng xảy ra như sau:

Dựa trên những thành tựu khoa học đã công bố, chúng tôi mạnh dạn

tiến hành đề tài: "Nghiên cứu quy trình tinh sạch và xác định hàm lượng

enzyme Superoxide Dismutase từ tế bào hồng cầu từ những người hiến máu tại Bệnh viện nhân dân Gia Định TP HCM"

Với nghiên cứu này chúng tôi mong muốn bước đầu có những thông số kỹ thuật về quy trình công nghệ và các chỉ số về hàm lượng SOD trong máu của một bộ phận người Việt Nam, nhằm mục đích áp dụng vào thực tế để giúp công tác lâm sàng chẩn đoán bệnh tốt hơn

Chúng tôi rất mong nhận được sự góp ý của những nhà khoa học chuyên môn với mục đích hoàn thiện nghiên cứu này Xin thành thật cảm

ơn

Thành Phố Hồ Chí Minh,tháng 7 năm 2003

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

I GIỚI THIỆU ENZYME SUPEROXIDE DISMUTASE (SOD):

[40],[44]

I.1 Lịch sử và khái niệm về enzyme SOD:

Enzyme Superoxide Dismutase (được gọi tắt là SOD) là enzyme oxy hóa khử (oxydoreductase), có chức năng xúc tác phản ứng oxy hóa khử, loại trừ gốc điện tử tự do superoxide O2- là độc tố oxy được sinh ra trong tế bào của cơ thể sống có chuyển hóa oxy

Năm 1938, Mann và Keilin đã tách được một protein mang màu xanh gần giống với màu của ion Cu2+, có phân tử lượng khoảng 32.000 Da, chứa khoảng 0,38 % nguyên tố đồng, đã được gọi với những tên như hemocuprein hoặc erythrocuprein (viết tắt của hemoglobin-cupric-protein hay erythrocyte-cupro-protein)

Năm 1962, khi O2- và đặc tính của nó được khám phá thì đặc tính xúc tác của SOD cũng được phát hiện bởi Joe Mccord và Irwin Fridovich

Đến năm 1968, J McCord và I Fridovich đã thực hiện lại thí nghiệm thu nhận SOD từ hồng huyết cầu của bò và sau đó đã nghiên cứu xác lập được phương pháp định lượng hoạt tính của SOD, từ đó SOD được khẳng định là một enzyme

SOD đã được khẳng định tồn tại trong tế bào sống của các loài sinh vật hiếu khí, là tác nhân duy nhất có thể giải độc cho tế bào trong việc loại trừ độc tố superoxide O2- sinh ra trong quá trình trao đổi chất của tế bào

I.2 Cấu trúc và phân loại enzyme SOD:

SOD thuộc loại metalloprotein, phân tử SOD (holoenzym) bao gồm trung tâm hoạt động có chứa ion kim loại (cofactor) và apoenzym Ion kim loại gắn ở trung tâm hoạt động có thể là Cu2+, Zn2+, Mn2+ và Fe2+ Apoenzym của SOD là chuỗi polypeptid xoắn kép, mỗi chuỗi polypeptid đơn nối với nhau bởi cầu nối disunfua (-S-S-), một nhóm sulhydryl và một sản phẩm amino acetyl hóa cuối cùng Số acid amin và vị trí các acid amin trong chuỗi polypeptid khác nhau tùy theo nguồn nguyên liệu

Đặc tính Cu,Zn - SOD Mn-SOD Fe-SOD

Trọng lượng

phân tử (Da)

y32.000 y135.000 (gian bào) ∼42.000÷85.000 ∼42.000 ÷ 85.000 Cấu trúc chuỗi

protein và trọng

lượng phân tử

α 2

(16.000) α(21.000) 2 hay α1 α(21.000) 2 hay α1Hoạt tính riêng

(UI/mg ptotein) ∼ 3.800 ∼ 3.000 ∼ 3.000

Chất kìm

Hãm enzym

Cyanua, Azit, Anions halogen, Diethyldithiocar ba-mate, Hydroperoxide

Azit

Azit, Fluor, Dithizone,

Hydroperoxyde

Bảng 1 : Một số đặc tính của SOD [44]

mol acide amine/ mol enzyme

Desul fo- vibrio Fe- SOD

E.Coli Fe- SOD

Chlorob i-um Fe- SOD

Pecto n-ema Fe- SOD

Eugle

na SOD

Fe-Cu,Zn -SOD của người

SOD của người

Bảng 2 Thành phần acide amine trong phân tử enzyme SOD từ các

nguồn gốc thu nhận khác nhau [47]

Enzyme SOD được phân thành ba loại như sau:

+ Cu,Zn-SOD (copper, zinc-superoxide dismutase): có chứa ion Cu2+ và ion Zn2+

+ Mn-SOD (Mangan-superoxide dismutase): có chứa ion Mn2+

+ Fe-SOD (Ferri- superoxide dismutase): có chứa ion Fe2+

I.2.1 Superoxide Dismutase chứa đồng, kẽm ( Cu,Zn-SOD ) [26], [29], [40], [44]

Hai loại Enzyme SOD chứa đồng, kẽm đó là EC-SOD và Cu, Zn-SOD:

I.2.1.1 EC-SOD ( Extracellular Superoxide Dismutase) là một Enzyme

chống lại các tác nhân oxy hoá như là các gốc tự do sinh ra trong quá trình hô hấp của tế bào Đây là enzyme được thu nhận từ dịch ngoại bào và trong gian bào Loại Cu, Zn-SOD tồn tại trong bào tương( EC-SOD) có MR= 135kDa, sẽ bao gồm hai chuỗi polypeptit xoắn kép (4 chuỗi đơn) và chứa 2÷4 nguyên tử gam của mỗi loại ion Cu2+ và Zn2+.[40],

Bằng kỹ thuật Elisa( Enzyme Link Immuno Sorbent Assay) các nhà khoa học ở Uùc, Nhật, Thụy Điển[28], [46] đã đưa ra được các chỉ số EC-SOD trong người bình thường và trong những người có vấn đề về sức khoẻ Họ cũng đã xác định được có sự đột biến điểm trên gene của phân tử EC-SOD dẫn đến việc biến đổi từ Arg213 Gly Những trường hợp có đột biến gene đều cho mức độ EC-SOD > 400ng/ml Như vậy trong người bình thường được chia ra thành 2 nhóm :

− Nhóm I có hàm lượng EC thấp EC-SOD < 120ng/ml (55.8 ±18.8ng/ml)

− Nhóm II có hàm lượng EC cao EC-SOD > 400ng/ml

Ngoài ra các nhà khoa học còn thấy rằng EC-SOD còn có các mức độ ái lực với Heparine khác nhau

− Type A không có ái lực với Heparine

− Type B có ái lực yếu với Heparine

− Type C có ái lực mạnh với Heparine

Nhóm I có chứa cả 3 Type nhưng nhóm II chủ yếu chứa type C

Trong các nghiên cứu chúng ta thấy rằng mức độ EC-SOD ở nam (86,6

± 5,1ng/ml) thấp hơn nữ (113,6 ± 13,2ng/ml) Ở người hút thuốc (75,0 ± 9,3ng/ml)thấp hơn người không hút thuốc( 111,7 ± 8,2ng/ml) Bên cạnh đó họ cũng thấy mức độ EC-SOD sẽ cao hơn so với những người bình thường trong những người có bệnh như : tiểu đường, tim mạch, gan, …

I.2.1.2 Cu,Zn-SOD (Cytosolic Cu,Zn-SOD) [ 26],[34], [43], [44], [48]

Cu,Zn-SOD có trong tế bào chất của động vật có chuyển hoá oxy Cu,Zn-SOD là 2 chuỗi polypeptid liên kết nhau theo cầu nối Histidin 61 Cu và Zn trong chuỗi polypeptid cũng liên kết bởi cầu nối Histidin 61 Trọng lượng phân tử của Cu,Zn-SOD khoảng 32.400 Da

Hình 1 Cấu trúc Cu,Zn-SOD

− Enzyme Cu, Zn – SOD có MR=31,7 ÷ 32,7 kDa, trung tâm hoạt động chứa 1÷2 nguyên tử gram Cu2+ và một lượng nguyên tử gram Zn2+ tương tự, liên kết với chuỗi polypeptid xoắn kép Do đó, tùy nguồn nguyên liệu mà có thể tồn tại 2 hoặc 4 nguyên tử gam Cu2+ và của Zn2+ trong chuỗi polypeptit Các thí nghiệm khảo sát về cấu trúc không gian của SOD cho thấy:

− Mỗi ion Cu2+ liên kết với nitơ imidazol của 4 histidin, và mỗi ion Zn2+liên kết với nhóm imidazol của 3 histidin và một gốc COO- của acid aspartic

− Ion Cu2+ giữ vai trò quan trọng trong cơ chế xúc tác trao đổi điện tử của enzym, Zn2+ chỉ giữ vai trò phụ trợ cho sự bền vững của trung tâm hoạt động

− Ion Cu2+ và ion Zn2+ liên kết chặt chẽ với chuỗi polypeptit bằng cầu nối disulfua, vị trí của chúng gần nhau nhưng độc lập nhau

− Cả 2 ion Cu2+ và Zn2+ có thể chuyển đổi thuận nghịch vị trí cho nhau trong trung tâm hoạt động của enzym

− Trình tự sắp xếp các acid amine trong chuỗi polypeptit của SOD là nguyên nhân của sự khác nhau về độ bền cũng như một số đặc tính của SOD, được chiết xuất từ các nguồn nguyên liệu khác nhau

− Một số acid amin của Cu, Zn-SOD bị biến đổi nhóm chức (gốc) tự nhiên khi SOD bị biến tính bởi các tác nhân hóa lý, sự biến đổi acid amin phụ thuộc tính bền của SOD từ các nguyên liệu khác nhau

− Các nghiên cứu đã cho thấy: SOD có khả năng thoái hóa chậm phù hợp với cấu trúc bền vững của phân tử SOD, để thực hiện vai trò quan trọng đối với sự sống hiếu khí Sự thay thế một số acid amin đã diễn ra trong suốt quá trình tồn tại của SOD

Đặc tính Cu,Zn-SOD (Cytosolic Cu,Zn-SOD) [28], [29], [34], [40]

Enzym Cu, Zn-SOD có những đặc tính như sau:

− Ion Cu2+ không bền ở pH<4,5, đưa đến sự giảm hoạt độ enzym trong môi trường pH acid

− Enzym Cu,Zn-SOD bị vô hoạt trong dung dịch KCN nồng độ 1÷5mM,

ở nhiệt độ phòng, do mất đi các ion Cu2+ và Zn2+ Hoạt độ Cu,Zn-SOD bị tổn thất 90,5% trong dung dịch 1mM KCN

− Hoạt độ Cu,Zn-SOD bị giảm 90% trong dung dịch EDTA nồng độ 10-3

M ở pH = 3,8 do dung dịch EDTA cạnh tranh kim loại Cu2+ của tâm hoạt động gây biến đổi không thuận nghịch cấu trúc enzym, khiến enzym bị giảm hoạt độ

− Hoạt độ Cu,Zn-SOD giảm 40% trong môi trường pH10,2 và 0,2M guanidin ở 250C, và sẽ bị bất hoạt hoàn toàn khi nồng độ guanidin tăng đến 1,2M

− Hoạt tính của Cu,Zn-SOD không bị ảnh hưởng bởi acid benzoic, chỉ bị giảm hoạt tính khi bị bổ sung muối guanidium clorua với nồng độ 8M, nhưng riêng guanidium clorua ở nồng độ thấp cũng có thể cản trở sự hoạt động của enzym SOD

tio-binitro-− Enzym Cu,Zn-SOD có thể kết tinh được trong các dung môi clorofom, etanol, aceton và nước, nhưng hoạt tính enzym có thể bị ảnh hưởng

− Hoạt tính Cu,Zn-SOD chỉ bị giảm đi 10% sau 3 giờ giữ trong môi trường 86% metanol ở 240C

− Enzym Cu,Zn-SOD không bền, dễ dàng bị thủy phân bởi proteaza và tác động của nhiệt độ cao

− Hoạt độ Cu,Zn-SOD không bị ảnh hưởng bởi môi trường ure nồng độ 8,0 ÷ 9,5M

− Chuỗi polypeptid của Cu,Zn-SOD không chứa tryptophan

− Các nhóm thuốc thử đặc trưng như xanh methylen được sử dụng để nhận dạng nhóm acid amin của chuỗi polypeptid , mà các nhóm acid này thường bị cản trở bởi Cu2+ hoặc Zn2+

− Chỉ riêng histidin bị biến đổi bởi nhóm thuốc thử hoạt quang Một số trường hợp enzym bị vô hoạt, biến tính hoàn toàn là do sự mất đi 3 gốc histidin trong một chuỗi xoắn kép

− Acid di-azo-sunfanilic dễ dàng liên kết với gốc histidin làm biến tính chuỗi polypeptid, nhưng không ảnh hưởng đến enzym

− Tác động của kim loại đồng đến hoạt độ SOD: khi cơ thể bị thiếu lượng Cu2+, thì hoạt độ cũng như hàm lượng sinh phẩm enzyme Cu,Zn-SOD trong tế bào giảm, dẫn đến sự lão hóa hư hoại tế bào Ion Cu2+ tác động tăng hoạt độ SOD trong tế bào của những cơ thể thiếu Cu2+, và không có tác dụng đối với cơ thểcó đầy đủ lượng Cu2+

Những nghiên cứu về ảnh hưởng của Cu2+ đến hoạt độ của SOD trong hồng cầu của chuột đã cho thấy: hoạt độ SOD trong hồng cầu của chuột bị thiếu lượng Cu2+ trong khẩu phần ăn (4,9UI/mg hồng cầu), chỉ bằng 38% so với chuột được cung cấp đầy đủ lượng Cu2+ (12,6UI/mg hồng cầu) Sau khi được tiêm một lượng khoảng 15% Cu2+ trong huyết thanh, thì hoạt độ SOD tăng lên đến 83% của trường hợp chuột được cung cấp đầy đủ lượng Cu2+ Hoạt độ SOD của tế bào hồng cầu trẻ cao hơn tế bào già 22%; trong trường hợp thiếu hàm lượng Cu2+, thì hoạt độ SOD như nhau trong cả hai loại tế bào (4,4UI/mg hồng cầu), khi được cung cấp Cu2+ thì hoạt độ SOD của chúng tăng lên như nhau đạt 56% Thí nghiệm trên chuột cũng có khả năng cho kết luận gần tương tự đối với người

I.2.2 Mn-SOD và Fe-SOD[40], [47]

− Mn-SOD có thể tìm thấy trong mitochondria của tế bào động vật bậc cao Mn-SOD và Fe-SOD đã được phát hiện trong nguyên sinh chất của tế bào nhân sơ Riêng Fe-SOD còn được phát hiện trong nguyên sinh chất của tế bào sinh vật yếm khí

Trong những nghiên cứu gần đây cho thấy rằng SOD còn được phát hiện tồn tại trong tế bào của các loài vi sinh vật; thực vật nhất là các cây họ đậu; tế bào của các loài tảo như tảo đỏ; trong hồng cầu và trong tế bào nội tạng của động vật như tim, gan

Đặc tính của Mn-SOD và Fe-SOD : [44], [47]

Trong quá trình xúc tác phản ứng loại trừ O2-, trung tâm hoạt động xúc tác Mn2+ của Mn-SOD chuyển thành Mn3+ và ngược lại, ion Fe2+ ở trung tâm hoạt động của Fe-SOD cũng chuyển thành Fe3+ và ngược lại Tính chất chức năng của Mn-SOD và Fe-SOD đều tương tự với Cu,Zn-SOD Ngoài ra còn một số đặc trưng riêng:

− Nhóm enzym Mn-SOD và Fe-SOD đều bị vô hoạt bởi quang phổ EPR, và cũng bị vô hoạt bởi pH acid và kiềm

− Nhóm enzym Mn-SOD và Fe-SOD đều không bị vô hoạt bởi muối Cyanua

− Chuỗi polypeptid tetrame của Mn-SOD thu nhận từ ty thể tế bào động vật hoặc từ nguyên sinh chất của tế bào nhân sơ có thể ở dạng dime, nhưng không ảnh hưởng đến hoạt độ enzym

I.3 Cơ chế xúc tác của SOD:[44]

Enzym SOD luôn tồn tại trong tế bào sinh vật, là nhân tố quan trọng thực hiện nhiệm vụ xúc tác cho phản ứng oxy hóa khử loại trừ gốc superoxide

O2- Cơ chế phản ứng xảy ra như sau:

2O2- + 2H+ H2O2 + O2 (1)

Vì O2- liên tục được sinh ra và liên tục bị phân hủy như (1) nên SOD

có hoạt tính càng cao thì nồng độ O2- càng nhỏ Do vậy, SOD là một chất chống oxy hóa rất cơ bản (làm hạ thấp nồng độ O2- ), bởi vì từ O2- sẽ sản sinh

ra các dạng oxy hoạt động khác có hại cho tế bào cơ thể

I.4 Cơ chất superoxide O 2 - của SOD:

I.4.1 Sự hình thành các dạng oxy hoạt động trong tế bào: [8],[9], [32]

Thuyết lão hóa do gốc tự do của oxy quan niệm rằng quá trình già là sự tích lũy dần dần các sai lệch trong cấu trúc tế bào Nguyên nhân của sự sai lệch đó là do các dạng oxy hoạt động sinh ra từng giờ, từng phút trong hô hấp tế bào

Các phản ứng oxy hóa khử trong cơ thể chỉ có thể trao đổi một điện tử Do đó oxy ở chuỗi hô hấp tế bào cũng chỉ nhận từng điện tử một Vì vậy, quá trình nhận bốn điện tử của oxy tạo ra nước:

O2 + 4H+ + 4e 2H2O (2) buộc phải qua bốn đoạn như sau :

SOD

O2 + e O2- (3)

O2- + 2H+ + e H2O2 (4)

H2O2 + H+ + e HO. + H2O (5)

HO. + H+ + e H2O (6) Phản ứng (4), (5), (6) có tốc độ chậm, cho nên quá trình thực tế dừng lại

ở phản ứng (3), tạo ra gốc anion superoxide O2- Gốc này chuyển thành H2O theo những phản ứng xúc tác enzym có tốc độ lớn hơn nhiều:

1O2 là oxy đơn bội, rất độc hại, có khả năng phản ứng cực kỳ mạnh mẽ

− Phản ứng phụ khác là phản ứng Haber-Weiss:

O2- + H2O2 1O2 + .OH + - OH (10) Oxy đơn bội (1O2) và gốc hydroxyl (.OH) đều có khả năng phản ứng mạnh và rất độc hại, chúng là thủ phạm chính trong quá trình peroxyd hóa các chất

RH + .OH R. + H2O

R_R' + .OH R. + R' OH

R. + O2 ROO. ROO. + RH ROOH + R.

(Với R, R' là các gốc hydrocacbon) Các phản ứng dây chuyền trên chỉ được dập tắt khi gốc R. gặp một gốc .R' để tạo thành:

R. + .R' R_ R'

Tóm lại, từ anion superoxide O2- được sinh ra đầu tiên sẽ sản sinh ra hàng loạt các chất: H2O2, HO., 1O2, ROO., R.….Chúng đều được gọi là các dạng oxy hoạt động, gây ra những sai lệch trong cấu trúc tế bào, dẫn đến quá trình già và nhiều bệnh lý khác của con người

I.4.2 Tính tích cực và tác hại của O 2 - đối với tế bào: [ 9]

I.4.2.1 Tính tích cực của O 2 - :

Đối với động vật cấp cao, O2- được sinh ra ở liều lượng rất nhỏ dưới sự xúc tác của xanthineoxydase để thực hiện nhiệm vụ:

SOD catalaza

− Tiêu diệt các DNA (Dezoxyribonucleic acid) bị tổng hợp sai, các protein có cấu trúc sai lệch hoặc đã lão hóa

− Tiêu diệt các vi khuẩn xâm nhập tế bào, loại trừ những thành phần không thích hợp, những thành phần không thể thực hiện đúng chức năng của mình trong tế bào

I.4.2.2 Tác hại của O 2 - đối với tế bào: [9]

Các kết quả nghiên cứu cho thấy O2- có tác động trực tiếp đến các mạch protein, lipid, polysaccarit, acid nucleic và những hợp chất sinh học như DNA

− O2- là nguyên nhân khởi đầu sự phân cắt mạch DNA, acid polysaccarit như acid alginic thành những gốc tự do và sự phân cắt vẫn tiếp diễn gây ra sự thoái hóa mạch polymer

− O2- cũng khởi đầu cho phản ứng peroxyd hóa chất béo không no, cũng như gây nên sự tự oxy hóa của thiol và của epinephrine, bắt đầu cho chuỗi phản ứng oxy hóa cystein

− O2- được xem là nguyên nhân sinh ra sự tổn hại cho tế bào và mô Chính SOD là enzym duy nhất có khả năng xúc tác cho phản ứng loại trừ sự tồn tại của O2-, ngăn chặn hiện tượng hư hoại xảy ra trong các tế bào hay các mô của cơ thể sống

− O2- dư thừa, ngoài việc làm tổn hại đến các mô, nó sẽ chuyển hóa tạo thành các độc tố khác của oxy là: .OH, 1O2, H2O2

I.5 Một số bệnh có liên quan đến O 2 - và SOD: [ 9]

I.5.1 Bệnh ung thư:

− Trong cơ thể người bình thường, những phần tử lạ được tổng hợp từ gen gây bệnh ung thư đều bị ức chế tiêu diệt bởi O2-, do đó mầm mống ung thư tự hoại Khi gen này hoạt động mạnh thì O2- không thể làm tròn chức năng và còn bị ức chế bởi lượng lớn phần tử lạ được tổng hợp Nếu gen gây bệnh ung thư đã kết gắn với mạch DNA thì phát sinh bệnh ung thư, hoạt tính SOD trong tế bào ung thư giảm thấp

− Phương pháp phóng xạ và hóa dược được sử dụng điều trị bệnh ung thư, tạo các gốc tự do có khả năng gây hư hoại hầu như toàn bộ các phân tử DNA gây chết tế bào ung thư Xạ trị mang tính cách điều trị tại vùng kiểm soát các ung thư còn khu trú, hạn chế tối đa sự tổn thương cho các vùng mô lân cận Còn phương pháp hóa dược điều trị có thể gây tổn thương cho nhiều

vùng mô lành khác Vì vậy SOD được đưa vào tế bào để bảo vệ các mô lành chống lại tổn thương bởi phương pháp hóa dược trị ung thư

I.5.2 Bệnh tai biến mạch máu não:

Do phẫu thuật hoặc một dạng bệnh lý (như có những phần tử phân giải từ ATP ) tích tụ lại trong huyết quản, đã khiến máu không thể lưu thông một cách bình thường Khi đó hàm lượng O2- trong tế bào giảm xuống đột ngột

do tế bào không được cung cấp đầy đủ O2 Để tạo lại sự cân bằng thì xanthinedehydrogenase (XHD) sẽ biến đổi thành xanthineoxydase (XOD) để tăng cường xúc tác phản ứng tạo O2- từ cơ chất hypoxanthine Đến khi máu lưu thông trở lại thì O2, hypoxanthine, XHD, XOD cùng tồn tại tạo ra một lượng thừa O2- không thể được chuyển hóa kịp thời bởi SOD, do đó sinh ra .OH gây tổn hại tim mạch

I.5.3 Bệnh Down:

Bệnh Down là do cặp nhiễm sắc thể thứ 21 của tế bào bào thai chứa số lượng gen di truyền SOD gấp đôi so với cặp nhiễm sắc thể thứ 21 của tế bào bình thường Do đó lượng SOD được tổng hợp nên trong tế bào của bào thai này lớn hơn nhiều so với các bào thai bình thường, khiến lượng O2- trong tế bào bị chuyển hóa nhanh chóng thành H2O2 và tăng cao vượt bình thường trong chu trình hô hấp Do đó lượng H2O2 này gây tổn thương hệ thần kinh của thai nhi, triệu chứng thường thấy ở bệnh Down là chứng tăng bạch cầu

I.6 NGUYÊN LIỆU MÁU:

Máu là một thành phần tổ chức của cơ thể Máu lưu thông trong các động mạch, tĩnh mạch và các mao mạch của cơ thể, thực hiện nhiều chức năng sinh lý quan trọng Máu được luân chuyển đến mọi bộ phận và cơ quan của cơ thể, vì vậy nó có ảnh hưởng tới tất cả các cơ quan và bộ phận đó

I.6.1 Tính chất và chức năng của máu: [6],[15],[19]

I.6.1.1 Tính chất của máu:

− Máu là một loại mô liên kết đặc biệt gồm chất cơ bản là chất lỏng (huyết tương) và phần tế bào (huyết cầu)

− Huyết tương chiếm 55-60% thể tích máu và huyết cầu chiếm 40-45% thể tích máu

− Huyết cầu gồm hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu

Nước (%) Chất khô(%)

Máu toàn phần 75-85 15-25

Bảng 3: Thành phần nước và chất khô trong máu [ 3]

− Máu động mạch có màu đỏ tươi, máu tĩnh mạch có màu đỏ sẫm

− Khối lượng máu trong cơ thể chiếm 7% - 9% tổng trọng lượng cơ thể Trung bình trong cơ thể người trưởng thành có khoảng 65 - 75 ml máu trong 1 kg trọng lượng

Bảng 4: Tỷ trọng của các chất trong máu [6]

− Độ nhớt của máu so với nước là: 3,8/1 đến 4,5/1

− Độ nhớt của huyết tương so với nước là: 1,6/1 đến 1,7/1

− Độ nhớt của máu phụ thuộc vào nồng độ protein và số lượng huyết cầu

Áp suất thẩm thấu của máu bằng 7,5 at Áp suất thẩm thấu của máu phụ thuộc vào tất cả các phân tử và ion có trong máu, chủ yếu là Na+, Cl−, HCO3− Các chất hữu cơ khác như ure, glucoza… tương đối ít ảnh hưởng vì nồng độ của chúng trong máu thấp so với NaCl và không phân ly thành các ion

Độ pH của máu bằng 7,39 Như vậy, máu có phản ứng kiềm yếu, nó nghiêng về phía acid khi bị ngạt, bị sốc và nghiêng sang kiềm khi thở nhanh

I.6.1.2 Chức năng của máu:

a Chức năng hô hấp: máu chuyển oxy từ phổi tới các mô và CO2 từ các mô tới phổi thải ra ngoài

b Chức năng dinh dưỡng: máu vận chuyển các chất như glucoza, acid amin, acid béo, vitamin… đến cung cấp cho các tổ chức tế bào

c Chức năng đào thải: máu lưu thông khắp cơ thể lấy những chất cặn bã của chuyển hóa tế bào đưa đến những cơ quan bài xuất như thận, phổi, tuyến mồ hôi…

d Chức năng bảo vệ cơ thể: các loại bạch cầu của máu có khả năng thực bào, khử độc, tiêu diệt vi trùng Trong máu có các kháng thể, kháng độc tố… tham gia vào cơ chế bảo vệ cơ thể

e Chức năng thống nhất và điều hòa hoạt động cơ thể:

- Máu mang các hormon, các loại khí O2 và CO2, các chất điện giải Ca2+,

K+, Na+… để điều hòa hoạt động các nhóm tế bào, các cơ quan khác nhau trong cơ thể, nhằm đảm bảo sự hoạt động đồng bộ của các cơ quan trong cơ thể

- Máu còn có khả năng điều hòa nhiệt độ cơ thể một cách nhanh chóng, làm cho các phần khác nhau trong cơ thể luôn có cùng một nhiệt độ tương đương nhau

I.6.2 Hồng cầu: [6],[12],[14],[19],[20]

I.6.2.1 Hình thể, thành phần cấu tạo và số lượng hồng cầu:

− Hồng cầu là những tế bào không nhân, hình dĩa, lõm hai mặt

− Đường kính của hồng cầu: 7-8 μm

− Chiều dày tế bào ở trung tâm là 1 μm và ở ngoại vi là 2-3 μm

− Hình dĩa lõm hai mặt thích hợp với khả năng vận chuyển khí của hồng cầu vì:

− Tổng diện tích tiếp xúc của hồng cầu trong cơ thể là 3000 m2 Hình dĩa lõm làm tăng diện tích tiếp xúc của hồng cầu lên 30% so với hồng cầu hình cầu

− Làm tăng tốc độ khuếch tán khí

− Làm cho hồng cầu có thể biến dạng dễ dàng khi nó xuyên qua các mao mạch có đường kính rất nhỏ

b Thành phần cấu tạo:

− Hồng cầu có màng bán thấm bao quanh Màng hồng cầu không cho protid, lipid thấm qua; đối với các ion muối khoáng, tính thấm của màng cũng không đều:

− Các ion H+, OH-, HCO3- và một số anion hữu cơ thấm qua dễ dàng

− Các ion K+, Na+ thấm qua rất ít và chậm

− Các ion Ca2+, Mg2+ không thấm qua được

− Hồng cầu không thay đổi hình dạng khi đặt trong dung dịch đẳng trương (dung dịch NaCl 9‰) Trong dung dịch ưu trương nước trong hồng cầu thấm ra ngoài nhiều hơn làm hồng cầu co lại Trong dung dịch nhược trương nước từ ngoài thấm vào hồng cầu làm nó trương to lên và cuối cùng vỡ ra gây tan máu

− Hồng cầu trong máu động mạch có độ bền cao hơn hồng cầu trong máu tĩnh mạch

− Độ bền hồng cầu tăng sau khi cắt lách và giảm trong bệnh vàng da huyết tán

Các chất Thành phần (%)

Bảng 3: Thành phần các chất trong hồng cầu [6],[17]

Chất Hàm lượng (%)

− Màng hồng cầu gồm ba lớp:

- Lớp ngoài: là glycoprotein, glycolipid và acid sialic, có nhiều lỗ nhỏ (khoảng 100000 lỗ), đường kính mỗi lỗ khoảng 3-4 Ao (Angstrong)

- Lớp lipid:

-Lớp lipid làm giữ nguyên hình dạng của hồng cầu

-Phospholipid chiếm 65%, chủ yếu gồm: phosphotidyl ethanolamin, phosphotidyl serin, phosphotidyl cholin, sphingomyelin

- Lớp trong cùng: là những sợi vi thể, những ống vi thể và những phân tử calmodulin, protein gắn hemoglobin Các phân tử calmodulin điều hòa hoạt động các enzym ở màng

c Số lượng hồng cầu:

Ở người Việt Nam trưởng thành: [5],[12],[19],[20]

− Số lượng hồng cầu phụ thuộc vào lứa tuổi:hồng cầu ở trẻ sơ sinh khoảng từ 5000000 ÷ 7000000 /mm3 máu

− Số lượng hồng cầu phụ thuộc vào sự bài tiết erythropoietin, vì erythropoietin tác động lên tủy xương, làm tăng sản xuất hồng cầu

− Số lượng hồng cầu thay đổi trong các trường hợp bệnh lý:

+ Hồng cầu tăng trong bệnh đa hồng cầu, khi ngạt, trong mất nước nhiều do tiêu chảy, nôn ói nhiều hoặc do bị phỏng, mất huyết tương…

+ Số lượng hồng cầu giảm trong các bệnh thiếu máu, xuất huyết…

I.6.2.2 Chức năng của hồng cầu:

a Chức năng hô hấp của hồng cầu: là chức năng chính của hồng cầu Chức năng này được thực hiện nhờ hemoglobin chứa trong hồng cầu

b Chức năng miễn dịch hồng cầu:

− Giữ lấy các phức hợp kháng nguyên- kháng thể - bổ thể tạo thuận lợi cho quá trình thực bào

− Hồng cầu có khả năng bám vào các lympho T và có các hoạt động enzym bề mặt Chính hai đặc tính này làm hồng cầu tiếp cận với các đại thực bào

− Các kháng nguyên của màng hồng cầu đặc trưng của các nhóm máu

c Chức năng điều hòa cân bằng toan-kiềm của cơ thể:

− Hemoglobin trong hồng cầu thực hiện một hệ thống đệm quan trọng Nhân imidazol của histidin trong globin có một sự cân bằng giữa dạng acid và dạng kiềm

− Tác dụng đệm của hemoglobin chiếm 70% tác dụng đệm của máu toàn phần

d Chức năng tạo áp suất keo: những thành phần cấu tạo của hồng cầu phần lớn là protein Vì vậy nó góp phần tạo áp suất keo của máu

I.6.2.3 Sự điều hòa sản xuất hồng cầu:

a Nơi sản sinh hồng cầu: hồng cầu được sinh sản ngay từ trong bào thai, nhưng từ lúc còn trong bào thai cho tới lúc cơ thể trưởng thành, hồng cầu được sản xuất ở những cơ quan khác nhau:

− Trong những tuần đầu của phôi hồng cầu được sinh ra ở lá thai giữa, những hồng cầu to gọi là nguyên hồng cầu

− Từ tháng thứ hai trở đi gan, lách và hạch sinh ra hồng cầu có nhân

− Từ tháng thứ năm trở đi cho tới khi trẻ sơ sinh, trẻ phát triển, trưởng thành… tủy xương là nơi duy nhất sản sinh ra hồng cầu Sự sản sinh ra hồng

+ H+

H N

Globin

Globin

cầu của tủy xương cũng giảm dần khi tuổi tăng lên Vì vậy ở những người cao tuổi thường thiếu máu nhẹ

b Sự sản sinh hồng cầu :

− Bình thường tủy xương sản xuất mỗi ngày từ 0,5-1% hồng cầu để thay thế 1% hồng cầu chết mỗi ngày trong máu ngoại vi và trong lách Khi có nhu cầu (bệnh tán huyết nặng) tủy xương có thể tăng sản xuất gấp 6-8 lần so với bình thường

− Hồng cầu non là những tế bào có nhân, dần dần các nhân đông đặc và

co lại Đến giai đoạn nguyên hồng cầu ưa acid, nhân tế bào lệch về một phía, rồi bị đẩy ra ngoài, tế bào trở thành hồng cầu lưới với mạng nội bào tương bắt màu kiềm

− Hồng cầu lưới xuyên mạch ra máu ngoại vi, sau hai mươi bốn giờ mạng lưới biến mất, hồng cầu lưới trở thành hồng cầu trưởng thành Tỷ lệ hồng cầu lưới trong máu ngoại vi khoảng 0,7-0,9% tổng hồng cầu

− Sự tổng hợp hemoglobin bắt đầu từ giai đoạn nguyên hồng cầu ưa kiềm và ngày càng tăng dần Đến giai đoạn nguyên hồng cầu ưa acid, nồng độ hemoglobin trong hồng cầu đạt mức bão hòa (34%)

I.6.2.4 Hemoglobin (Hb): [6]

a Số lượng hemoglobin trong hồng cầu:

− Hemoglobin là huyết cầu tố (ký hiệu là Hb), là một cromoprotein có màu đỏ ở trong hồng cầu Hemoglobin có nhóm ngoại là hem, phần protein là globin Hemoglobin có phân tử lượng là 68.000Da, có khả năng chuyên chở chất khí

− Tỷ lệ phần trăm tính theo trọng lượng của các thành phần của hemoglobin như sau:

Hemoglobin

Sắt Protoporphyrin 94%

− Hemoglobin được màng hồng cầu bảo vệ Trong những trường hợp bệnh lý (trúng độc rắn, bệnh bẩm sinh…) sức bền màng hồng cầu giảm, hồng cầu bị bể trong mạch máu, hemoglobin giải phóng vào huyết tương, không còn bảo đảm được chức năng vận chuyển khí

b Sự thành lập hemoglobin:

− Hemoglobin được tổng hợp chính từ acid acetic và glycin Acid acetic được biến đổi trong chu trình Krebs thành α - cetoglutaric acid và từ hai phân tử chất này sẽ kết hợp với một phân tử glycin để thành lập chất pyrrol

− Sau đó từ bốn phân tử pyrrol sẽ kết hợp lại thành một protoporphyrin và protoporphyrin kết hợp với sắt để tạo thành phân tử hem Cuối cùng bốn phân tử hem kết hợp với một phân tử globin để tạo thành hemoglobin

Hình 2: Công thức cấu tạo của Hemoglobin

− Hemoglobin được thành lập ngoài các chất cần thiết như: acid amin,sắt, còn một số chất phụ khác như: đồng (Cu), pyridoxin (B6), cobalt, nikel…làm vai trò chất xúc tác

c Chức năng hô hấp của hemoglobin:

i Hemoglobin vận chuyển oxy từ phổi đến các mô:

- Hemoglobin kết hợp với oxy tạo thành oxyhemoglobin (HbO2) Oxy được gắn với Fe2+ trong thành phần hem Một phân tử Hb có thể gắn với bốn phân tử O2 Hb +

O2 HbO2O2

+O2

Hb Hb(O2) 2

+ O2(O2

Hb )3 Hb(O2)4

O2+ Hb(O2)3(O2

Hb )2

F e

N N N N

G L O B I N

M M

P : C H2 C H2 C OOH

N : nitơ của acid amin histidin

- Khi hồng cầu đến phổi, oxy từ phổi sẽ di chuyển và kết hợp với Hb Khi đến mô nơi có phân áp oxy thấp hơn ở máu, oxy sẽ rời khỏi Hb vào huyết tương, rồi vào mô Trong kết hợp này, oxy vẫn ở dạng phân tử, mô dễ hấp thu

ii Hemoglobin vận chuyển CO2:

- 20% CO2 trong máu được kết hợp với Hb để tạo thành carbamino-hemoglobin CO2 kết hợp vào Hb qua các nhóm amin (-NH2) của globin

- Ở các mô, phân áp CO2 cao, phản ứng xảy ra theo chiều thuận (1) Ở phổi HbCO2 sẽ phân ly và CO2 được thải ra khỏi cơ thể qua hô hấp

iii Hemoglobin kết hợp với CO:

- Hb kết hợp với CO tạo thành cacboxy-hemoglobin, là một hợp chất rất bền vững và không vận chuyển được O2 , gây ngạt bên trong

- Hb không còn khả năng kết hợp với O2 nữa

iv Các loại hemoglobin:

- Ở người bình thường có hai loại Hb: HbA ở người trưởng thành và HbF ở bào thai

- Khi có sự đột biến gen sẽ tạo ra những Hb không bình thường: HbS, HbC, HbE, HbJ… gây ra các bệnh

v Sự thoái biến hemoglobin:

− Đời sống trung bình của hồng cầu trong máu ngoại biên khoảng 120 ngày

− Khi các hồng cầu già, bị phá vỡ trong hệ thống võng nội mô Hb được tách ra thành hem và globin Globin được chuyển hóa như các protein khác trong cơ thể Phần hem được phân hủy như sau:

− Sắt được tách ra và giải phóng vào huyết tương

− Transferrin sẽ vận chuyển sắt đến tủy xương để tạo hồng cầu mới hoặc đến gan và các tổ chức khác để dự trữ dưới dạng ferritin

+

(1)(2)+

− Phần còn lại của hem chuyển thành bilirubin

I.7 CÁC PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN VÀ TINH SẠCH PROTEIN, ENZYM: [21], [23]

I.7.1 Các phương pháp phá vỡ tế bào:

I.7.1.1 Phương pháp cơ học: Thường áp dụng hai phương pháp nghiền

bi và đồng hóa cao áp

− Ưu điểm: cho phép tiến hành phá vỡ tế bào một cách liên tục, thời gian hoạt động ngắn, giúp giảm đến mức tối đa sự biến tính của sản phẩm sinh học

− Nhược điểm: phương pháp này không mang tính đặc trưng vì tế bào luôn bị phá vỡ cấu trúc và không thể quan sát sự tương tác ở giai đoạn làm vỡ

I.7.1.2 Phương pháp vật lý:

Sử dụng nhiệt, áp suất thẩm thấu, làm lạnh nhanh, sóng siêu âm để làm vỡ màng tế bào

I.7.1.3 Phương pháp hóa học:

Sử dụng các loại acid, kiềm, muối, dung môi hữu cơ, chất hoạt động bề mặt có khả năng thẩm thấu vào tế bào giải phóng ra protein, enzym

I.7.1.4 Phương pháp sinh học:

Phương pháp sinh học phá vỡ tế bào có hai dạng: tự phân và phân hủy bằng enzym thủy phân

− Tự phân là phương pháp dựa trên sự tạo nên stress gây lão hóa thành tế bào, hoặc gây biến đổi cấu trúc tế bào, làm thoái hóa thành tế bào Quá trình lão hóa thành tế bào hoặc quá trình tự phân phá vỡ tế bào lại phóng thích các enzym thủy phân tiếp tục giúp thành tế bào càng bị phá hủy sâu sắc

− Phương pháp dùng enzym thủy phân rất đặc trưng, thường được sử dụng với nguyên liệu nấm men

I.7.2 Các phương pháp tinh sạch protein, enzym:

I.7.2.1 Dựa trên kích thước phân tử:

a Thẩm tích và siêu lọc:

Một đặc điểm nổi bật của protein là có kích thước phân tử lớn, nhờ đó mà ta có thể tách các phân tử protein ra khỏi những phân tử nhỏ cũng như tách

riêng các loại protein ra khỏi hỗn hợp bằng phương pháp thẩm tích và siêu lọc

− Thẩm tích: dùng một màng bán thấm để giữ những phân tử protein lại

và để cho những chất hòa tan có phân tử nhỏ và nước đi qua

− Siêu lọc: dùng áp suất chân không để lọc dịch lỏng và những chất hòa

tan có phân tử nhỏ qua màng bán thấm, còn những phân tử protein thì được giữ lại

b Sắc ký loại trừ phân tử (sắc ký rây phân tử ):

Sắc ký loại trừ phân tử hay sắc ký rây phân tử là một trong những công cụ có ích và có hiệu lực nhất để tách phân đoạn các protein, enzym dựa trên trọng lượng phân tử của chúng Người ta sử dụng các “rây phân tử” như: sephadex, sepharose, sepharyl…

I.7.2.2 Dựa trên những khác biệt về độ hòa tan:

a Hòa tan và kết tủa protein bằng muối:

− Với nồng độ thấp, muối làm tăng độ hòa tan của nhiều protein Các muối hóa trị hai như MgCl2, (NH4)2SO4 có hiệu lực làm tăng độ hòa tan của protein lớn hơn nhiều so với những muối hóa trị một như NaCl, KCl, NH4Cl

− Muối trung tính ảnh hưởng đến độ hòa tan của protein phụ thuộc vào lực ion của chúng Khi hàm lượng muối tăng cao, độ hòa tan của protein bắt đầu giảm.Với hàm lượng muối cao protein có thể kết tủa hoàn toàn trong dung dịch, tác dụng này được gọi là kết tủa protein bằng muối

− Nguyên tắc của hiện tượng kết tủa protein bằng muối là nồng độ muối cao có thể tách lớp nước hydrat hóa ra khỏi phân tử protein, do đó làm giảm độ hòa tan của chúng (NH4)2SO4 được dùng để kết tủa protein bởi vì độ hòa tan trong nước của nó rất lớn và có thể đạt được lực ion cao

− Ưu điểm: protein được kết tủa bằng muối vẫn giữ nguyên cấu trúc ban đầu, có thể được hòa tan trở lại và thường không bị biến tính

− Khuyết điểm: việc tách muối ra khỏi tủa protein tiến hành khá phức tạp vì trong quá trình lắng tủa tuy phần lớn muối tồn tại trong dung dịch trên cặn, nhưng vẫn có một phần nhỏ có mặt trong tủa protein

b Kết tủa protein bằng dung môi hữu cơ:

Những dung môi hữu cơ trung tính có thể hòa tan với nước (như etanol, aceton…) sẽ làm giảm độ hòa tan trong nước của protein đến mức

chúng có thể tủa lại trong dung dịch Độ hòa tan của protein ở một pH và lực ion không đổi sẽ phụ thuộc vào hằng số điện môi của môi trường

c Kết tủa protein ở điểm đẳng điện:

− Phương pháp này dựa trên tính chất của protein có độ hòa tan thấp ở

pH đẳng điện của nó

− Ở giá trị pI đặc hiệu của từng protein, enzym thì điện tích toàn phần của phân tử protein bằng 0 Ở điểm này khả năng hydrat hóa của protein là cực tiểu và có sự gia tăng tương tác giữa các phân tử protein với nhau, dẫn đến tạo tủa lắng chung

− Ưu điểm: protein kết tủa ở pI Vẫn có thể giữ nguyên cấu trúc và có thể được hòa tan trở lại trong môi trường có pH và nồng độ muối thích hợp

− Khuyết điểm: hiệu quả không cao vì protein chỉ ổn định trong một khoảng giá trị pH giới hạn

I.7.2.3 Tinh sạch protein, enzym bằng các phương pháp sắc

ký:[1],[22]

Sắc ký là quá trình tách liên tục từng vi phân hỗn hợp các chất do sự phân bố không đồng đều của chúng giữa pha tĩnh và pha động khi cho pha động đi xuyên qua pha tĩnh Pha động thường là khí, lỏng được đi qua pha tĩnh Pha tĩnh là chất rắn hoặc chất lỏng mà ở trên bề mặt của nó xảy ra sự hấp phụ

Tùy theo loại enzym mà cần phải lựa chọn và phối hợp một cách hiệu quả nhất các phương pháp tách và tinh sạch khác nhau

Một số phương pháp sắc ký đang được áp dụng rộng rãi và hiệu quả để tinh sạch protein, enzym là:

I.7.2.3.1 Sắc ký trao đổi ion:

Dựa trên cơ sở của phản ứng trao đổi ion giữa protein được tan trong nước hoặc dung dịch đệm loãng và các tác nhân trao đổi ion Tác nhân trao đổi ion có thể là nhựa trao đổi ion dựa trên chất mang tự nhiên như xenluloza, sephadex

b Các giai đoạn xảy ra trong sắc ký trao đổi ion:

− Khi cho pha động chứa chất cần phân tích đi qua cột trao đổi ion thì những phần tử tích điện trái dấu với pha tĩnh sẽ được giữ lại trên cột do liên kết ion, những phần tử khác cùng dấu với pha tĩnh hoặc trung tính sẽ theo pha động ra ngoài một cách không chọn lọc

− Những phần tử đã được hấp phụ trên pha tĩnh sẽ được giải hấp phụ bởi pha động có ái lực với pha tĩnh mạnh hơn như dùng pha động có nồng độ muối cao hay pH cao Khi tăng pH của dung dịch đệm thì làm giảm lực tương tác điện tích giữa chất được hấp phụ và pha tĩnh Càng tăng lực ion trong pha động thì có thể tách được các phân tử chất tan càng nhiều

c Chất trao đổi ion:

− Trong sắc ký trao đổi ion việc lựa chọn chất trao đổi ion rất quan trọng

− Xenluloza ionit là chất trao đổi ion tốt nhất thường dùng trong việc tinh chế protein, enzym, acid nucleic Đó là do chúng có khả năng phân tách cao, không hấp phụ các chất có phân tử lượng thấp và không làm biến tính protein, enzym

− Có hai loại xenluloza ionit:

+Xenluloza cationit gồm: cacboxymetylxenluloza (CM–xenluloza), photphoxenluloza, sunfoetylxenluloza, sunfometylxenluloza Trong đó

CM–xenluloza thường dùng hơn cả, CM–xenluloza có ion trao đổi là H+:

+Xenluloza anionit gồm: dietylaminoetylxenluloza (DEAE–xenluloza), trietylaminoetylxenluloza DEAE–xenluloza thường dùng hơn, có ion trao đổi là OH- :

Xa+, Xc- là các ion không hòa tan của xenluloza anionit, xenluloza cationit

− Mỗi protein đều có điểm đẳng điện pI khác nhau, phân tử trung hòa điện tại giá trị pI Các phân tử protein sẽ tích điện âm (-) khi pH của dung môi cao hơn pI thì ta chọn chất trao đổi ion là anionit Khi pH của dung môi nhỏ hơn pI protein tích điện dương (+), lúc đó ta dùng ion trao đổi là cationit

d Chọn dung dịch đệm:

Dung dịch đệm hay pha động được lựa chọn theo chất tan trong dung dịch đệm, theo pH và theo lực ion Ion của dung dịch đệm luôn tương tác cạnh tranh với chất tan để được hấp phụ trên chất hấp phụ trao đổi ion, điều

này gây giảm khả năng trao đổi của cột Nên chọn đệm acetat hoặc Cl- ở pH 7,8 ÷ 8,2 khi sử dụng DEAE–xenluloza và đệm chứa cation (như K+, Na+,

Mg2+…) ở pH < 7 khi sử dụng CM–xenluloza

I.7.2.3.2 Sắc ký lọc gel: [1 ]

Sắc ký lọc gel (hay sắc ký rây phân tử) là một dạng sắc ký có khả năng tách và tinh sạch các hợp chất cao phân tử (các protein, polyme…), cũng như nghiên cứu tính chất của các đại phân tử trong dung dịch, xác định kích thước và trọng lượng phân tử của chúng

b Nguyên tắc:

Các phân tử chất tan trong pha động có thể thẩm thấu và được giữ lại trong khung gel một cách chọn lọc theo phân tử lượng của chúng và được phản hấp phụ theo trình tự ngược lại với quá trình thẩm thấu vào gel

Trong đó:

− Pha động là dung môi tự do

− Pha tĩnh là dung môi nằm trong các lổ, hốc hay trong lòng các hạt gel

Mức độ xâm nhập của chất tan phụ thuộc vào phân tử lượng, kích thước và cấu trúc của chúng

c Các chất mang trong phương pháp lọc gel:

− Sephadex là chất mang phổ biến nhất, dựa trên nền là dextran

− Sephacryl là chất mang dựa trên nền là dextran và được ghép nối bởi methylen bis-acrylamide

− Sepharose là chất mang dựa trên nền gel agarose

− Biogel P là chất mang dựa trên nền gel polyacrylamide

− Ultragel là chất mang siêu lọc loại A và AcA có nền là agarose hay acrylamide

d Bản chất của sự lọc gel:

Khi dung dịch đi qua cột có chứa các hạt gel sephadex, những phân tử chất hòa tan có kích thước lớn hơn mắc lưới của gel thì nó sẽ đi qua lớp sephadex trong pha lỏng một cách nhanh chóng, chúng không thể xâm nhập vào các lỗ gel, chúng chỉ có thể khuếch tán vào các kẽ hở giữa các hạt gel và

do đó bị rửa ra khỏi cột rất sớm Các thành phần có trọng lượng phân tử nhỏ hơn kích thước lỗ thì có thể xâm nhập vào các lổ, những phân tử càng nhỏ càng giữ lại nhiều hơn Vì vậy sự phản hấp phụ của các chất chứa trong lổ gel sephadex sẽ xảy ra theo cấp trọng lượng phân tử giảm dần: hợp chất có trọng lượng phân tử lớn đi ra trước, rồi đến hợp chất có trọng lượng phân tử nhỏ và cuối cùng là những muối khoáng và ion Do đó có thể ví việc tách các chất bằng phương pháp lọc gel sephadex như một quá trình sàng lọc phân tử

e Cấu trúc và tính chất hóa học của gel sephadex:

− Sephadex là một loại dextran đặc biệt có những liên kết ngang giữa các mạch polysaccarit với nhau tạo thành mạng lưới ba chiều

− Sephadex trung hòa điện tích nên không có tương tác tĩnh điện đối với anion và cation

− Sephadex là một loại bột khô, không tan trong nước nhưng khi cho vào nước sẽ ngậm nước trương ra và tạo thành gel Các gel sephadex chứa những mắc lưới (lỗ) to nhỏ tùy theo mức độ liên kết Nếu ít liên kết giữa các chuỗi polysaccarit, thì gel có mắc lưới lớn và ngậm nước nhiều Ngược lại nếu nhiều liên kết giữa các chuỗi polysaccarit, thì gel có mắc lưới nhỏ và ngậm nước ít

− Gel sephadex không tan trong dung dịch muối, bền trong môi trường kiềm và acid yếu, chỉ trương trong môi trường nước và các dung môi có cực khác (glycol, dimetyl sunfoxit…) Sephadex không trương trong acid acetic, metanol hoặc etanol

− Sephadex ở trạng thái ẩm có thể khử trùng bằng cách để nồi hấp (110oC trong 40 phút) Nếu để sephadex khô, nóng trên 120oC thì cấu trúc hạt gel bị hư hỏng

f Phân loại gel sephadex:

− Sephadex loại G có đặc điểm ưa nước và trương nở mạnh trong nước

− Sephadex loại LH là sản phẩm ankyl hóa và có đặc điểm ưa chất béo, trương được trong nhiều dung môi hữu cơ

− Số viết cùng ký hiệu chữ của sephadex tương ứng với kích thước lổ của lưới phân tử mà những phân tử đi qua (theo đơn vị 1000 dalton)

g.Ứng dụng của gel sephadex:

Gel sephadex có thể dùng trong các công việc sau:

− Loại muối

− Tách các chất có trọng lượng phân tử khác nhau

− Cô đặc: nhiều chất có trọng lượng phân tử cao có thể cô đặc bằng sephadex G–25 khô Phương pháp cô đặc này rất đơn giản, nhanh chóng, thường được dùng cho các dung dịch protein kém bền vững

− Điện di: sephadex có thể sử dụng làm giá cho điện di

− Sắc ký hấp phụ: đối với các chất có trọng lượng phân tử nhỏ (các chất thơm) có thể dùng gel sephadex để hấp phụ chúng

I.7.2.3.3 Sắc ký ái lực: [1], [22 ]

Phương pháp này dựa trên ái lực sinh học của phân tử protein đối với chất kết hợp đặc hiệu của nó

b Bản chất của quá trình sắc ký ái lực:

Khi hỗn hợp protein có chứa enzym cần phân lập được đặt lên một cột sắc ký ái lực thì phân tử enzym vốn có khả năng kết hợp đặc hiệu với coenzym của nó sẽ kết hợp với coenzym trong vật liệu nhồi cột (ví dụ như chất polysaccarit agarose) Coenzym ở đây đóng vai trò là chất kết hợp bất động, được gắn chặt trên các hạt agarose thông qua một tay nối Như vậy các phân tử enzym được giữ lại, còn các protein khác không có khả năng kết hợp đặc hiệu với các phân tử chất kết hợp đó sẽ thoát ra khỏi cột Sau đó các phân tử enzym mà đã được kết hợp đặc hiệu vào những hạt của chất liệu cột sẽ được đẩy ra bằng một dung dịch các phân tử chất kết hợp ở trạng thái tự do, cùng với việc tăng lực ion hay thay đổi pH Protein hay enzym được hấp phụ trên cơ sở tính đặc hiệu và ái lực cao đối với phân tử chất kết hợp

c Chất mang trong sắc ký ái lực:

− Các chất mang chủ yếu là:

+ Chất mang polysaccarit trên nền agarose, sephadex

+ Chất mang polyacrylamide

− Yêu cầu đối với chất mang:

+ Có tính háo nước nhưng không tan trong nước

+ Cứng ở dạng hạt và có kích thước thích hợp

+ Bền hóa học

+ Có độ xốp lớn

+ Không có tính hấp phụ đặc biệt

d Ứng dụng của sắc ký ái lực:

Š Tách protein, enzym từ một hỗn hợp phức tạp với độ tinh khiết cao

CHƯƠNG II:

NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

II.1 NGUYÊN LIỆU:

II.1.1 Nguồn nguyên liệu:

Thu nhận các mẫu máu từ những người tình nguyện hiến máu tại Bệnh Viện Nhân Dân Gia Định (độ tuổi từ 18 đến 60) Thể tích máu được lấy là 1mL chứa trong tube có chất kháng đông EDTA và lưu giữ ở nhiệt độ 4oC

Mẫu máu chọn lọc không được mang các bệnh truyền nhiễm như HIV, HBV, HCV, Giang mai , Sốt rét…

Ngoài ra chúng tôi còn thu nhận một số mẫu máu của những người đã có chẩn đoán xác định như : phụ nữ có thai, các loại bướu, ung thư, các bệnh về hệ thống tiêu hóa…

Mẫu máu thu nhận đồng thời các thông số như :

-Nhóm máu (theo hệ thống ABO)

-Thể tích hồng cầu (Hct)

Bảng 5 Thành phần và số lượng mẫu máu người bình thường

Thành phần mẫu theo chẩn đoán Chẩn đoán Số lượng

Phụ nữ có thai 60

II.1.2 Các chỉ số đối với nguyên liệu:[3],[5],[12],[20]

II.1.2.1 Số lượng hồng cầu:

Š Tính trung bình ở người bình thường, số lượng hồng cầu trong 1 lít máu là:

+Trẻ sơ sinh : (5,0 ÷ 7,0)∗1012

II.1.2.2 Thể tích khối hồng cầu (Hematocrit):

Š Thể tích khối hồng cầu là tỷ lệ phần trăm giữa khối hồng cầu và máu toàn phần

Š Theo phương pháp Wintrobe, thể tích khối hồng cầu bình thường như sau:

II.1.2.3 Huyết sắc tố:

Š Lượng huyết sắc tố biểu thị bằng số gam huyết sắc tố trong 100 ml máu Š Lượng huyết sắc tố bình thường ở người Việt Nam :

+ Trẻ sơ sinh : 11,3 ÷ 12,3 g/100 ml

+ Nam : 12,8 ÷ 16 g/100 ml

+ Nữ : 11 ÷ 14,2 g/100 ml

Š Lượng huyết sắc tố giảm là một tiêu chuẩn để đánh giá thiếu máu

II.1.2.4 Nồng độ huyết sắc tố trung bình của hồng cầu :

MCCH trung bình từ : 32 ÷ 35 g/100 ml

( g /100 ml ) MCCH = Huyết sắc tố Hematocrit