Nghiên cứu thu nhận cellulose vi khuẩn làm chất mang trong kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật

TÓM TẮT Cellulose vi khuẩn – BC được biết đến với nhiều khả năng ứng dụng trong các lĩnh vực kỹ thuật, công nghệ vật liệu, y khoa… Bên cạnh những ứng dụng đó, trong đề tài nghiên cứu này

Đại Học Quốc Gia Tp Hồ Chí Minh

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

[ \

ĐÀO NGỌC CHÂU

NGHIÊN CỨU THU NHẬN CELLULOSE VI KHUẨN LÀM CHẤT MANG TRONG KỸ THUẬT CỐ ĐỊNH TẾ

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHIÃ VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc

Tp HCM, ngày 10 tháng 7 năm 2008

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ và tên học viên: ĐÀO NGỌC CHÂU Giới tính : Nữ

Ngày, tháng, năm sinh : 15/10/1983 Nơi sinh : Bạc Liêu Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học

Khoá (Năm trúng tuyển) : 2006

1- TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu thu nhận cellulose vi khuẩn làm chất mang trong kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật

2- NHIỆM VỤ LUẬN VĂN:

- Tối ưu hóa môi trường và điều kiện nuôi cấy để thu nhận bacterial cellulose

- Ứng dụng BC làm vật liệu trong kỹ thuật cố định nấm men

Saccharomyces cerevisiae, thực hiện cố định bằng 2 phương pháp:

phương pháp bẫy hấp phụ và phương pháp nhốt

3- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : tháng 1 năm 2008

4- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ : tháng 07 năm 2008

5- HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN : TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG

Nội dung và đề cương Luận văn thạc sĩ đã được Hội Đồng Chuyên Ngành thông qua

(Họ tên và chữ ký)

L ỜI CẢM ƠN!

Xin chân thành cảm ơn đến Thầy Cô trong bộ môn Công nghệ Sinh học đã tạo điều kiện cho tôi và các bạn của tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Châu xin cảm ơn Cô: TS Nguyễn Thúy Hương – Một người Thầy rất gần gũi, tận tình chỉ bảo và thương yêu học trò Châu học hỏi được nhiều điều hay ở Cô về nhiệt huyết, tinh thần trách nhiệm trong công việc, về sự bao dung và tình yêu thương đối với mọi người Cô à! Châu sẽ nhớ Cô nhiều lắm đó!

Xin cảm ơn các bạn CH2006 đã luôn giúp đỡ, quan tâm trong suốt thời gian tôi học tập tại lớp

Con (em) xin cảm ơn gia đình và gia đình chồng đã luôn quan tâm, ủng hộ con (em) trong quá trình con đi học Cảm ơn

em gái – Út Châu luôn ủng hộ và thương yêu, quan tâm và chăm sóc tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện luận văn

Cảm ơn anh, Ông Xã của bé! Anh chính là nguồn động viên

to lớn, là động lực để bé phấn đấu, là chỗ dựa tinh thần vững chắc Mình sắp được gặp nhau rồi Xã à! Anh hãy ráng đợi bé nha!

TÓM TẮT

Cellulose vi khuẩn – BC được biết đến với nhiều khả năng ứng dụng trong các lĩnh vực kỹ thuật, công nghệ vật liệu, y khoa… Bên cạnh những ứng dụng đó, trong

đề tài nghiên cứu này BC sẽ được biết đến với vai trò làm chất mang trong kỹ thuật

cố định vi sinh vật Đối tượng được chúng tôi lựa chọn cố định trên chất mang BC

là Saccharomyces cerevisiae 28 Trước khi lên men thu nhận và tiến hành xử lý BC,

chúng tôi thực hiện tối ưu hóa pH và môi trường lên men nhằm thu nhận được lượng BC tối ưu pHopt của chủng Acetobacter xylinum BC16 được chúng tôi ghi

nhận tại pH = 4.4 và môi trường lên men BC tối ưu với nồng độ glucose, (NH4)2SO4

và (NH4)2HPO4 lần lượt là 20g/l, 8g/l và 2g/l môi trường nước dừa già BC trở thành chất mang cố định tế bào nấm men bằng 2 phương pháp: bẫy – hấp phụ và nhốt chủ động Chế phẩm BC với kích thước 2cmx2cm, chế độ lắc 200 vòng/phút

và thời gian ủ 2 ngày của phương pháp bẫy – hấp phụ đã cố định lượng lớn tế bào nấm men với mật độ 9,251x106 tế bào/cm3; đồng thời chế phẩm này được sử dụng khảo sát biến động của quá trình lên men rượu Với phương pháp nhốt chủ động,

BC sau xử lý có dạng hình tròn với Ø = 11cm, bề dày là 2mm đã cố định được 1,102x107 tế bào/cm3 Hiệu quả sử dụng chế phẩm Saccharomyces cerevisiae 28 cố

định trên chất mang BC trong giai đoạn lên men (số lần tái sử dụng) là 8 lần mà vẫn đảm bảo hoạt tính sinh học của nấm men

Abstract

Bacterial Cellulose (BC) is known with many applications in material technology, and medical field… Beside those applications, BC in this project will

be known as a carrier in the immobilizing bacterial cell technology Saccharomyces

cerevisiae 28 is the object that we chose for immobilization using the BC carrier

Before fermenting, gathering and treating BC, we brought the pH concentration and fermentative environment into the optimized level where we could collect the most

BC pHopt concentration of Acetobacter xylinum BC16 strain was collected at pH =

4.4, and the optimized level of fermentative environment was found in juice of old coconut with glucose concentration, (NH4)2SO4 and (NH4)2HPO4 respectively was 20g/l, 8g/l, and 2g/l BC became the carrier immobilizing yeasts by 2 methods: trap – absorb and active confinement In trap – absorb method, BC preparation with size 2cm x 2cm, agitator at 200 cycle/min, and incubation time in 2 days had immobilized a huge amount of yeasts with density 9,251x106 cells/cm3; also, this preparation was used for testing the fluctuation of the alcoholic fermentation In active confinement method, BC after treatment had circle shape with diameter was

11 cm, and the thickness was 2mm This BC had immobilized 1,102x107 cells/cm3 The effect of using Saccharomuces cerevisiae 28 preparation for immobilizing the

BC carrier in the fermentative process could be up to 8 times, and still keep the biology properties of the yeast

MỤC LỤC

Chương 1 – MỞ ĐẦU

Mở đầu .1

Chương 2 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về cellulose vi khuẩn (BC) và Acetobacter xylinum 2

2.1.1 Các vi sinh vật sản sinh BC .2

2.1.2 Sơ lược về vi khuẩn Acetobacter xylinum 3

2.1.3 Các đặc điểm của cellulose vi khuẩn (bacterial cellulose – BC) .4

2.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo BC .13

2.1.5 Nước dừa già -Nguyên liệu dùng để nuôi A xylinum nhằm thu nhận BC 16

2.1.6 Các nghiên cứu về A.xylinum 17

2.2 Kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật 19

2.2.1 Sơ lược về kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật 19

2.2.2 Các phương pháp cố định 20

2.2.3 Ưu điểm của vi sinh vật cố định với vi sinh vật tự do .23

2.2.4 Chất mang trong kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật 23

2.3 Tính chất của chất mang BC .25

Chương 3 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện 27

3.2 Vật liệu 27

3.3 Phương pháp nghiên cứu 30

3.3.1 Sơ đồ nghiên cứu 30

3.3.2 Khảo sát giống A xylinum 31

3.3.3 Phương pháp giữ giống và nhân giống 31

3.3.4 Phương pháp thu nhận BC 32

3.3.5 Phương pháp quy hoạch thực nghiệm 33

3.3.6 Xác định trọng lượng BC khô .35

3.3.7 Phương pháp xử lý cellulose vi khuẩn tươi khi thu hoạch 36

3.3.8 Phương pháp xác định mật độ tế bào được cố định trên chất mang BC .37

3.3.9 Phương pháp hóa lý 37

3.3.10 Nghiên cứu các phương pháp và điều kiện cố định S cerevisiae trên chất mang BC 37

3.3.11 Nghiên cứu các biến động trong quá trình lên men rượu 40

Chương 4 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Một số đặc điểm sinh học của chủng Acetobacter xylinum BC16 khảo sát trong đề tài 42

4.2 Tối ưu hóa môi trường và điều kiện nuôi cấy để thu nhận BC 44

4.2.1 Tối ưu hóa pH môi trường lên men 45

4.2.2 Tối ưu hóa môi trường 46

4.3 Ứng dụng BC làm vật liệu trong kỹ thuật cố định nấm men Saccharomyces cerevisiae 28 50

4.3.1 Xử lý BC trước khi cố định vi sinh vật lên chất mang 50

4.3.2 Khảo sát quá trình cố định trên chất mang BC bằng phương pháp bẫy - hấp phụ 51

4.3.3 Cố định tế bào nấm men S cerevisiae 28 lên chất mang BC bằng phương pháp nhốt chủ động 55

4.4 Khả năng ứng dụng của nấm men cố định bằng chất mang BC trong lên men rượu 58

Chương 4 – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận 64

5.2 Kiến nghị 65

Tài liệu tham khảo 66

DANH MỤC HÌNH ẢNH

1 Hình 2.1 Acetobacter xylinum 3

2 Hình 2.2 A-BC được tạo ra từ môi trường lắc (a) và S-BC được tạo ra từ môi trường tĩnh (b) 6

3 Hình 2.3 Cấu trúc của cellulose (a) Cellulose vi khuẩn (x 20000) và (b) cellulose của thực vật (x200) .7

4 Hình 2.4 Vị trí – quá trình biến dưỡng carbon và tổng hợp cellulose ở A xylinum 9

5 Hình 2.5 Con đường dự đoán của quá trình sinh tổng hợp và tiết ra cellulose khi glucose được tế bào A xylinum hấp thụ từ bên ngoài 9

6 Hình 2.6 Sự tổnghợp vi sợi bởi Acetobacter xylinum 10

7 Hình 2.7 Con đường chuyển hóa carbon của Acetobacter xylinum 12

8 Hình 2.8 Bacterial cellulose ở điều kiện nuôi cấy tĩnh 14

9 Hình 2.9 Bacterial cellulose ở điều kiện nuôi cấy lắc 14

10 Hình 2.10 Sơ đồ các chất mang trong việc cố định tế bào 24

11 Hình 3.1 Sơ đồ tiến trình nghiên cứu 30

12 Hình 3.2 Sơ đồ thu nhận BC .32

13 Hình 3.3 Sơ đồ xử lý BC 36

14 Hình 4.1. Hình ảnh vi thể của A xylinum BC16 42

15 Hình 4.2 Hình ảnh đại thể A xylinum BC16 trên môi trường đặc 43

16.Hình 4.3 Màng BC trên môi trường lỏng 43

17 Hình 4.4 Màng BC trước khi xử lý .50

18 Hình 4.5 Màng BC sau khi xử lý 50

19 Hình 4.6 Nấm men cố định trên chất mang BC .55

20 Hình 4.7 Nấm men cố định trong chất mang BC 55

21 Hình 4.8 BC trước khi cố định bằng phương pháp nhốt 56

22 Hình 4.9 BC sau khi cố định bằng phương pháp nhốt 56

DANH MỤC BẢNG VÀ ĐỒ THỊ

1 Bảng 2.1 Cấu trúc BC ở một số loài vi khuẩn 2

2 Bảng 2.2 Thành phần của nước dừa 16

3 Bảng 2.3 Ưu, nhược điểm các phương pháp thông dụng để cố định tế bào 22

4 Bảng 4.1 Kết quả kiểm tra các đặc điểm sinh hóa .44

5 Bảng 4.2 Trọng lượng BC thu được tại các pH 45

6 Bảng 4.3 Các nhân tố quy họach thực nghiệm 47

7 Bảng 4.4 Mô hình quy hoạch thực nghiệm trong điều kiện lên men tĩnh (YT) và lên men lắc (YL) 48

8 Bảng 4.5 Kết quả thí nghiệm tại tâm 48

9 Bảng 4.6 Hệ số bj của phương trình hồi quy .49

10 Bảng 4.7 Mật độ tế bào nấm men cố định trên chất mang qua các phương pháp trong 30 phút đầu hấp phụ 51

11 Bảng 4.8 Ảnh hưởng của thời gian ủ lên mật độ tế bào nấm men được cố định trên chất mang BC 53

12 Bảng 4.9 So sánh phương pháp bẫy – hấp phụ và phương pháp nhốt

chủ động 57

13 Bảng 4.10 Một số chỉ tiêu hóa lý trong lên men rượu 59

14 Bảng 4.11 So sánh các chất mang trong kỹ thuật cố định tế bào nấm men 62

1 Đồ thị 4.1 Ảnh hưởng của pH đến trọng lượng BC khô trên môi trường lên men 46

2 Đồ thị 4.2 Mật độ vi khuẩn cố định trên BC với các kích thước khác nhau

và qua chế độ khuấy đảo khác nhau .52

3 Đồ thị 4.3 Ảnh hưởng của thời gian ủ lên mật độ tế bào nấm men 54

4 Đồ thị 4.4 So sánh độ rượu của dịch lên men giữa mẫu đối chứng và qua các lần tái sử dụng chế phẩm 60

5 Đồ thị 4.5 So sánh chỉ số mật độ quang giữa mẫu đối chứng với các

lần tái sử dụng chế phẩm nấm men cố định 60

CHƯƠNG 1 – MỞ ĐẦU

Trong quá trình cố định vi sinh vật, vật liệu và phương pháp cố định là hai yếu

tố mang tính chất quyết định đến hiệu quả của việc cố định vi sinh vật Trong đó, đặc biệt tính chất của vật liệu cố định (hay còn gọi là chất mang) là cơ sở cho sự lựa chọn phương pháp cố định Trên thế giới, chất mang có tính chất là polymer tổng hợp đã được nghiên cứu và sử dụng trong những thập niên 70 – 80 đa dạng với các vật liệu như: Sephadex, polyacrylamid, polyvinylacetat, polystyren, polyetylen, polyhydroxyetyl metacrylat… Tuy nhiên, ngoài những ưu điểm là bền, độ trương và khả năng cố định tốt thì nhược điểm của những chất mang này là giá thành cao, không tương hợp sinh học và không phân hủy sinh học được cho nên ít được sử

dụng [3] Từ những nhược điểm polymer tổng hợp mang lại, polymer sinh học đã

được chú ý nghiên cứu và sử dụng với các sản phẩm như: chitin, chitosan, alginate… Đây là những sản phẩm tự nhiên, phong phú, rẻ tiền và có khả năng phân hủy sinh học nên thân thiện với môi trường Bên cạnh đó, nhược điểm mắc phải của loại chất mang này là độ trương thấp, tính chất cơ lý kém bền và không đồng nhất Chính vì những lý do trên, việc nghiên cứu và tìm kiếm chất mang thay thế có những ưu điểm ưu việt, đồng thời khắc phục những nhược điểm của những chất mang trên là cần thiết Cellulose vi sinh vật (hay còn gọi là microbial cellulose - MC) hay cụ thể hơn cellulose vi khuẩn (bacterial cellulose - BC) là một loại polymer sinh học được xem là nguồn nguyên liệu tiềm năng và đã được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như y học, thực phẩm [4],[25], công nghiệp dệt [26], mỹ phẩm…[27] Các nghiên cứu về tính chất hóa lý, cơ lý của BC cho thấy BC đáp ứng được các yêu cầu lý tưởng của vật liệu cố định [17],[18],[50] Đề

tài này nhằm tìm hiểu và mở ra một hướng ứng dụng mới của BC: “Nghiên cứu

thu nhận cellulose vi khuẩn làm chất mang trong kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật”

và cơ chế điều hòa tổng hợp BC ở các loài giống nhau, nhưng cấu trúc BC ở mỗi loài thì khác nhau [18] Có các điểm khác biệt đáng kể về thuộc tính vật lý của các sản phẩm cellulose, chủ yếu là chiều dài của chuỗi glucan (được đặc trưng bởi mức

độ polymer hóa), tính kết tinh và trạng thái kết tinh của nó Tùy thuộc vào mỗi loại

mà trạng thái kết tinh của cellulose khác nhau Từ đó tính chất vật lý của sản phẩm như độ bền, độ hòa tan trong các dung môi, tính chịu ảnh hưởng của các tác nhân biến tính cũng khác nhau [43]

Bảng 2.1 Cấu trúc BC ở một số loài vi khuẩn

Giống Cấu trúc cellulose

Sợi Các sợi không tách biệt

Sợi ngắn

Cellulose dị hình

Chưa xác định rõ cấu trúc

Acetobacter xylinum (A.aceti ssp xylinum, A xylinus), là vi sinh vật tạo

cellulose hữu hiệu nhất Gần đây, nó được xếp vào giống mới Gluconacetobacter, bao gồm các loài là G xylinus, G hansenii, G europaeus, G oboediens và G

Hình 2.1 Acetobacter xylinum [55]

intermedius)[18] Những nghiên cứu về cellulose vi khuẩn tập trung vào đối tượng

A xylinum cả về nghiên cứu cơ bản và các ứng dụng rộng rãi [39]

2.1.2 Sơ lược về vi khuẩn Acetobacter xylinum

A xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, có thể di động hoặc không

di động và không sinh bào tử Tế bào A xylinum đứng riêng lẽ hoặc kết thành chuỗi

dài, có khả năng tạo váng dày trên môi trường nuôi cấy [4]

2.1.2.3 Đặc điểm sinh lý và sinh hóa của A xylinum

A xylinum là vi khuẩn Gram âm, nhưng đặc điểm Gram của chúng có thể bị

biến đổi do tế bào già đi hay do điều kiện môi trường A xylinum thuộc loại vi

khuẩn hiếu khí bắt buộc, nên chúng tăng trưởng ở bề mặt tiếp xúc giữa môi trường

lỏng và môi trường khí [3],[30],[34]

Chúng không sử dụng muối NH4 làm nguồn N duy nhất, đồng thời trên bề mặt

môi trường dịch thể tạo thành màng dày nhầy, có chứa cellulose [11] Ngoài ra, A

xylinum tạo: (1) phản ứng catalase dương tính, (2) oxy hóa ethanol thành CO2 và

H2O, (3) không tăng trưởng trên môi trường Hoyer, (4) không tạo sắc tố nâu, (5) tổng hợp cellulose [3],[30]

A xylinum có thể sử dụng nhiều nguồn đường khác nhau và tùy thuộc vào chủng

mà nguồn đường nào được sử dụng tốt nhất Chúng có thể chuyển glucose thành

acid gluconic, điều này làm cho pH môi trường giảm từ 1 đến 2 đơn vị [34]

Nhiệt độ tối ưu để A xylinum phát triển là từ 25 đến 30oC và pH từ 5,4 đến

6,3 [30] Theo Hestrin (1947), pH tối ưu của A xylinum là 5,5 và chúng không phát

triển ở nhiệt độ 37oC ngay cả trong môi trường dinh dưỡng tối ưu [27]

Khi nuôi trên môi trường đặc, lúc tế bào còn non, khuẩn lạc mọc riêng rẽ, nhầy và trong suốt, xuất hiện sau 3 đến 5 ngày Khi già, tế bào mọc dính nhau thành

từng cụm và khuẩn lạc mọc theo đường nuôi cấy [7]

2.1.3 Các đặc điểm của cellulose vi khuẩn (bacterial cellulose – BC)

2.1.3.1 Đặc điểm về cấu trúc của BC

Cellulose là một polymer không phân nhánh bao gồm những gốc glucopyranose nối với nhau bởi nối β-1,4 Các nghiên cứu cơ bản về BC cho thấy,

BC có cấu trúc hóa học giống y hệt PC (plant cellulose – cellulose thực vật) Tuy nhiên, cấu trúc đa phân và thuộc tính của BC khác với PC Các sợi mới sinh ra của

BC kết lại với nhau để hình thành nên các sợi sơ cấp (subfibril), có chiều rộng khoảng 1,5nm, là những sợi mảnh nhất có nguồn gốc tự nhiên Các sợi cơ bản kết lại thành các vi sợi (microfibril) Các vi sợi nằm trong các bó (bundle), và cuối cùng hình thành các dải (ribbon) Trong khi chiều rộng của các sợi cellulose được tạo ra

từ gỗ thông là 30.000 – 75.000 nm hay gỗ bulô (Betula) là 14.000 – 40.000 nm (hình 2.3) Những dải vi sợi cellulose mịn có chiều dài thay đổi từ 1 – 9 µm làm

hình thành nên cấu trúc lưới dày đặc, được ổn định bởi các nối hydrogen

[5],[18],[29]

BC khác PC về chỉ số kết chặt, về mức độ polymer hóa BC có mức độ polymer hóa từ 2.000 – 6.000; một vài trường hợp đạt tới 16.000 – 20.000, trong khi mức polymer hóa ở thực vật là 13.000 – 14.000 So với PC, BC có độ kết tinh cao hơn, thấm nước tốt hơn, sức bền cơ học ở trạng thái ẩm cao hơn và dễ uốn nắn hơn [5],[18],[29] BC được hình thành qua một quá trình phức tạp gồm nhiều giai đoạn, cho sản phẩm có kích thước khác nhau theo sơ đồ sau:

Cấu trúc của BC phụ thuộc chặt chẽ vào điều kiện nuôi cấy Ở điều kiện nuôi cấy tĩnh Vi khuẩn tổng hợp những miếng cellulose trên bề mặt của dịch nuôi cấy, tại ranh giới giữa bề mặt dịch lỏng và không khí giàu oxy Các miếng BC này được gọi là BC trên môi trường tĩnh (S-BC: Static BC) Các sợi cellulose sơ cấp liên tục được đẩy ra từ những lỗ được xếp dọc trên bề mặt của tế bào vi khuẩn, kết tinh lại thành các vi sợi, và đẩy xuống sâu hơn trong môi trường dinh dưỡng Các dải cellulose từ môi trường tĩnh tạo nên các mặt phẳng song song nhưng không tổ chức,

có vai trò chống đỡ cho quần thể tế bào A xylinum Các sợi BC kế nhau được tạo ra

từ môi trường tĩnh nối với nhau và bẻ nhánh ít hơn các sợi BC được tạo từ môi trường lắc (A-BC: Agitated-BC) A-BC được tạo ra dưới dạng các hạt nhỏ, các hạt hình sao và các sợi dài, chúng phân tán rất tốt trong môi trường Các sợi đan lưới với nhau trong môi trường lắc giống như mô hình kẻ ô, có cả hai hướng song song

và vuông gốc [5],[18]

Sự khác nhau về cấu trúc không gian ba chiều của hai dạng S-BC và A-BC được quan sát rõ ràng hơn bằng kính hiển vi điện tử quét (scanning electron microscope) Những sợi S-BC kéo dài và chồng trên các sợi khác theo chiều đan chéo nhau Những sợi A-BC thì rối rắm và cong(hình 2.2) [36] Ngoài ra, bề mặt

cắt ngang của sợi A-BC (0,1-0,2µm) lớn hơn sợi S-BC (0.05 – 0.10µm) Sự khác Sợi sơ cấp-subfibril vi sợi-microfibril bó-bundle dải-ribbon [37] (rộng 1,5 nm) (rộng 3,0-3,5nm) (rộng 40-60nm)

nhau về hình thái giữa hai loại BC này làm mức độ kết tinh, kích cỡ kết tinh của chúng khác nhau [5],[17]

Hình 2.2 A-BC được tạo ra từ môi trường lắc (a) và S-BC được tạo ra từ môi

Cellulose I được tổng hợp bởi đa số thực vật và A xylinum ở môi trường tĩnh

Các chuỗi β-1,4-glucan ở cellulose I được sắp xếp song song với nhau theo một trục Trong khi đó, các chuỗi β-1,4-glucan ở cellulose II thì xếp một cách ngẫu nhiên, hầu như không song song và nối với nhau bởi một số lượng lớn nối

hydrogen, làm cho cellulose II có độ bền về nhiệt Rất ít tế bào Eukaryota tổng hợp

cellulose II A xylinum thì tổng hợp được cả 2 loại cellulose I và II [18],[19] Trong

phân tử cellulose I có sự hiện diện của Iα và Iβ, do được cấu tạo bởi glucose dạng α hay dạng β Dạng Iβ bền về nhiệt động học hơn [19] Glucose dạng α và glucose dạng β là hai dạng đồng phân không gian của nhau Hai dạng đồng phân này chỉ

khác nhau ở sự định hướng của nhóm hydroxyl [6] Hai dạng này có ở các cellulose

có nguồn gốc từ tảo, vi khuẩn , thực vật BC có dạng Iα nhiều hơn PC

S-BC có nhiều dạng Iα hơn A-BC Sự khác nhau về tỉ lệ Iα giữa hai loại S-BC và A-BC làm phóng đại các chỉ số kết tinh, chỉ số Iα tỉ lệ thuận với kích cỡ kết tinh A-

BC có chỉ số kết tinh thấp hơn và kích cỡ kết tinh nhỏ hơn S-BC [5],[18]

Một phần đáng kể cellulose II có ở A-BC Trong tự nhiên, cellulose II chỉ được

tổng hợp ở một vài vi sinh vật (một số tảo, mốc, và vi khuẩn như Sarcina ventriculi,

A xylinum) Hiện nay, sản phẩm công nghiệp của cellulose II chủ yếu có được là

dựa trên sự biến đổi hóa học cellulose thực vật [18]

Hình 2.3 Cấu trúc của cellulose (a) Cellulose vi khuẩn (x 20000) và (b) cellulose

của thực vật (x200) [53]

2.1.3.2 Chức năng sinh lý của cellulose đối với A xylinum

A xylinum là vi khuẩn không có khả năng quang hợp Trong môi trường tự

nhiên, đa số vi khuẩn tổng hợp các polysaccharide ngoại bào để hình thành nên lớp

vỏ bao quanh tế bào, màng BC là một ví dụ Những tế bào vi khuẩn sản xuất cellulose được bẫy bên trong mạng lưới polymer Mạng lưới này là vật chống đỡ cho quần thể vi sinh vật luôn ở bề mặt tiếp giáp giữa môi trường lỏng và không khí

Tế bào vi khuẩn Cellulose của thực vật

(hình 2.3a) Vì vậy, các chủng vi khuẩn sản xuất BC có thể sống ở những nơi cống

rãnh Hệ thống lưới polymer làm cho các tế bào có thể bám chặt trên bề mặt môi trường và làm tế bào thâu nhận chất dinh dưỡng một cách dễ dàng hơn so với khi tế bào ở trong môi trường lỏng không có mạng lưới cellulose

Một vài tác giả cho rằng, cellulose được tổng hợp bởi A xylinum còn đóng vai

trò tích trữ và có thể được sử dụng khi vi sinh vật này bị thiếu nguồn dinh dưỡng

Sự phân hủy cellulose được xúc tác bởi enzyme exo-glucanase hay endo-glucanase,

sự hiện diện cả hai loại enzyme này được phát hiện trong dịch nuôi cấy một vài

chủng A xylinum sản xuất cellulose [18]

Nhờ vào tính dẻo và tính thấm nước của các lớp cellulose mà các tế bào vi khuẩn kháng lại được những thay đổi bất lợi trong môi trường sống như giảm lượng nước, thay đổi pH, xuất hiện các chất độc, và các vi sinh vật gây bệnh Các vi khuẩn

A xylinum có thể tăng trưởng và phát triển bên trong lớp vỏ bao Cellulose bao

quanh tế bào vi khuẩn bảo vệ chúng khỏi tia cực tím Khoảng 23% tế bào A

xylinum được bao BC sống sót sau 1 giờ xử lý tia cực tím Tách BC khỏi tế bào, khả

năng sống của tế bào giảm đáng kể, chỉ còn 3% [5],[18]

2.1.3.3 Sinh tổng hợp BC

A xylinum là vi khuẩn không có khả năng quang hợp Chúng có thể sử dụng

nguồn carbon là các monosaccharide, cụ thể là D-glucose để tạo ra cellulose ngoại bào chỉ trong vài ngày Trong môi trường nuôi cấy tĩnh, A xylinum tạo ra màng

cellulose ngay trên bề mặt tiếp xúc giữa môi trường và không khí Quá trình tổng

hợp BC đã được chứng minh gồm 5 giai đoạn cơ bản do 5 enzyme khác nhau xúc

tác tạo thành để chuyển hóa dần cơ chất ban đầu là D-glucose thành UDP-glucose qua các sản phẩm trung gian là glucose-6-phosphat và glucose-1-phasphat Sau đó, sản phẩm cuối UDP-glucose sẽ được liên kết tạo chuỗi polymer bởi enzyme cellulose synthase (hình 2.4, 2.5)

Hình 2.5 Con đường dự đoán của quá trình sinh tổng hợp và tiết ra

cellulose khi glucose được tế bào A xylinum hấp thụ từ bên ngoài [53]

Hình 2.4 Vị trí – quá trình biến dưỡng carbon và tổng hợp cellulose ở A

phosphate

Chu trình Krebs

Vi sợi Cellulose Tiền sợi Cấu tử tạo

từ phức hợp chỉ tạo ra được chuỗi gồm 6-8 glucan được gọi là sợi sơ cấp (subfibril), sau đó các sợi sơ cấp kết lại thành vi sợi có kích thước lớn hơn (microfibril), kế tiếp các vi sợi này sẽ gắn kết với nhau thành các dải ribbon Cuối cùng, các dải ribbon này tụ họp hình thành nên màng cellulose [21] Quá trình đó được mô tả qua hình 2.6

Hình 2.6 Sự tổng hợp vi sợi bởi Acetobacter xylinum (Iguchi et al, 2000)[31]

Sinh tổng hợp BC là một tiến trình bao gồm nhiều bước được điều hòa một cách chuyên biệt và chính xác, liên quan đến một số lớn enzyme, các phức hợp xúc tác và các protein điều hòa Tiến trình này bao gồm sự tổng hợp uridine diphosphoglucose (UDPGlc), tiền chất của cellulose, tiếp đến là sự polymer hóa glucose vào chuỗi β-1,4-glucan, và sự kết hợp các sợi mới vào dải (ribbon), được

hình thành từ hàng trăm, thậm chí hàng ngàn sợi cellulose riêng lẽ Con đường và

cơ chế của sự tổng hợp UDPGlc tương đối được biết nhiều, trong khi đó cơ chế phân tử của sự polymer hóa glucose vào mạch dài và các mạch nhánh, sự đẩy ra bên

ngoài tế bào của chúng và sự kết hợp thành sợi cần được làm sáng tỏ hơn [18]

Cellulose được tổng hợp từ A xylinum là sản phẩm cuối cùng của sự biến dưỡng

carbon, phụ thuộc vào trạng thái sinh lý tế bào liên quan đến hoặc là chu trình pentose phosphate hoặc là chu trình Krebs, đi kèm với quá trình sinh tạo glucose

(hình 2.7) Quá trình glycose giải không hoạt động ở vi khuẩn acid acetic bởi vì nó

không tổng hợp được enzyme quan trọng của con đường này đó là phosphofructose

kinase Ở A xylinum, sự tổng hợp cellulose liên hệ chặt chẽ với tiến trình dị hóa

oxid hóa và tiêu thụ khoảng 10% năng lượng có nguồn gốc từ những phản ứng dị dưỡng Sự tổng hợp BC không gây trở ngại cho các quá trình đồng hóa khác, bao

gồm sự tổng hợp protein [18]

A xylinum chuyển nhiều phức hợp carbon như: hexose, glycerol, pyruvate,

dihydroxyacetone, và các dicarboxylic acid thành cellulose, thường có hiệu suất 50% Dicarboxylic acid đi vào chu trình Krebs nhờ quá trình decarboxyl hóa để thành pyruvate, chuyển thành hexose thông qua con đường sinh tạo glucose, tương

tự đối với glycerol, dihydroxyacetone và các hợp chất trung gian của chu trình

pentone phosphate [18] Con đường chuyển hóa carbon của A xylinum được mô tả

chi tiết qua hình 2.7

Tiền chất trực tiếp của cellulose là UDPGlc (uridine diphosphoglucose), là sản phẩm của con đường phổ biến ở các sinh vật, bao gồm cả thực vật, liên quan tới sự phosphoryl hóa glucose thành glucose-6-phosphate, được xúc tác bởi glucokinase, tiếp đến là quá trình đồng phân hóa hợp chất này thành glucose-α-1-phosphate, được xúc tác bởi photphoglucomutase và cuối cùng chuyển thành UDPGlc bởi enzyme UDPGlc pyrophosphorylase Enzyme cuối cùng này dường như quan trọng liên quan đến quá trình tổng hợp BC Một vài đột biến không tổng hợp cellulose

(Cel -) thiếu enzyme này (Valla và cộng sự, 1989) Hơn nữa, hoạt động của

pyrophosphorylase thay đổi ở những chủng A xylinum khác nhau và hoạt động cao

nhất được phát hiện ở các sinh vật tổng hợp cellulose hữu hiệu nhất, như là A

xylinum ssp sucrofermentans BPR2001 Chủng này thích sử dụng fructose hơn,

biểu lộ sự hoạt động cao của phosphoglucoisomerase, và có một hệ thống phosphotransferase Hệ thống này chuyển fructose thành fructose-1-phosphate và tiếp đến là fructose-1,6-biphosphate [5], [18]

Hình 2.7 Con đường chuyển hóa carbon của Acetobacter xylinum [5],[39]

Chu trình Krebs

2.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo BC

Chất lượng và năng suất của BC được tạo ra phụ thuộc rất nhiều yếu tố như sau:

2.1.4.1 Ảnh hưởng bởi phương pháp lên men

Ngày nay, sản xuất BC được thực hiện bằng nhiều phương pháp lên men khác nhau như nuôi cấy lắc, nuôi cấy tĩnh trên khay… Việc lựa chọn phương pháp nào để thực hiện là tùy thuộc vào định hướng ứng dụng vì sản phẩm BC sẽ có đặc tính hóa

lý và cấu trúc khác nhau ứng với từng phương pháp khác nhau [17]

Khi nuôi cấy tĩnh hay bề mặt, màng BC (S-BC) được tích lũy trên bề mặt môi trường nuôi S-BC thương mại thông dụng như Nata-de Coco, màng rung truyền âm thanh, làm màng trị bỏng… Còn khi nuôi cấy lắc thì BC (A-BC) sẽ có dạng sợi huyền phù, hay dạng khối không đồng nhất (dạng hột nhỏ, hoặc hình cầu, hình elip) Kiểu nuôi này thích hợp hơn cho sản xuất BC công nghiệp và cho các ứng dụng khác của A-BC như: mỹ phẩm, vật liệu, chất nhũ hóa… Kiểu lên men BC này chưa

được nghiên cứu và tiến hành ở Việt Nam [5]

Theo các nhà nghiên cứu thì phương pháp nuôi cấy chìm cho hiệu suất sinh tổng hợp BC cao hơn vì các thiết bị lên men chìm có thể cung cấp tốt lượng oxy cho tế bào hoạt động Đồng thời BC này còn có khả năng giữ nước cao hơn từ phương

pháp tĩnh Tuy nhiên, trở ngại ở đây là thường phát sinh các chủng đột biến Cel một cách ngẫu nhiên sau thời gian lên men Các chủng Cel - này sẽ không còn khả

-năng sản sinh BC nữa, vì thế làm hiệu suất BC giảm đáng kể sau đó

PTS: hệ thống chuyển đổi phospho

IPFK: frurose-1-phosphate kinase

Glc-6-P: glucose-6-phosphate

Glc-1-P: glucose-1-phosphate

Fru-6-P: frutose-6-phosphate

Fru-bi-P: frutose-1,6-bi-phosphate

UDPGlc: uridine diphosphoglucose

PGA: phosphogluconic acid

GK: glucokinase PGM: phosphoglucomutase UGP: pyrophosphorylase UDPGlc CS: cellulose synthase

PGI: phosphoglucomutase FK: frutokinase

FBP: frutose-1,6-biphosphate phosphatase G6PDH: glucose-6-phosphate dehydrogenase

2.1.4.2 Ảnh hưởng bởi nhiệt độ, pH và oxy

• Ảnh hưởng bởi nhiệt độ

Nhiệt độ tối ưu cho sản sinh cellulose là 25-30oC, có tác giả lại cho là từ

28-30oC [30]

• Ảnh hưởng bởi pH

Nhìn chung, khoảng pH tối ưu để sản sinh BC là 4-7 Theo Hestrin và Schramm (1954) cho rằng pH dưới 7 là quan trọng hơn cả Còn Fiedler và cộng sự thì cho pH=5-7 thì tối ưu Hầu hết pH bằng 5 hay 6 được dùng trong các nghiên cứu Nhưng để sản xuất cellulose công nghiệp thì pH=4-4,5 thì cho kết quả ưu thế

hơn do giảm sự tạp nhiễm [17] A xylinum đồng thời cũng sản xuất ra 2 loại:

enzyme cellulase và bacterial cellulose Các nghiên cứu gần đây cho thấy, tuy đồng thời cùng sản xuất 2 loại: cellulose và cellulase nhưng có thể khống chế độ pH của môi trường dinh dưỡng để điều chỉnh mức độ sản sinh ra 1 trong 2 loại này Khi pH

Hình 2.8 Bacterial cellulose ở điều

kiện nuôi cấy tĩnh [39]

Hình 2.9 Bacterial cellulose ở điều kiện

nuôi cấy lắc [39]

ở mức từ 4 - 4,5 thì lượng BC được sản sinh ra nhiều nhất, còn pH ở mức từ 5 – 5,5 thì lượng enzyme cellulase được sản sinh cao hơn [44]

Theo S Hestrin và M Schramm (1954), HCl và NaOH thích hợp dùng để điều chỉnh pH môi trường [41]

• Ảnh hưởng bởi nồng dộ oxy

Nồng độ O2 liên quan trực tiếp đến việc sinh tổng hợp BC [49] Khi không khí giàu O2 (duy trì nồng độ O2 lớn hơn 39%) được cho vào tại thời điểm 8h sau khi nuôi cấy thì sản lượng BC tăng lên 1,5 lần và năng suất BC tăng từ 11% lên đến 18% Tuy nhiên, với nồng độ O2 như thế, nhưng cho vào từ khi bắt đầu nuôi cấy thì

số lượng tế bào suy giảm một cách nhanh chóng và hầu như vi khuẩn không sản sinh BC nữa Điều này tác giả giải thích vì số lượng tế bào sống sót tại thời điểm bắt đầu nuôi cấy quá thấp nên không thể tìm thấy BC trong điều kiện nồng độ O2

hòa tan cao (vì trong điều kiện này đã làm ức chế vi khuẩn) Trong môi trường nuôi cấy tĩnh, tại nồng độ O2 10% và 15% một vài chủng A xylinum cho sản lượng BC

cao hơn ở nồng độ O2 là 20% [44] Khi nồng độ O2 tăng đến 30% sẽ làm giảm đáng

kể sản lượng BC trong khi sự tăng trưởng của tế bào vẫn tiếp tục duy trì [44],[47]

2.1.4.3 Ảnh hưởng bởi nguồn dinh dưỡng

• Ảnh hưởng do nguồn carbon

Những cơ chất được đánh giá là cho sản lượng BC cao, bao gồm: glucose, sorbitol và manitol Glycerol, galactose, lactose, sucrose và maltose được xem là cơ chất thích hợp Những cơ chất mà vi khuẩn này không có khả năng sử dụng để tạo màng cellulose là sorbose, mannose, cellobiose, erythritol, ethanol và acetate [27] Nguồn carbon từ glucose được cho là thích hợp trong việc tăng hiệu suất khả năng sản sinh BC [16]

• Ảnh hưởng do nguồn nitrogen

Môi trường được dùng để nghiên cứu là môi trường có 0,5% cao nấm men và

0,5% pepton [27] Đối với một số dòng A xylinum lại cho thêm tryptophan, dịch

chiết ngô vào trong môi trường Tuy nhiên dịch chiết ngô cho hiệu quả hơn cả Các

acid amin như methionin, glutamate thì luôn cần phải có trong môi trường vì những acid amin này có ảnh hưởng quan trọng đến sự phát triển của tế bào và sự tổng hợp cellulose [16]

Người ta tìm ra ammonium dihydrogen phosphate có thể được sử dụng thay cho cao nấm men như một nguồn cung cấp nitơ và thêm vào một lượng nhỏ dịch chiết bột bắp (từ 0,125 tới 0,5 ml/l) thì gia tăng sản lượng BC [24]

2.1.5 Nước dừa già -Nguyên liệu dùng để nuôi A xylinum nhằm thu nhận BC

Nước dừa già là môi trường cổ điển để thu nhận BC từ A xylinum Đây là môi trường chứa nhiều chất dinh dưỡng (Bảng 2.2)

Bảng 2.2 Thành phần của nước dừa

Nước Protein:

Lipid tổng số:

Tro Đường tổng:

Calcium Sắt Magnesium Phosphorus Kali

Natrium Kẽm Đồng Mangan Selenium Vitamin C Thiamin

94,99 (%) 0,72 (%) 0,20 (%) 0,39 (%) 2,61 (%) 24,00 (mg/100g) 0,29 (mg/100g) 25,00 (mg/100g) 20,00 (mg/100g) 250,00 (mg/100) 105,00 (mg/100g) 0,10 (mg/100g) 0,040 (mg/100g) 0,142 (mg/100g) 1,000 (µg/100g) 2,400 (mg/100) 0,030 (mg/100g)

Riboflavin Niacin Pantothenic acid Vitamin B6 Folate Acid béo no Acid béo không no

0,057 (mg/100g) 0,080 (mg/100g) 0,043 (mg/100g) 0,032 (mg/100g) 3,000 (µg/100) 0,176 (g/100g) 0,010 (g/100g) [56]

Ngoài ra, trong nuớc dừa còn chứa các chất kích thích tố sinh trưởng: 1,3 diphenyllurea, hexitol, cytokinin, myo-inositol, sorbitol…

2.1.6 Các nghiên cứu về A.xylinum

2.1.6.1 Các nghiên cứu cơ bản về bacterial cellulose

Năm 1886, lần đầu tiên nhà bác học Brown đã báo cáo về sự tổng hợp lớp màng

cellulose ngoại bào của vi khuẩn A xylinum [18],[52] Mặc dù vậy, đến nữa sau thế

kỷ XX các nhà khoa học mới thực sự nghiên cứu rộng rãi BC Cùng với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, cấu trúc của cellulose vi khuẩn ngày càng được hiểu rõ [18]

Từ năm 1947 đến năm 1954, tại phòng thí nghiệm Hóa Vi sinh học, S Hestrin

và các cộng sự của trường Đại học Hebrew đã đưa ra bài báo về quá trình tổng hợp

cellulose từ A xylinum Bài báo xoay quanh về các vấn đề về nguồn cơ chất, điều

kiện oxy, chất ức chế và các sản phẩm trung gian đã tác động lên quá trình hình thành cellulose [28]

Năm 1988, Atsushi đã nhận đột biến A xylinum kháng 5-Fluorouridine và cho

sản lượng BC cao, và chủng cho sản lượng BC cao có cấu trúc thay đổi [38]

Năm 1997, Toda K., Asakura T và cộng sự cho rằng, giống Acetobacter

xylinum có sức đề kháng với acid acetic, cụ thể là có khả năng sinh trưởng và phát

triển trong những môi trường có tới 2% acid acetic, những giống này có sản phẩm

BC có khả năng giữ nước cao, chất lượng tốt và ít bị nhiễm tạp [46]

Cellulose vi khuẩn với nhiều ứng dụng rộng rãi, nên việc nghiên cứu để tạo ra nguồn cellulose với sản lượng cao được sự quan tâm của giới khoa học Với các công trình tiêu biểu như:

- Tổng hợp cellulose bởi Acetobacter xylinum từ nguồn carbon là glucose [26]

- Năm 2000, John Wiley và Sons đã nghiên cứu bằng cách thực hiện việc nuôi

phản ứng loop airlift để sản xuất cellulose Nghiên cứu cho thấy, khi cung cấp không khí cho vi khuẩn thì sau 67 giờ thì vi khuẩn sẽ sản sinh 3,8g/l cellulose Nếu cung cấp nhiều oxy hơn thì tốc độ sản sinh BC của vi khuẩn sẽ tăng gấp đôi [32]

- Năm 2002, Takehiko Ishida, Yasushi Sugano và các cộng sự nghiên cứu về sự

ảnh hưởng của acetan đối với sản lượng cellulose vi khuẩn được sinh ra [45]

- Năm 2004, Sangok Bae, Yasushi Sugano và các cộng sự đã nghiên cứu việc

sử dụng thêm agar trong fermentor để cải thiện sản lượng BC tạo ra [40]

2.1.6.2 Các nghiên cứu ứng dụng của bacterial cellulose

Ứng dụng trong thực phẩm: BC được sản xuất từ Acetobacter xylinum được

sử dụng làm thức ăn truyền thống của người Philippine, cũng như ở một số nước

thuộc Châu Á bao gồm Indonesia, Nhật Bản, Taiwan [25] Sản phẩm cellulose được

sử dụng trong nước ép trái cây và những thức uống khác, trong mức kẹo, kem, yoghurt, salad, thức ăn tráng miệng có tác dụng như chất làm đặc, vật liệu ổn định dịch huyền phù, vật liệu làm vỏ bọc thực phẩm F Yoshinaga & cộng sự (1997) so sánh tác động giữ ổn định dịch huyền phù của BC với các vật liệu khác như xanthan gum, sorbitan monolaurate, MCC (microcrystalline cellulose) và MFC (microfibrilated cellulose) MCC và MFC là các cellulose có nguồn gốc từ cellulose thực vật Họ nhận thấy rằng, BC có tác dụng giữ ổn định dịch huyền phù ở các nồng

độ muối khác nhau, pH khác nhau và được xử lý ở các nhiệt độ khác nhau Trong khi đó, sorbitan monolaurate không giữ được dịch huyền phù ở pH 2 hoặc dịch huyền phù ở 20oC Xanthan gum không ổn định được dịch huyền phù sau khi dịch

được hấp vô trùng ở 120oC, trong 20 phút Với đặc tính ổn định dịch huyền phù, BC

có triển vọng là một vật liệu công nghệ mới cho tương lai [5]

Ứng dụng trong y học: Làm màng băng vết thương, làm vi mạch nhân tạo bằng

chế phẩm BASYC® hỗ trợ cho vi phẫu thuật [23] Năng lực tự nhiên chữa lành vết thương của microbial cellulose đã được sử dụng trong việc làm da nhân tạo [48]

Ứng dụng trong công nghệ sản xuất giấy đặc biệt: Cellulose vi khuẩn có thể

được tổng hợp với một lượng lớn trong thời gian ngắn, lại có độ tinh sạch cao trong khi muốn thu cellulose từ thực vật phải qua thời gian dài [42] Một ưu điểm khác của loại giấy đặc biệt này là đặc tính hút và giữ mực cao [5]

Ứng dụng trong các sản phẩm audio: sử dụng BC làm màng rung bộ chuyển đổi

âm thanh dựa vào tính cơ học đặc biệt của màng BC sấy khô có vận tốc truyền âm lớn có thể đạt 5000m/s BC đã được sử dụng cho màng trong loa phóng thanh và ống nghe điện đài [4] Công ty Sony liên kết với công ty Ajinomoto sản xuất ra màng loa phóng thanh đầu tiên bằng cellulose vi sinh vật [51]

Ứng dụng trong công nghiệp gỗ: Màng cellulose được tinh sạch, xay nghiền để

thu bột, sau đó kết dính bột này với bột cellulose Vì thế trong việc tạo gỗ nhân tạo, bột BC được sử dụng làm tác nhân kết dính [4],[42]

Trong công nghiệp mỹ phẩm: làm chất ổn định kem dưỡng da, gel vuốt tóc

[5],[51]

Ngoài ra BC còn được sử dụng làm màng bao trong bảo quản dừa tươi [5]

2.2 Kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật

2.2.1 Sơ lược về kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật

Kỹ thuật cố định tế bào được định nghĩa là kỹ thuật bao bọc hoặc định vị các

tế bào còn nguyên vẹn lên một vùng không gian nhất định nhằm bảo vệ các hoạt tính xúc tác mong muốn Cố định thường là sự bắt chước các hiện tượng xảy ra trong tự nhiên do các tế bào có thể phát triển trên bề mặt hoặc bên trong các cấu trúc của nguyên liệu có trong tự nhiên [35]

Cố định tế bào còn được định nghĩa là việc gắn tế bào vi sinh vật vào chất mang không hòa tan trong nước, tế bào sau khi sử dụng có thể được sử dụng nhiều

lần, không lẫn vào sản phẩm và có thể chủ động ngừng phản ứng mong muốn [15]

2.2.2 Các phương pháp cố định

Có nhiều phương pháp để cố định tế bào vi sinh vật sau:

2.2.2.1 Phương pháp gắn tế bào vi sinh vật bằng các liên kết hóa học

Phương pháp này áp dụng khá rộng để thu nhận tế bào cố định Thường thì tế bào vi sinh vật được kết hợp với chất mang không hòa tan Việc chọn chất mang có

ý nghĩa rất lớn ảnh hưởng đến hoạt tính trao đổi chất của tế bào cố định

• Gắn tế bào bằng các liên kết ion

Việc gắn tế bào vi sinh vật sẽ có hiệu quả cao khi điện tích của tế bào vi sinh vật và của chất mang có dấu ngược nhau

• Gắn tế bào bằng các liên kết cộng hóa trị

Quá trình gắn giữa tế bào vi sinh vật và chất mang có thể xảy ra: một giai đoạn nếu chất mang có chứa các nhóm có khả năng tham gia trực tiếp với nhóm amin của protein trong tế bào vi sinh vật; hai giai đoạn: giai đoạn thứ nhất là giai đoạn hoạt hóa chất mang bằng cách gắn lên chất mang các nhóm chức có khả năng phản ứng hơn, giai đoạn thứ hai là giai đoạn tạo liên kết giữa các nhóm chức lên chất mang với tế bào vi sinh vật [11]

• Kết hợp đồng hóa trị các tế bào vi sinh vật riêng biệt thành đại phân tử

không tan

Việc cố định các tế bào vi sinh vật bằng cách đính chúng lại với nhau nhờ tác

nhân lưỡng hay đa chức [15]

2.2.2.2 Cố định bằng phương pháp hấp phụ lên chất mang

Tế bào vi sinh vật có thể được hấp phụ trên các chất mang như than hoạt tính, cellulose, agarose, kitin, polyacrylamide, nhựa trao đổi ion, silicagel, thủy tinh

Có ba trường hợp xảy ra:

- Thứ nhất: chất mang không có lỗ xốp, tế bào vi sinh vật sẽ được đính vào chất mang theo từng lớp trên bề mặt

- Thứ ba: chất mang có lỗ xốp, tế bào vi sinh vật sẽ xâm nhập vào các lỗ này Đồng thời, nếu chất mang có tích điện sẽ tạo thành các liên kết ion giữa chất mang với tế bào [11]

2.2.2.3 Phương pháp nhốt tế bào vi sinh vật trong khuôn gel

Để gói tế bào vi sinh vật vào khuôn gel, người ta tiến hành trùng hợp hóa các gel khi có mặt đồng thời tế bào vi sinh vật Sau khi hoàn thành, tế bào vi sinh vật bị giữ chắc trong gel

Các tế bào vi sinh vật được gói trong khuôn gel kiểu này thường phân bố không đồng đều Thông thường chỉ những phần tế bào vi sinh vật nằm gần bề mặt gel là tiếp xúc được với cơ chất và tham gia quá trình lên men

Một số phương pháp gói (nhốt) tế bào vi sinh vật:

• Nhốt trong cấu trúc gel

Alginate được lấy từ rong biển có khả năng tạo gel rất tốt và rất thuận lợi để bao gói các enzyme hoặc tế bào nguyên vẹn Có thể tạo khối dưới dạng viên có đường kính 0,5- 4 mm bằng cách nhỏ giọt dung dịch natri alginate 2% vào dung dịch giàu canxi clorua

• Các tế bào vi sinh vật bị nhốt trong các lỗ nhỏ của các sợi tổng hợp

Phương pháp này chỉ thích hợp cho các tế bào vi sinh vật không bị mất hoạt tính trong các dung môi không hòa lẫn với nước

• Phương pháp gói vi sinh vật trong bao vi thể

Tế bào vi sinh vật được gói trong các bao vi thể có màng bán thấm được tạo ra

từ các polymer có kích thước lỗ đủ nhỏ để ngăn cản sự khuếch tán của tế bào ra ngoài môi trường

Riêng đối với ứng dụng trong sản xuất công nghiệp, 5 phương pháp sau là phù hợp, đó là: phương pháp hấp phụ, phương pháp liên kết hóa trị với bề mặt chất mang, phương pháp liên kết giữa các tế bào, phương pháp bao tế bào và phương pháp bọc tế bào trong khuôn xốp Ưu nhược điểm giữa các phương pháp được tóm tắt trong bảng (Bảng 2.3 )

Bảng 2.3 Ưu, nhược điểm các phương pháp thông dụng để cố định tế bào

- Tế bào dễ bị tách khỏi chất mang do tác động cơ học hoặc khi thay đổi điều kiện môi trường

- Số lượng tế bào cố định được thường thấp

- Quá trình cố định “thụ động” khó điều khiển

- Thường ảnh hưởng đến

sự sống và hoạt tính của tế bào

- Mỗi tế bào phải có phản ứng đặc thù

- Khả năng trao đổi chất tốt

- Độ bền cơ học kém

- Sự sinh trưởng của tế bào

dễ phá hủy màng chắn

- Cản trở sự trao đổi chất của tế bào

- Có thể ảnh hưởng đến hoạt tính của tế bào

[10],[20]

2.2.3 Ưu điểm của vi sinh vật cố định với vi sinh vật tự do

Nhìn chung, việc cố định tế bào đem lại nhiều ưu thế sau:

- Tạo điều kiện thuận lợi để tách tế bào khỏi môi trường lên men, đơn giản hóa khâu thu nhận sản phẩm trao đổi chất và sinh khối Có thể tái sử dụng cho các chu

kỳ lên men tiếp theo Có thể chủ động ngừng phản ứng theo ý muốn [8], [11]

- Tạo ra các gradient như: nồng độ cơ chất và sản phẩm, nồng độ oxy hòa tan,

pH trong môi trường lên men; từ đó có thể tạo ra các môi trường vi mô khác nhau cho tế bào trong lĩnh vực nghiên cứu và ứng dụng khác nhau

- Có thể bảo vệ tế bào trong quá trình lên men chống lại sự tạp nhiễm

- Cho phép sử dụng tế bào ở một pha riêng biệt đối với môi trường lên men

- Tạo điều kiện cho việc định vùng từng bộ phận trong thiết bị đối với các chủng loại vi sinh vật khác nhau

- Tăng độ ổn định hoạt tính trao đổi chất của tế bào khi có sự thay đổi pH, nhiệt

độ hay sự có mặt của các chất ức chế trong môi trường lên men

2.2.4 Chất mang trong kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật

2.2.4.1 Tính chất của chất mang

Các chất mang đóng vai trò quan trọng trong việc ảnh hưởng đến khả năng cố định tế bào vi sinh vật Chất mang phải đảm bảo các tính chất như sau:

- Không gây tác dụng kìm hãm đến tế bào

- Có độ hòa tan thấp và bền vững đối với tác dụng cơ học và hóa học

- Dễ dàng cố định tế bào vi sinh vật

- Một chất mang lý tưởng sử dụng trong cố định đòi hỏi trước hết là rẻ Điều này có liên quan đến hiệu quả kinh tế của quy trình công nghệ, đặc biệt có ý nghĩa khi quy trình đó ứng dụng ở quy mô công nghiệp

- Chất mang phải an toàn cho môi trường sống

- Chất mang tốt hơn cả là có bản chất háo nước, vì chất mang kỵ nước có thể gây ra tác dụng ức chế đến tế bào vi sinh vật đã được liên kết [11] Chất mang loại này thường là polypeptid, polysaccarit dẫn xuất cellulose, dextran (DEAE - Cellulose, CM – cellulose, DEAE – sephadex), agaroza và các chất polymer tổng hợp khác nhau như polyacrylamid, polystirol, polyamid và các chất vô cơ: silicagel, nhôm hydroxyt [11],[16],[53]

2.2.4.2 Các chất mang trong cố định tế bào

Chất mang được dùng để cố định tế bào vi sinh vật được phân theo sơ đồ hình 2.10

Hình 2.10 Sơ đồ các chất mang trong việc cố định tế bào

Chất

mang

Chất mang hữu cơ

Chất mang

vô cơ

Chất mang hữu cơ tự nhiên: cellulose, CM-cellulose, DEAE-cellulose, collagen, gel agar, K-carragenan, gel alginate, chitin, chitosan

Chất mang hữu cơ tổng hợp:

polyacrymic, polyester, polyvinylacetate, polyacrylamide, polyalcolhol

Chất mang vô cơ tự nhiên: zeolit, than hoạt tính, cát, silicat

Chất mang vô cơ tổng hợp:

aluminum oxide, silicum oxide, sợi bông thủy tinh

2.3 Tính chất của chất mang BC

Các tính chất của BC như độ cứng , độ dính, độ dai và ảnh hưởng của dung

dịch đường, muối, các chất gum (HM pectin, LM pectin) lên tính chất của BC đã được nghiên cứu Các mảnh BC có độ cứng là 3,68kg/cm2 Độ cứng của các miếng

BC giảm khi BC được nhúng vào dung dịch đường, HM pectin, LM pectin, carrageenan và độ cứng tăng lên khi được nhúng vào dung dịch muối [22]

Sản phẩm của BC có nhiều đặc tính phù hợp với các yêu cầu của chất mang trong kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật:

- BC có tính chất cơ lý bền và ổn định: độ chịu lực của BC khá cao, gần bằng với độ chịu lực của nhôm Tính chất cơ lý bền và ổn định của BC giúp cho chất mang chịu được sự tác động của môi trường như khuấy trộn hoặc các áp lực [5]

- Chất mang BC có thể tạo hình dạng phù hợp thiết bị phản ứng sinh học: hình dạng, kích thước của sản phẩm BC rất đa dạng và có thể chủ động tạo ra kích thước mong muốn (đối với S-BC) Đây là ưu điểm của BC so với các chất mang khác [1], [5]

- BC có khả năng giữ nước và độ ẩm cao [5]

- BC là dạng polymer có độ tinh sạch cao, không chứa lignin và hemicellulose

BC có thể dễ dàng bị phân hủy bởi một số nhóm vi sinh vật Vì vậy, BC được xem

là nguồn vật liệu mới có nhiều ưu thế trong tương lai

- Trọng lượng nhẹ, kích thước ổn định, sức căng và độ bền sinh học cao [5],[9],[50]

- BC đã qua xử lý không gây tác động kìm hãm đến hoạt động sống của tế bào

vi sinh vật cố định Sau giai đoạn xử lý, BC chỉ là giá thể trơ về mặt hóa học do đó không gây tác động kìm hãm đến hoạt động sống của vi sinh vật cố định [5]

- Giá thể BC có độ trương nở tốt giúp cho sự khuếch tán của cơ chất, sản phẩm Môi trường trong và ngoài chất mang không có sự khác biệt giúp cho vi sinh vật cố định giữ nguyên các đặc điểm của tế bào tự do [5]

Tuy nhiên BC cũng có nhược điểm là không thể cố định những vi sinh vật sản sinh ra cellulase vì enzyme nay sẽ phân hủy cellulose dùng làm chất mang [5]

Có rất nhiều nghiên cứu về BC và ứng dụng của nó trong nhiều lĩnh vực khác nhau Tuy nhiên công trình nghiên cứu trong và ngoài nước về BC sử dụng làm chất mang trong việc cố định vi sinh vật vẫn còn quá ít, mang tính chất thăm dò và chưa có nhiều công bố khoa học cụ thể Nguồn cellulose thực vật đã là chất mang kinh điển trong kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật Các nghiên cứu cơ bản đều

chứng minh BC của A.xylinum như là lớp màng bảo vệ và nhốt vi khuẩn, đã gợi mở

cho chúng tôi theo hướng ứng dụng mới này