Thu nhận hydroxyapatite có kích thước nanometer từ xương cá rô phi (oreochromis niloticus) và thử nghiệm bổ sung vào kem đánh răng có thành phần tự nhiên

Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân xương đầu, xương mình và vây cá rô phi bằng enzyme Alcalase .... Phương pháp nghiên cứu - Sử dụng phương pháp Kjeldahl để xác định hàm lượn

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

––––––––

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

THU NHẬN HYDROXYAPATITE CÓ KÍCH THƯỚC

NANOMETER TỪ XƯƠNG CÁ RÔ PHI (Oreochromis niloticus)

VÀ THỬ NGHIỆM BỔ SUNG VÀO KEM ĐÁNH RĂNG CÓ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

––––––––



ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

THU NHẬN HYDROXYAPATITE CÓ KÍCH THƯỚC

NANOMETER TỪ XƯƠNG CÁ RÔ PHI (Oreochromis niloticus)

VÀ THỬ NGHIỆM BỔ SUNG VÀO KEM ĐÁNH RĂNG CÓ

Trường Đại học Nha Trang

Khoa Công nghệ Thực phẩm

Bộ môn Kỹ thuật Hóa học

Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

Cán bộ hướng dẫn: GV.TS Trần Thị Hoàng Quyên

Tên đề tài: “Thu nhận hydroxyapatite có kích thước nanometer từ xương cá rô

phi (Oreochromis niloticus) và thử nghiệm bổ sung vào kem đánh răng có

- Đồ án được trình bày đẹp và khoa học; văn phong sáng sủa, rõ ràng và súc tích Kết quả thực nghiệm đáng tin cậy Đây là một nghiên cứu có ý nghĩa khoa học

và ý nghĩa thực tiễn cao Đã tận dụng phế liệu thuỷ sản là xương cá rô phi tạo sản phẩm có giá trị gia tăng là nano-hydroxyapatite Có thể nhận thấy các sản phẩm cá

rô phi phi lê bắt đầu được bán ở các siêu thị lớn trong cả nước Nghiên cứu này có tính mới và có tính cấp thiết Chưa có nhiều nghiên cứu trên thế giới thu nhận hydroxyaptite từ xương cá rô phi, một số bài báo công bố là của tác giả Fara A.N.K.A và cộng sự

- Lưu Thị Bích Hân là cộng sự đóng góp phần lớn của bài báo đã được công

bố: Tran Thi Hoang Quyen, Luu Thi Bich Han, Hoang Ngoc Cuong, Ngo Cong

Tuan, Phan Van Vang (2018), Preparation of nano-sized hydroxyapatite from

enzyme-treated bones of tilapia (Oreochromis niloticus), Inter-Regional J of

Organization & Regulation of Physicologico-biochemical Processes, Voronezh

State University , Russia, V.20, 131-137

Nha Trang, ngày tháng năm

Cán bộ hướng dẫn

GV.TS Trần Thị Hoàng Quyên

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình thực hiện đề tài vì kinh nghiệm còn ít ỏi và kiến thức còn hạn chế nên em đã gặp rất nhiều khó khăn, nhưng bên cạnh những khó khăn gặp phải thì em cũng nhận được rất nhiều sự động viên, ủng hộ, giúp đỡ từ bạn bè, thầy cô Chính những tình cảm tốt đẹp ấy, đã giúp em hoàn thành đề tài nghiên cứu của mình và có được những kinh nghiệm, kiến thức mới hữu ích cho bản thân Nay

em xin gởi lời cảm ơn chân thành nhất tới:

Ban Giám Hiệu trường Đại học Nha Trang, Lãnh đạo Khoa Công nghệ Thực phẩm cùng tất cả Thầy Cô trong Bộ môn Kỹ thuật Hóa học đã tận tình truyền đạt cho em những kiến thức, kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình học tập và rèn luyện tại Trường

Em cảm ơn đến các Cán bộ quản lý các phòng thí nghiệm Hóa, phòng thí nghiệm khu Công Nghệ Cao, các Khoa, Phòng Ban chức năng đã giúp đỡ, tạo điều kiện trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu đề tài

Đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới GV TS Trần Thị Hoàng Quyên đã quan tâm giúp đỡ, tận tình hướng dẫn em hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp này trong thời gian qua

Xin cảm ơn các bạn lớp 56CNHH đã giúp đỡ, chia sẻ, đóng góp ý kiến Cảm

ơn gia đình đã luôn bên cạnh ủng hộ, quan tâm, giúp đỡ trong suốt thời gian làm

đề tài

Do điều kiện thời gian cũng như kinh nghiệm còn hạn chế nên không tránh khỏi thiếu sót, em rất mong nhận được sự góp ý từ Thầy Cô để đề tài của em được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Sinh viên

LƯU THỊ BÍCH HÂN

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC BẢNG viii

DANH MỤC HÌNH ẢNH ix

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 5

1.1 Tổng quan về hydroxyapatite 5

1.1.1 Tính chất vật lý 5

1.1.2 Tính chất hóa học 6

1.1.3 Tính chất sinh học 6

1.1.4 Các ứng dụng của vật liệu hydroxyapatite 7

1.1.4.1 Ứng dụng của hydroxyapatite ở dạng bột có kích thước nanometer 7

1.1.4.2 Ứng dụng của hydroxyapatite ở dạng màng 7

1.1.4.3 Ứng dụng của hydroxyapatite ở dạng khối xốp 8

1.1.4.4 Ứng dụng của hydroxyapatite ở dạng composite 8

1.1.5 Các phương pháp nghiên cứu tính chất của hydroxyapatite 8

1.1.5.1 Phương pháp hiển vi điện tử quét 9

1.1.5.2 Phương pháp hiển vi điện tử truyền qua 9

1.1.5.3 Phương pháp nhiễu xạ tia X 10

1.5.1.4 Phương pháp phổ hồng ngoại 11

1.1.6 Tình hình nghiên cứu hydroxyapatite trong và ngoài nước 12

1.1.6.1 Tình hình nghiên cứu hydroxyapatite ngoài nước 12

1.1.6.2 Tình hình nghiên cứu hydroxyapatite trong nước 14

1.2 Tổng quan về cá rô phi vằn 16

1.2.1 Cá rô phi vằn (Oreochromis niloticus) 16

1.2.1.1 Phân loại 16

1.2.1.2 Đặc điểm hình thái 16

1.2.1.3 Nguồn gốc và phân bố 17

1.2.1.4 Khả năng thích ứng với môi trường 17

1.2.1.5 Đặc điểm sinh dưỡng 17

1.2.1.6 Đăc điểm sinh trưởng 17

1.2.1.7 Đặc điểm sinh sản 18

1.2.1.8 Thành phần hóa học 19

1.2.2 Tình hình sử dụng cá rô phi vằn 19

1.2.2.1 Tình hình sản xuất cá rô phi vằn 19

1.2.2.2 Phế liệu cá rô phi 20

1.3 Tổng quan về enzyme protease và quá trình thủy phân protein từ cá rô phi

21

1.3.1 Enzyme protease và một số enzyme protease thương mại 21

1.3.3 Quá trình thủy phân protein 22

1.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân 22

1.3.5 Tình hình nghiên cứu sự thủy phân protein trên thế giới và trong nước

24

1.4 Tổng quan về kem đánh răng 27

1.4.1 Khái niệm về kem đánh răng 27

1.4.2 Các thành phần của kem đánh răng 27

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1 Đối tượng nghiên cứu 29

2.1.1 Phế liệu cá rô phi 29

2.1.2 Enzyme Alcalase 29

2.1.3 Các thành phần trong kem đánh răng tự nhiên 29

2.2 Dụng cụ - Thiết bị - Hóa chất 31

2.2.1 Dụng cụ 31

2.2.2 Thiết bị 32

2.2.3 Hóa chất 32

2.3 Phương pháp nghiên cứu 32

2.3.1 Xác định thành phần hóa học của xương đầu, xương mình và vây cá rô phi sau phi lê 33

2.3.1.1 Xác định hàm lượng protein thô bằng phương pháp Kjeldahl 33

2.3.1.2 Xác định hàm lượng lipid theo phương pháp Folch 35

2.3.1.3 Xác định hàm lượng khoáng bằng phương pháp nung 36

2.3.2 Quy trình đề xuất thu nhận hydroxyapatite từ xương cá rô phi 37

2.3.2.1 Bố trí thí nghiệm xác định nồng độ enzyme Alcalase thích hợp cho quá trình thủy phân xương đầu, xương mình và vây cá rô phi 41

2.3.2.2 Bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân xương đầu, xương mình và vây cá rô phi bằng enzyme Alcalase 43

2.3.2.3 Bố trí thí nghiệm xác định thời gian thích hợp cho quá trình thủy phân xương đầu, xương mình và vây cá rô phi bằng enzyme Alcalase 45

2.3.2.4 Bố trí thí nghiệm thu nhận hydroxyapatite từ xương cá rô phi bằng phương pháp nung 47

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 48

3.1 Thành phần hóa học của xương đầu, xương mình và vây cá rô phi sau phi lê 48

3.2 Kết quả xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân xương đầu, xương mình và vây của cá rô phi 48

3.2.1 Kết quả xác định nồng độ enzyme Alcalase thích hợp cho quá trình thủy phân xương đầu, xương mình và vây của cá rô phi 48

3.2.2 Kết quả xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân xương đầu, xương mình và vây của cá rô phi 49

3.2.3 Kết quả xác định thời gian thích hợp cho quá trình thủy phân xương đầu, xương mình và vây của cá rô phi 51

3.3 Kết quả thu nhận hydroxyapatite từ xương cá rô phi bằng phương pháp nung 51

3.3.1 Hiệu suất thu nhận hydroxyapatite qua các nhiệt độ khác nhau 52

3.3.2 Kết quả chụp hiển vi điện tử quét (SEM) ở các nhiệt độ khác nhau 54

3.3.4 Quy trình tối ưu thu nhận nano-hydroxyapatite từ xương cá rô phi sau phi lê

59

3.4 Kết quả thử nghiệm bổ sung nano-hydroxyapatite vào thành phần kem đánh răng tự nhiên 59

3.4.1 Kết quả khảo sát tỷ lệ xanthan gum ảnh hưởng đến kem đánh răng 59

3.4.2 Kết quả bổ sung nano-hydroxyapatite vào thành phần kem đánh răng

59

3.4.2.1 Ngoại quan 60

3.4.2.2 Độ pH của dung dịch 60

3.4.2.3 Chỉ tiêu vi sinh 60

CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO 64

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Nano-HA Nano-hydroxyapatite

DNFB Dinitrofluorobenzene

SEM Scanning Electron Microscope

TEM Transmission Electron Microscope

XRD X-Ray Diffraction

FT-IR Fourier Transformation Infrared Spectrophotometer

AU/g (Anson Unit)/g

Cfu/g (Colony forming unit)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Đặc điểm phân biệt giới tính của cá rô phi 18

Bảng 1.2 Thành phần hóa học của cá rô phi 19

Bảng 2.1 Thành phần kem đánh răng tự nhiên 40

Bảng 3.1 Thành phần hóa học của xương đầu, xương mình và vây cá rô phi 48

Bảng 3.1 Hiệu suất thu nhận HA ở các nhiệt độ khác nhau 54

Bảng 3.2 Khảo sát tỷ lệ xanthan gum 59

Bảng 3.3 Kết quả phân tích chỉ tiêu vi sinh 60

Bảng 3.3 Kiểm tra chất lượng sản phẩm của kem đánh răng Dạ Lan trà xanh 61

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Ảnh hiển vi điển tử quét của các tinh thể hydroxyapatite 5

Hình 1.2 Cấu trúc ô mạng cơ sở của tinh thể của hydroxyapatite 6

Hình 1.3 Công thức cấu tạo phân tử hydroxyapatite 6

Hình 1.4 Thuốc bổ sung calcium sử dụng nguyên liệu hydroxyapatie dạng vi tinh thể 7

Hình 1.5 Hydroxyapatite xốp tổng hợp từ san hô được sử dụng làm mắt giả 8

Hình 1.6 Sơ đồ nguyên lý hoạt động của phương pháp hiển vi điện tử quét (SEM)

9

Hình 1.7 Sơ đồ nguyên lý hoạt động của phương pháp hiển vi điện tử truyền qua (TEM) 10

Hình 1.8 Sơ đồ nguyên lý hoạt động của phương pháp nhiễu xạ tia X 11

Hình 1.9 Sơ đồ nguyên lý hoạt động của máy quang phổ hồng ngoại 12

Hình 1.10 Cá rô phi vằn (Oreochromis niloticus) 16

Hình 1.11 Sản lượng xuất khẩu cá rô phi của Việt Nam 20

Hình 2.1 Sơ đồ xác định thành phần hóa học của xương đầu, xương mình và vây cá rô phi 33

Hình 2.2 Quy trình đề xuất thu nhận hydroxyapatite từ xương cá rô phi 37

Hình 2.3 Sơ đồ xác định nồng độ enzyme Alcalase thích hợp cho quá trình thủy phân xương đầu, xương mình và vây cá rô phi 42

Hình 2.4 Sơ đồ xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân xương đầu, xương mình và vây cá rô phi bằng enzyme Alcalase 44

Hình 2.5 Sơ đồ xác định thời gian thích hợp cho quá trình thủy phân xương đầu, xương mình và vây cá rô phi bằng enzyme Alcalase 46

Hình 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme Alcalase đến quá trình thủy phân xương đầu, xương mình và vây cá rô phi 49

Hình 3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân xương đầu, xương mình và vây cá rô phi bằng enzyme Alcalase 50 Hình 3.3 Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thủy phân xương đầu, xương mình

và vây cá rô phi bằng enzyme Alcalase 51

Hình 3.4 Xương cá sau khi nung ở các nhiệt độ khác nhau với tốc độ gia nhiệt 5oC/phút trong 2 giờ 53

Hình 3.5 Ảnh chụp SEM của HA thu nhận bằng phương pháp nung ở các nhiệt độ khác nhau 55

Hình 3.6 Ảnh SEM của cá ngừ 56

Hình 3.7 Ảnh SEM từ xương và vảy của cá rô phi 57

Hình 3.8 Ảnh chụp SEM của xương cá rô phi đen 57

Hình 3.9 Quy trình tối ưu thu nhận nano-hydroxyapatite từ xương cá rô phi 58

Hình 3.10 Kem đánh răng ở các tỉ lệ xanhthan gum khác nhau 59

Hình 3.11 pH của mẫu kem đánh răng 60

Hình 3.12 Ảnh kiểm tra vi sinh vật trong kem đánh răng 62

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Ngày nay, bên cạnh việc khai thác đánh bắt, nuôi trồng thủy sản cũng ngày càng gia tăng và chiếm tỷ trọng càng lớn trong tổng sản lượng sản xuất thủy sản Sản lượng khai thác thủy sản trên thế giới ngày càng tăng nhưng chỉ khoảng 30% sản lượng này thật sự được con người tiêu thụ, phần còn lại là phế liệu.Vì vậy, việc tận dụng các phế liệu thủy sản để sản xuất các sản phẩm có giá trị gia tăng là vấn đề cấp thiết hiện nay

Ở Việt Nam, những năm gần đây, diện tích và sản lượng nuôi trồng thủy sản (như cá rô phi, cá tra và cá basa,…) tăng cao và đạt doanh thu đáng kể, đem lại nhiều lợi nhuận Trong năm 2016, cá rô phi xuất khẩu với giá trung bình khoảng

2900 USD/tấn, tăng 300 USD/tấn so với năm 2015 và tăng hơn 1000 USD/tấn so với năm 2014 Theo thống kê mỗi ngày các nhà máy chế biến tung ra thị trường hơn

2000 tấn phế phụ phẩm gồm xương, đầu, da cá, vây, vảy…, mà đây là những bộ phận chứa protein, acid béo omega–3, vi chất dinh dưỡng như: vitamin A, D và khoáng chất như: sắt, kẽm, Đồng thời từ xương cá có thể thu được hydroxyapatite, chất này có hoạt tính sinh học cao có thể bổ sung vào một số thực phẩm chức năng cho con người, làm răng giả, xương giả,…

Cụ thể hơn, hydroxyapatite (Ca10(PO4)6(OH)2) vốn là thành phần chính trong xương và răng (chiếm 50-70%) Tỷ lệ mol Ca/P bằng 1,67 trong phân tử HA đúng như tỷ lệ mol Ca và P trong xương (1,71) và răng người (1,63) Nên đây là hợp chất

có cấu trúc tinh thể tương tự men răng tự nhiên nên có thể giúp tái cấu trúc men răng mất khoáng giúp khắc phục triệt để và ngăn ngừa tình trạng ê buốt răng Khi hydroxyapatite tiếp xúc với bề mặt răng thì các tinh thể sẽ giúp bịt các ống ngà, giúp ngăn không cho các chất kích thích như cồn, thức ăn chua, cay, nóng, lạnh xâm nhập qua dây thần kinh từ đó giảm cảm giác ê buốt khó chịu Ngoài ra hydroxyapatite còn có tác dụng giúp tái tạo lại khoáng cho các vết sâu răng ở giai đoạn đầu, đồng thời giúp phần nào tẩy trắng răng

Trong xã hội hiện đại ngày nay, đối với mỗi gia đình, kem đánh răng là một

trong những sản phẩm tiêu dùng thiết yếu Nhưng làm sao để lựa chọn kem đánh răng an toàn là một vấn đề đáng quan trọng Với xu thế lợi nhuận là trên hết nên một số nhà sản xuất chỉ quan tâm đến số lượng mà quên hẳn đi chất lượng của sản phẩm, có những sản phẩm kem đánh răng kém chất lượng, chứa những hóa chất độc hại ra đời, mà chính người tiêu dùng là nạn nhân Để đáp ứng nhu cầu về sức khỏe của con người nên việc sản xuất những sản phẩm kem đánh răng có chứa những thành phần tự nhiên và có bổ sung những thành phần giúp làm giảm quá trình khử khoáng răng như hydroxyapatite là một việc làm có ý nghĩa

Từ những vấn đề trên nên tôi chọn đề tài: “Thu nhận hydroxyapatite có

kích thước nanometer từ xương cá rô phi (Oreochromis niloticus) và thử

nghiệm bổ sung vào kem đánh răng có thành phần tự nhiên”

2 Mục tiêu đề tài

- Xác định được điều kiện tối ưu để thu nhận hydroxyapatite có kích thước

nanometer từ xương cá rô phi (Oreochromis niloticus) đã qua xử lý enzyme

Alcalase

- Nghiên cứu phối trộn ra một công thức kem đánh răng gồm các thành phần

tự nhiên và thử nghiệm bổ sung nano-hydroxyapatite vào kem đánh răng

3 Nội dung nghiên cứu

- Xác định thành phần hóa học của xương đầu, xương mình và vây cá rô phi

sau khi phi lê

- Xác định điều kiện xử lý xương đầu, xương mình và vây cá rô phi bằng

enzyme Alcalase để thu được nguyên liệu cho quá trình thu nhận hydroxyapatite

- Xác định điều kiện thu nhận hydroxyapatite từ xương cá rô phi đã qua xử lý

enzyme Alcalase

- Xác định đặc tính của hydroxyapatite (hình dạng, kích thước,…)

- Xác định điều kiện tối ưu để thu nhận hydroxyapatite có kích thước

nanometer

- Nghiên cứu đưa ra một công thức kem đánh răng gồm các thành phần tự

nhiên và thử nghiệm bổ sung nano-hydroxyapatite vào kem đánh răng

4 Phương pháp nghiên cứu

- Sử dụng phương pháp Kjeldahl để xác định hàm lượng protein; phương pháp

Folch để xác định hàm lượng lipid; phương pháp nung để xác định thành phần

khoáng của xương đầu, xương mình và vây cá rô phi (Oreochromis niloticus)

- Sử dụng phương pháp quang phổ UV-Vis tạo chất màu với

1-fluoro-2,4-dinitrobenzene để xác định độ thủy phân nhằm đưa ra điều kiện tối ưu xử lý xương

đầu, xương mình và vây cá rô phi bằng enzyme Alcalase

- Sử dụng phương pháp nung để thu nhận hydroxyapatite từ xương cá rô phi

đã qua xử lý enzyme Alcalase

- Dùng phương pháp hiển vi điện tử quét (SEM), hiển vi điện tử truyền qua (TEM) để xác định kích thước, hình dạng của hydroxyapatite vừa thu được

- Sử dụng phương pháp đồng hóa để thử nghiệm bổ sung nano-hydroxyapatite

có kích thước nanometer vào kem đánh răng có các thành phần tự nhiên

5 Đối tượng nghiên cứu

Cá rô phi (Oreochromis niloticus) được mua từ chợ Vĩnh Hải, thành phố Nha

Trang Lựa chọn những con cá tươi, có kích thước đồng đều, sau đó lọc thu lấy

xương Xương sau khi được loại bỏ tối đa phần thịt được bảo quản đông –20oC để

sử dụng cho các lần thí nghiệm Trước khi tiến hành thí nghiệm thì rã đông xương

6 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn

6.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu này cung cấp thêm thông tin khoa học về điều kiện tối

ưu để xử lý xương đầu, xương mình và vây cá rô phi (Oreochromis niloticus) bằng

enzyme Alcalase để thu nguyên liệu cho quá trình thu nhận hydroxyapatite

Kết quả nghiên cứu cung cấp thông tin về điều kiện tối ưu để thu nhận hydroxyapatite có kích thước nanometer từ xương cá rô phi

6.2 Ý nghĩa thực tiễn

- Đề tài này góp phần hạn chế ô nhiễm môi trường do phụ phẩm cá rô phi gây

ra, mở ra một hướng mới cho nhà máy chế biến thủy sản về việc tận dụng phế liệu

xương cá và mang lại lợi ích thiết thực về kinh tế

- Góp phần nâng cao hiệu quả sử dụng phế liệu cá rô phi để tạo ra sản phẩm có

giá trị gia tăng là nano-hydroxyapatite

- Tạo ra sản phẩm kem đánh răng thiên nhiên an toàn cho sức khỏe con người, ngoài ra còn có bổ sung nano-hydroxyapatite giúp làm tăng quá trình khử khoáng

răng

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về hydroxyapatite

Tùy theo phương pháp tổng hợp khác nhau như phương pháp kết tủa, phương pháp sol–gel, phương pháp điện hóa,… cũng như các điều kiện tổng hợp khác nhau như nhiệt độ phản ứng, nồng độ, thời gian mà các tinh thể có hình dạng khác nhau

Các tinh thể HA thường tồn tại ở hình dạng que, hình kim, hình vảy, hình cầu,… (Hình 1.1), và có thể nhận biết các dạng tồn tại của tinh thể HA nhờ sử dụng phương pháp hiển vi điện tử quét (SEM) hoặc hiển vi điện tử truyền qua (TEM) [32]

Hình 1.1 Ảnh hiển vi điển tử quét của các tinh thể hydroxyapatite [32]

Cấu trúc ô mạng cơ sở của tinh thể HA gồm các ion Ca2+, PO43- và OHđược sắp xếp theo dạng lục phương là dạng cấu trúc thường gặp của HA tổng hợp trong thành phần của xương và ngà răng Còn dạng đơn tà là dạng cấu trúc thường

-a) HA dạng hình que,

b) HA dạng hình trụ,

c) HA dạng hình cầu, d) HA dạng hình sợi,

e) HA dạng hình vảy, f) HA dạng hình kim

được tìm thấy trong men răng (Hình 1.2)

Hình 1.2 Cấu trúc ô mạng cơ sở của tinh thể của hydroxyaptite: a) dạng lục

phương, b) dạng đơn tà [5]

1.1.2 Tính chất hóa học

Phân tử HA có công thức cấu tạo thể hiện ở (Hình 1.3) Phân tử HA có cấu trúc mạch thẳng, các liên kết Ca–O là liên kết cộng hóa trị Hai nhóm OH được gắn với nguyên tử P ở hai đầu mạch [23]

Hình 1.3 Công thức cấu tạo phân tử hydroxyapatite [24]

 HA không phản ứng với kiềm nhưng phản ứng với các acid tạo thành các muối calcium và nước:

Ca10(PO4)6(OH)2 + 2HCl 3Ca3(PO4)2 + CaCl2 + 2H2O

 HA tương đối bền nhiệt, bị phân hủy chậm trong khoảng nhiệt độ từ 800–

1200oC tạo thành oxy–hydroxyapatite theo phản ứng:

Ca10(PO4)6(OH)2 Ca10(PO4)6(OH)2–2xOx + xH2O (0 ≤ x ≤ 1)

 Nhiệt độ lớn hơn 1200o

C, HA bị phân hủy thành β–Ca3(PO4)2 (β–TCP) và

Ca4P2O9 hoặc CaO:

Ca10(PO4)6(OH)2 2β–Ca3(PO4)2 + Ca4P2O9 + 2H2O

Ca10(PO4)6(OH)2 3β–Ca3(PO4)2 + CaO + 2H2O

1.1.3 Tính chất sinh học

Do có cùng bản chất và thành phần hóa học, HA tự nhiên và nhân tạo đều là những vật liệu có tính tương thích sinh học cao Ở dạng bột mịn kích thước nanometer, HA là dạng calcium phosphate dễ được cơ thể hấp thụ nhất với tỷ lệ mol Ca/P trong phân tử đúng như tỷ lệ trong xương (1,71) và răng người (1,63) [12,19] Ở dạng màng và dạng xốp, HA có thành phần hóa học và đặc tính giống xương tự nhiên, các lỗ xốp liên thông với nhau làm cho các mô sợi, mạch máu dễ dàng xâm nhập Chính vì vậy mà vật liệu này có tính tương thích cao với tế bào mô,

có tính dẫn xương tốt, tạo liên kết trực tiếp với xương non dẫn tới sự tái tạo xương nhanh mà không bị cơ thể đào thải [14]

1.1.4 Các ứng dụng của vật liệu hydroxyapatite

1.1.4.1 Ứng dụng của hydroxyapatite ở dạng bột có kích thước nanometer

Do lượng calcium hấp thụ thực tế từ thức ăn mỗi ngày tương đối thấp nên rất cần bổ sung calcium cho cơ thể, đặc biệt là trẻ em và người cao tuổi Calcium có trong thức ăn hoặc thuốc thường nằm ở dạng hòa tan nên khả năng hấp thụ của cơ thể không cao và thường phải kết hợp với vitamin D nhằm tăng cường việc hấp thụ

và chuyển hóa thành HA HA ở dạng bột mịn, kích thước nanometer được cơ thể hấp thu nhanh qua niêm mạc lưỡi và thực quản, do vậy nó ít chịu ảnh hưởng của dung dịch acid có trong dạ dày Vì những đặc tính này, HA có kích thước nanometer được dùng làm thuốc bổ sung calcium với hiệu quả cao [34]

cường khả năng liên kết giữa các xương nhân tạo với mô và xương tự nhiên Bằng những tiến bộ trong viêc tạo màng nano-HA không chỉ làm tăng tuổi thọ các chi tiết ghép mà còn mở rộng phạm vi ứng dụng của màng nano-HA từ chỗ chỉ áp dụng cho xương hông tiến đến có thể sử dụng ghép xương đùi, xương khớp gối và các vị trí

khác nhau [29]

1.1.4.3 Ứng dụng của hydroxyapatite ở dạng khối xốp

Ứng dụng trong việc chế tạo răng giả và sữa chữa khuyết tật của răng Các nhà khoa học Nhật Bản đã thành công trong việc tạo ra một hỗn hợp gồm HA tinh thể có kích thước nanometer và polymer sinh học có khả năng phủ và bám dính trên răng theo cơ chế epitaxy, nghĩa là tinh thể HA mới tạo thành lớp men răng cứng chắc, “ bắt chước” theo đúng tinh thể HA của lớp men răng tự nhiên [24]

Trong chế tạo mắt giả, HA tổng hợp từ san hô có cấu trúc bền vững, nhẹ và đặc biệt có khả năng cao với cơ thể [37]

Hình 1.5 Hydroxyapatite xốp tổng hợp từ san hô được sử dụng làm mắt giả [37]

1.1.4.4 Ứng dụng của hydroxyapatite ở dạng composite

Vật liệu ở dạng này được sử dụng làm các chi tiết cấy ghép xương chất lượng cao, làm kẹp nối xương hoặc có thể làm chất truyền thuốc Việc sử dụng các polymer sinh học làm chất nền tạo điều kiện cho việc gia công, chế tạo các chi tiết

dễ dàng Mặt khác, các polymer này còn có năng liên kết với các tế bào sinh học thông qua các nhóm chức –OH, –NH2, CH3COOH, Đây cũng là ưu điểm vượt trội của vật liệu composite chứa HA [44]

1.1.5 Các phương pháp nghiên cứu tính chất của hydroxyapatite

1.1.5.1 Phương pháp hiển vi điện tử quét

Thiết bị hiển vi điện tử quét (SEM) là thiết bị phóng đại đặc biệt giúp quan sát trực tiếp bề mặt của các đối tượng cần nghiên cứu Sự phóng đại được thực hiện không phải bằng hệ thống thấu kính quang học mà sử dụng va chạm của các hạt electron cường độ cao với mẫu đã được xử lý rồi nhập tín hiệu để thu hình ảnh của

bề mặt vật Độ phóng đại của nó rất lớn (cỡ vào khoảng vài ngàn đến vài chục ngàn lần) kích thước quan sát có thể đến nanometer [6]

Nguyên tắc hoạt động chùm điện tử được tạo ra từ cathod qua hai tụ quang sẽ được hội tụ lên mẫu nghiên cứu Chùm điện tử đập vào mẫu phát ra các điện tử phản xạ thứ cấp Mỗi điện từ phát xạ này qua điện thế gia tốc vào phần thu và biến đổi thành tín hiệu sáng, chúng được khuếch đại đưa vào mạng lưới điều khiển tạo

độ sáng trên màn hình Mỗi điểm trên mẫu nghiên cứu cho một điểm trên màn hình

Độ sáng tối trên màn hình phụ thuộc lượng điện tử thứ cấp phát với bộ thu, đồng thời còn phụ thuộc bề mặt của mẫu nghiên cứu

Hình 1.6 Sơ đồ nguyên lý hoạt động của phương pháp hiển vi điện tử

quét (SEM) [6]

Ưu điểm của phương pháp SEM là có thể thu được những bức ảnh ba chiều

rõ nét và không đòi hỏi khâu chuẩn bị mẫu quá phức tạp

1.1.5.2 Phương pháp hiển vi điện tử truyền qua

Kính hiển vi điển tử truyền qua (TEM) là một thiết bị nghiên cứu vi cấu trúc vật rắn, sử dụng chùm điện tử có năng lượng cao chiếu xuyên qua mẫu vật rắn

mỏng và sử dụng các thấu kính từ để tạo ảnh với độ phóng đại lớn (có thể tới hàng triệu lần), ảnh có thể tạo ra trên màn huỳnh quang, hay trên film quang học, hay ghi nhận bằng các máy chụp kỹ thuật số [3]

Cơ chế phóng đại của TEM là nhờ thấu kính điện tử đặt bên trong hệ đo Thấu kính này có khả năng thay đổi tiêu cự Khi tia điện tử có bước sóng cỡ 0,4 nm chiếu lên mẫu ở hiệu điện thế khoảng 100 kV, ảnh thu được cho biết chi tiết hình thái học của mẫu theo độ tương phản tán xạ và tương phản nhiễu xạ, qua đó có thể xác định được kích thước hạt một cách khá chính xác

Sử dụng chùm tia điện tử để tạo ảnh mẫu nghiên cứu, ảnh đó khi đến màn hình huỳnh quang có thể đạt độ phóng đại theo yêu cầu Chùm tia điện tử được tạo

ra từ cathod qua hai “tụ quang” điện tử sẽ được hội tụ lên mẫu nghiên cứu Khi chùm tia điện tử đập vào mẫu sẽ phát ra các chùm tia điện tử phản xạ và điện tử truyền qua Các điện tử phản xạ và điện tử truyền qua này được đi qua điện thế gia tốc vào phần thu và biến đổi thành một tín hiệu ánh sáng, tín hiệu này được khuếch đại, đưa vào mạng lưới điều khiển để tạo ra độ sáng trên màn Độ sáng tối trên màn ảnh phụ thuộc vào lượng điện tử phát ra tới bộ thu và phụ thuộc hình dạng bề mặt mẫu nghiên cứu (Hình 1.7)

Ưu điểm của TEM là cho phép ghi ảnh với độ phân giải cao và có độ nhạy cao với sự thay đổi cấu trúc nên các chế độ ghi ảnh từ tính cũng là các công cụ mạnh trong các nghiên cứu về vi từ

Hình 1.7 Sơ đồ nguyên lý hoạt động của phương pháp hiển vi điện tử truyền

qua (TEM) [3, 6]

1.1.5.3 Phương pháp nhiễu xạ tia X

Phương pháp nhiễu xạ tia X (XRD) được dùng để nghiên cứu cấu trúc tinh

thể của vật liệu, có thể xác định nhanh, chính xác các pha tinh thể, định lượng pha tinh thể và kích thước hạt với độ tin cậy cao

Khi một chùm tia X có bước sóng  và cường độ I đi qua vật liệu, nếu tia tới thay đổi phương truyền và thay đổi năng lượng gọi là tán xạ không đàn hồi Khi tia tới thay đổi phương truyền nhưng không thay đổi năng lượng gọi là tán xạ đàn hồi Trường hợp vật liệu đang nghiên cứu có cấu trúc tinh thể thì hiện tượng tán xạ đàn hồi của tia X sẽ đưa đến hiện tượng nhiễu xạ tia X (Hình 1.8) Hiện tượng này chỉ xảy ra với ba điều kiện: vật liệu có cấu trúc tinh thể, có tán xạ đàn hồi, bước sóng của tia X (tia tới) có giá trị cùng bậc với khoảng cách giữa các nguyên tử trong mạng tinh thể [3]

Hình 1.8 Sơ đồ nguyên lý hoạt động của phương pháp nhiễu xạ tia X [3] 1.5.1.4 Phương pháp phổ hồng ngoại

Phổ hồng ngoại (FT-IR) dùng để xác định cấu trúc phân tử của chất cần nghiên cứu, dựa vào các tần số đặc trưng trên phổ của các nhóm chức trong phân tử

Nguồn bức xạ (1) phát ra một chùm tia hồng ngoại với một tần số trong vùng cần đo Chùm tia này đi qua bộ giao thoa kế (gồm gương cố định, gương di động và

bộ phận phân chia chùm sáng) Bức xạ hồng ngoại sau khi đi ra khỏi giao thoa kế sẽ

đi qua mẫu rồi đến detector Detector ghi nhận sự biến đổi của cường độ của bức xạ theo quãng đường d mà gương di động thực hiện được rồi chuyển thành tín hiệu điện

Khi đó, thu được tín hiệu dưới dạng hàm của điện thế V theo quãng đường:

V = f(d)

Hình 1.9 Sơ đồ nguyên lý hoạt động của máy quang phổ hồng ngoại [3]

2) Gương cố định 6) Detecto

4) Bộ phân chia chùm sáng 8) Bút tự ghi

Máy tính sẽ thực hiện phép biến đổi Fourie để chuyển hàm V = f(d) thành hàm của cường độ bức xạ I theo nghịch đảo của quãng đường d (d–1)

1.1.6 Tình hình nghiên cứu hydroxyapatite trong và ngoài nước

1.1.6.1 Tình hình nghiên cứu hydroxyapatite ngoài nước

Hiện nay, trên thế giới đã sản xuất được nhiều chế phẩm từ nguyên liệu HA Klein A và các cộng sự (1983) lần đầu tiên tạo ra chi tiết ghép xương bằng gốm chứa 100% HA Sự phát triển của xương trong miếng ghép này có tốc độ phát triển chậm Điều này tạo cho chất lượng của xương ở nơi cấy ghép rất tốt, nhưng thời gian điều trị kéo dài [45]

Để điều trị bệnh loãng xương, Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ (FDA) đã cho phép sử dụng HA trong sản xuất thuốc và thực phẩm chức năng [19]

biến đổi Fourie

Nhiều loại thuốc và thực phẩm bổ sung calcium có sử dụng HA đã lưu hành trên thị trường Trong số đó có thể kể đến Ossopan của Pháp, Bone Booster Complex, Bone

Dense Calcium của Mỹ,…

HA dạng màng đã được các nhà khoa học Nhật Bản chế tạo thành vật liệu chế tạo răng giả và sửa chữa những khuyết tật của răng

Trên đà phát triển đó nhiều nhà khoa học hay các nhóm khoa học không ngừng nghĩ để nghiên cứu điều chế HA từ các nguồn phế phẩm khác nhau như xương bò hay xương cá và vảy cá, vỏ cua, ghẹ,…

Manalu L.J và cộng sự (2015) cũng sử dụng phương pháp nung xương bò ở các nhiệt độ và thời gian khác nhau như 200–1000oC trong 5 giờ với tốc độ gia nhiệt 10oC/phút thu được HA có kích thước 0,4 m ở 700oC, phân tích độ tinh khiết bằng phương pháp XRD, FT-IR và xác định được lượng calcium và phosphate chiếm lần lượt là 20% và 11,4% [39]

Raya I và cộng sự (2015) sử dụng vỏ cua (Portunus pelagicus ) làm nguyên liệu để tổng hợp HA để bảo vệ chống lại khử khoáng răng Vỏ cua được nung ở

1000oC trong 5 giờ, sau đó phản ứng với (NH4)2HPO4 sấy khô ở 110°C trong 5 giờ Kết quả cho thấy nhiệt độ tối ưu để thu HA là 800oC và tỷ lệ khử khoáng răng tốt khi bổ sung HA vào [46]

Tác giả Mustafa N và cộng sự (2014) đã nghiên cứu tổng hợp HA từ xương

cá rô phi bằng phương pháp nung với các nhiệt độ khác nhau như 800–1000oC trong 5 giờ với tốc độ gia nhiệt là 5oC/phút, thu được HA ở dạng bột [42]

Fara A.N.K.A, Abdullah H.Z., và cộng sự (2015) đã nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nung đến tích chất của HA thu nhận từ xương cá rô phi Cụ thể ông và cộng sự đã khảo sát các nhiệt độ 600oC, 800oC, 1000oC và 1200oC Các mẫu được đem đi phân tích bằng các phương pháp như: SEM, XRD, FT-IR để xác định hình dạng, tính chất cũng như độ tinh khiết của HA Qua phân tích SEM thì kích thước hạt lần lượt ở các nhiệt độ 800oC, 1000oC và 1200oC là 88 nm, 126 nm và 147 nm, kết quả XRD cho thấy tính chất hóa học và cấu trúc qua các mẫu HA tương tự nhau Tạp chất hữu cơ và nước được loại bỏ hoàn toàn ở 600oC khi phân tích bằng quang

phổ hồng ngoại FT-IR

Rất ít nghiên cứu sử dụng xương cá rô phi làm nguyên liệu thu nhận HA vì

cá rô phi được nuôi trồng và cung cấp cho các cơ sở chế biến thủy sản trong những năm gần đây và việc tạo các sản phẩm có giá trị gia tăng từ phế liệu cá rô phi mới được chú ý, quan tâm Các nghiên cứu thu nhận HA sử dụng chủ yếu xương từ các loại cá khác nhau để làm nguyên liệu

Boutinguiza M và cộng sự năm (2011) đã nghiên cứu thu nhận HA từ xương

cá ngừ và cá kiếm ở nhiệt độ 600oC và 950oC Kết quả thu được ở 600oC cá ngừ có kích thước 54±10 nm, cá kiếm là 47±10 nm Còn ở 950oC cá ngừ có kích thước khoảng 67±16 nm và cá kiếm là 66±16 nm [26]

Hầu hết các nghiên cứu thu nhận HA từ các loại cá khác như Venkatesan J

và cộng sự (2015) thu nano-HA từ xương cá hồi [51] Sukaimi J và cộng sự thu HA

từ vảy cá thải ra ở các chợ cá bằng phương pháp nhiệt kiềm (NaOH ở 100oC) [50]

Modal S và cộng sự (2012) thu HA từ vảy cá (Labeo rohita) bằng phương pháp nung [40] Prabakaran K và Rajeswari S thu nhận HA từ xương cá (Thynnus

thynnus) Xương được luộc trong 1 giờ sau đó rửa sạch thu xương Xương được

đem đi sấy ở 100o

C trong 3 giờ, rồi đem nung ở 400, 700, 900, 1200oC trong 2 giờ Đặc tính của HA được xác định bởi XRD, FT-IR Kết quả của cả XRD và FT-IR đều cho thấy mẫu xương cá nung ở 900oC cho HA có độ tinh khiết cao [53]

Đặc biệt, Amaechi, B.T và cộng sự (2015) đã thử nghiệm bổ sung nano-HA vào trong thành phần kem đánh răng vời tỷ lệ là 10% và 15% Kết quả được phân tích bằng cách chụp SEM và mẫu thử được khảo sát trong 7 ngày Kết quả cho thấy quá trình khử khoáng răng ở 15% cao hơn 10% [23]

1.1.6.2 Tình hình nghiên cứu hydroxyapatite trong nước

Trong nước, các nghiên cứu về các hợp chất vô cơ có khả năng ứng dụng làm vật liệu sinh học nói chung và HA nói riêng còn nhiều hạn chế

Năm 2005, lần đầu tiên Viện Công nghệ Xạ hiếm đã triển khai đề tài chế thử gốm HA theo công nghệ của Italia và đã bước đầu thử nghiệm thành công trên động vật [4, 17] Công nghệ này dựa trên phương pháp nhúng tẩm khung xốp hữu cơ

cellulose vào dung dịch huyền phù HA, sau đó nung thiêu kết ở nhiệt độ cao Khoa

Hoá học, Đại học Bách khoa Hà Nội đã nghiên cứu và công bố kết quả sơ bộ về

phương pháp tổng hợp bột và màng gốm HA [11]

Từ năm 2005 đến nay, Viện Hoá học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt

Nam đã công bố một số kết quả nghiên cứu chế tạo HA bột [8] và HA xốp [7]

Trong đó HA xốp được chế tạo bằng phương pháp nén-ép-thiêu kết HA bột với các

chất tạo xốp chitosan, cellulose, đường saccarose và phương pháp phản ứng pha rắn

giữa Ca(OH)2 và Ca3(PO4)2 Việc chế tạo gốm HA từ khung xốp tự nhiên của san

hô, mai mực, vỏ sò,… bằng phản ứng thuỷ nhiệt ở áp suất cao cũng đã được thực

hiện

Năm 2008, Trung tâm Phát triển Khoa học và Công nghệ Trẻ đã nghiên cứu

đề tài “nghiên cứu chế tạo gốm sinh học calcium phosphate (HA và tricalcium

phosphate)” Trong nghiên cứu này còn ứng dụng HA và tricalcium photphate thay

thế một số bộ phận xương, khớp trong cơ thể con người

Trên đà phát triển đó thì ở Việt Nam các nhà khoa học cũng hăng say tìm tòi

nghiên cứu điều chế HA từ các nguồn phế phẩm khác nhau và đặc biệt là điều chế

HA bằng các phương pháp khác nhau

Đỗ Ngọc Liên (2005) sử dụng phương pháp nhúng tẩm khung xốp hữu cơ

cellulose vào dung dịch huyền phù với đối tượng là xương bò thu được HA ở dạng

bột và gốm xốp HA [11]

Năm 2011, PGS.TS Đào Quốc Hương, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên,

Khoa Hóa học đã khảo sát quá trình tách HA từ xương bò theo các phương pháp

nhiệt Sản phẩm HA thu được có kích thước hạt trung bình dưới 500 nm, giản đồ

XRD cho thấy sản phẩm là đơn pha HA với độ tinh thể 97,4% Tuy nhiên, bên cạnh

sản phẩm HA còn lẫn một số ít tạp chất khác như CaCO3 [8]

Đào Quốc Hương và Phạm Thị Sao (2007) đã sử dụng đối tượng nghiên cứu

điều chế HA ở đây là vỏ trứng bằng phương pháp phản ứng thuỷ nhiệt, các tinh thể

HA tạo thành ở dạng hạt, kích thước không đồng đều và nằm trong khoảng 50−100 nm Các hạt không liên kết với nhau, giữa chúng tồn tại các biên hạt rõ rệt,

chứng tỏ mẫu nhận được chỉ ở dạng khối xốp, chưa tạo thành gốm HA [7]

Tác giả Nguyễn Văn Hòa, Trần Thị Hoàng Quyên, Trần Quang Ngọc (Bộ môn Kỹ thuật Hóa học, Đại học Nha Trang) (2014) chỉ ra khả năng sử dụng xương

cá và vảy cá để thu vật liệu HA bằng các cách xử lí khác nhau [45]

1.2 Tổng quan về cá rô phi vằn (Oreochromis niloticus)

1.2.1 Cá rô phi vằn (Oreochromis niloticus)

Loài : Oreochromis niloticus

Hình 1.10 Cá rô phi vằn (Oreochromis niloticus)

1.2.1.2 Đặc điểm hình thái

Thân cao, hình hơi bầu dục, dẹp bên, đầu ngắn, miệng rộng hướng ngang, hai hàm dài bằng nhau, môi trên dầy Lỗ mũi gần mắt hơn mõm Khoảng cách hai mắt rộng, gáy lõm ở ngang lỗ mũi Vây ngực nhọn, dài, mềm Vây bụng to cứng, chưa tới lỗ hậu môn

Toàn thân nhiều vẩy, ở phần lưng có màu sáng vàng nhạt hoặc xám nhạt, phần bụng có màu trắng ngà hoặc màu xanh nhạt Trên thân có 9–12 vạch sắc tố

chạy từ lưng xuống bụng Các vạch sắc tố ở các vây đuôi, vây lưng rõ [32]

1.2.1.3 Nguồn gốc và phân bố

Cá rô phi có nguồn gốc từ châu Phi, cho đến năm 1964, hiện nay trên thế giới con số đó khoảng 100 loài, trong đó có 10 loài có giá trị kinh tế cao [29]

1.2.1.4 Khả năng thích ứng với môi trường

Nhiệt độ: nhiệt độ cần thiết cho sự phát triển của cá rô phi từ 20–35oC thích hợp nhất là 28–30oC [21] Khả năng chịu đựng và biến đổi nhiệt độ cũng rất cao từ 8–42oC, cá chết rét ở 7oC và bắt đầu chết nóng ở 42oC Nhiệt độ xuống thấp thì cá sinh trưởng phát triển chậm

Độ mặn: cá rô phi là loài rộng muối, có khả năng sống được trong môi

trường nước sông, suối, ao hồ nước ngọt, nước lợ và nước mặn Tuy nhiên, tốc độ tăng trưởng của chúng bị giảm khi nồng độ muối trên 36% [21] Trong môi trường nước lợ (độ mặn 10–25%) cá tăng trưởng nhanh, thịt thơm ngon

pH: môi trường có độ pH từ 6,5–8,5 thích hợp cho cá rô phi, nhưng có thể

chịu đựng trong môi trường nước có pH = 4 [27]

Oxy hòa tan: cá rô phi có thể sống trong ao, đầm có màu nước đậm, mật độ

tảo dày, có hàm lượng chất hữu cơ cao, thiếu oxy Yêu cầu hàm lượng oxy hòa tan trong nước của cá rô phi ở nước 0,1 mg O2/lít [25]

1.2.1.6 Đăc điểm sinh trưởng

Cá lớn nhanh, tuy nhiên tốc độ lớn phụ thuộc vào nhiệt độ, thức ăn, mật độ nuôi và loài cá Cá sau 1 tháng tuổi đạt 2–3 g/con Sau 2 tháng tuổi đạt 15–20 g/con Nuôi thương phẩm sau 4–5 tháng nuôi đủ thức ăn có thể đạt 0,4–0,6 kg/con

Cá rô phi vằn lớn nhanh vòa tháng 5–6, cá nuôi tốt 1 năm đạt 1kg/con, cá lớn nhất là

3 kg [22]

1.2.1.7 Đặc điểm sinh sản

a) Tuổi và kích thước thành thục

Trong điều kiện ao nuôi cá rô phi thành thục sinh dục vào tháng thứ 3, 4 khi

cá có trọng lượng là 100–150 g/con Tuy vậy kích thước thành thục sinh dục phụ

thuộc vào điều kiện chăm sóc, nhiệt độ và độ tuổi Cá nuôi trong mô hình thâm canh

năng suất cao cá tham gia sinh sản lần đầu khi trọng lượng đạt trên 200 g trong khi

đó ở điều kiện nuôi kém, cá cái bắt đầu đẻ khi trọng lượng cơ thể mới 100 g [13]

b) Giới tính

Bảng 1.1 Đặc điểm phân biệt giới tính của cá rô phi

Hầu hết các loài cá rô phi đều tham gia sinh sản nhiều trong năm Cá rô phi

sống trong điều kiện nước ấm, nhiệt độ thích hợp thì sinh sản quanh năm Ở miền

Nam nước ta thì cá có thể đẻ 10–12 lần/năm, ở miền Bắc chỉ đẻ 5–7 lần/năm Chu

kì sinh sản của cá rô phi kéo dài từ 3–4 tuần

1.2.1.8 Thành phần hóa học

Thành phần dinh dưỡng có trong 100 g cá rô phi được thể hiện ở Bảng 1.2

Bảng 1.2 Thành phần hóa học của cá rô phi

1.2.2 Tình hình sử dụng cá rô phi vằn (Oreochromis niloticus )

1.2.2.1 Tình hình sản xuất cá rô phi vằn

Cá rô phi đang đứng thứ 4 trong tốp 10 loại thủy sản được ưa chuộng tại Mỹ Riêng ở Colombia, Việt Nam là nguồn cung số 1 về cá rô phi ở thị trường này, chiếm 53–63% thị phần, với thế mạnh là cá rô phi nguyên con đông lạnh

Chỉ tính riêng 6 tháng đầu năm 2016, giá trị xuất khẩu cá rô phi của Việt Nam sang các thị trường đã tăng gấp 8 lần so với cùng kỳ, với kim ngạch xuất khẩu đạt gần 14 triệu USD Các dự báo khác cũng cho thấy, tiêu thụ cá rô phi đang tăng trưởng không chỉ ở Mỹ mà trên toàn thế giới [54]

Việt Nam xuất khẩu chủ yếu sản phẩm cá rô phi đông lạnh Năm 2014 tổng kim ngạch xuất khẩu cá rô phi của Việt Nam đạt hơn 32 triệu USD Giá xuất khẩu bình quân cá rô phi nguyên con đông lạnh là 2,5 USD/kg và cá rô phi phi lê đông lạnh là 4,5 USD/kg

Cụ thể, tăng từ 1,9 triệu USD năm 2004 lên đến 35,7 triệu USD năm 2014, tăng 265%

Năm 2014, xuất khẩu sang thị trường Mỹ đạt 8,9 triệu USD; chiếm 25%; Tây Ban Nha đạt 4,4 triệu USD chiếm 12,4%; Colombia đạt 3,7 triệu USD chiếm 10,4%; Hà Lan đạt 2,9 triệu USD chiếm 8,3%; Bỉ đạt 1,7 triệu USD chiếm 4,8%; Đức đạt 1,6 triệu USD chiếm 4,5% [57]

Cá rô phi Việt Nam đang có cơ hội tại thị trường Mỹ vì lượng nhập khẩu từ Trung Quốc và Đài Loan vào thị trường này đang co lại Tại Mỹ, cá rô phi Việt Nam có giá trung bình đạt 2,7 USD/kg; cao hơn Trung Quốc (2,3 USD) và Đài Loan (2,5 USD)

Theo đó, kế hoạch sản xuất đến năm 2020, đạt chỉ tiêu nuôi thâm canh 20.000 ha, năng suất 20–25 tấn/ha, sản lượng 400.000–500.000 tấn, nuôi bán thâm canh 10.000 ha, năng suất 10–15 tấn, sản lượng khoảng 100.000–150.000 tấn Đặc biệt, giá trị xuất khẩu cá rô phi ước đạt 150 triệu USD, tạo việc làm cho 2 vạn lao động trên cả nước

Hình 1.11 Sản lượng xuất khẩu cá rô phi của Việt Nam

Ở Nha Trang trong các siêu thị Vinmart, những năm gần đây xuất hiện sản phẩm cá rô phi phi lê bảo quản đông lạnh cho thấy người tiêu dùng khắp cả nước đã quan tâm đến các sản phẩm chế biến từ cá rô phi

1.2.2.2 Phế liệu cá rô phi

Cùng với sự phát triển của thị trường xuất khẩu cá phi lê thì phần lớn phế liệu đang trong tình trạng báo động gây ô nhiễm môi trường mà phần lớn phế liệu là đầu, xương, vây, vẩy, da, Gần như toàn bộ những gì được gọi là phần bỏ đi vẫn còn chứa nhiều protein và acid béo không sản sinh cholesterol, cộng với khoáng chất và các nguyên tố vi lượng Đó là những chất có nhu cầu lớn trong nhiều ngành công nghiệp hiện nay

1.3 Tổng quan về enzyme protease và quá trình thủy phân protein từ cá rô phi 1.3.1 Enzyme protease và một số enzyme protease thương mại

Enzyme là những protein có khả năng xúc tác đặc hiệu cho các phản ứng hóa học Chúng không những có khả năng cho các phản ứng xảy ra trong tế bào sống

mà khi tách khỏi tế bào chúng vẫn có thể xúc tác cho các phản ứng hóa học

Protease là enzyme thủy phân liên kết peptide của phân tử protein Enzyme protease được phân thành hai dạng endoprotease và exoprotease Các endoprotease như trypsin, chymotrypsin, chymosin thủy phân các liên kết peptide ở bên trong polypeptide, các exoprotease cắt các liên kết ở hai đầu tận cùng được gọi là carboxylpeptidase còn những enzyme tác dụng vào đầu có nhóm amino tận cùng gọi là aminopeptidases

Hiện nay trên thị trường có nhiều loại protease, một số loại protease được sử

dụng phổ biến hiện nay là: Flavourzyme, Alcalase, Neutrase, Protamex,…

Alcalase 2,4 L (Novo Nordisk, Bagsvaerd, Denmark) là protease của

Bacillus licheniformis với hoạt tính endopeptidase Alcalase là enzyme thương mại

thuộc nhóm serine protease subtilisin A Hoạt tính của Alcalase 2,4 AU/g, pH = 6,5–8,5; nhiệt độ 45–65oC [38] Alcalase đã được chứng minh là một trong những enzyme tốt nhất được các nhà nghiên cứu dùng để chế biến thủy phân protein cá

Enzyme này cũng dựa trên đặc trưng của nó cho khả năng không hút nước của các amino acid vào giai đoạn cuối, dẫn đến sản phẩm thủy phân không có mùi

vị, đắng đồng thời sản phẩm có sự cân bằng về các amino acid thiết yếu

Alcalase còn được ưa chuộng nhất và được sử dụng rộng rãi Các enzyme có nguồn gốc từ vi khuẩn phù hợp hơn vì chúng có nhiều hoạt động xúc tác có sẵn

cũng như ổn định về pH và nhiệt độ Các nghiên cứu trước đây cho thấy Alcalase là enzyme hiệu quả nhất trong số các enzyme proteolytic nghiên cứu protein thủy phân

và có khả năng thủy phân cao nhất Sự phục hồi protein cao và hàm lượng lipid thấp nhất đã được báo cáo trong quá trình thủy phân với Alcalase so với Papain và Neutrase

Flavourzyme là peptidase mang cả hai loại hoạt tính endoprotease và

exoprotease, được sản xuất từ quá trình lên men chìm loài Aspergillus Enzyme này

hoạt động thủy phân protein trong điều kiện trung tính hoặc acid yếu Điều kiện hoạt động tối ưu là pH = 5–7; nhiệt độ khoảng 50oC Flavourzyme có thể bị ức chế

ở 90oC trong 10 phút hoặc 120oC trong 5 giây [35]

Neutrase là endoprotease được chiết từ vi khuẩn được sử dụng để thủy phân

protein Enzyme này chỉ cắt protein ở mức độ vừa phải hoặc tạo thành các đoạn peptide Điều kiện hoạt động tốt của nó là pH = 5,5–7,5; ở nhiệt độ 45−55oC, bị ức chế khi pH < 4 [36]

Protamex là protease của Bacillus (Bagsvaerd, Denmark) Enzyme này có

họat tính endoprotease Điều kiện hoạt động tối ưu trong khoảng pH = 5,5−7,5 ở nhiệt độ 35−60oC Protamex có hoạt tính 1,5 AU/g Enzyme này cũng bị bất hoạt ở

85oC trong 10 phút và ở pH thấp [35]

1.3.3 Quá trình thủy phân protein

Thực chất quá trình thủy phân thịt cá là quá trình biến đổi protein để tạo ra các aminno acid dưới tác dụng của hệ enzyme protease nội tại và enzyme bổ sung bên ngoài [35]

Tùy mức độ thủy phân, thời gian thủy phân mà ta thu được peptide hay amino acid

Enzyme là chất xúc tác sinh học có tính đặc hiệu cao do vậy nó chỉ có tác dụng đối với một vài loại liên kết nào đó và kiểu liên kết nhất định

1.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân

 Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân

Nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn hoạt tính enzyme Bản chất enzyme là một protein nên khi tăng hay giảm nhiệt độ làm ảnh hưởng đến hoạt động của chúng Khi nhiệt độ cao thì làm biến tính không thuận nghịch, enzyme có nguồn gốc từ động vật thì khoảng nhiệt độ thích hợp từ 40−50oC, enzyme có nguồn gốc từ thực vật khoảng nhiệt độ khoảng 50−60oC Enzyme có nguồn gốc từ vi sinh vật từ 30−40oC Trong khoảng nhiệt độ thích hợp cho hoạt độ của enzyme thì nếu nhiệt độ tăng 10 lần thì tốc độ phản ứng tăng 1,5−2 lần Tốc độ phản ứng của enzyme không phải lúc nào cũng tỷ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng, tốc độ phản ứng chỉ tăng đến một giới hạn nhiệt độ nhất định Vượt qua nhiệt độ đó, tốc độ phản ứng của enzyme

sẽ giảm và dẫn đến mức triệt tiêu Nhiệt độ tương ứng với tốc độ phản ứng cao nhất được gọi là nhiệt độ tối ưu Nhiệt độ thích hợp với một enzyme có sự thay đổi khi

có sự thay đổi về pH, nồng độ cơ chất [2]

 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân

Trong quá trình thủy phân, thời gian tác dụng của enzyme lên cơ chất dài hay ngắn phụ thuộc vào nhiều yếu tố: độ mịn của nguyên liệu, pH, nhiệt độ, Thời gian thủy phân còn đủ để enzyme phân cắt các liên kết trong cơ chất tạo thành các sản phẩm cần thủy phân đã bị phân hủy hết, quá trình thủy phân kết thúc Thời gian thủy phân phải thích hợp để đảm bảo hiệu suất cao đồng thời đảm bảo chất lượng sản phẩm tốt Nhưng nếu kéo dài thời gian phân hủy quá mức sẽ tạo điều kiện cho các vi sinh vật hoạt động làm sản sinh ra các sản phẩm cấp thấp như NH2, H2S và việc kéo dài thời gian thủy phân sẽ làm giảm hiệu quả kinh tế Ngược lại, nếu thời gian thủy phân quá ngắn thì quá trình thủy phân chưa triệt để các amino acid tạo thành còn ít trong các peptide còn tồn tại nhiều sản phẩm như vậy sẽ lãng phí nguyên liệu và khó khăn cho quá trình lọc để thu dịch thủy phân protein [2]

 Ảnh hưởng của pH

pH có ảnh hưởng mạnh mẽ đến hoạt tính enzyme vì pH ảnh hưởng đến mức

độ ion hóa cơ chất, ion hóa enzyme và đến độ bền của protein enzyme Đa số enzyme có khoảng pH thích hợp từ 5−9 Với protease pH sẽ thích hợp ở vùng trung tính nhưng cũng có một số protease có pH trong vùng acid (pepsin, protease acid

của vi sinh vật) hoặc nằm trong vùng kiềm (tripsin) với từng enzyme, giá trị pH thích hợp có thể thay đổi theo nhiệt độ, loại cơ chất thay đổi Mỗi enzyme chỉ hoạt động ở một pH nhất định gọi là pH tối ưu của đa số enzyme nằm trong vùng trung tính, acid yếu, bazơ yếu, chỉ có rất ít enzyme nằm trong vùng hoạt động của acid hoặc kiềm [2]

 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất

Khi nồng độ cơ chất thấp, tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ

cơ chất Khi tăng nồng độ cơ chất, cơ hội cơ chất gặp được enzyme nhiều thì tốc độ phản ứng tăng theo Tuy nhiên, sự liên hệ này chỉ giới hạn đến mức nào đó, nếu tiếp tục tăng tốc độ cơ chất thì thì tốc độ phản ứng cũng không tăng hoặc ức chế ngược lại hoạt động xúc tác của enzyme Trong các phản ứng do enzyme xúc tác trước hết tạo phức trung gian giữa enzyme và cơ chất Sau đó phức này chuyển hóa tiếp tục tạo thành sản phẩm cuối cùng và enzyme tự do, enzyme lại tiếp tục kết hợp với các phân tử cơ chất khác Quá trình này cứ tiếp tục diễn ra đến khi hết cơ chất nếu nồng

độ cơ chất thích hợp với lượng enzyme thì phản ứng diễn ra đều đặn và nhanh chóng [2]

 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme

Trong điều kiện thừa cơ chất nếu càng tăng nồng độ enzyme thì quá trình xảy

ra mãnh liệt Khi nồng độ enzyme bão hòa với nồng độ cơ chất dù tăng nồng độ enzyme bao nhiêu đi nữa thì vận tốc của quá trình thủy phân ít thay đổi Sự tăng tốc

độ phản ứng trong tế bào sinh vật lại phụ thuộc vào khả năng điều hòa của gen Nhìn chung tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính với lượng enzyme Nhưng nếu tăng nồng độ enzyme quá lớn vận tốc phản ứng chậm lại [2]

1.3.5 Tình hình nghiên cứu sự thủy phân protein trên thế giới và trong nước a) Tình hình nghiên cứu thế giới

Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về một số đặc tính chức

năng của sản phẩm thủy phân

Elavarasan K và cộng sự (2012) đã nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa và

đặc tính chức năng của sản phẩm thủy phân protein từ cá chép nước ngọt Tác giả

tiến hành thủy phân bằng enzyme: Alcalase, Bromelain, Flavorzyme và Protamex Kết quả cho thấy khả năng khử gốc tự do DPPH (1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) của sản phẩm thủy phân từ enzyme Bromelain cao hơn khi thủy phân bằng các enzyme còn lại Ổn định nhũ tương và chỉ số tạo bọt của sản phẩm thủy phân bằng enzyme Bromelain cũng cao hơn Khả năng tạo bọt cho sản phẩm thủy phân bằng enzyme Flavorzyme là tốt nhất [30]

Sousissi N và cộng sự (2006) đã nghiên cứu về thuộc tính sinh hóa và chức

năng của sản phẩm thủy phân từ đầu và nội tạng cá trích Tiến hành thủy phân bằng enzyme Alcalase, dịch thủy phân đem đi sấy phun rồi xác định hàm lượng protein thô Hàm lượng protein đạt từ 73% đến 75% Hàm lượng chất béo thấp Khi tăng độ thủy phân, khả năng hòa tan tăng trong khi khả năng tạo nhũ và khả năng tạo bọt lại giảm [43]

Shamloo M và cộng sự (2012) đã nghiên cứu về thành phần amino acid và khả năng khử gốc tự do DPPH của sản phẩm thủy protein từ cá rô phi đỏ Sản phẩm thủy phân protein từ cá rô phi đỏ được sản xuất bằng các enzyme Alaclase, Flavourzyme, Protamex Kết quả nghiên cứu cho thấy sau quá trình thủy phân tỷ lệ amino acid thiết yếu tăng lên trong tất cả cá mẫu, khả năng khử gốc tự do DPPH mẫu thủy phân bằng enzyme Alcalase cao hơn hai mẫu enzyme còn lại, không có sự khác biệt đáng kể trong việc khử gốc tự do DPPH khi thủy phân bằng enzyme Flavorzyme và Protamex Mức độ thủy phân của enzyme Flavourzyme thấp hơn hai enzyme Alcalase và Protamex [49]

Herpandi H.N và cộng sự (2012) đã nghiên cứu độ thủy phân và lượng amino acid trytophan tự do của sản phẩm thủy phân cá ngừ bằng các loại enzyme protease khác nhau Sản phẩm thủy phân protein thịt cá ngừ vằn được sản xuất bằng các protease (Alcalase, Protamex, Neutrase và Flavourzyme) trong thời gian 60,

120, 180, và 240 phút với tỷ lệ enzyme protease là 0,5; 1; 1,5; và 2% so với khối lượng của nguyên liệu Kết quả cho thấy thời gian dài với tỷ lệ enzyme cao đã làm tăng độ thủy phân Alcalase cho độ thủy phân cao nhất trong số tất cả các protease

tiếp theo là Protamex, Flavourzyme và Neutrase [33]

b) Tình hình nghiên cứu trong nước

Tại Việt Nam, những năm gần đây, việc nghiên cứu quá trình thủy phân cũng

đã được quan tâm rất nhiều và đạt được những kết quả nhất định Tuy nhiên, việc nghiên cứu về độ thủy phân, thành phần hóa, độ hòa tan và khả năng chống oxy hóa của sản phẩm thủy phân protein từ cá vẫn còn rất ít Một số công trình nghiên cứu

về quá trình thủy phân

Vũ Ngọc Bội (Khoa Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nha Trang)

(2004) đã nghiên cứu quá trình thủy phân cá bằng enzyme protaese từ B.subtilis S5

Chế phẩm protease kỹ thuật này có thể sử dụng tốt nhất ở nhiệt độ là 55oC, pH thích hợp là 6,0 để thủy phân cơ thịt cá tạp để sản xuất bột đạm thủy phân và thủy phân

cá cơm trong sản xuất nước mắm ngắn ngày [1]

Nguyễn Thị Mỹ Hương (Khoa Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nha Trang) (2011) đã nghiên cứu sản xuất sản phẩm thủy phân protein từ đầu cá ngừ vây vàng và sử dụng sản phẩm thủy phân này trong thức ăn cho tôm Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng việc bổ sung bột protein thủy phân từ đầu cá ngừ vào trong thức ăn cho tôm đã cải thiện được sự tăng khối lượng của tôm, hệ số chuyển hóa thức ăn và hiệu quả sử dụng protein [9]

Phạm Thị Đan Phượng (Khoa Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nha Trang) (2012) với nghiên cứu thu nhận bột đạm giàu carotene từ đầu thẻ chân trắng bằng phương pháp xử lý kết hợp hai enzyme protease Kết quả nghiên cứu cho thấy

độ thủy phân sử dụng kết hợp hai loại enzyme protease thích hợp như sau :

- Giai đoạn đầu xử lý bằng Alcalase ở nhiệt độ 55oC, pH tự nhiên, tỷ lệ nguyên liệu là 0,2% trong 2 giờ

- Sau đó tiếp tục xử lý bằng Flavourzyme tỷ lệ là 0,1% trong 1 giờ Chế phẩm protein giàu carotene thu được với các thành phần gia vị khác gồm: bột carotene sấy khô 41g, muối ăn: 41g, đường 9 g, mì chính 9 g [16]

Trần thị Xô và Đặng Thị Mộng Quyên (2007) đã thực hiện đề tài nghiên cứu tận dụng phế liệu để sản xuất sản phẩm dẫn mùi giàu đạm dùng trong thức ăn nuôi tôm, cá Với công nghệ sản xuất đơn giản sử dụng chất xúc tác enzyme của vi

khuẩn đã phân lập được bổ sung vào phế liệu thủy sản, chúng sẽ tự tách phần thịt ra khỏi xương Với phần thịt được cô đặc giàu chất đạm trộn với thức ăn cho tôm, phần xương được làm sạch và sấy khô, nghiền thành bột khoáng dùng cho chăn

nuôi gia súc [17]

1.4 Tổng quan về kem đánh răng

1.4.1 Khái niệm về kem đánh răng

Là một chất tẩy sạch răng dạng hỗn hợp nhão hay gel được sử dụng với bàn chải đánh răng như một phụ kiện để tẩy sạch, duy trì thẩm mỹ và sức khoẻ cho răng Kem đánh răng dùng để thúc đẩy vệ sinh răng miệng, được dùng làm chất mài mòn

để loại bỏ mảng bám răng và thức ăn ra khỏi răng, giúp ngăn ngừa chứng hôi miệng

và cung cấp thành phần hoạt động (thường là florua) giúp ngăn ngừa sâu răng và viêm nướu [49]

1.4.2 Các thành phần của kem đánh răng

– Nước hòa tan và phân tán các tác nhân trị liệu, tẩy rửa, làm sạch và làm dịu

– Các tác nhân làm ướt chúng giúp làm giảm khối lượng nước trong công thức

và làm bóng bề mặt kem đánh răng Một số chất làm ướt như:

 Sorbitol (HOCH2[CH(OH)]3CH2OH) là chất chống khô, đóng rắn có vai trò lớn trong kem đánh răng góp phần làm bóng răng và làm dịu kem

 Glycerin (HOCH2CH(OH)CH2OH) làm dịu, tạo nhũ cho sản phẩm

– Các chất tẩy rửa, giúp tẩy trắng răng, tạo bọt theo yêu cầu người tiêu dùng, hòa tan và phân tán các mùi hương không tan trong nước (tạo các mixel trong các dầu thơm hòa tan) như:

 Laureth sulfate sodium: CH3–(CH2)11 –SO4 –Na+

 Alkylbenzene sulfonate sodium: CH3–(CH2)11–CH6H4SO3–Na

– Các chất mài mòn, làm sạch răng:

 Calcium carbonate:CaCO3

 Aluminium hydroxide: Al(OH)3

 Dicalcium phosphate: CaHPO4.2H2O

– Các chất làm sệt, làm tăng độ nhớt cho sản phẩm như: