Thiết lập quy trình công nghệ lên men, tinh chế insulin tái tổ hợp từ tế bào pichia

2.1 – Phân loại khoa học của Pichia pastoris 2.2 – Các ứng dụng lên men sản xuất protein từ Pichia pastoris 3.1 – Các thí nghiệm của thực nghiệm yếu tố từng phần với 4 yếu tố 3.2 – Các

ðại Học Quốc Gia Tp Hồ Chí Minh

TRƯỜNG ðẠI HỌC BÁCH KHOA

-

NGUYỄN HỮU QUYỀN

THIẾT LẬP QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ LÊN MEN,

TINH CHẾ INSULIN TÁI TỔ HỢP TỪ TẾ BÀO PICHIA

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 6 năm 2008

CÔNG TRÌNH ðƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ðẠI HỌC BÁCH KHOA ðẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ðẠI HỌC BÁCH KHOA ðộc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc

-

Tp HCM, ngày tháng năm

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ và tên học viên: Nguyễn Hữu Quyền Giới tính : Nam
/ Nữ  Ngày, tháng, năm sinh : 10/06/1982 Nơi sinh : Quảng Bình

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Khoá (Năm trúng tuyển) : 2005

1- TÊN ðỀ TÀI: “Thiết lập quy trình công nghệ lên men, tinh chế insulin

.tái tổ hợp từ tế bào Pichia”

2- NHIỆM VỤ LUẬN VĂN:

.+ Tối ưu hóa môi trường, ñiều kiện nuôi cấy Pichia pastoris ở quy mô erlen

.+ Khảo sát khả năng tăng trưởng sinh khối và cảm ứng sản xuất mini-proinsulin ở quy mô fermenter

.+ Nghiên cứu phương pháp thu nhận, tinh sạch mini-proinsulin sau lên men

3- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 02/2007

4- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ : 06/2008

5- HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN : TS Nguyễn Quốc Bình

Nội dung và ñề cương Luận văn thạc sĩ ñã ñược Hội ðồng Chuyên Ngành thông qua

QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH

Tôi xin chân thành cám ơn thầy TS Nguyễn Quốc Bình, Phó giám ñốc Trung tâm Công nghệ sinh học Tp HCM, ñã ñịnh hướng ñề tài và tận tình hướng dẫn, tạo ñiều kiện cho tôi thực hiện luận văn này

Tôi xin chân thành cám ơn cô ThS Nguyễn Thị Thùy Dương, giảng viên Bộ môn Công nghệ sinh học trường ðại học Bách khoa Tp HCM, ñã hỗ trợ và tạo ñiều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện các thí nghiệm lên men trong qúa trình nghiên cứu

Tôi xin chân thành cám ơn bạn ThS Trần Thị Thúy Hằng và em KS Phạm Thị Thùy Dương ñã hỗ trợ tôi trong việc chuẩn bị nguyên vật liệu, tiến hành các thí nghiệm và

xử lý số liệu thí nghiệm trong qúa trình nghiên cứu

Tôi xin chân thành cám ơn cô TS Nguyễn Thúy Hương, giảng viên Bộ môn Công nghệ sinh học trường ðại học Bách khoa Tp HCM, ñã hỗ trợ và tạo ñiều kiện thuận lợi cho tôi trong việc thực hiện các thủ tục gia hạn thời gian thực hiện luận văn và bảo vệ luận văn

Tôi xin chân thành cám ơn tất cả quý thầy cô ở Bộ môn Công nghệ sinh học trường ðại học Bách khoa Tp HCM ñã tạo ñiều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại trường

Tôi xin chân thành cám ơn Trung tâm Công nghệ sinh học Tp HCM ñã tạo ñiều kiện

về các nguyên vật liệu cho tôi thực hiện qúa trình nghiên cứu

Tôi xin chân thành cám ơn Ban giám ñốc Công ty Dược phẩm Phil Inter Pharma ñã tạo ñiều kiện về mặt thời gian cho tôi trong qúa trình thực hiện luận văn

Tôi xin chân thành cám ơn các bạn học cùng lớp Cao học CNSH-K2005 trường ðại học Bách khoa Tp HCM ñã mang lại cho tôi niềm vui, tình bạn và những ý kiến ñóng góp chân thành trong qúa trình học tập và nghiên cứu

Cuối cùng, tôi xin chân thành cám ơn gia ñình tôi ñã ủng hộ, khích lệ và ñộng viên tôi

Qúa trình lên men Pichia pastoris trong fermenter gồm 3 phase (pha): glycerol batch phase, glycerol fed-batch phase và methanol fed-batch phase Pichia pastoris phát triển

ñể ñạt mật ñộ sinh khối cao trong hai phase ñầu: Sử dụng cơ chất glycerol trong môi trường ban ñầu ñể phát triển sinh khối trong glycerol batch phase; sau ñó, cơ chất cho phát triển sinh khối này (glycerol) sẽ ñược bổ sung thêm trong glycerol fed-batch phase Khi ñạt ñược mật ñộ sinh khối thích hợp thì sẽ bổ sung cơ chất thứ hai (methanol) trong methanol fed-batch phase ñể cảm ứng cho qúa trình sản xuất mini-proinsulin Mini-proinsulin trong dịch lên men sau ñó sẽ ñược ñịnh tính bằng phương pháp ñiện di và Western blot, ñịnh lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao – HPLC

Glycerol batch phase:

Tiến hành lên men với 4,1% glycerol trong môi trường ban ñầu

Glycerol fed-batch phase:

Tiến hành bổ sung glycerol theo 3 chế ñộ thí nghiệm:

Ở chế ñộ lên men 1, bổ sung liên tục: 0,5% glycerol/h trong 4 giờ ñầu và 0,75% glycerol/h trong 4 giờ sau (5% glycerol) Trong 2 chế ñộ còn lại thì chỉ bổ sung một lần: 5% glycerol ở chế ñộ lên men 2 và 7% glycerol ở chế ñộ lên men 3

Methanol fed-batch phase:

Tiến hành bổ sung methanol liên tục: 0,3% methanol/h trong 4 giờ ñầu, 0,6% methanol/h trong 2 giờ tiếp theo và 0,9 % methanol/h cho ñến khi kết thúc thí nghiệm

The process of Pichia pastoris fermentation in fermenter containing 3 phases: glycerol batch phase, glycerol fed-batch phase and methanol fed-batch phase Pichia pastoris

develops to reach the high mass density in the first two phases: Using glycerol in initial medium to develop the mass in glycerol batch phase; after that, this mass developing – substance (glycerol) will be added more in glycerol fed-batch phase After reaching the suitable mass density, the second substance (methanol) will be added in methanol fed-batch phase for the induction process of producing mini-proinsulin Mini-proinsulin in the cultured supernatant after fermentation will be identified by the method of polyacrilamide gel electrophoresis and Western blot, assayed by the method of high performance liquid chromatography – HPLC

Glycerol batch phase:

Carry out the fermentation process with 4.1% glycerol in the initial medium

Glycerol fed-batch phase:

Carry out adding glycerol with 3 experiment regulations:

In the 1st experiment, add glycerol continuously: 0.5% glycerol/h in the first 4 hours and 0.75% glycerol/h in the next 4 hours (total 5% glycerol) In the 2 remain experiments, add glycerol only 1 time: 5% glycerol in the 2nd experiment and 7% glycerol in the 3rd experiment

Methanol fed-batch phase:

Carry out adding methanol continuously: 0.3% methanol/h in the first 4 hours, 0.6% methanol/h in the next 2 hours and 0.9 % methanol/h to the end of experiment

Lời cám ơn

Tóm tắt luận văn

Danh mục hình

Danh mục bảng

1.1 ðẶT VẤN ðỀ 14

1.2 CÁC NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 15

1.2.1 Các nghiên cứu, ứng dụng trên thế giới 15

1.2.2 Các nghiên cứu, ứng dụng trong nước 16

PHẦN 2 TỔNG QUAN 2.1 TỔNG QUAN VỀ BỆNH TIỂU ðƯỜNG 19

2.1.1 Tiểu ñuờng là gì 19

2.1.2 Các dạng tiểu ñường 19

2.1.2.1 Tiểu ñường tuýp 1 20

2.1.2.2 Tiểu ñường tuýp 2 21

2.1.2.3 Xuất hiện bệnh tiểu ñường tuýp 3 21

2.1.3 Tác hại của bệnh tiểu ñường 23

2.1.4 Tình hình bệnh tiểu ñường trên thế giới và ở Việt Nam 25

2.2 TỔNG QUAN VỀ INSULIN VÀ PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT INSULIN TÁI TỔ HỢP 25

2.2.1 Insulin là gì 25

2.2.2 Cấu tạo insulin 25

2.2.3 Chức năng sinh học của insulin 28

2.2.4 Tại sao cần phải sản xuất insulin tái tổ hợp 30

2.3.1 ðặc ñiểm sinh học của nấm men Pichia pastoris 32

2.3.1.1 Phân loại khoa học của Pichia pastoris 33

2.3.1.2 ðặc ñiểm dinh dưỡng của Pichia pastoris 33

2.3.1.3 ðặc ñiểm sinh hóa – di truyền của Pichia pastoris 33

2.3.1.4 Qúa trình trao ñổi chất của Pichia pastoris 34

2.3.2 So sánh nấm men Pichia pastoris với các hệ thống biểu hiện khác 36

2.3.3 ðặc ñiểm thuận lợi của Pichia pastoris phù hợp với ứng dụng sản xuất insulin người tái tổ hợp theo qui mô công nghiệp 37

2.4 LÊN MEN PICHIA PASTORIS SẢN XUẤT INSULIN TÁI TỔ HỢP 38

2.4.1 Khái quát về kỹ thuật lên men 38

2.4.2 Phương pháp lên men fed-batch 38

2.4.2.1 Khái quát về phương pháp lên men fed-batch 38

2.4.2.2 Ưu ñiểm của phương pháp lên men fed-batch 40

2.4.2.3 Nhược ñiểm của phương pháp lên men fed-batch 40

2.4.2.4 Các nhân tố ñược kiểm soát trong lên men fed-batch 40

2.4.2.5 Các thiết bị cho hệ thống trong lên men fed-batch 47

2.4.3 Lên men Pichia pastoris sử dụng phương pháp lên men fed-batch 48

2.4.3.1 Glycerol batch phase (GBP) 48

2.4.3.2 Glycerol fed-batch phase (GFP) 49

2.4.3.3 Methanol fed-batch phase (MFP) 49

2.4.4 Các nghiên cứu ứng dụng lên men Pichia pastoris 50

PHẦN 3 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 54

3.1.1 Môi trường 54

3.1.1.1 Môi trường YPD (Yeast Extract Peptone Dextrose Medium) 54

3.1.1.2 Môi trường BMGY (Buffered Glycerol-coplex Medium) 54

3.1.2 Chủng vi sinh vật 55

3.1.3 Dụng cụ và thiết bị 56

3.1.3.1 Dụng cụ 56

3.1.3.2 Thiết bị 56

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 56

3.2.1 Sơ ñồ khối qúa trình nghiên cứu 56

3.2.2 Tối ưu hóa ñiều kiện nuôi cấy Pichia pastoris thu sinh khối ở quy mô erlen.57 3.2.3 Khảo sát ñường cong tăng trưởng của chủng ở quy mô erlen 59

3.2.4 Khảo sát khả năng tăng trưởng sinh khối và cảm ứng sản xuất mini-proinsulin ở quy mô fermenter 60

3.2.4.1 Khảo sát khả năng phát triển sinh khối (thay ñổi cách nạp liệu và nồng ñộ glycerol bổ sung) 63

3.2.4.2 Khảo sát khả năng sử dụng cơ chất methanol tổng hợp mini-proinsulin 64 3.2.5 Phương pháp phân tích 64

3.2.5.1 Xác ñịnh hàm lượng sinh khối khô 64

3.2.5.2 Xác ñịnh tốc ñộ tăng trưởng riêng của chủng (µ) 65

3.2.5.3 Xác ñịnh protein tổng bằng phương pháp Bradford 66

3.2.5.4 ðịnh tính mini-proinsulin bằng phương pháp ñiện di và Western blot 67

3.2.5.5 ðịnh lượng mini-proinsulin bằng phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao – HPLC (High Performance Liquid Chromatography) 70

PHẦN 4 KẾT QỦA VÀ BIỆN LUẬN 4.1 TỐI ƯU HÓA ðIỀU KIỆN NUÔI CẤY PICHIA PASTORIS THU SINH KHỐI Ở QUY MÔ ERLEN 74

4.1.1 Thực nghiệm yếu tố từng phần 74

4.1.2 Tối ưu hóa thực nghiệm ñường dốc nhất 74

4.2 KHẢO SÁT ðƯỜNG CONG TĂNG TRƯỞNG CỦA CHỦNG Ở QUY MÔ ERLEN 76

XUẤT MINI-PROINSULIN Ở QUY MÔ FERMENTER 784.3.1 Khảo sát khả năng phát triển sinh khối (thay ñổi cách nạp liệu và nồng ñộ

glycerol bổ sung) 78 4.3.2 Kiểm tra khả năng sử dụng cơ chất methanol tổng hợp mini-proinsulin 83

PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ

A KẾT LUẬN 88

B ðỀ NGHỊ 89

PHẦN 6 TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 91 TÀI LIỆU TIẾNG NƯỚC NGOÀI 91 CÁC TRANG WEB 94

PHỤ LỤC A: CÁC BẢNG KẾT QỦA THÍ NGHIỆM 96 PHỤ LỤC B: CÁC HÌNH KẾT QỦA THÍ NGHIỆM 106

LÝ LỊCH TRÍCH NGANG

2.1 – Cơ chế của bệnh tiểu ñường tuýp 1

2.2 – Cơ chế của bệnh tiểu ñường tuýp 2

2.3 – Công thức cấu tạo của insulin người

2.4 – Công thức cấu tạo của insulin heo

2.5 – Công thức cấu tạo của insulin bò

2.6 – Quá trình biến ñổi thành insulin từ pre-proinsulin

2.7 – Tổng hợp isulin tái tổ hợp từ các gene chuỗi A và B nhân tạo

2.8 – Số ấn bản phát hành về Pichia pastoris từ năm 1982 ñến năm 2002

3.1 – Sơ ñồ khối qúa trình nghiên cứu

3.2 – Sơ ñồ khối qúa trình khảo sát khả năng tăng trưởng sinh khối và cảm ứng sản xuất mini-proinsulin ở quy mô fermenter

4.1 – Sinh khối khô, tốc ñộ tăng trưởng riêng và pH theo thời gian trong khảo sát ñường cong tăng trưởng ở quy mô erlen

4.2 – Lượng sinh khối khô (g/L), tốc ñộ tăng trưởng riêng (1/h) và tổng protein ngoại bào (g/L) trong chế ñộ lên men 1

4.3 – Lượng sinh khối khô (g/L), tốc ñộ tăng trưởng riêng (1/h) và tổng protein ngoại bào (g/L) trong chế ñộ lên men 2

4.4 – Lượng sinh khối khô (g/L), tốc ñộ tăng trưởng riêng (1/h) và tổng protein ngoại bào (g/L) trong chế ñộ lên men 3

4.5 – Tốc ñộ tăng trưởng riêng trong 2 pha ñầu phát triển sinh khối của 3 chế ñộ lên

men ở quy mô fermenter

7.1 – Khuẩn lạc nấm men Pichia pastoris trên môi trường YPD

7.2 – Hệ thống fermenter Bioflo 110 1,3 lít

7.3 – ðồ thị ñường chuẩn OD600nm và nồng ñộ sinh khối khô (g/L)

7.4 – ðồ thị ñường chuẩn OD595nm và nồng ñộ protein tổng (mg/L)

7.5 – Kết quả ñịnh tính mini-proinsulin (ñiện di Native và Western blot)

7.6 – ðồ thị ñường chuẩn nồng ñộ insulin – diện tích ñỉnh

7.7 – Sắc ký ñồ mẫu chuẩn insulin nồng ñộ 4 IU/ml (thể tích tiêm 20µl)

7.8 – Sắc ký ñồ mẫu chuẩn insulin nồng ñộ 8 IU/ml (thể tích tiêm 20µl)

7.9 – Sắc ký ñồ mẫu chuẩn insulin nồng ñộ 12 IU/ml (thể tích tiêm 20µl)

7.10 – Sắc ký ñồ mẫu chuẩn insulin nồng ñộ 16 IU/ml (thể tích tiêm 20µl)

2.1 – Phân loại khoa học của Pichia pastoris

2.2 – Các ứng dụng lên men sản xuất protein từ Pichia pastoris

3.1 – Các thí nghiệm của thực nghiệm yếu tố từng phần với 4 yếu tố

3.2 – Các mức của các yếu tố thí nghiệm tối ưu hóa

3.3 – Các thí nghiệm ñược thiết kế của thực nghiệm yếu tố từng phần

3.4 – Chương trình chạy pha ñộng theo gradient cho HPLC

4.1 – Kết qủa các hệ số hồi quy

4.2 – Kết qủa tối ưu hóa các yếu tố thực nghiệm

4.3 – So sánh khả năng tăng trưởng và cảm ứng tổng hợp mini-proinsulin của 3 chế ñộ lên men ở quy mô fermenter

7.1 – Kết qủa các thí nghiệm thực nghiệm yếu tố từng phần

7.2 – Kết qủa các thí nghiệm tối ưu hóa thực nghiệm ñường dốc nhất

7.3 – Sinh khối khô, tốc ñộ tăng trưởng riêng và pH theo thời gian trong khảo sát ñường cong tăng trưởng ở quy mô erlen

7.4 – Kết qủa hàm lượng sinh khối khô, tốc ñộ tăng trưởng riêng và hàm lượng tổng protein ngoại bào trong chế ñộ lên men 1

7.5 – Kết qủa hàm lượng sinh khối khô, tốc ñộ tăng trưởng riêng và hàm lượng tổng protein ngoại bào trong chế ñộ lên men 2

7.6 – Kết qủa hàm lượng sinh khối khô, tốc ñộ tăng trưởng riêng và hàm lượng tổng protein ngoại bào trong chế ñộ lên men 3

7.7 – Kết qủa chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao – HPLC

PHẦN 1

MỞ ðẦU

1.3 đẶT VẤN đỀ

Bệnh tiểu ựường hay ựái tháo ựường (diabetes) với những biến chứng nguy hiểm có thể dẫn ựến tử vong ựã và ựang gây thiệt hại lớn về kinh tế - xã hội toàn cầu Mỗi năm, nhân Ngày đái tháo ựường thế giới 14-11, người ta lại lựa chọn một chủ ựề hành ựộng nhằm kêu gọi cộng ựồng hãy quan tâm ựến căn bệnh này, có những hiểu biết cần thiết

ựể phòng chống nó; những người bị tiểu ựường hoặc có nguy cơ bị tiểu ựường ựều xứng ựáng ựược hưởng chất lượng giáo dục, phòng ngừa và chăm sóc tốt nhất hiện có Chủ ựề của ngày tiểu ựường thế giới năm 2007 vừa qua là ỘNgày ựái tháo ựường của trẻ em và tuổi vị thành niênỢ với hy vọng mọi người hãy chung tay ngăn chặn căn bệnh nguy hiểm này Theo Hiệp hội đái tháo ựường quốc tế (IDF), ựây là năm ựầu tiên Liên hợp quốc tổ chức ngày ựái tháo ựường trên toàn thế giới với chủ ựề này vì có tới 95% bệnh nhân ựái tháo ựường mắc ở tuýp 2 và ựáng báo ựộng là số lượng bệnh nhân là trẻ

em và vị thành niên ngày càng nhiều [43, 45]

Trong những năm gần ựây, các nhà khoa học và các công ty dược phẩm/công nghệ sinh học trên khắp thế giới ựã và ựang nỗ lực không ngừng ựể ựưa ra những giải pháp hiệu qủa trong việc sản xuất insulin tái tổ hợp từ vi sinh vật theo quy mô công nghiệp nhằm ựáp ứng ựược nhu cầu với số lượng lớn và khắc phục các nhược ựiểm của việc sử dụng insulin thu nhận theo cách truyền thống về giá thành và các tác dụng phụ không mong muốn

Theo số liệu năm 2007, Việt Nam ựã có khoảng 1,3 triệu người mắc bệnh tiểu ựường

và số người mắc bệnh có khả năng tăng gấp ựôi vào năm 2025 [43, 45] Hiện nay, các bệnh nhân tiểu ựường ở Việt Nam ựang ựược ựiều trị bằng nguồn insulin nhập khẩu từ nước ngoài Nhu cầu về insulin ở Việt Nam ựã và ựang thúc ựẩy chúng ta bắt ựầu có những chắnh sách, chiến lược chú trọng ựến việc nghiên cứu ựể trong tương lai gần Việt Nam có thể ứng dụng sản xuất insulin tái tổ hợp theo quy mô công nghiệp Chắnh

vì vậy, một vấn ựề quan trọng, cấp thiết cần ựược quan tâm ựó là việc nghiên cứu công

nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp trên một số ñối tượng vi sinh vật công nghiệp (trong ñề

tài này chúng tôi sử dụng ñối tượng nấm men Pichia pastoris với nhiều ưu ñiểm ñang

nhận ñược nhiều sự quan tâm của giới khoa học) nhằm tiến tới khả năng triển khai ứng dụng sản xuất theo quy mô công nghiệp trong ñiều kiện thực tế ở Việt Nam

Với mục ñích góp một phần nhỏ vào các nghiên cứu nhằm triển khai quy trình lên men sản xuất insulin tái tổ hợp theo quy mô công nghiệp, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề

tài “Thiết lập quy trình công nghệ lên men, tinh chế insulin tái tổ hợp từ tế bào

Pichia”

1.4 CÁC NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

1.2.3 Các nghiên cứu, ứng dụng trên thế giới:

Vào ñầu những năm 1980, hãng Eli Lilly và Genentech Inc của Mỹ ñã ñưa ra quy trình

sản xuất insulin người tái tổ hợp từ Echerichia coli Nhờ công nghệ này mà hiện nay

insulin ñã ñược sản xuất ñại trà với giá thành rẻ hơn nhiều so với trước kia [6]

Các nhà khoa học ñã sử dụng các gene nhân tạo mã hoá cho các chuỗi A và B và ñưa

vào trong tế bào vi khuẩn Echerichia coli ñể tổng hợp insulin tái tổ hợp Các chuỗi A

và B sau ñó sẽ ñược gắn với nhau bởi cầu disulphide trong ống nghiệm [6, 11, 39] Tuy nhiên, phương pháp này gặp nhiều khó khắn Trở ngại lớn nhất là sự hình thành cầu disulfide xảy ra khá ngẫu nhiên nên làm ảnh hưởng ñến cấu trúc và hoạt tính insulin [39]

Trước những khó khăn ñó, các nhà khoa học ñã cải tiến phương pháp bằng cách nhân dòng chuỗi DNA pro-insulin hay những dạng chuyển hóa của nó (bằng cách thay ñổi chiều dài, kích cỡ của peptide C) trong các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm men; nổi bật

vẫn là Echerichia coli, Saccharomyces cerevisiae và Pichia pastoris Cách làm này có

ưu ñiểm hơn là insulin ñược tổng hợp có hoạt tính cao hơn Tuy nhiên, một vấn ñề cần lưu ý ñó là ñoạn peptide C hay những vị trí ñược biến ñổi ñôi chút ở trong peptide C ñặc biệt nhạy cảm bởi enzyme cắt trong tế bào chủ, dễ bị phân hủy bởi protease trước

khi hình thành nên cầu disulfide dẫn ñến kết quả là tạo ra các chuỗi peptide A, B và C riêng biệt Sau này, các nhà khoa học tiếp tục thay chuỗi polypeptide C bằng các peptide nối có kích thước nhỏ hơn (chỉ vài amino acid) và tiền insulin này ñược gọi là mini-proinsulin [39]

Cho ñến ngày nay người ta vẫn thương mại hoá các phương pháp sử dụng các ñối

tượng Echerichia coli và Saccharomyces cerevisiae Gần ñây, các nhà khoa học ñã và

ñang không ngừng quan tâm nghiên cứu nhằm tiến tới thương mại hoá phương pháp sử

dụng một ñối tượng mới hoàn hảo hơn ñó là nấm men Pichia pastoris

Promoter alcohol oxidase trong nấm men Pichia pastoris là một promoter mạnh và

hoạt ñộng rất chặt chẽ, nó sẽ cảm ứng và ñiều khiển việc sản xuất protein ngoại Nhờ

sự ñiều khiển sản xuất rất chặt chẽ nên các biến ñổi sau phiên mã ở Pichia pastoris phù hợp hơn cho việc sử dụng ở người Pichia pastoris phát triển trên môi trường khoáng

chất ñơn giản và không tiết ra protein của bản thân nó nhiều nên dịch nuôi cấy chứa protein ngoại tiết ra sẽ tương ñối tinh khiết giúp cho việc chiết tách và tinh chế nó sẽ

thuận lợi, dễ thực hiện Do các protein ñược sản xuất từ Pichia pastoris có những biến

ñổi sau dịch mã chính xác và tiết ra môi trường nên việc lên men sản xuất protein tái tổ

hợp nói chung và insulin người nói riêng từ Pichia pastoris ñã cung cấp một giải pháp thay thế xuất sắc cho những hệ thống biểu hiện ở Echerichia coli [35]

Hệ thống biểu hiện Pichia pastoris ñã ñược sử dụng thành công ñể sản xuất insulin-like

growth factor 1 (IGF-1) 600 mg/L (Brierley và các cộng sự, 1998), human insulin precursor 500 mg/L (Wang Y và các cộng sự, 2001), mini-proinsulin (B1−30-Lys-Arg-

A1−21) 300 mg/L (José M País-Chanfrau và các cộng sự, 2004), monomeric insulin precursor (MIP) 200 mg/L (Jin-Guo DING và các cộng sự, 2005).v.v

1.2.4 Các nghiên cứu, ứng dụng trong nước:

Các nhà khoa học Việt Nam hiện nay chỉ mới dừng lại ở các nghiên cứu tạo dòng một

số ñối tượng vi sinh vật công nghiệp tạo insulin tái tổ hợp (các ñề tài này tập trung ở

các Viện nghiên cứu và các trường ðại học chẳng hạn như Trung tâm Công nghệ sinh học TP HCM, Trường ðại học Khoa học Tự nhiên TP HCM v.v…) Hiện nay, Trung tâm Công nghệ sinh học TP HCM ñã tiến hành thành công giai ñoạn nghiên cứu tạo

dòng nấm men Pichia pastoris mang gene mã hóa mini-proinsulin trong ñề tài nghiên cứu sản xuất insulin tái tổ hợp từ nấm men Pichia pastoris

Chính vì vậy rất cần có những nghiên cứu ñi sâu vào kỹ thuật lên men, khảo sát qúa trình lên men có kiểm soát sản xuất insulin tái tổ hợp trong fermenter ðề tài chúng tôi ñang thực hiện là giai ñoạn tiếp theo của ñề tài nói trên nhằm nghiên cứu khảo sát quy trình lên men sản xuất mini-proinsulin trong fermenter, tiến tới khả năng triển khai ứng dụng sản xuất theo quy mô công nghiệp

PHẦN 2

TỔNG QUAN

2.5 TỔNG QUAN VỀ BỆNH TIỂU ðƯỜNG

do cả hai nguyên nhân trên Kết quả là số lượng ñường trong máu tăng lên trong khi các tế bào chết vì thiếu năng lượng Qua nhiều năm, mức ñường trong máu cao, ñược gọi là hyperglycemia, gây hư hỏng các dây thần kinh và các mạch máu, mà có thể dẫn ñến các biến chứng như là bệnh tim mạch và ñột qụy, bệnh thận, mù, các vấn ñề về thần kinh, nhiễm trùng lợi, hoại tử v.v…

Tiền tiểu ñường là gì?

Ở tiền tiểu ñường, mức glucose máu cao hơn bình thường nhưng không ñủ cao ñặc trưng cho tiểu ñường Tuy nhiên, nhiều người mắc tiền tiểu ñường tiến triển thành tiểu ñường tuýp 2 trong vòng 10 năm Tiền tiểu ñường cũng tăng nguy cơ bệnh tim và ñột qụy Với sự giảm cân vừa phải và ñiều chỉnh hoạt ñộng thể chất, người mắc tiền tiểu ñường có thể trì hoãn hay ngăn chặn tiến triển thành tiểu ñường tuýp 2

2.1.6 Các dạng tiểu ñường [1, 32, 33, 34, 36, 37, 40, 44]

Bệnh tiểu ñường có hai dạng chính: tuýp 1 và tuýp 2 Gần ñây, nghiên cứu của các nhà khoa học Mỹ cho thấy có thể xuất hiện dạng mới của bệnh tiểu ñường – tuýp 3 [46]

2.1.6.1 Tiểu ñường tuýp 1

Tiểu ñường tuýp 1 (trước kia thường ñược gọi là tiểu ñường phụ thuộc insulin hoặc tiểu ñường khởi phát ở trẻ em) ñặc trưng bởi thiếu sản sinh insulin (do tuyến tụy tiết qúa ít hoặc không tiết insulin), phần lớn xảy ra ở trẻ em và người trẻ tuổi Nếu không cung cấp insulin hằng ngày, tiểu ñường tuýp 1 rất dễ gây tử vong Nhóm này chiếm khoảng 5-10% tổng số bệnh nhân tiểu ñường

Các triệu chứng bao gồm ñi tiểu nhiều, khát nước, luôn ñói, giảm cân, thay ñổi thị lực

và mệt mỏi Những triệu chứng này có thể xảy ra ñột ngột

Cơ chế của bệnh tiểu ñường tuýp 1: thức ăn vào dạ dày sẽ ñược biến ñổi thành glucose, sau ñó glucose này sẽ ñi vào trong máu ðối với người bị bệnh tiểu ñường tuýp 1 thì tuyến tụy tiết rất ít hoặc không tiết insulin ñi vào máu ñể ñiều hòa lượng glucose trong máu dẫn ñến lượng glucose trong máu tăng cao

Hình 2.1 – Cơ chế của bệnh tiểu ñường tuýp 1

2.1.6.2 Tiểu đường tuýp 2

Tiểu đường tuýp 2 (tên cũ là tiểu đường khơng phụ thuộc insulin hoặc tiểu đường khởi

phát ở người lớn) là do cơ thể khơng sử dụng hiệu quả insulin, thường gặp ở lứa tuổi trên 40 nhưng gần đây xuất hiện ngày càng nhiều ở lứa tuổi 30, thậm chí cả lứa tuổi thanh, thiếu niên Tiểu đường tuýp 2 chiếm khoảng 90-95% số trường hợp bị bệnh tiểu đường trên tồn thế giới, và phần lớn là do thừa cân và ít hoạt động thể chất

Các triệu chứng cĩ thể tương tự như triệu chứng của tiểu đường tuýp 1, nhưng thường

ít rõ ràng hơn Kết quả là, cĩ thể vài năm sau khi khởi phát, bệnh mới được chẩn đốn, khi đĩ các biến chứng đã xảy ra

Cơ chế của bệnh tiểu đường tuýp 2: thức ăn vào dạ dày sẽ được biến đổi thành glucose, sau đĩ glucose này sẽ đi vào trong máu ðối với người bị bệnh tiểu đường tuýp 2 thì tuyến tụy tiết insulin đủ để cĩ thể điều hịa lượng glucose trong máu tuy nhiên lượng insulin này khơng được sử dụng hiệu qủa dẫn đến việc cơ thể khơng sử dụng hiệu qủa glucose và làm cho glucose trong máu tăng cao

Hình 2.2 – Cơ chế của bệnh tiểu ñường tuýp 2

2.1.6.3 Xuất hiện bệnh tiểu ñường tuýp 3 [46]

Insulin thông thường ñược tiết ra từ tuyến tụy Sự cố liên quan ñến chất này gây ra bệnh tiểu ñường tuýp 1, 2 Nhưng mới ñây, các nhà khoa học Mỹ ñã phát hiện thấy bộ não cũng tiết ra insulin ðây có thể là dạng mới của bệnh tiểu ñường - tuýp 3

Bệnh tiểu ñường tuýp 1 và 2 xảy ra khi cơ thể không còn khả năng sản xuất hoặc sử dụng hiệu quả insulin từ tuyến tụy Trong khi ñó, tiểu ñường tuýp 3 lại không ảnh

hưởng tới lượng ñường huyết Nó liên quan ñến sự giảm sút lượng insulin não, tác ñộng ñến chức năng của bộ não, và gây bệnh gần giống với căn bệnh Alzheimer

Các nhà khoa học từng cho rằng, người bị tiểu ñường rất dễ mắc bệnh Alzheimer - nguy cơ tăng lên gần 65% Người ta cũng phát hiện ra nhiều bệnh nhân tiểu ñường tuýp 2 có tích tụ một loại protein trong tuyến tụy giống như loại tập trung trong mô não của bệnh nhân Alzheimer

Tiến sĩ Suzanne de la Monte và cộng sự ñến từ Trường y Brown ñã tìm hiểu mối liên quan giữa 2 căn bệnh trên bằng cách phân tích mô não của bệnh nhân Alzheimer ñã tử vong và của chuột Họ nhận thấy bộ não thực sự có tiết ra insulin và những protein liên quan ðặc biệt, phần lớn bệnh nhân Alzheimer ñều có lượng insulin và các protein này rất thấp

Theo giải thích của Suzanne thì insulin, các cảm thụ thể và những yếu tố tăng trưởng liên quan trong bộ não ñóng vai trò sống còn ñối với sự tồn tại của các tế bào não Nếu chúng không ñược duy trì ở mức ñộ bình thường, tế bào não sẽ chết

"Phát hiện ñáng chú ý là insulin không chỉ ñược tiết ra từ tuyến tụy mà còn ở cả não

bộ Nó không liên quan ñến bệnh tiểu ñường tuýp 1 và tuýp 2 nhưng lại phản ánh một căn bệnh khác phức tạp hơn, bắt nguồn từ hệ thần kinh trung ương", Suzanne nhận ñịnh

Phát hiện mới cũng cho thấy việc ñiều trị tiểu ñường tuýp 1 và 2 có thể không liên quan ñến bệnh Alzheimer ðể chữa trị căn bệnh thần kinh này phải cần ñến các dược liệu nhắm vào hoạt ñộng của insulin trong não

2.1.7 Tác hại của bệnh tiểu ñường [36]

Bệnh tiểu ñường là một trong những căn bệnh không lây nhiễm nhưng nó gây ra nhiều biến chứng nguy hiểm

Tiểu ñường dễ gây các biến chứng bao gồm biến chứng cấp tính như: hạ ñường huyết; hôn mê do tăng ñường máu, hay hôn mê do tăng áp lực thẩm thấu Những biến chứng này xảy ra ñột ngột, diễn biến nhanh, triệu chứng lâm sàng ña dạng, thường ñe dọa ñến tính mạng của người bệnh nếu không ñược cấp cứu kịp thời

Biến chứng mãn tính như tổn thương các mạch máu lớn, gây bệnh tim mạch, hoại tử chi, tổn thương mạch máu nhỏ gây mù lòa, bệnh lý cầu thận, hủy hoại các dây thần kinh, giảm khả năng chống lại các bệnh nhiễm trùng ðây là những biến chứng xảy ra liên tục và âm ỉ nên không dễ nhận ra, thường khi phát hiện ñựơc thì ñã ở giai ñoạn muộn

Bệnh võng mạc tiểu ñường là nguyên nhân quan trọng gây mù, và xảy ra do hậu quả của tổn thương tích luỹ trong thời gian dài ở các mạch máu nhỏ tại võng mạc Sau 15 năm bị tiểu ñường, xấp xỉ 2% số bệnh nhân tiểu ñường bị mù, và khoảng 10% bị suy giảm thị lực nặng

Bệnh thần kinh tiểu ñường là tổn thương dây thần kinh do bệnh tiểu ñường, và xảy ra

ở tới 50% số người bị tiểu ñường Mặc dù có nhiều vấn ñề khác có thể xảy ra do hậu quả của bệnh thần kinh tiểu ñường, song các triệu chứng hay gặp nhất là cảm giác kiến

bò, ñau, tê bì hoặc yếu ở bàn chân và bàn tay

Kết hợp với giảm lưu thông máu, bệnh thần kinh ở chân làm tăng khả năng bị loét bàn chân và cuối cùng là cắt cụt chi

Tiểu ñường là một trong những nguyên nhân hàng ñầu gây suy thận 10-20% số người

bị tiểu ñường tử vong vì suy thận

Tiểu ñường làm tăng nguy cơ bị bệnh tim và ñột qụy 50% số người bị tiểu ñường tử

vong vì bệnh tim mạch (bệnh tim và ñột qụy nguyên phát)

Nguy cơ tử vong nói chung ở bệnh nhân tiểu ñường cao ít nhất gấp ñôi so với người không bị tiểu ñường

2.1.8 Tình hình bệnh tiểu ñường trên thế giới và ở Việt Nam

Trên thế giới, năm 2000 ñã có khoảng 157,3 triệu người mắc bệnh tiểu ñường; dự tính ñến năm 2010, con số này có thể lên ñến 215,6 triệu người [44]

Trong năm 2005, tổ chức y tế thế giới – WHO ước tính trên thế giới có khoảng 1,1 triệu người chết do tiểu ñường Gần 80% số trường hợp tử vong do tiểu ñường xảy ra ở các nước có thu nhập trung bình và thấp Gần ½ số trường hợp tử vong do tiểu ñường xảy ra ở người < 70 tuổi, 55% số trường hợp tử vong là phụ nữ [36]

Ở Việt Nam, tính ñến năm 2007 ñã có khoảng 1,3 triệu người mắc bệnh tiểu ñường và

số người mắc bệnh có khả năng tăng gấp ñôi vào năm 2025 [43, 45]

2.6 TỔNG QUAN VỀ INSULIN VÀ PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT INSULIN TÁI TỔ HỢP

2.2.6 Insulin là gì?

Insulin là hormone ñược tổng hợp bởi tế bào beta trong tuyến tụy trong cơ thể người và các loài ñộng vật có vú khác, có chức năng ñiều khiển lượng ñường trong máu (hormone ñồng hoá giúp làm giảm ñường huyết) Insulin ñược sử dụng trong ñiều trị bệnh tiểu ñường [8, 37, 40]

2.2.7 Cấu tạo insulin

Insulin là một phức hợp protein nhỏ, gồm hai chuỗi polypeptide (51 amino acid): chuỗi

21 amino acid (chuỗi A) và chuỗi 30 amino acid (chuỗi B) ñược nối với nhau bằng cầu disulfide ở vị trí A7B7 và A20B19 và một cầu disufide nội tại trong chuỗi peptide A tại vị trí A6A11 [19] Amino acid ở ñầu –NH2 của chuỗi A là glycine (GlyA1) và amino acid ở ñầu –NH2 của chuỗi B là phenylalanine (PheB1); còn ở ñầu C ở chuỗi B là lysine (LysB29) [17]

Cấu trúc insulin có sự khác nhau nhỏ giữa các loài ñộng vật, và khả năng ñiều khiển sự chuyển hoá ñường cũng khác nhau giữa mỗi người Insulin của heo về cơ bản gần

giống với insulin người, công thức cấu tạo của phân tử insulin heo khác insulin người một amino acid [8, 25, 26, 27, 28] Mặc dù chuỗi protein insulin giữa các loài có khác nhau một vài ñặc ñiểm nhưng một số ñoạn của phân tử lại có tính bảo tồn cao như các ñoạn có chứa vị trí của 3 cầu disulfide

Công thức hóa học và công thức cấu tạo của insulin [25, 26, 28]:

Insulin người: C257H383N65O77S6

Hình 2.3 – Công thức cấu tạo của insulin người

Insulin heo: C256H381N65O76S6

Hình 2.4 – Công thức cấu tạo của insulin heo

Insulin bò: C254H377N65O75S6

Hình 2.5 – Công thức cấu tạo của insulin bò

Quy ñổi ñơn vị [25, 26, 28]: Một ñơn vị (International unit – IU) insulin tương ñương 0,0347mg insulin người, tương ñương 0,0345mg insulin heo hoặc tương ñương 0,0342mg insulin bò

Ở người, các chuỗi này ñược tổng hợp thành pre-proinsulin (một cấu trúc trước tiền insulin), bao gồm hai ñoạn A, B nối với nhau bởi một ñoạn thứ ba là ñoạn C (33 amino acid) và phía trước có thêm một trình tự tín hiệu (signal sequence) Trình tự này ñược tách ra sau quá trình dịch mã (phần còn lại bao gồm ba ñoạn A, B và C ñược gọi là proinsulin hay tiền insulin) và ñoạn C cũng ñược tách ra, kết qủa là hai ñoạn A và B ñược gắn với nhau bằng hai cầu disulfide

Hình 2.6 – Quá trình biến ñổi thành insulin từ pre-proinsulin

2.2.8 Chức năng sinh học của insulin

Insulin là một trong những hormone sinh học ựiều hòa nồng ựộ glucose trong máu Chức năng cân bằng nội môi và năng lượng sinh học này cực kỳ quan trọng bởi vì glucose là nguồn nguyên liệu chắnh của hô hấp tế bào và là nguồn khung C quyết ựịnh cho tổng hợp chất hữu cơ [7]

Khi hàm lượng glucose trong máu cao, insulin ựóng vai trò là chìa khóa cho phép glucose từ máu qua màng tế bào chất vào trong tế bào đồng thời, insulin xúc tác quá

trình chuyển hóa glucose trong gan thành các chất dự trữ glycogen và chất béo Khi

hàm lượng glucose trong máu thấp, insulin giữ vai trò chuyển hóa glycogen dự trữ trong gan thành glucose ựưa vào máu, không cho glucose từ máu chuyển vào tế bào [2]

Insulin tác dụng lên tế bào ựắch theo 2 cơ chế: cơ chế sinh hóa và cơ chế thụ thể

Cơ chế sinh hóa: insulin hoạt hóa hexokinase, do ựó làm tăng tắnh thấm glucose và tăng sự chuyển glucose thành G6P Cầu nối S-S của chuỗi A hoạt hóa nhóm SH màng

tế bào làm tăng tắnh thấm glucose qua màng tế bào Insulin kắch hoạt G6P chuyển thành glycogen Insulin ức chế G6phosphatase làm hạn chế biến G6P thành glucose

Cơ chế thụ thể: Thụ thể là sự sắp xếp 3 chiều trong không gian của nhóm hóa học lập thể gắn trên một ựại phân tử của màng tế bào ựắch Như vậy, thụ thể có tắnh ựặc hiệu Thụ thể insulin gồm tiểu ựơn vị α là nơi gắn insulin và tiểu ựơn vị β là protein xuyên màng với hoạt tắnh kinase có tác dụng kắch thắch sự chuyên chở glucose vào tế bào đáp ứng sinh học của insulin khởi ựầu khi hormone này gắn với thụ thể ựặc hiệu trên màng huyết tương của tế bào ựắch Sự gắn này gây phân ly màng tế bào tạo thông tin thứ hai hay chất trung gian có bản chất là oligoglycopeptide Chất trung gian tác dụng kắch hoạt vận chuyển glucose và tác dụng trên quá trình chuyển hóa nội bào bằng cách ựiều hòa các enzym hòa tan, enzym bào tương, enzym ty lập thểẦ tạo các tác dụng sinh lý nêu trên [3]

2.2.9 Tại sao cần phải sản xuất insulin tái tổ hợp

Trước ñây, insulin thường ñược thu nhận theo cách truyền thống là từ tuyến tụy của heo và bò khi mổ lấy thịt Insulin ñộng vật thì nhìn chung khá phù hợp, tuy nhiên có vài vấn ñề có thể nảy sinh khi sử dụng ñể ñiều trị bệnh tiểu ñường Một trong những vấn ñề ñó là sự khác nhau về cơ bản giữa protein người và ñộng vật có thể dẫn ñến các tác dụng phụ không mong muốn ở một vài bệnh nhân Một vấn ñề khác ñó là sự khó khăn trong qúa trình tinh chế, và khả năng những mối nguy hại không thể ñược loại bỏ hoàn toàn Hơn nữa, phương án này sẽ ñưa ñến vấn ñề giá thành sản phẩm cao và không ñáp ứng ñủ ñược về số lượng

Sản xuất insulin người tái tái tổ hợp từ vi sinh vật (theo quy mô công nghiệp) chính là hướng ñể khắc phục các vấn ñề trên Hơn nữa, kích thước của phân tử insulin nhỏ nên khá thuận lợi cho việc sản xuất nó bằng kỹ thuật DNA tái tổ hợp

2.2.10 Phương pháp sản xuất insulin tái tổ hợp

Các nhà khoa học ñã tiến hành thực hiện một vài chiến lược ñể tạo insulin tái tổ hợp Một trong những phương pháp ñầu tiên ñược thực hiện ñó là sử dụng các gene nhân tạo

mã hoá cho các chuỗi A và B và ñưa vào trong tế bào vi khuẩn Echerichia coli ñể tổng hợp insulin tái tổ hợp [6, 11, 39]

Hình 2.7 – Tổng hợp isulin tái tổ hợp từ các gene chuỗi A và B nhân tạo

Các gene mã hoá cho các chuỗi A và B của insulin ñã ñược tổng hợp vào năm 1978

Trong mỗi trường hợp, gene nhân tạo ñược nối với khung ñọc LacZ’ (LacZ’ reading

frame) trong vector pBR322 Vì thế, các gene insulin ñược ñiều khiển bởi promoter

lac, và ñược biểu hiện thành những protein liên kết, bao gồm một số các amino acid ñầu tiên của β-galactosidase kế tiếp là polypeptide A hoặc B Mỗi gene ñược thiết kế sao cho β-galactosidase và ñoạn insulin cách nhau bởi methionine, vì thế các polypeptide của insulin có thể tách ra khỏi β-galactosidase bằng cách xử lý với

cyanogene bromide Các chuỗi A và B được thu nhận và sau đĩ sẽ được gắn với nhau bởi cầu disulphide trong ống nghiệm [6, 11, 39]

Eli Lilly sản xuất insulin tổng hợp đầu tiên, humulin vào năm 1982 Sau đĩ Genentech phát triển kỹ thuật của Eli Lilly đã sử dụng Novo Nordisk cũng phát triển insulin kỹ thuật gene một cách độc lập Nhờ cơng nghệ gene mà hiện nay insulin đã được sản xuất đại trà với giá thành rẻ hơn nhiều so với trước kia [8]

Thị trường insulin trên thế giới chủ yếu do 3 tập đồn dược phẩm sản xuất: Novo Nordish (ðan Mạch - chiếm 45% thị phần), Eli Lilly (Mỹ), Aventis-Hoechst (ðức) Lúc đầu, chiết tách insulin từ tuyến tụy của bị và heo Ở chế phẩm dùng cho người: alanine ở vị trí 30 mạch B của insulin heo được thay thế bằng threonine đúng như insulin người Ngày nay, chủ yếu sản xuất insulin tái tổ hợp với nhiều cơng thức khác nhau [8]:

Insulin của Novo Nordish được tạo nhờ tế bào nấm men, gồm 2 họ: họ Novolin (insulin người) cĩ 8 cơng thức và họ Novolog (mạch B P28D) cĩ 2 cơng thức

Eli Lilly sử dụng tế bào chủ Echerichia coli, insulin cũng gồm 2 họ: họ Humulin

(insulin người) cĩ 5 cơng thức và họ Humalog (mạch B P28K/K29P) cĩ 2 cơng thức Aventis-Hoechst chỉ cĩ một cơng thức insulin (mạch A N21G) dùng tiêm dưới da và loại để xơng hơi qua đường hơ hấp

2.7. TỔNG QUAN VỀ NẤM MEN PICHIA PASTORIS

2.3.4. ðặc điểm sinh học của nấm men Pichia pastoris

carbon chính; Tuy nhiên, nồng độ methanol trong mơi trường khơng được qúa nhiều và phải được điều khiển chặt chẽ để tránh tổn hại, gây độc đối với tế bào nấm men), được

sử dụng rộng rãi làm hệ thống biểu hiện protein sử dụng kỹ thuật DNA tái tổ hợp [22,

38, 41, 42]

2.3.4.1. Phân loại khoa học của Pichia pastoris [38]

Bảng 2.1 – Phân loại khoa học của Pichia pastoris

2.3.4.2. ðặc ñiểm dinh dưỡng của Pichia pastoris

dụng methanol Trong ñó, glycerol là nguồn carbon ưa thích nhất và với một lượng nhỏ methanol cho vào sẽ kích thích khả năng sinh tổng hợp protein Nguồn nitrogen sử dụng là nguồn hữu cơ và vô cơ như pepton, casein, dịch chiết thịt (meat extract), dịch chiết khoai tây (potato extract), dịch chiết nấm men (yeast extract), các muối amonium, muối nitrate,… Ngoài ra nó còn sử dụng các chất khoáng như Mn, Zn, P, S, và các vitamin như vitamin B12,… Pichia pastoris là vi sinh vật hiếu khí, cần nguồn oxygen

ñể phát triển [12]

2.3.4.3. ðặc ñiểm sinh hóa – di truyền của Pichia pastoris

methanol như là nguồn carbon trong môi trường không có glucose bằng cách oxy hoá

nó thành formandehyde và hydrogen peroxide nhờ sự xúc tác của enzyme alcohol oxydase Sự biểu hiện của gene này theo một nguyên tắc chặt chẽ: khi nấm men phát triển trên glucose hoặc ethanol thì enzyme này không xuất hiện trong tế bào; tuy nhiên,

khi phát triển trên methanol thì enzyme này có thể chiếm tới 35% tổng số protein tế bào Có 2 gene alcohol oxydase: AOX1 và AOX2, các vùng mã hoá protein của các gene này lớn tương ñương nhau, các promoter thì lại phân phối rất ít tương ñồng nhau Khi nấm men phát triển trên glycerol thì không có mRNA của cả 2 gene xuất hiện Promoter của AOX2 có một vùng ức chế ñể ngăn chặn sự biểu hiện gene và một vùng hoạt ñộng ñể thúc ñẩy sự biểu hiện gene Promoter của AOX1 cũng có cơ cấu tương tự Các enzyme liên quan ñến sự chuyển hoá methanol nằm trong peroxisome Sự gia tăng nhanh peroxisome là sự ñáp ứng lại các ñiều kiện môi trường Khi tế bào phát triển trên glucose thì có rất ít peroxisome hiện diện Khi phát triển trên methanol, peroxisome có thể hiện diện chiếm tới 80% của tổng thể tích tế bào Alcohol oxidase promoter là một promoter mạnh và hoạt ñộng rất chặt chẽ, nó sẽ cảm ứng và ñiều khiển việc sản xuất protein ngoại [22, 35]

Có 3 dòng cho Pichia pastoris có khả năng sử dụng methanol khác nhau: Mut+ có chứa 2 gene AOX1 và AOX2 nên khả năng sử dụng methanol tốt, Muts sử dụng methanol chậm do gene AOX1 bị bất hoạt và Mut- mất cả 2 gene AOX1 và AOX2 nên

không thể sử dụng methanol như là nguồn C [20, 22, 31]

2.3.4.4. Qúa trình trao ñổi chất của Pichia pastoris

Qúa trình chuyển hóa glycerol

Nấm men Pichia pastoris sử dụng glycerol trong ñiều kiện hiếu khí Con ñường trao

ñổi chất liên quan ñến sự khuếch tán thụ ñộng qua màng plasma, phosphoryl hóa bởi glycerol kinase và oxy hóa bởi glycerol phosphate ubiquinone oxireductase Glycerol

bị thủy phân sau khi nó ñược chuyển hóa thành glyceraldehyde-3-phosphate [31] Trước hết, glycerol bị phosphoryl hóa tạo thành glycerol-3-phosphate (G3P) bởi glycerol kinase Sau ñó, qúa trình glucolysis bắt ñầu bằng phản ứng oxy hóa G3P bởi glycerol-3-phosphate dehydreogenase tạo thành dihydroxyacetone phosphate và kết

enzyme pyruvate dehydrogenase Tiếp theo, acetyl-CoA sẽ ñi vào chu trình TCA, tại ñây nhiều sản phẩm chuyển hóa sẽ ñược hình thành và ñược dùng cho sinh tổng hợp các thành phần tế bào như amino acid, nucleic acid Khi ñó phần lớn năng lượng dạng ATP, NADH ñược hình thành, cần thiết cho sự tăng trưởng của tế bào và duy trì hiệu qủa chu trình TCA Trong khi nuôi cấy, nếu qúa trình hô hấp bị giới hạn (không cung cấp ñủ oxygen) thì ethanol có thể ñược hình thành từ pyruvate Pyruvate ñược chuyển hóa thành acetaldehyde bởi enzyme pyruvate decarboxylase và sau ñó bị oxy hóa thành ethanol nhờ enzyme alcohol dehydrogenase Ethanol cũng có thể ñược sử dụng như là một cơ chất nếu giới hạn về oxygen ở trên ñược khắc phục Trong trường hợp này, ethanol sẽ bị oxy hóa thành acetaldehyde nhờ enzyme alcohol dehydrogenase, sau ñó thành acetate dưới tác dụng của acetaldehyde dehydrogenase, và cuối cùng sẽ ñược chuyển hóa thành acetyl-CoA bởi acetyl-CoA synthase [13]

Qúa trình chuyển hóa methanol

Qúa trình chuyển hóa methanol trong tế bào của nấm men Pichia pastoris diễn ra ở

peroxisome và tế bào chất Giai ñoạn ñầu xảy ra trong peroxisome, methanol sẽ bị oxy hóa thành formaldehyde và hydrogen peroxide, nhờ sự xúc tác của enzyme alcolhol oxydase, oxygen ñóng vai trò như là chất nhận ñiện tử Sau ñó, peroxide bị oxy hóa thành nước và oxygen bởi peroxisomal catalase Formaldehyde tiếp tục ñi vào trong tế bào chất và kết hợp với glutathione tạo thành một phức GS-CH2OH, phức hợp nà bị oxy hóa thành CO2 qua hai phản ứng: trước hết, formandehyde dehydrogenase xúc tác chuyển hóa GS-CH2OH thành formate; sau ñó, formate ñược chuyển hóa thành CO2

nhờ enzyme formate dehydrogenase [31]

Trong con ñường ñồng hóa, formaldehyde trong thể peroxisome phản ứng với xylulose-5-phosphate Phản ứng này ñược xúc tác bởi dihydroxyacetone synthase tạo thành hai hợp chất C3 là dihydroxyacetone và glyceraldehyde-3- phosphate Những hợp chất này thực hiện phản ứng trong tế bào chất và cuối cùng xylulose-5-phosphate

ựược thu hồi lại Và một phần ba glyceraldehyde-3- phosphate hình thành ựược dùng cho những phản ứng biến dưỡng và tổng hợp sinh khối [31]

2.3.5. So sánh nấm men Pichia pastoris với các hệ thống biểu hiện khác [16, 35]Việc sản xuất một protein chức năng có liên quan chặt chẽ ựến cơ cấu tế bào của sinh vật sản xuất protein

nhiều các ứng dụng sản xuất protein tái tổ hợp (chẳng hạn nó cũng ựã ựược lựa chọn

trong việc lần ựầu tiên sản xuất insulin người tái tổ hợp) bởi vì Echerichia coli ựã ựược

nghiên cứu rất kỹ, bản ựồ bộ gene của nó hoàn toàn ựược biết rõ và sự ựơn giản của sinh vật này giúp dễ dàng thao tác và ắt tốn kém chi phắ khi làm việc với nó đó là những ựặc ựiểm như nguồn nguyên liệu ựơn giản và phát triển không ựòi hỏi ựiều kiện phức tạp Tốc ựộ phát triển nhanh, tiết protein ra môi trường giúp thuận lợi trong việc thu nhận Những plasmid trong tế bào chất có thể dễ dàng tách ra, thao tác gene và ựưa

trở lại là những lợi thế rất lớn của Echerichia coli

Tuy nhiên, Echerichia coli là một prokaryote và thiếu các cơ quan nội bào chẳng hạn

như mạng lưới nội chất và bộ máy golgi như trong tế bào eukaryote, có chức năng biến ựổi các protein sau khi ựược sản xuất Nhiều protein của eukaryote có thể sản xuất từ

protein cuối cùng bởi những biến ựổi sau dịch mã không diễn ra Mặt khác, Echerichia

sản xuất protein ngoại

Từ những ựiểm không thuận lợi khi sử dụng Echerichia coli ựể sản xuất protein

eukaryote, các sinh vật khác ựã và ựang ựược nghiên cứu nhằm thay thế một cách phù hợp Chắnh vì vậy, các nhà khoa học ngày nay quay trở về các hệ thống biểu hiện của nấm men eukaryote và ựộng vật có vú

Nấm men Saccharomyces cerevisiae ñã ñược quan tâm vì nó khá quen thuộc với các

nhà sinh học phân tử Nhiều protein ngoại ñã ñược sản xuất thành công, tuy nhiên nó

ñã thể hiện một số hạn chế khi ñược sử dụng ñể sản xuất một vài protein eukaryote ñó

là ñem lại hiệu suất sản phẩm thấp Các sản phẩm protein thường gây trở ngại cho sự phát triển của nó, mặt khác một số protein không tiết ra môi trường gây khó khăn trong tinh sạch và hơn nữa là làm giảm hiệu suất sản phẩm

Chính vì vậy, Pichia pastoris một trong những loài ñã ñược lựa chọn và quan tâm từ

khi promoter alcohol oxidase ñược phân lập và tạo dòng Thuận lợi ñầu tiên là nó có

thể phát triển trong ñiều kiện tương tự Saccharomyces cerevisiae mà người ta ñã quen thuộc Hơn nữa, Pichia pastoris có một propmotor mạnh (promoter alcohol oxidase) và

có thể dùng cho sản xuất protein Mặt khác, những biến ñổi sau dịch mã ở Pichia

ñiểm quan trọng nữa ñó là việc tinh sạch protein ngoại trở nên dễ dàng hơn nhờ một

thực tế là Pichia pastoris không tiết ra nhiều protein của bản thân nó

2.3.6. ðặc ñiểm thuận lợi của Pichia pastoris phù hợp với ứng dụng sản xuất

insulin người tái tổ hợp theo qui mô công nghiệp

khuẩn cũng như vấn ñề nhiễm virus trong nuôi cấy tế bào ñộng vật Hơn nữa, Pichia

methanol như là nguồn carbon trong môi trường không có glucose bằng cách oxy hoá

nó thành formandehyde và hydrogen peroxide nhờ sự xúc tác của enzyme alcohol oxydase [19, 35]

Alcohol oxidase promoter là một promoter mạnh và hoạt ñộng rất chặt chẽ, nó sẽ cảm ứng và ñiều khiển việc sản xuất protein ngoại Nhờ sự ñiều khiển sản xuất rất chặt chẽ

nên các biến ñổi sau phiên mã ở Pichia pastoris phù hợp hơn cho việc sử dụng ở người Pichia pastoris phát triển trên môi trường khoáng chất ñơn giản và không tiết ra

protein của bản thân nó nhiều nên dịch nuôi cấy chứa protein ngoại tiết ra sẽ tương ñối tinh khiết giúp cho việc chiết tách và tinh chế nó sẽ thuận lợi, dễ thực hiện Do các

protein ñược sản xuất từ Pichia pastoris có những biến ñổi sau dịch mã chính xác và

tiết ra môi trường nên việc lên men sản xuất protein tái tổ hợp nói chung và insulin

người nói riêng từ Pichia pastoris ñã cung cấp một giải pháp thay thế xuất sắc cho những hệ thống biểu hiện ở Echerichia coli [35]

2.8. LÊN MEN PICHIA PASTORIS SẢN XUẤT INSULIN TÁI TỔ HỢP

2.4.5 Khái quát về kỹ thuật lên men [22, 47]

Trong kỹ thuật lên men, có ba phương pháp lên men cơ bản: lên men theo mẻ, lên men fed-batch và lên men liên tục Trong ñó, các phương pháp lên men theo mẻ và fed-batch thường ñược sử dụng phổ biến trong các ứng dụng lên men công nghiệp

Trong phương pháp lên men theo mẻ, toàn bộ môi trường nuôi cấy và giống ñược nạp một lần trước khi lên men (giống ñược bổ sung vào một fermenter chứa môi trường nuôi cấy) Qúa trình lên men diễn ra cho ñến khi một thành phần dinh dưỡng trong môi trường ñược sử dụng hết; sau ñó dừng qúa trình lên men và thu nhận sản phẩm

Trong phương pháp lên men fed-batch, ban ñầu nuôi cấy theo mẻ, sau ñó nguyên liệu (cơ chất giới hạn) ñược nạp vào nồi lên men trong qúa trình nuôi cấy Sau một thời gian nuôi cấy nhất ñịnh, dịch lên men ñược chiết ra trong qúa trình nuôi cấy hoặc sản phẩm ñược thu nhận một lần vào cuối qúa trình lên men

Trong phương pháp lên men liên tục, môi trường ñược bổ sung vào liên tục và sản phẩm lên men ñược thu nhận liên tục

2.4.6 Phương pháp lên men fed-batch

2.4.6.1 Khái quát về phương pháp lên men fed-batch [21, 22, 47]

Lên men fed-batch là dạng trung gian giữa lên men theo mẻ và lên men liên tục Ban ñầu nuôi cấy theo mẻ, sau ñó nguyên liệu (cơ chất giới hạn) ñược nạp vào nồi lên men trong qúa trình nuôi cấy (nhằm tăng cường hiệu suất sản xuất và hạn chế sự hình thành các sản phẩm phụ) Sau một thời gian nuôi cấy nhất ñịnh, dịch lên men ñược chiết ra trong qúa trình nuôi cấy (nhằm tận dụng tối ña thể tích nồi lên men) hoặc thu nhận một lần vào cuối qúa trình lên men

Nuôi cấy fed-batch ñược thiết kế như nuôi cấy theo mẻ khi vừa bắt ñầu lên men, sau

ñó, môi trường ñược ñưa vào là một trong những dạng môi trường sau [21]:

(i) Sử dụng cùng một loại môi trường với môi trường nuôi cấy theo mẻ

(ii) Dùng dung dịch cơ chất giới hạn có nồng ñộ giống như nồng ñộ trong môi

trường ban ñầu ñược thêm vào

(iii) Một dung dịch có nồng ñộ của cơ chất giới hạn cao ñược thêm vào với tốc ñộ

thấp hơn so với hai trường hợp trên

(iv) Dung dịch cô ñặc của cơ chất giới hạn ñược thêm vào với tốc ñộ thấp hơn so với

ba trường hợp trên

Trong các dạng môi trường trên chỉ có môi trường (iv) là thể tích môi trường tăng không ñáng kể, còn các trường hợp còn lại thì thể tích môi trường ñều tăng Dựa vào cách thức ñưa môi trường vào mà người ta phân biệt ra ba dạng nuôi cấy fed-batch: nuôi cấy fed-bacth thể tích thay ñổi ñối với hai cách thức (i) và (ii); nuôi cấy fed-batch với thể tích môi trường cố ñịnh khi sử dụng cách (iv) Và dạng trung gian giữa hai dạng trên khi dùng ñưa môi trường vào fermenter theo cách (iii) [21]

Nuôi cấy fed-batch có một số thuận lợi như nồng ñộ cơ chất còn lại có thể duy trì ở mức thấp, tránh ñược những tác ñộng bất lợi của thành phần môi trường trong hệ thống

và do ñó sẽ loại bỏ ñược các yếu tố bất lợi của việc sử dụng nhanh nguồn carbon và duy trì tình trạng nuôi cấy trong khi vẫn cung cấp oxygen [21]

2.4.6.2 Ưu ñiểm của phương pháp lên men fed-batch [22]

Phương pháp lên men fed-batch có nhiều ưu ñiểm hơn phương pháp lên men theo mẻ

và phương pháp lên men liên tục

Lên men fed-batch có nhiều ưu ñiểm hơn lên men theo mẻ do nó cho phép sử dụng ñược nhiều các cơ chất mà khi ở nồng ñộ cao sẽ gây ñộc ñối với chủng nuôi cấy Bên cạnh ñó, nó còn cho phép tăng sự phát triển sinh khối và hạn chế sự hình thành các sản phẩm phụ, khắc phục ñược các vấn ñề về ức chế sản xuất các sản phẩm thứ cấp

Lên men fed-batch giúp giảm ñược các vấn ñề về nhiễm, ñột biến và sự không ổn ñịnh của plasmid có thể diễn ra trong phương pháp lên men liên tục do vi sinh vật phát triển trong thời gian dài ở trạng thái ổn ñịnh, dịch lên men ñược thu nhận liên tục cùng tốc

ñộ với môi trường bổ sung liên tục

2.4.6.3 Nhược ñiểm của phương pháp lên men fed-batch [22]

Nhược ñiểm duy nhất của của phương pháp lên men fed-batch ñó là so với phương pháp lên men theo mẻ, nó cần các thiết bị ño ñạc ñắt tiền cho việc kiểm soát các phản ứng kìm hãm ngược (feed-back control) và ñòi hỏi nhiều kỹ năng vận hành, ñiều khiển qúa trình (Brown, 1990)

2.4.6.4 Các nhân tố ñược kiểm soát trong lên men fed-batch [47]

Khử trùng trong lên men nhằm loại bỏ các yếu tố gây tạp nhiễm sinh học (như nấm mốc, nấm men, vi khuẩn, phage) giúp nâng cao hiệu suất lên men

Yêu cầu khi khử trùng ñó là loại bỏ ñược tác nhân gây nhiễm sinh học có thể ảnh hưởng lên qúa trình lên men Tác nhân ñó có thể bao gồm cả tế bào sinh dưỡng hoặc bào tử Qúa trình khử trùng không ñược gây nên những biến ñổ ñáng kể về chất lượng môi trường, không tạo ra các chất ñộc hại có thể gây kìm hãm hay ức chế sự phát triển, hoặc làm suy giảm hoạt tính sinh tổng hợp của chủng nuôi cấy sau này