Nghiên cứu sự phát triển và sinh tổng hợp carotenoid của rhodotorula sp trên môi trường chất mang cùi bắp

Đối với động vật và con người, nhiều hợp chất carotenoid có hoạt tính sinh học giúp ngăn cản quá trình oxi hóa trong cơ thể do các gốc tự do gây nên, điển hình như lycopene, β-carotene,

LÝ THỊ MINH HIỀN

NGHIÊN CỨU SỰ PHÁT TRIỂN VÀ SINH

TỔNG HỢP CAROTENOID CỦA

RHODOTORULA SP TRÊN MÔI

TRƯỜNG CHẤT MANG CÙI BẮP

Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm và đồ uống

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 6 năm 2009

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS Đống Thị Anh Đào

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ và tên học viên: Lý Thị Minh Hiền Phái: Nữ

Ngày, tháng, năm sinh: 21/08/1983 Nơi sinh: TP Hồ Chí Minh

Chuyên ngành: Công Nghệ Thực Phẩm và Đồ Uống

MSHV: 01107430

1- TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu sự phát triển và sinh tổng hợp carotenoid của Rhodotorula sp

trên môi trường chất mang cùi bắp

2- NHIỆM VỤ LUẬN VĂN:

Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển và sinh tổng hợp carotenoid của nấm men

Rhodotorula sp như: nguồn thức ăn, nguồn khoáng, điều kiện môi trường (ẩm độ, ánh

sáng), tỷ lệ giống cấy, khảo sát sự sinh trưởng và sinh tổng hợp carotenoid theo thời gian

3- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 02/02/2009

4- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ : 03/07/2009

5- HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS.TS Đống Thị Anh Đào

Nội dung và đề cương Luận văn thạc sĩ đã được Hội Đồng Chuyên Ngành thông qua

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN KHOA QL CHUYÊN NGÀNH

(Họ tên và chữ ký) QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH (Họ tên và chữ ký)

(Họ tên và chữ ký)

Để được kết quả như ngày hôm nay, với lòng biết ơn sâu sắc tôi xin chân thành gởi đến:

 Giáo viên hướng dẫn: PGS.TS Đống Thị Anh Đào đã tận tình hướng dẫn,

truyền đạt kiến thức và những kinh nghiệm sống quý báu cho em trong suốt thời gian học, cũng như trong quá trình thực hiện luận văn

 Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Minh Nguyệt đã quan tâm, hỗ trợ và giúp đỡ tôi

rất nhiều để có thể hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp này

 Ban giam hiệu trường Đại Học Bách Khoa TP HCM, quý Thầy Cô bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm: đã giảng dạy, hướng dẫn để tôi có được nền kiến thức như ngày hôm nay

 Quý Thầy Cô phụ trách phòng thí nghiệm bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn tại phòng thí nghiệm

 Các anh chị, các bạn học viên cao học niên khóa 2007 chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm và Đồ Uống, bạn Tạ Đăng Khoa đã giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện luận văn

Xin chân thành cảm ơn !

TP HCM, tháng 07 năm 2009

LÝ THỊ MINH HIỀN

Carotenoid là một nhóm hợp chất thiên nhiên có đặc tính chống oxy hóa rất tốt đồng thời rất nhiều loại carotenoid còn là tiền vitamin A, một trong những loại vitamin không thể thiếu trong cơ thể người Trước đây, carotenoid chủ yếu được ly trích từ thực vật Hiện nay có rất nhiều các nghiên cứu giúp thu nhận các hợp chất

này từ vi sinh vật Trong đó nấm men Rhodotorula là loại nấm men đỏ được nghiên

cứu nhiều nhất trong việc thu nhận carotenoid và β-carotene

Mục tiêu nghiên cứu của chúng tôi là khảo sát sự sinh trưởng và sinh tổng hợp

carotenoid của Rhodotorula sp trên môi trường bán rắn với chất mang mới là cùi

bắp Từ mục tiêu đó trước tiên chúng tôi khảo sát một số phương pháp phá vỡ màng

tế bào nấm men Rhodotorula để thu nhận carotenoid, sau đó khảo sát các yếu tố ảnh

hưởng đến sự phát triển và tạo thành carotenoid của loại nấm men này Sau cùng là

khảo sát sự phát triển của Rhodotorula theo thời gian trên môi trường có các thông

số tối ưu tìm được

Chúng tôi tiến hành các thí nghiệm và thu được các kết quả sau:

 Chế phẩm enzyme Trichoderma có thể dùng để phá màng tế bào nấm men

hỗ trợ cho quá trình ly trích thu carotenoid Phương pháp này ứng dụng phá vỡ màng tế bào tốt hơn một số phương pháp vật lý mà chúng tôi đã khảo sát

 Hàm lượng khoáng phù hợp cho sự phát triển và sinh tổng hợp carotenoid của nấm men như sau: hàm lượng N: 100.000µg/100g chất mang, hàm lượng C: 20.000µg/100g chất mang, hàm lượng P: 500µg/100g chất mang, hàm lượng S: 400µg/100g chất mang

 Điều kiện ẩm độ phù hợp cho sự phát triển và sinh tổng hợp carotenoid của

tổng hợp carotenoid

 Thời điểm sinh khối phát triển nhất về số lượng là từ 5 – 8 ngày sau nuôi cấy, thời điểm này đồng thời ứng thời điểm hàm lượng carotenoid thu được là cao nhất

Carotenoids is a group of color compounds functioning as an anti-oxidation Most of them are provitamin A, which is known as a very important compound for our health, such as: α-carotene, β-carotene,… In nature, the traditional resources of carotenoids are plants, especially some kinds of orange or red fruits and dark green leaves and vegetables, such as: carrot, tomato, green broccoli, tagete, yellow maize,… Another resource of carotenoids can be released from microorganisms

One of these is red yeast Rhodotorula which attracts more and more attention of

researchers

Our research is about how to develop Rhodotorula on solid state matrix and extract carotenoid from this process Using Trichoderma enzymes is a good way to break the yeast’s membrane for extracting carotenoid from Rhodotorula

For nutritious environment, Rhodotorula can use NaNO3 as nitrogen resource, and saccharose as carbon resource for growing Suitable concentrations of N, C, S,

P resources in growing environment for the yeast are:

Like other solid state fermentations, moisture is an important factor for

growing and producing carotenoid of Rhodotorula And by experiments, moisture at 80% is the most appropriated for the Rhodotorula

Besides, the effect of the light on the carotenoid production is not important

So the simplest way is using the nature light for the yeast development

fermentation

Trang

MỞ ĐẦU - 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU - 3

1.1 Carotenoid - 3

1.1.1 Giới thiệu về carotenoid - 3

1.1.2 Tính chất hóa lý của carotenoid - 6

1.1.3 Chức năng của carotenoid - 8

1.1.4 Sự sinh tổng hợp carotenoid trong tự nhiên - 9

1.2 Nấm men - 13

1.2.1 Sơ lược về nấm men - 13

1.2.1.1 Hình thái và cấu trúc của tế bào nấm men - 13

1.2.1.2 Hình thức sinh sản của nấm men - 14

1.2.1.3 Dinh dưỡng của nấm men - 15

1.2.2 Đặc điểm của nấm men Rhodotorula - 17

1.3 Lên men bán rắn - 21

1.3.1 Giới thiệu - 21

1.3.2 Đặc điểm của quá trình lên men bán rắn - 22

1.3.3 So sánh lên men bán rắn và lên men trong môi trường lỏng - 23

1.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men bán rắn - 24

1.3.5 Các yếu tố sinh hóa ảnh hưởng đến quá trình lên men bán rắn - 25

1.3.6 Mô hình lên men bán rắn - 26

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP - 27

2.1 Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm - 27

2.2 Nguyên vật liệu – hóa chất – thiết bị - 27

2.2.1 Nguyên vật liệu - 27

2.2.2 Giống vi sinh vật và môi trường - 27

2.2.3 Hóa chất – Dụng cụ – Thiết bị - 29

2.2.3.1 Các hóa chất cung cấp dinh dưỡng cho nấm men - 29

2.2.3.2 Các hóa chất dùng trích ly carotenoid - 30

2.2.3.3 Dụng cụ và thiết bị - 30

2.2.4 Quy trình nuôi cấy và trích carotenoid - 30

2.2.4.1.Sơ đồ quy trình - 30

2.2.4.2 Thuyết minh quy trình - 32

2.3 Các thí nghiệm - 33

2.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát một số phương pháp phá vỡ màng tế bào nấm men - 33

2.3.1.1 Mục đích - 33

2.3.1.2 Các nghiệm thức thí nghiệm - 34

2.3.1.3 Thành phần môi trường nuôi cấy - 34

2.3.1.4 Cách tiến hành - 34

2.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát sự ảnh hưởng của các yếu tố khoáng đến sự phát triển và sinh tổng hợp carotenoid - 36

2.3.2.1 Mục đích - 36

2.3.2.2 Các thí nghiệm khảo sát sơ bộ - 36

2.3.2.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của các yếu tố khoáng đến sự phát triển và sinh tổng hợp carotenoid của Rhodotorula - 40

2.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng ánh sáng, ẩm độ đến sự phát triển và sinh tổng hợp carotenoid của Rhodotorula - 41

2.3.3.1 Mục đích - 41

2.3.3.2 Bố trí thí nghiệm - 42

2.3.3.3 Thành phần môi trường nuôi cấy - 42

2.3.3.4 Cách tiến hành - 42

2.3.4.2 Bố trí thí nghiệm - 43

2.3.4.3 Thành phần môi trường nuôi cấy - 43

2.3.4.4 Cách tiến hành - 44

2.3.5 Khảo sát số lượng tế bào và hàm lượng carotenoid theo thời gian nuôi cấy - 44

2.4 Các phương pháp thí nghiệm sử dụng trong đề tài - 45

2.4.1 Phương pháp đo mật độ sinh khối - 45

2.4.2 Phương pháp xác định hàm lượng carotenoid - 48

2.4.2.1 Đường chuẩn carotenoid - 49

2.4.2.2 Cách xác định nồng độ carotenoid - 50

2.4.3 Phương pháp định lượng vi sinh vật bằng cách đếm khuẩn lạc - 50

2.4.3.1 Chuẩn bị mẫu và môi trường thạch malt - 50

2.4.3.2 Cấy gạt - 51

2.4.3.3 Tính kết quả - 51

2.4.4 Phương pháp xác định ẩm độ theo TCVN 4326:1986 - 51

2.4.5 Phương pháp xử lý số liệu - 52

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát một số phương pháp phá vỡ màng tế bào - 53

3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát sự ảnh hưởng của các yếu tố khoáng đến sự phát triển và sinh tổng hợp carotenoid - 55

3.2.1 Các thí nghiệm khảo sát sơ bộ - 55

3.2.1.1 Khảo sát ảnh hưởng hàm lượng N đến sự tạo thành carotenoid - 55

3.2.1.2 Khảo sát ảnh hưởng hàm lượng C đến sự tạo thành carotenoid - 57

3.2.1.3 Khảo sát ảnh hưởng hàm lượng S đến sự tạo thành carotenoid - 59

3.2.1.4 Khảo sát ảnh hưởng hàm lượng P đến sự tạo thành carotenoid - 60

lượng tế bào sau nuôi cấy - 61

3.2.2.2 Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của các yếu tố khoáng đến hàm lượng carotenoid sau nuôi cấy - 63

3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng ánh sáng, ẩm độ đến sự phát triển và sinh tổng hợp carotenoid của Rhodotorula - 65

3.3.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng ánh sáng, ẩm độ đến lượng tế bào sau nuôi cấy - 65

3.3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng ánh sáng, ẩm độ đến lượng carotenoid sau nuôi cấy - 66

3.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến sự sinh tổng hợp carotenoid của Rhodotorula - 69

3.5 Khảo sát số lượng tế bào và hàm lượng carotenoid theo thời gian nuôi cấy Rhodotorula - 70

3.5.1 Kết quả khảo sát sự thay đổi lượng tế bào trong thời gian nuôi cấy - 70

3.5.2 Khảo sát hàm lượng carotenoid trong thời gian nuôi cấy - 72

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ - 74

4.1 Kết luận - 74

4.2 Kiến nghị - 75

TÀI LIỆU THAM KHẢO - 76

Hình 1.1 Khả năng chống oxi hóa tăng dần từ

β-carotene đến 2,2’-dihydroxycanthaxanthin - 7

Hình 1.2 Tổng hợp IPP bằng con đường MVA - 10

Hình 1.3 Sơ đồ tổng hợp các hợp chất isoprenoid 10 từ IPP bằng con đường terpenoid - 10

Hình 1.4 Sơ đồ tổng quát tổng hợp các carotenoid - 11

Hình 1.5 Tổng hợp các carotenoid từ IPP - 12

Hình 1.6 Nấm men Rhodotorula glutinis - 18

Hình 1.7 Khuẩn lạc Rhodotorula - 19

Hình 1.8 Các hợp chất carotenoid chủ yếu tổng hợp bởi Rhodotorula - 19

Hình 2.1 Nguyên liệu cùi bắp làm chất mang - 27

Hình 2.2 Khuẩn lạc chủng nấm men Rhodotorula sp.CBS10104 (MN12) trên môi trường thạch malt - 28

Hình 2.3 Cấy chuyền giữ giống trên môi trường thạch malt trong ống nghiệm - 29

Hình 2.4: Sơ đồ quy trình nuôi cấy Rhodotorula sp và trích ly thu carotenoid - 31

Hình 2.5 Chất mang trước và sau khi nuôi cấy nấm men - 32

Hình 2.6 Sinh khối nấm men trong nước cất sau khi tách khỏi chất mang - 33

Hình 2.7 Đồ thị đường tương quan tuyến tính giữa OD610nmvà log(N/ml) của sinh khối nấm men Rhodotorula sp.CBS10104 - 48

Hình 2.8 Đồ thị đường tương quan tuyến tính giữa OD400nmvà hàm lượng carotenoid (µg/ml) trong dung dịch - 50

Hình 3.1 Đồ thị mô tả sự ảnh hưởng các phương pháp phá vỡ tế bào đến lượng carotenoid thu được - 54

hàm lượng C đến sự tạo thành carotenoid - 58 Hình 3.4 Đồ thị mô tả sự ảnh hưởng của hàm lượng

S đến sự tạo thành carotenoid - 59 Hình 3.5 Đồ thị mô tả sự ảnh hưởng của hàm lượng

P đến sự tạo thành carotenoid - 60 Hình 3.6 Đồ thị lượng tế bào theo thời gian nuôi cấy - 71 Hình 3.7 Đồ thị hàm lượng carotenoid theo thời gian nuôi cấy - 72

Bảng 1.1 Các nguồn thu nhận carotenoid - 4

Bảng 1.2 Nhu cầu khoáng của vi sinh vật - 17

Bảng 1.3 So sánh lên men bán rắn và lên men trong môi trường lỏng - 24

Bảng 2.1 Các nghiệm thức phá vỡ màng tế bào nấm men - 34

Bảng 2.2 Nghiệm thức thí nghiệm các hàm lượng N - 36

Bảng 2.3 Nghiệm thức thí nghiệm các hàm lượng C - 37

Bảng 2.4 Nghiệm thức thí nghiệm các hàm lượng S - 38

Bảng 2.5 Nghiệm thức thí nghiệm các hàm lượng P - 39

Bảng 2.6 Các yếu tố thí nghiệm khoáng - 40

Bảng 2.7 Các nghiệm thức thí nghiệm khoáng - 40

Bảng 2.8 Các nghiệm thức thí nghiệm 3 - 42

Bảng 2.9 Nghiệm thức mật độ giống cấy - 43

Bảng 2.10 Số khuẩn lạc theo độ đục OD - 47

Bảng 2.11 Giá trị OD tương ứng với nồng độ β-carotene - 49

Bảng 3.1 Hàm lượng carotenoid ly trích được bằng các phương pháp phá vỡ màng tế bào khác nhau - 53

Bảng 3.2 Hàm lượng carotenoid ở các nghiệm thức hàm lượng N - 56

Bảng 3.3 Hàm lượng carotenoid ở các nghiệm thức hàm lượng C - 57

Bảng 3.4 Hàm lượng carotenoid ở các nghiệm thức hàm lượng S - 59

Bảng 3.5 Hàm lượng carotenoid ở các nghiệm thức hàm lượng P - 60

Bảng 3.6 Lượng tế bào nấm men ở các nghiệm thức khoáng - 61

Bảng 3.7 Lượng tế bào trung bình ở các mức yếu tố khoáng - 62

Bảng 3.8 Hàm lượng carotenoid ở các nghiệm thức khoáng - 63

Bảng 3.9 Hàm lượng carotenoid trung bình ở các mức yếu tố khoáng - 63

Bảng 3.10 Lượng tế bào ở các nghiệm thức điều kiện nuôi cấy - 65

Bảng 3.11 Lượng tế bào trung bình ở các ẩm độ khác nhau - 65

Bảng 3.12 Lượng tế bào trung bình ở các điều kiện ánh sáng - 66

Bảng 3.15 Hàm lượng carotenoid trung bình ở

các điều kiện ánh sáng nhau nhau - 68 Bảng 3.16 Hàm lượng carotenoid sinh ra ở

các mật độ giống cấy khác nhau - 69 Bảng 3.17 Lượng tế bào theo thời gian nuôi cấy - 70 Bảng 3.18 Hàm lượng carotenoid theo thời gian - 72

MỞ ĐẦU

ĐẶT VẤN ĐỀ

Carotenoid là hợp chất phổ biến trong tự nhiên, đóng vai trò thu nhận năng lượng ánh sáng hỗ trợ cho quá trình quang hợp ở thực vật và vi sinh vật tự dưỡng Ngoài ra carotenoid còn là các hợp chất tạo màu hấp dẫn côn trùng và động vật trong quá trình thụ phấn và phát tán thực vật Đối với động vật và con người, nhiều hợp chất carotenoid có hoạt tính sinh học giúp ngăn cản quá trình oxi hóa trong cơ thể do các gốc tự do gây nên, điển hình như lycopene, β-carotene, … Quá trình oxi hóa này là nguyên nhân của lão hóa và rất nhiều loại bệnh, chế độ dinh dưỡng đầy

đủ hợp chất chống oxi hóa như carotenoid có thể giúp con người bảo vệ sức khỏe và hạn chế bệnh do hạn chế hoạt động các gốc tự do

Theo phương pháp cổ điển, carotenoid được ly trích từ thực vật, rồi sau đó được tổng hợp bằng phương pháp tổng hợp hóa hữu cơ Hiện nay, với sự phát triển của công nghệ vi sinh, có rất nhiều nghiên cứu thu nhận hợp chất đáng giá này từ

các loại nấm men Các chủng Rhodotorula là một trong số các loại nấm men đỏ

đang được nghiên cứu và ứng dụng nhiều trong sinh tổng hợp carotenoid Chủ yếu các nghiên cứu thực hiện trong môi trường lỏng với các nguồn C và N rẻ tiền Với cơ sở các nghiên cứu trên và để đa dạng hóa môi trường nuôi cấy, chúng

tôi tiến hành nuôi cấy Rhodotorula sp phân lập từ thực vật trên môi trường chất

mang cùi bắp để thu nhận carotenoid

Bắp là loại nông sản trồng phổ biến trên thế giới để dùng làm lương thực cho

cả người và gia súc Phần dùng của bắp chủ yếu là hạt, cùi bắp hiện nay rất ít được

sử dụng Do đó, chúng tôi tận dụng nguồn phụ phẩm nông nghiệp rẻ tiền này để làm chất mang và bổ sung thêm các chất dinh dưỡng cần thiết khác như các muối chứa

S, P, N và đường cho sự phát triển và tạo carotenoid của nấm men

Với cơ sở trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu sự phát triển và sinh

tổng hợp carotenoid của Rhodotorula sp trên môi trường chất mang cùi bắp”

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI BAO GỒM:

- Khảo sát một số phương pháp phá vỡ tế bào nấm men để thu nhận carotenoid

- Nghiên cứu thành phần khoáng C, N, S, P tối ưu cho sự sinh trưởng và sinh tổng

hợp carotenoid của Rhodotorula sp.CBS10104 (MN12) trên môi trường cùi bắp

- Nghiên cứu điều kiện ánh sáng và ẩm độ tối ưu cho sự sinh trưởng và sinh tổng

hợp carotenoid của Rhodotorula sp.CBS10104 (MN12) trên môi trường cùi bắp

- Khảo sát tỷ lệ giống cấy phù hợp trên môi trường nghiên cứu

- Khảo sát sự sinh trưởng và sinh tổng hợp carotenoid của Rhodotorula

sp.CBS10104 (MN12) trên môi trường cùi bắp trong các điều kiện tối ưu tìm được

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 CAROTENOID

1.1.1 Giới thiệu về carotenoid [11], [20], [28]

Carotenoid là một hợp chất tự nhiên quan trọng, được tổng hợp trong tự nhiên khoảng 100 triệu tấn mỗi năm Chúng tạo màu từ vàng sáng đến màu đỏ cho các loại trái cây, rau củ, hoa, rễ cây và cả lá mùa thu Chúng còn tạo màu cho lòng đỏ trứng, nhiều loại tảo, nấm men, nấm cũng như lông và da của các loài chim

Carotenoid là những hợp chất tan trong chất béo và giữ nhiều vai trò quan

trọng trong sinh học tế bào

Carotenoid được tổng hợp nhờ thực vật và vi sinh vật bằng phương pháp quang tổng hợp Tên của chúng có nguồn gốc từ năm 1831 khi Wachenroder ly trích được β-carotene từ cà rốt và đặt tên cho nó là carotene Berzelius (1837) đặt tên cho các hợp chất có cực hơn, màu vàng, trích ly được từ lá là xanthophyll Richard Willstatter (1907) xác định công thức của carotenoid theo kinh nghiệm (C40) và Tswett (1911) sử dụng kỹ thuật sắc ký để tách các hợp chất mà ông gọi là carotenoid Có rất nhiều nhà khoa học trong thế kỷ 20, ví dụ Otto Vưlker, một nhà khoa học người Đức, đã thu thập và phân tích hàng ngàn mẫu các hợp chất từ hàng trăm loài có màu khác nhau, kể cả động và thực vật Ngày nay với sự phát triển của sinh học và gen, người ta nghiên cứu ngày càng nhiều về carotenoid

Thành phần carotenoid khác nhau ở các loài Nồng độ và thành phần của xanthophyll ảnh hưởng bởi độ nhạy cảm ánh sáng Các carotenoid đặc biệt thường tích tụ hàm lượng cao trong sắc lạp của hoa và trái cây Thực vật bậc cao thường tích trữ lutein, β-carotene, violaxanthin và neoxanthin

Định nghĩa carotenoid của IUPAC: Carotenoid là các hợp chất hydrocarbon và các dẫn xuất có oxy của chúng (xanthophyll) Trong cấu tạo bao gồm 8 đơn vị isoprene, các nhóm isoprene xếp ngược chiều nhau sao cho các nhóm methyl ở vị trí trung tâm của chúng nằm ở vị trí 1-6 sau khi kết hợp Tất cả các phân tử carotenoid đều có tiền thân là hợp chất không chứa vòng có các nối đôi tiếp cách,

được tổng hợp nhờ enzyme qua các quá trính: hydro hóa, dehydro hóa, tạo vòng, oxi hóa và các quá trình khác

Bảng 1.1 Các nguồn thu nhận carotenoid

Theo bảng 1.1 cho thấy carotenoid chủ yếu được thu nhận từ thực vật và các hợp chất được ly trích thường có hoạt tính vitamin A

Phương pháp cổ điển để sản xuất carotenoid là ly trích bằng dung môi từ thực vật giàu hợp chất này

Việc sản xuất carotenoid bằng cách ly trích bắt đầu giảm khi người ta tìm được phương pháp tổng hợp β-carotene Ngày nay chỉ còn tinh thể β-carotene là còn được sản xuất bằng ly trích từ cà rốt khô còn được bán trên thị trường Hiện nay, người ta còn sản xuất β-carotene và carotenoid bằng cách lên men nhờ vi sinh vật

Carotenoid được phân làm hai loại:

Carotene: có cấu tạo là các hợp chất hydrocarbon mạch thẳng hay mạch vòng như lycopene, α-carotene, β-carotene…

Xanthophyll: hay còn gọi là oxycarotenoid, trong phân tử có các nhóm chức chứa oxy như epoxy, keto hay hydroxyl ví dụ: lutein, zeaxanthin,… Các hợp chất carotenoid phổ biến:

Lutein Astacene

Lycopene

Zeaxanthin

Rhodoxanthin Canthaxanthin Alpha-carotene Beta-carotene

Các hợp chất carotenoid khác nhau về chiều dài phân tử, nhưng thông thường

có cấu tạo gồm 40 carbon bất đối xứng (C40) Carotenoid có chứa nhiều nối đôi liên hợp (9-13 nối đôi, và thường tồn tại ở dạng trans), các nối đôi liên hợp này tạo nên nhiều chức năng của carotenoid Khả năng tạo nên nhiều đồng phân của carotenoid làm cho chúng có khả năng tham gia hàng ngàn sự kết hợp khác nhau Mặc dù có một số tồn tại ổn định ở dạng cis, hầu hết các carotenoid tránh dạng không gian gây cản trở trong quá trình xoay Một vài enzyme có khả năng liên kết với cis carotenoid, tuy nhiên dạng cis tồn tại không phổ biến trong các quá trình sinh học tự nhiên

1.1.2 Tính chất hóa lý của carotenoid [8]

Độ tan: chỉ trừ một số ngoại lệ, carotenoid là hợp chất ưa béo Chúng không tan trong nước mà tan trong các dung môi hữu cơ như acetone, alcohol, ethyl ether, chloroform và ethyl acetate Các hợp chất carotene tan dễ dàng trong ether dầu hỏa, hexane, toluene, còn các hợp chất xanthophyll tan tốt hơn trong ethanol và methanol

Sự hấp thu ánh sáng: hệ thống nối đôi liên hợp làm cho carotenoid có khả

năng hấp thu ánh sáng nhờ vậy chúng là các hợp chất có màu Dựa vào khả năng hấp thu ánh sáng mắt thường thấy được mà người ta xây dựng nên các phương pháp định tính và định lượng carotenoid Màu sắc giúp kiểm tra các bước trong quá trình phân tích carotenoid Sự mất màu hay thay đổi màu sắc giúp ta xác định nhanh sự phân hủy hay thay đổi cấu trúc của carotenoid Màu sắc giúp phân tách carotenoid qua cột sắc ký và đó cũng là phương pháp cổ điển để định lượng carotenoid Các phương pháp này vẫn được dùng cho đến ngày nay

Sự hấp thu và phân tách của caroteniod: tương tác của carotenoid và cột sắc

ký phụ thuộc cấu trúc của carotenoid Tuy nhiên số liệu sắc ký không được sử dụng làm tiêu chí duy nhất để xác định carotenoid Nhưng các dữ liệu này là thông tin bổ sung hữu ích Trong sắc ký cột, ái lực hấp thu phụ thuộc số lượng nối đôi, số lượng vòng và nhóm chức có oxy Ảnh hưởng của nối đôi là minh họa tiêu biểu cho ái lực của các hợp chất carotenoid mạch vòng Chúng được rửa giải khỏi cột theo thứ tự

phytoene, phytofluene, ζ-carotene, neurosporene và lycopene So sánh giữa carotenoid vòng đơn và vòng đôi thì δ-carotene rửa giải trước γ-carotene và α-carotene rửa giải trước β-carotene Vòng làm giảm ái lực hấp thu Do đó, β-carotene

có ái lực yếu hơn γ-carotene và γ-carotene có ái lực hấp thu yếu hơn lycopene Sự

có mặt của các nhóm thế chứa oxy làm tăng ái lực hấp thu của carotenoid, sự tăng ái lực này lại phụ thuộc vào loại nhóm chức, số lượng và vị trí của chúng trong phân

tử carotenoid

Sự đồng phân hóa và oxi hóa: tính bất bão hòa của carotenoid làm chúng dễ

tham gia phản ứng đồng phân hóa và oxi hóa Nhiệt độ, ánh sáng, độ acid và sự hấp phụ bề mặt của carotenoid làm tăng khả năng đồng phân hóa của trans carotenoid thành dạng cis Kết quả là làm mất màu và hoạt tính tiền vitamin A Sự oxi hóa là nguyên nhân chính của việc thất thoát carotenoid Sự oxi hóa này phụ thuộc vào ánh sáng, enzyme, sự có mặt của kim loại và các peroxide của lipid

Hình 1.1 Khả năng chống oxi hóa tăng dần từ β-carotene đến

2,2’-dihydroxycanthaxanthin Nguồn: http://www.chm.bris.ac.uk/motm/carotenoids/carotenoids.htm

Phản ứng của các nhóm chức: xanthophyll chứa các nhóm chức giúp phát

hiện carotenoid bằng các phản ứng hóa học đơn giản Ví dụ nhóm hydroxy ở carbon bậc 1 và 2 dễ bị acetyl hóa bởi anhydride acetic ở vòng pyridine

1.1.3 Chức năng của carotenoid [11]

Mặt trời chiếu sáng trái đất và cung cấp cho trái đất nguồn năng lượng rất lớn Đây là nguồn năng lượng cơ bản cho sự sống nhưng cần phải được thu nhận và chuyển thành năng lượng cho các quá trình sinh hóa học Thực vật, tảo và một số vi khuẩn hấp thu năng lượng mặt trời nhờ quá trình quang tổng hợp và chuyển thành năng lượng cho hoạt động sống Tuy nhiên nguồn năng lượng này cũng rất nguy hiểm, nó có thể phá hủy tế bào và mô nếu cơ thể sinh vật không có phương tiện bảo

vệ

Đặc điểm cấu tạo của carotenoid với mạch dài và nhiều nối đôi liên hợp giúp chúng có khả năng hấp thu ánh sáng có năng lượng cao ở bước sóng từ 400-500nm Chức năng đầu tiên của carotenoid là hấp thu ánh sáng và chuyển năng lượng này đến chlorophyll để thực hiện phản ứng quang tổng hợp

Hệ thống nôi đôi liên hợp của carotenoid còn đem đến một hiệu quả khác Với

sự gia tăng của oxi trong quá trình quang tổng hợp, môi trường trở nên hiếu khí Tế bào chịu sự oxi hóa cao trong môi trường có ánh sáng và oxi Carotenoid hạn chế sự hủy hoại do hàm lượng oxi cao và trong tế bào

Màu sắc của sinh vật là dấu hiệu để nhận biết lẫn nhau, carotenoid có màu từ

đó có chức năng tạo dấu hiệu nhận biết giữa các loài

Cấu trúc nối đôi liên hợp của carotenoid làm cho nó ưa béo, từ đó có thể liên kết với nguyên sinh chất và giữ vai trò nhất định trong cấu trúc và đặc điểm màng nguyên sinh Hệ thống nối đôi giàu electron của carotenoid phản ứng lại với tác động của các tác nhân oxi hóa cũng như các gốc tự do Từ đó, carotenoid có khả năng chống oxi hóa

Vai trò carotenoid trong màng tế bào?

- Các cực chứa lutein và zeaxanthin giúp hạn chế sự di chuyển của phân tử lipid giúp làm cứng chắc màng tế bào

- β-carotene lại giúp cho sự linh hoạt của các phân tử lipid trong màng tế bào

- β-carotene và zeaxanthin giúp gia tăng quá trình thẩm thấu các phân tử nhỏ

Carotenoid có sẵn trong thực phẩm từ tự nhiên, nhất là trái cây và rau quả Chúng được cơ thể hấp thu, vận chuyển và lưu giữ ở các mô trước khi sử dụng Carotenoid có thể giúp giảm sự khó chịu và hủy hoại do viêm nhiễm vì cháy nắng từ đó giúp bảo vệ da

1.1.4 Sự sinh tổng hợp carotenoid trong tự nhiên [17], [30]

Isoprenoid (hay còn gọi là terpenoid) bao gồm nhóm các hợp chất trao đổi chất bậc 2 như: carotenoid, sterol, polyprenyl alcohol, ubiquinone (coenzyme Q), heme

A và prenylated proteins Tất cả hợp chất isoprenoid đều được tổng hợp từ isopentenyl diphosphate (IPP) Con đường đầu tiên để tạo thành IPP là con đường mevalonic acid (MVA) Khoảng 600 loại carotenoid có cấu tạo gồm 40 C, một số ít loài vi khuẩn tổng hợp carotenoid 30, 45 và 50 C

Hình 1.2 Tổng hợp IPP bằng con đường MVA

IPP: isopentenyl pyrophosphate; ERG10: acetoacetyl-CoA ligase; ERG13: hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase (HMG-CoA synthase); HMG1 and HMG2: 2-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductases; ERG12: mevalonate kinase; ERG8: phosphomevalonate kinase; MVD1: diphosphomevalonate decarboxylase; IDI1: isopentenyl pyrophosphate:dimethylallyl diphosphate isomerase; ERG20: farnesyl diphosphate synthase

2-Nguồn: http://www.microbialcellfactories.com/content/5/1/20

Hình 1.3 Sơ đồ tổng hợp các hợp chất isoprenoid từ IPP bằng con đường

terpenoid

Nguồn: http://www.chm.bris.ac.uk/motm/carotenoids/carotenoids.htm

Hình 1.4 Sơ đồ tổng quát tổng hợp các carotenoid

Nguồn:

IMAGE?type=PATHWAY&object=CAROTENOID-PWY

http://biocyc.org/META/NEW-Hình 1.5 Tổng hợp các carotenoid từ IPP

IPP: Isopentyl pyrophosphate; crtE: geranylgenranyl diphosphate synthase; crtB: phytoene synthase; crtI: phytoene desaturase; crtZ: -carotene hydroxylase; crtX: zeaxanthin glucosylase; crtM: dehydrosqualene synthase; crtN: dehydrosqualene desaturase; crtEb: lycopene elongase; crtYe/Yf: heterodimeric decaprenoxanthin synthase

1.2 NẤM MEN

1.2.1 Sơ lược về nấm men [1]

Nấm men (yeast, levure) là tên gọi thông thường của một nhóm nấm có vị trí phân loại không thống nhất nhưng có chung các đặc điểm sau đây:

- Tồn tại ở trạng thái đơn bào

- Đa số sinh sôi theo lối nẩy chồi, cũng có khi phân cắt tế bào

- Nhiều loại có khả năng lên men đường

- Thành tế bào có chứa mannan

- Thích nghi với môi trường chứa đường cao, có tính acid cao

Nấm men phân bố rộng rãi trong tự nhiên, nhất là trong các môi trường có chứa đường, có pH thấp, như hoa quả, rau dưa, mật mía, mật ong,…

1.2.1.1 Hình thái và cấu trúc của tế bào nấm men

Nấm men là vi sinh vật điển hình cho nhóm nhân thật Tế bào nấm men thường lớn gấp 10 lần tế bào vi khuẩn Tùy theo loại nấm men mà tế bào có hình cầu, hình trứng, hình ovan, hình chanh,…

Có loài có khuẩn ty hoặc khuẩn ty giả Khuẩn ty giả chưa thành sợi rõ rệt mà chỉ là nhiều tế bào nối với nhau thành chuỗi dài Có loại có thể tạo thành váng khi nuôi cấy trên môi trường dịch thể

Thành tế bào nấm men dày khoảng 25nm (chiếm 25% khối lượng chất khô của

tế bào) Đa số nấm men có thành tế bào cấu tạo bởi glucan và mannan Một số nấm men có thành tế bào chứa chitin và mannan Trong thành tế bào nấm men còn có chứa khoảng 10% protein, trong đó có một phần là các enzyme Trên thành tế bào còn thấy có cả một lượng nhỏ lipid

Dưới lớp màng tế bào là lớp tế bào chất, quan sát dưới kính hiển vi thấy có 3 tầng kết cấu khác nhau ở lớp tế bào chất này Cấu tạo chủ yếu là protein (chiếm 50% khối lượng chất khô), phần còn lại là lipid (40%) và một ít polysaccharide Nhân của tế bào nấm men được bao bọc bởi màng nhân có cấu trúc hai lớp và

có rất nhiều lỗ thủng

Ty thể của nấm men cũng giống như nấm sợi và các sinh vật có nhân khác

Các tế bào nấm men khi già sẽ xuất hiện không bào Trong không bào có chứa các enzyme thủy phân, polyphosphate, lipid, ion kim loại, các sản phẩm trao đổi chất trung gian Ngoài tác dụng dự trữ, không bào còn có chức năng điều hòa áp suất thẩm thấu của tế bào

1.2.1.2 Hình thức sinh sản của nấm men

Nấm men có nhiều hình thức sinh sản khác nhau:

Sinh sản vô tính:

 Nảy chồi (ở tất cả các chi nấm men): Nảy chồi là phương pháp sinh sản phổ biến nhất ở nấm men Khi một chồi xuất hiện, các enzyme thủy phân sẽ làm phân giải phần polysaccharide của thành tế bào làm cho chồi chui ra khỏi

tế bào mẹ Vật chất mới được tổng hợp sẽ được huy động đến chồi và làm chồi

to dần lên Thành phần của vách ngăn cũng tương tự như thành tế bào

 Phân cắt (ở chi Schizosaccharomyces): lối phân cắt này tương tự như vi

khuẩn Tế bào dài ra, ở giữa mọc ra vách ngăn chia tế bào thành 2 phần tương đương nhau, mỗi tế bào sẽ có một nhân

 Bằng bào tử:

- Bào tử đốt (ở chi Geotrichum)

- Bào tử bắn (ở chi Sporobolomyces, Sporidiobolus, Bullera và

Aessosporon): loại bào tử này có hình thận sinh ra trên một cuống nhỏ

mọc ở các tế bào dinh dưỡng hình trứng Sau khi bào tử chín, nhờ một

cơ chế đặc biệt bào tử sẽ được bắn ra phía đối diện

- Bào tử áo (ở nấm Candida albicans): thường mọc ở đỉnh của các

khuẩn ty giả

Sinh sản hữu tính: bằng bào tử túi (ở các chi Saccharomyces,

Zygosaccharomyces và nhiều chi nấm men thuộc bộ Endomycetales): bào tử túi

được sinh ra trong các túi Hai tế bào khác giới (mang dấu + và -) đứng gần nhau sẽ mọc ra hai mấu lồi Chúng tiến lại gần nhau và tiếp nối với nhau Chỗ tiếp nối sẽ tạo

ra một lỗ thông và qua đó chất nguyên sinh có thể đi qua để tiến hành phối chất, nhân cùng đi qua để tiến hành phối nhân Sau đó nhân phân cắt thành 2 thành 4

thành 8 Mỗi nhân được bao bọc bởi chất nguyên sinh rồi được tạo màng dày chung quanh và hình thành các bào tử túi Tế bào dinh dưỡng biến thành túi

1.2.1.3 Dinh dưỡng của nấm men

a Nguồn thức ăn carbon

Nấm men là vi sinh vật dị dưỡng Người ta thường sử dụng đường để làm thức

ăn carbon cho các vi sinh vật dị dưỡng Cần chú ý rằng đường đơn ở nhiệt độ cao có thể bị chuyển hóa thành loại hợp chất có màu tối gọi là đường cháy rất khó hấp phụ Trong môi trường kiềm sau khi khử trùng đường còn dễ bị acid hóa và biến đổi pH môi trường Để tránh các hiện tượng này khi khử trùng môi trường chứa đường người ta thường chỉ hấp ở áp lực 0,5atm (112,5oC) và duy trì trong 30 phút Với các loại đường đơn tốt nhất là nên sử dụng phương pháp hấp gián đoạn hoặc lọc riêng dung dịch đường (thường dùng nồng độ 20%) bằng nến lọc hoặc màng lọc vi khuẩn sau đó mới dùng thao tác vô trùng để bổ sung vào các môi trường đã khử trùng Khi chế tạo các môi trường chứa tinh bột trước hết phải hồ hóa tinh bột ở nhiệt

độ 60-70oC sau đó đun sôi rồi mới đưa đi khử trùng ở nồi hấp áp lực

Để nuôi cấy các vi sinh vật khác nhau, người ta dùng các nồng độ đường khác nhau Đối với nấm men, nấm sợi là khoảng 3-10% đường

Hầu hết các vi sinh vật chỉ đồng hóa được các loại đường ở dạng đồng phân D Các hợp chất hữu cơ chứa cả C và N (pepton, nước thịt, nước chiết ngô, nước chiết nấm men, nước chiết đại mạch, nước chiết giá đậu,…) có thể sử dụng vừa làm nguồn C vừa làm nguồn N đối với vi sinh vật

Với vi sinh vật dị dưỡng, nguồn thức ăn carbon làm cả hai chức năng: nguồn dinh dưỡng và nguồn năng lượng

b Nguồn thức ăn nitơ

Nguồn N dễ hấp thu nhất đối với vi sinh vật là NH3 và NH4

+

Nhiều khi để nuôi cấy vi sinh vật bằng nguồn N là ure người ta phải bổ sung thêm muối amon Sở

dĩ như vậy là bởi vì phải có thức ăn N dễ hấp thu cho vi sinh vật phát triển từ đó mới có thể sản sinh ra được urease để thủy phân ure

Muối nitrate là nguồn thức ăn nitơ thích hợp với nhiều loại tảo, nấm sợi và xạ khuẩn nhưng ít thích hợp đối với nhiều loại nấm men và vi khuẩn Sau khi vi sinh vật sử dụng hết gốc NO3- các ion kim loại còn lại (K+, Na+, Mg2+,…) sẽ làm kiềm hóa môi trường Để tránh hiện tượng này người ta thường sử dụng muối NH4NO3 để làm nguồn N cho nhiều loại vi sinh vật Tuy nhiên gốc NH4

+

thường bị hấp thụ nhanh hơn, rồi mới hấp thụ đến gốc NO3

-

Vi sinh vật còn có khả năng đồng hóa rất tốt N chứa trong các thức ăn hữu cơ

Vi sinh vật không có khả năng hấp thụ trực tiếp các protein cao phân tử Chỉ có các polypeptide chứa không quá 5 gốc acid amine mới có thể di chuyển trực tiếp qua màng tế bào chất của vi sinh vật Rất nhiều vi sinh vật có khả năng sản sinh protease xúc tác việc thủy phân protein thành các hợp chất có phân tử lượng thấp có khả năng xâm nhập vào tế bào

Nguồn N hữu cơ thường được sử dụng để nuôi cấy vi sinh vật là pepton loại chế phẩm thủy phân không triệt để của một nguồn protein nào đó

c Nguồn thức ăn khoáng

Khi sử dụng môi trường thiên nhiên để nuôi cấy vi sinh vật người ta thường không cần thiết bổ sung các nguyên tố khoáng Trong nguyên liệu dùng làm các môi trường này (khoai tây, nước thịt, sữa, huyết thanh, pepton, giá đậu,…) thường

có chứa đủ các nguyên tố khoáng cần thiết đối với vi sinh vật Ngược lại khi làm các môi trường tổng hợp bắt buộc phải bổ sung đủ các nguyên tố khoáng cần thiết Những nguyên tố khoáng mà vi sinh vật đòi hỏi phải được cung cấp với liều lượng lớn được gọi là nguyên tố khoáng đại lượng Còn những nguyên tố khoáng

mà vi sinh vật chỉ yêu cầu những liều lượng nhỏ được gọi là các nguyên tố khoáng

Nhu cầu khoáng của vi sinh vật cũng không giống nhau Người ta nhận thấy nồng độ cần thiết về các muối khoáng đối với vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn thường thay đổi trong các phạm vi sau:

Bảng 1.2 Nhu cầu khoáng của vi sinh vật

Nồng độ cần thiết (g/l) Muối khoáng

1.2.2 Đặc điểm của nấm men Rhodotorula [2], [5], [18], [28]

Đặc điểm phân loại:

Hình 1.6 Nấm men Rhodotorula glutinis

(Nguồn: http://www.vscht.cz/kch/galerie/obrazky/kvasinky/rhod.gif)

Rhodotorula là nấm men có trong không khí, đất, nước ao hồ, nước biển,…

Chúng sống trên thực vật, người và các động vật hữu nhũ khác

Theo Nguyễn Lân Dũng, Đào Thị Lương (2006), khuẩn lạc Rhodotorula có

màu cam đến màu đỏ, vàng, dạng bơ hoặc nhầy

Hình thái nấm men: Tế bào hình cầu, gần cầu, elip, trứng hoặc trứng kéo dài

Có thể xuất hiện sợi giả và sợi thật

Hình 1.7 Khuẩn lạc Rhodotorula

(Nguồn: http://www2.andong.ac.kr/~hysohn/rhodotorula-glutinis.jpg

Theo Zumriye Aksu và cộng sự (2005), Rhodotorula là loài nấm men phân bố

khá rộng rãi trong tự nhiên và có thể sinh tổng hợp một số hợp chất carotenoid như β-carotene, torulene và torulahordin Trong đó, β-carotene là hợp chất carotenoid chính được tổng hợp

Hình 1.8 Các hợp chất carotenoid chủ yếu tổng hợp bởi Rhodotorula

R glutinis khi bị đột biến bởi ánh sáng trắng thì lượng carotenoid tổng hợp

được tăng 58% (Bhosale và Gadre, 2002) Khả năng chịu chiếu sáng của

Rhodotorula rất khác nhau ở các loài và giống khác nhau Ví dụ: R minuta có R glutinis phát triển rất kém khi ánh sáng lên đến 1.000Lx (Bhosale và Gadre, 2002)

Khi ở điều kiện nhiệt độ thấp, R glutinis sẽ sinh tổng hợp nhiều β-carotene

hơn các carotenoid khác, trong khi ở nhiệt độ cao, chất chiếm tỷ lệ cao lại là torulene (Simpson và cộng sự, 1996)

Có nhiều nghiên cứu cho biết có sự gia tăng hàm lượng carotenoid tổng hợp ở nấm men khi môi trường lên men chứa kim loại và muối (Atamanyuk &

Razumorskii 1974; Daushvili & Elisashvili 1990) R rubra được cho biết có thể

chịu được môi trường chứa các ion kim loại của đồng, coban, calci, và bari (Gammal & Rizk 1989) Tương tự như vậy, một số ion hóa trị II được xem như chất

kích thích sinh trưởng của R glutinis (Komemushi và cộng sự, 1994) Theo Mahattanatavee & Kulprecha (1991), nấm men Rhodotorula sẽ tăng tổng hợp

carotenoid khi được cung cấp các ion kim loại như đồng, kẽm, sắt

Trong nghiên cứu của mình, J Tinoi và cộng sự (2004) cho biết một vài chủng

Rhodotorula hiện nay đang được dùng để sản xuất carotenoid trong công nghiệp

Nấm men rất thuận tiện cho lên men với quy mô lớn vì chúng có dạng đơn bào và

tốc độ sinh trưởng khá nhanh Trong đó, Rhodotorula glutinis sinh tổng hợp chủ

yếu β-carotene và torulahordin, tỷ lệ hai loại carotenoid này tùy thuộc điều kiện nuôi cấy Torulahordin được cho là tạo nên khi nấm men chịu cường độ cao của quá

trình oxi hóa, từ đó khi tạo nên đột biến cho R glutinis do ánh sáng sẽ dẫn đến việc

gia tăng quá trình tổng hợp torulahordin của nấm men (Hideyuki Sakaki & cộng sự, 2001)

Theo nghiên cứu của Iriani R Maldonade & cộng sự (2006), nấm men R

glutinis tổng hợp hàm lượng carotenoid cao nhất (881µg/l), tiếp theo là R graminis

(594µg/l), Rhodotorula 137 (590µg/l), Rhodotorula

mucilaginosa-108 (562µg/l) và Rhodotorula mucilaginosa-135 (545µg/l) Rhodotorula minuta và

Sporobolomyces roseus cho hàm lượng carotenoid thấp nhất (168 và 237µg/l) R glutinis có thể tổng hợp được 132µg carotenoid/g tế bào khô

Nấm men R mucilaginosa tổng hợp chủ yếu là β-carotene và torulahordin Theo Z Aksu (2005), R mucilaginosa có điều kiện sống tối ưu ở pH=7, nhiệt độ

30oC, dùng nguồn nitơ là ammonium sulfate với nồng độ 2g/L và tỷ lệ không khí là

2,4vvm Khi bổ sung dầu bông vải vào môi trường nuôi cấy giúp gia tăng hàm lượng carotenoid tạo thành Loại nấm men này có thể sử dụng các loại phụ phẩm rẻ tiền như mật rỉ từ củ cải đường và lactose trong whey làm nguồn thức ăn mà hàm lượng carotenoid tạo thành vẫn cao

Một vài tác chất như phụ gia bột giặt, dầu thực vật, các chất hoạt động bề mặt

được biết đến như các chất làm tăng khả năng tổng hợp carotenoid của Rhodotorula

glutinis Thí nghiệm của Herbert Fuhrmann & cộng sự (2007) cho thấy khi bổ sung

dầu bông vải hàm lượng carotenoid, hiệu suất tổng hợp carotenoid và mật độ sinh khối của nấm men đều tăng có ý nghĩa so với mẫu đối chứng Cụ thể hàm lượng carotenoid tăng từ 35mg/L canh trường lên 52mg/L canh trường khi bổ sung % dầu bông vải (Herbert Fuhrmann & cộng sự, 2007)

Quan trọng nhất là Rhodotorula có thể phát triển tốt trên môi trường nguồn C

và N rẻ tiền như: nước ép nho, syrup glucose, mật rỉ củ cải đường, dịch trích bột đậu nành, dịch trích bắp, mật rỉ đường mía, whey siêu lọc,…

1.3 LÊN MEN BÁN RẮN

1.3.1 Giới thiệu [23], [22], [31]

Lên men bán rắn có thể xảy ra một cách tự nhiên ở những nơi hầu như không

có nước ví dụ: trong các thùng phân hữu cơ, bánh mì, trái cây chín,… Từ thời xa xưa con người đã sử dụng phương pháp này để lên men thực phẩm như: phô mai ở châu Âu, nước tương, tempe, nước trái cây ở châu Á,…

Trong hai thập niên vừa qua, có rất nhiều quá trình lên men bán rắn được nghiên cứu bao gồm thực phẩm, phụ phẩm nông công nghiệp, sản phẩm ngành dược,… Các nghiên cứu nhắm đến các loài vi sinh vật, các loại cơ chất và các sản phẩm trao đổi chất của vi sinh vật (Pandey và cộng sự, 2000)

Lên men bán rắn (solid – state fermentation, SSF) được định nghĩa là quá trình lên men trong môi trường không có hay hầu như không chứa nước Lên men bán rắn cần nguồn nguyên liệu tự nhiên như nguồn thức ăn carbon và nguồn năng lượng Lên men bán rắn cũng có thể thực hiện trên một vật liệu tự nhiên trơ dùng

như giá thể hay chất mang, trong trường hợp này cần bổ sung thêm các chất dinh dưỡng cần thiết cũng như bổ sung thêm nguồn carbon

Các bước của quá trình lên men bán rắn:

- Chuẩn bị chất mang rắn

- Tiệt trùng chất mang

- Tăng sinh giống vi sinh vật

- Chuyển giống vi sinh vật qua chất mang ẩm

- Ủ trong điều kiện thích hợp

- Duy trì điều kiện tối ưu (pH, nhiệt độ, lượng khí,…)

- Thu hoạch chất mang

- Trích lấy sản phẩm

1.3.2 Đặc điểm của quá trình lên men bán rắn [30]

Tùy vào chất mang sử dụng mà lượng nước hấp thu có thể gấp nhiều lần khối lượng chất khô Các chất mang này phải có đủ độ ẩm cần thiết Lượng nước này tạo nên hoạt độ nước cao và trở thành môi trường thuận tiện cho các quá trình sinh hóa xảy ra Hoạt độ nước thấp làm cho sự khuyếch tán dinh dưỡng và trao đổi chất chậm lại Do đó, duy trì độ ẩm đầy đủ cho chất mang rắn cũng như duy trì hoạt độ nước thích hợp là điều cần thiết cho quá trình lên men bán rắn

Chất mang rắn dùng trong lên men bán rắn thường có tỷ lệ diện tích bề mặt trên thể tích lớn (khoảng 103 – 106m2/cm3) Kích thước chất mang càng nhỏ thì diện tích bám của vi sinh vật càng lớn nhưng lại khó khăn trong việc lưu thông của không khí do khoảng cách giữa chúng quá nhỏ Ngược lại, kích thước chất mang lớn thì tạo điều kiện hiếu khí tốt nhưng bề mặt tiếp xúc lại bé Trong các quá trình sinh học, đôi khi người ta dùng dạng hỗn hợp vì lý do kinh tế Ví dụ, chất mang thường dùng làm môi trường lên men bán rắn là cám lúa mì, người ta thường dùng

ở hai dạng: mịn và thô Các dạng chất mang mịn có thể bé hơn 500 – 600µm Quá trình lên men bán rắn thường dùng hỗn hợp 2 dạng cơ chất có tỷ lệ kích thước khác nhau tùy vào sản phẩm nuôi cấy

Chất mang rắn cung cấp môi trường sống cho các loại vi sinh vật như vi khuẩn, nấm men, nấm mốc Trong đó, nấm sợi là đối tượng được nghiên cứu nhiều nhất cho quá trình lên men bán rắn, chúng không chỉ sống trên bề mặt chất mang

mà còn đâm sâu vào bên trong

Một vài loại lương thực như sắn, lúa mạch,… hay các bán thành phẩm công nghiệp như cám lúa mì, cám gạo, bã mía, bã sắn, các loại bánh dầu, thịt quả, bã trà,

bã cà phê,… là các chất mang phổ biến cho lên men bán rắn Trong suốt quá trình nuôi cấy trên chất mang, nhờ nguồn carbon và nguồn dinh dưỡng bổ sung thêm, vi sinh vật tạo ra các enzyme thủy phân ngoại bào và phóng thích chúng khỏi tế bào Tiếp đến, các enzyme này xúc tác các quá trình sinh tổng hợp và giúp cho vi sinh vật hoạt động

1.3.3 So sánh lên men bán rắn và lên men trong môi trường lỏng [22]

Lên men bán rắn trở nên cao cấp hơn lên men trong môi trường lỏng là do các

ưu điểm của nó Lên men bán rắn làm giảm chi phí do điều kiện lên men đơn giản, chất mang là các dạng phụ phẩm công nghiệp, sử dụng ít nước do đó lượng chất thải hầu như không có, từ đó giảm bớt quan tâm đến vấn đề ô nhiễm Quá trình lên men bán rắn rất đơn giản, thiết bị lên men có thể tích nhỏ (giá thành thấp), sản phẩm lại đạt nồng độ cao do có ít nước trong môi trường Các quá trình lên men hiếu khí thực hiện dễ dàng trên bề mặt chất mang Và quy mô sản xuất cũng nhỏ hơn

Mặc dù có nhiều sự phát triển nhưng so với lên men trong môi trường lỏng, lên men bán rắn vẫn có nhược điểm và lên men bán rắn còn có những yếu tố hóa sinh chưa tìm hiểu được hết So với lên men trong môi trường lỏng, lên men bán rắn khó điều khiển và cũng khó tăng năng suất hơn Trong môi trường lỏng, chất dinh dưỡng và sinh khối của vi sinh vật nằm trong môi trường dung dịch Trong khi đó, lên men bán rắn thì đa phần sinh khối chỉ tiếp xúc trên bề mặt chất mang ẩm, có thể dùng nhiều chất tạo xốp như bã mía, bã trấu để tạo điều kiện hiếu khí cho sinh khối hoạt động, sinh trưởng

Khi vi sinh vật trao đổi chất sẽ sinh nhiệt Sự hạn chế nước dẫn đến việc khó giải nhiệt môi trường, một trong các vấn đề chính cần quan tâm trong lên men bán rắn

Bảng 1.3 So sánh lên men bán rắn và lên men trong môi trường lỏng

1.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men bán rắn [31]

Có vài yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phát triển của các quá trình lên men bán rắn Trong đó có việc chọn lựa vi sinh vật, chọn chất mang, phương pháp phân tách và tinh chế sản phẩm

Dựa vào hoạt độ nước thì nấm mốc và nấm men là các vi sinh vật phù hợp trong lên men bán rắn Còn vi khuẩn thường yêu cầu hoạt độ nước cao nên khó có

- Môi trường không di chuyển tự do

- Môi trường cạn

- Chất mang có thể cung cấp C, N,

khoáng và năng lượng

- Môi trường hấp thụ nước và lấy dinh

- Môi trường di chuyển tự do

- Môi trường sâu hơn

- Không có

- Môi trường tan trong nước

- Nhiệt độ, pH, nồng độ các chất đồng nhất trong môi trường

- Càng nhiều nước càng tăng thể tích môi trường