Tối ưu sản lượng lipase pichia anomala bằng thiết kế thí nghiệm theo ma trận plackett burman và rsm ccd, nghiên cứu đặc điểm của lipase thu được

Đồng thời, chúng tôi cũng đã nghiên cứu một vài đặc điểm lipase P.anomala: pH hoạt động thích hợp 9,0; nhiệt độ hoạt động thích hợ 25oC, các ion kim loại không gia tăng hoạt tính mà làm

-

BÙI HỒNG QUÂN

Tối ưu sản lượng lipase

ma trận Plackett –Burman và RSM-CCD, nghiên cứu đặc điểm của lipase thu được

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 60 42 80

LUẬN VĂN THẠC SĨ Hướng dẫn khoa học: PGS.TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 11 năm 2008

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Đức Lượng

-

Cán bộ chấm nhận xét 1:

-

Cán bộ chấm nhận xét 2:

-

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA, ngày tháng …năm

Tp Hồ Chí Minh, ngày………tháng…….năm………

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Ngày, tháng, năm sinh: 14/09/1980 Nơi sinh: Nam Định

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học MSHV: 03106680

I- TÊN ĐỀ TÀI: Tối ưu sản lượng lipase Pichia anomala bằng thiết kế thí

nghiệm theo ma trận Plackett –Burman và RSM-CCD, nghiên cứu đặc điểm lipase thu được

II- NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Thực hiện theo mục tiêu nghiên cứu: Thiết lập

thí nghiệm theo ma trận Plackett-Burman và RSM-CCD để thu được sản lượng lipase có hoạt tính cao nhất và ứng dụng trong sản xuất bột giặt Nội dung nghiên cứu bao gồm:

1. Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hoá của chủng nấm men P.anomala

2 Sử dụng thiết kế thí nghiệm theo ma trận Plackett – Burman để sàng lọc các yếu tố lý hoá ảnh hưởng đến sản lượng lipase

3 Sử dụng thiết kế thí nghiệm cấu trúc có tâm và phương pháp bề mặt đáp ứng để xác định giá trị tối ưu của ba yếu tố cho sản lượng lipase cực đại

4 Thu nhận sinh khối nấm men Thu nhận lipase thô từ dịch nuôi cấy bằng kết tủa cồn lạnh

5 Nghiên cứu một vài đặc điểm của lipase P.anomala

6. Bổ sung lipase thu được vào một số bột giặt trên thị trường

III- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: tháng 01/2008

IV- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: tháng 11/2008

Thầy PGS.TS Nguyễn Đức Lượng người đã đưa ra phương hướng, mục tiêu cũng như hướng dẫn khoa học cặn kẽ cho em trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn này

Xin gửi lời tri ân đối với Cha mẹ và gia đình đã nuôi dưỡng con và là chỗ dựa cho con trong suốt cuộc đời này

Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Thầy TS Nguyễn Tiến Thắng, Cô TS Nguyễn Thúy Hương và các thầy cô khác đã truyền

đạt kiến thức, kinh nghiệm và dành cho em sự giúp đỡ quý báu

trong quá trình học tập và nghiên cứu tại bộ môn Công nghệ sinh học

Xin gửi lời cảm ơn đến TS Quyền Đình Thi, TS Ching Tsing Hou đã có những trao đổi, góp ý quý báu giúp tôi hoàn thành tốt luận văn này

Xin chân thành cảm ơn các Cô trong bộ môn Công nghệ sinh học đã giúp đỡ và tạo điều kiện làm việc tốt nhất cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn này

Xin chân thành cảm ơn Ông Nguyễn Văn Thái, giám đốc Trung tâm kiểm tra vệ sinh thú y trung ương II cùng các bạn đồng nghiệp của trung tâm đã tạo điều kiện cho tôi thực hiện một số thí nghiệm tại trung tâm

Xin cảm ơn những người bạn đã cùng tôi học tập, trao đổi,

động viên và có những trợ giúp cần thiết, đúng lúc cho tôi

Bùi Hồng Quân

Plackett –Burman và RSM-CCD, nghiên cứu đặc điểm của lipase thu được Tóm tắt

Mục tiêu nghiên cứu là thiết lập thí nghiệm theo ma trận Plackett-Burman

và RSM-CCD để thu được sản lượng lipase có hoạt tính cao nhất và ứng dụng trong sản xuất bột giặt

Thực hiện các phương pháp kiểm tra theo Kurtzman và Fell (1999); Dũng

và Lương (2006), chúng tôi đã xác định được đặc điểm sinh lý, sinh hoá của

chủng nấm men P.anomala Chủng nấm men có khả năng lên men đường

sucrose, glucose, không có khả năng lên men lactose, đồng hoá nhiều nguồn cacbon (sucrose, maltose, tinh bột, glycerol, D-manitol, citrate, lipid) và đồng hoá nitrate Nấm men phát triển tối ưu ở pH 9,0; nhiệt độ 25oC; giai đoạn phát triển cần nhu cầu ôxy cao

Nấm men Pichia anomala đã được tối ưu hoá quá trình nuôi cấy nhằm thu

được sản lượng lipase cực đại P.anomala có khả năng sinh tổng hợp lipase ở pH tối ưu 9,0 Chúng tôi đã sử dụng thiết kế thí nghiệm Plackett – Burman để kiểm tra mức độ ảnh hưởng của các yếu tố lý hoá khác nhau lên sản lượng lipase Trong đó, chiết nấm men, tỷ lệ giống và dầu ăn là ba yếu tố có tác động mạnh nhất Thiết kế thí nghiệm theo phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM)- phương án cấu trúc có tâm (CCD) đã được thực hiện và tìm ra giá trị tối ưu của ba yếu tố chiết nấm men (3,0%), tỷ lệ giống (2,37%; 108 tế bào/mL) và dầu ăn (4,19%) cho sản lượng lipase cực đại theo mô hình 18,8078 (U/mL) Mô hình đã được áp dụng vào thực tế với kết quả 100mL nuôi cấy lắc là 18,95 (U/mL) và 3,0L trong fermentor tự động là 22,52(U/mL) Đã thu nhận được 9,5g sinh khối nấm men ướt /100mL dịch nuôi cấy

Sau khi lên men fermentor, chúng tôi đã thu nhận 4,32g tủa protein thô (chứa enzym) từ 2L dịch nuôi cấy khi kết tủa bằng cồn lạnh

Đồng thời, chúng tôi cũng đã nghiên cứu một vài đặc điểm lipase

P.anomala: pH hoạt động thích hợp 9,0; nhiệt độ hoạt động thích hợ 25oC, các ion kim loại không gia tăng hoạt tính mà làm giảm hoạt tính của lipase (Li+ K+

Cu2+ Zn2+ Fe2+ Mg2+ Mn2+ Hg+ Ca2+ Al3+ Fe3+); EDTA và muối mật cũng làm giảm hoạt tính của lipase này

Với lipase thô thu được, chúng tôi đã bổ sung vào bột giặt Omo, Surf (Sản phẩm của Unilever Việt Nam), Only (Công ty CP Bột giặt Lix) Kết quả hoạt tính lipase giảm mạnh ngay sau khi trộn Omo (35%), Surf (41%), Only (62%) Sau 24 giờ hoạt tính bị mất hoàn toàn

Từ khoá: Pichia anomala, Lipase, Plackett –Burman, RSM-CCD, fermentor

Composite Designs - Response surface methodology to optimal lipase yield

by Pichia anomala and research properties of lipase

Summary

The aim of the present research is design experiments following Burman matrix and RSM-CCD to highest level lipase yield and apply to detergent power

Plackett-We tested yeast following Kurtzman and Fell (1999); Dung and Luong (2006) to determined property phisical and biochemical of the strain The strain could fermentation sucrose, glucose; couldn’t fermentation lactose; could assimilate many carbon sources (sucrose, maltose, starch soluble, glycerol, D-manitol, citrate, lipid) and N source nitrate The yeast strain could growth at optimum pH pH 9.0; at 25oC The growth stage needed oxygen at high level

Yeast Pichia anomala was optimized culture process for maximum lipase

production The pH optimum for this secretion is 9.0; this lipase of great promise can act very well at alkaline pH (pH>9) and be applied in detergent industry We use the design of optimum multifactorial experiments Plackett – Burman to estimate level effect of physical and chemical factors on lipase yield As the result, Yeast (%), inoculum’s size (%) and vegetable oil (%) were identified as significant factors After screening, these factors were subsequently optimized using the response surface methodology (RSM) - Central Composite Designs (CCD) These optimal levels were found out yeast extract (3.0%), inoculum’s size (2.37%; 108 cells mL-1) and vegetable oil (4.19%) in which the lipase yield is highest The regression equations (model) obtained and predicted maximum lipase yield 18.8078 (U/mL) We also verify model in shake- flasks (100mL) as well as automatic fermentor (3.0L) Lipase production yields were recorded from supernatant is 18.95 (U/mL) and 22.52 (U/mL), respectively We also take in 9.5g yeast biomass from 100mL supernatant culture

Two liter supernatant culture after fermentation was precipitated by cool ethanol and result 4.32g crude protein

Simultaneous, we studied some properties of lipase P.anomala: optimum

acitive pH 9.0; optimum active temperature 25oC, metals ionic not enhance activity that decrease activity of lipase (Li+ K+ Cu2+ Zn2+ Fe2+ Mg2+ Mn2+ Hg+ Ca2+

Al3+ Fe3+); EDTA and bile salt also decrease lipase activity

Crude lipase was mix with soap powder as Omo, Surf (Products of Unilever Viet Nam), Only (Lix Joint stock Company) Result as lipase activity strongly drop as soon as mixture Omo (35%), Surf (41%), Only (62%) After 24h, activity lost all

Key words: Pichia anomala, lipase, Plackett – Burman, Response surface

methodology (RSM)- Central composite designs (CCD), fermentor

Mục lục

Mục lục 1

Danh mục các hình 4

Danh mục các đồ thị 4

Danh mục các bảng 4

Chương 1 4

1 Đặt vấn đề 6

Chương 2 8

2 Tổng quan các nghiên cứu liên quan 8

2.1. Tổng quan nghiên cứu nấm men P.anomala 8

2.2 Tổng quan nghiên cứu lipase nấm men 12

2.2.1 Nguồn gốc và ứng dụng lipase nấm men 12

2.2.2 Tinh sạch protein và các thuộc tính hoá sinh 16

2.2.2.1. Lipase từ nấm men Pichia 16

2.2.2.2. Lipase từ các nấm men khác 17

2.2.3 Tạo dòng gen 24

2.2.3.1. Nấm men Pichia 24

2.2.3.2 Các nấm men khác 24

2.3 Nghiên cứu lipase các vi sinh vật khác 29

2.4 Ứng dụng của lipase vi sinh vật 33

2.4.1 Ứng dụng lipase trong công nghiệp thực phẩm 34

2.4.2 Ứng dụng lipase trong công nghiệp tẩy rửa 35

2.4.3 Ứng dụng lipase trong công nghiệp thuộc da, dệt, giấy 35

2.4.4 Ứng dụng lipase trong quản lý môi trường 36

2.4.5 Ứng dụng lipase trong công nghiệp hóa chất 36

2.4.6 Ứng dụng lipase trong hóa sinh dược và y tế 37

2.4.7 Ứng dụng lipase trong nông dược 38

2.4.8 Ứng dụng lipase trong mỹ phẩm và công nghiệp nước hoa 39

2.4.9 Ứng dụng lipase trong sản xuất biodiesel 39

Chương 3 42

3 Vật liệu và phương pháp 42

3.1 Chủng vi sinh vật 42

3.2 Thiết bị - Hoá chất môi trường 42

3.3 Phương pháp xác định lipase 42

3.3.1 Cơ sở lý thuyết 42

3.3.2. Định tính lipase P.anomala bằng phương pháp đục lỗ 45

3.3.3 Định lượng hoạt tính lipase bằng phương pháp chuẩn độ liên tục 46

3.4. Xác định đặc điểm sinh lý sinh hoá của chủng nấm men P.anomala 47

3.4.1 Cơ sở lý thuyết 47

3.4.2 Bố trí thí nghiệm 48

3.5 Sàng lọc các yếu tố quan trọng theo thiết kế Plackett-Burman 51

3.5.1 Cơ sở lý thuyết 51

3.5.2 Bố trí thí nghiệm 55

3.6 Tối ưu giá trị của ba yếu tố theo thiết kế cấu trúc có tâm theo phương pháp bề mặt đáp ứng 57

3.6.1 Cơ sở lý thuyết 57

3.6.2 Bố trí thí nghiệm 59

3.7 Thử nghiệm mô hình tối ưu ở điều kiện nuôi cấy lắc 100mL và fermentor 3,0L 61

3.8 Thu nhận lipase thô từ dịch nuôi cấy bằng kết tủa cồn lạnh .61

3.9. Nghiên cứu một vài đặc điểm của lipase P.anomala .61

3.9.1 pH hoạt động tối ưu 61

3.9.2 Nhiệt độ hoạt động tối ưu 62

3.9.3 Khả năng bền với nhiệt của enzym 63

3.9.4 Ảnh hưởng của ion kim loại và các chất kìm hãm 63

3.10 Bổ sung lipase vào bột giặt 64

3.10.1 Cơ sở lý thuyết 64

3.10.2 Bố trí thí nghiệm 67

Chương 4 70

4 Kết quả và bàn luận 70

4.1 Kết quả xác định đặc điểm sinh lý sinh hoá của chúng nấm men P.anomala và một số yếu tố ảnh hưởng 70

4.1.1. Kết quả đặc điểm sinh lý, sinh hoá của P.anomala 70

4.1.2. Kết quả ảnh hưởng giá trị pH khác nhau lên khả năng phát triển của

P.anomala 73

4.1.3 Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ lên khảnăng phát triển của P.anomala 74

4.2 Kết quả sàng lọc các yếu tố quan trọng theo thiết kế Plackett-Burman 76

4.3 Kết quả tối ưu giá trị của ba yếu tố theo thiết kế cấu trúc có tâm theo phương pháp bề mặt đáp ứng 78

4.4 Thử nghiệm mô hình tối ưu ở điều kiện nuôi cấy lắc 100mL và fermentor 3,0L 80

4.5 Thu nhận lipase thô từ dịch nuôi cấy bằng kết tủa cồn lạnh 82

4.6. Nghiên cứu một vài đặc điểm của lipase P.anomala 83

4.6.1 Kết quả xác định giá trị pH thích hợp cho hoạt động của enzym 83

4.6.2 Kết quả xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzym 84

4.6.3 Kết quả xác định độ bền của enzym với nhiệt độ 86

4.6.4 Kết quả xác định sự ảnh hưởng của một số ion kim loại, EDTA, muối mật lên hoạt tính của enzym .87

4.7 Kết quả bổ sung lipase vào bột giặt 88

Chương 5 90

5 Kết luận và kiến nghị 90

5.1 Kết luận 90

5.2 Kiến nghị 90

TÀI LIỆU THAM KHẢO 91 PHỤ LỤC 1 pL 1 PHỤ LỤC 2 pL 4 PHỤ LỤC 3 pL 5 PHỤ LỤC 4 pL 6 PHỤ LỤC 5 pL 7

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 3.1 Mô hình hoá thiết kế có tâm tổng quát cho hai yếu tố và ba

dạng CCD 58

Hình 4.1 Hình dạng tế bào, cách thức nảy chồi của P.anomala 70

Hình 4.2 Hình dạng khuẩn lạc P.anomala trên môi trường Sabouraund 2% glucose sau 48 giờ nuôi cấy 71

Hình 4.3 Khả năng phân giải lipid trên môi trường chiết nấm men – nhũ tương dầu ăn 72

Hình 4.4 Khả năng phát triển của P.anomala trên Sabouraund 2% glucose ở pH 8,9,10 74

Hình 4.5 Kết quả nhiệt độ hoạt động tối ưu của enzym trên thạch đĩa 85

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ Đồ thị 4.1 Đường cong tăng trưởng của P.anomala trên Sabouraund 2% glucose 73

Đồ thị 4.2 Kết ảnh hưởng giá trị pH khác nhau lên khả năng phát triển của P.anomala 73

Đồ thị 4.3 Mặt đáp ứng sản lượng lipase theo tỷ lệ giống và dầu ăn 80

Đồ thị 4.4 Mặt đáp ứng sản lượng lipase theo tỷ lệ giống và chiết nấm men 80

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Chủng nấm men sinh tổng hợp lipase 13

Bảng 2.2 Tính đặc hiệu cơ chất của lipase một số dòng Pichia 16

Bảng 2.3 Lipase tự do và lipase cố định dùng trong sản xuất biodiesel 41

Bảng 3.1 Tóm tắt một số phương pháp xác định hoạt tính lipase 43

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của tween kết hợp với chất nhiễm sắc và các hệ thống cơ chất khác trong xác định hoạt tính lipase 46

Bảng 3.3 Các chỉ tiêu kiểm tra sinh hoá P.anomala 49

Bảng 3.4 Bố trí thí nghiệm xác định giá trị pH phát triển thích hợp 50

Bảng 3.5 Bố trí thí nghiệm xác định giá trị nhiệt độ phát triển thích hợp 50

Bảng 3.6 Bố trí thí nghiệm xác định giá trị pH phát triển thích hợp 51

Bảng 3.7 Các mức của 11 yếu tố trong thiết kế Plackett-Burman 55

Bảng 3.8 Mã hoá thiết kế thí nghiệm theo ma trận Plackett-Burman 57

Bảng 3.9 Giá trị Các điểm sao α trong thiết kế CCD 59

Bảng 3.10 Nồng độ ba yếu tố dùng trong RSM –CCD 60

Bảng 3.11 Mã hoá thiết kế thí nghiệm theo CCD 60

Bảng 3.12 Thành phần của chất tẩy có enzym 65

Bảng 3.13 Thành phần chất tẩy có chứa enzym lipase và protease công thức 1 66

Bảng 3.13 Thành phần chất tẩy có chứa enzym lipase và protease công thức 2 67

Bảng 3.14 Thành phần bột giặt Surf (một sản phẩm của Unilever Việt nam) 67

Bảng 3.15 Thành phần bột giặt Only (Công ty CP Bột giặt Lix) 68

Bảng 3.16 Thành phần bột giặt Omo (một sản phẩm của Unilever Việt nam) 69

Bảng 4.1 Kết quả kiểm tra hình thái và sinh sản của P.anomala 70

Bảng 4.2 Kết quả kiểm tra đặc tính sinh hoá của nấm men P.anomala 71

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng phát triển của P.anomala 74

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của độ thông khí lên khả năng phát triển của P.anomala 75

Bảng 4.5 Kết quả thực nghiệm và suy đoán ma trận thiết kế thí nghiệm Plackett-Burman 76

Bảng 4.6 Mức độ ảnh hưởng của cá yếu tố lên sản lượng lipase 77

Bảng 4.7 Kết quả thực nghiệm theo RSM-CCD để tối ưu hoá sản lượng lipase

78

Bảng 4.8 Sản lượng lipase, sinh khối P.anomala ghi nhận được từ 100mL, 3,0L môi trường tối ưu 81

Bảng 4.9 Kết quả thu nhận enzym thô 82

Bảng 4.10 Hoạt tính lipase ở các giá trị pH khác nhau 84

Bảng 4.11 Kết quả kiểm tra độ bền của enzym ở các nhiệt độ khác nhau 86

Bảng 4.12 Kết quả ảnh hưởng của ion kim loại và chất ức chế lên hoạt tính lipase P.anomala 87

Bảng 4.13 Kết quả bổ sung lipase thô vào bột giặt 88

1 Đặt vấn đề

Mối quan tâm cũng như việc sử dụng enzym lipase trong các ngành công nghiệp

đã gia tăng trong những năm gần đây Việc ứng dụng lipase gia tăng đồng thời với những phát hiện ứng dụng lipase trong các lĩnh vực mới làm gia tăng nhu cầu lipase Thị phần enzym lipase trên thị trường thế giới ngày càng gia tăng Trong đó, lipase từ các vi sinh vật có một ý nghĩa vô cùng quan trọng trong các ngành công nghiệp công nghệ sinh học hiện nay Lipase vi sinh vật đang được ứng dụng trong các lĩnh vực như: thực phẩm, hoá học, dược phẩm, mỹ phẩm, thuộc da, công nghiệp tẩy rửa, sản xuất biodiesel, sản xuất các polymer phân huỷ sinh học, y học ứng dụng, công nghiệp giấy và chế tạo các biosensor

Trên thế giới, nghiên cứu về enzym lipase vi sinh vật đã đạt được những thành

tựu đáng kể Nghiên cứu lipase vi sinh vật tập trung vào vi khuẩn (Pseudomonas spp., Bacillus spp ); nấm mốc (Aspergillus spp., Rhizopus spp., ); nấm men (Candida spp., Geochitrum spp., Yarrowia spp.,…) Ở Việt Nam, sản xuất enzym ở

quy mô công nghiệp còn hạn chế Đã có nghiên cứu enzym lipase nhưng còn hạn chế, cho đến tháng 11/2008 chỉ dưới 20 công bố chủ yếu của nhóm tác giả Q.Đ Thi

và cs., việc tìm kiếm nguồn lipase mới có khả năng chịu kiềm, chịu acid, chịu nhiệt

vẫn là một chủ đề thu hút sự chú ý của các nhà khoa học

Pichia anomala có thể phát triển dưới điều kiện môi trường khắc nghiệt như pH thấp và pH cao, môi trường có hoạt tính nước thấp, điều kiện áp suất thẩm thấu cao

và điều kiện yếm khí Nấm men P.anomala đã được nghiên cứu sâu về sinh tổng

hợp ethyl acetate, độc tố giết, hệ enzym (phytase, amylase, invertase, ), khả năng kháng nấm và điều khiển sinh học trong quá trình bảo quản ngũ cốc Lipase

P.anomala chưa được nghiên cứu nhiều như các lipase từ nấm men khác như

Candida rugosa Ở Việt Nam, đã có một số nghiên cứu phân lập P.anomala từ bánh men rượu đăng trên các tạp chí quốc tế (Thanh và cs., 2008; Dung và cs., 2007)

Tối ưu hoá quá trình lên men để xây dựng mô hình nhằm thu được sản lượng lớn

và gia tăng quy mô sản xuất có một ý nghĩa quan trọng trong việc ứng dụng những nghiên cứu cơ bản vào trong công nghiệp Bất cứ một quá trình lên men nào cũng bị ảnh hưởng bởi các yếu tố vật lý cũng như sinh hoá học khác nhau Bước đầu tiên để tối ưu hoá là sàng lọc các yếu tố quan trọng sau Một cách đơn giản và thuận tiện là tối ưu từng yếu tố trong khi giữ nguyên các yếu tố khác Cách thực hiện này tốn

thời gian và không xác định được sự tác động qua lại của các yếu tố Thiết kế thí nghiệm tối ưu đa yếu tố theo Plackett – Burman đã được áp dụng hiệu quả, chi phí thấp, cho phép nghiên cứu sự tương tác và đồng thời tiên đoán được phạm vi của các yếu tố Sau đó, thí nghiệm tối ưu theo phương pháp RSM–CCD1 được dùng để xác định giá trị tối ưu các yếu tố đang được nghiên cứu

Từ chủng P.anomala mua từ Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật Việt Nam IMBT

– VNU có hoạt tính lipase, chúng tôi đã dùng chủng nấm men này để thực hiện đề

tài: Tối ưu sản lượng lipase Pichia anomala bằng thiết kế thí nghiệm theo ma

trận Plackett –Burman và RSM-CCD, nghiên cứu đặc điểm lipase thu được

Mục tiêu nghiên cứu là thiết lập thí nghiệm theo ma trận Plackett-Burman và CCD để thu được sản lượng lipase có hoạt tính cao nhất và ứng dụng trong sản xuất bột giặt Nội dung nghiên cứu bao gồm:

RSM-1. Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hoá của chủng nấm men P.anomala

2 Sử dụng thiết kế thí nghiệm theo ma trận Plackett – Burman để sàng lọc các yếu tố lý hoá ảnh hưởng đến sản lượng lipase

3 Sử dụng thiết kế thí nghiệm cấu trúc có tâm và phương pháp bề mặt đáp ứng để xác định giá trị tối ưu của ba yếu tố cho sản lượng lipase cực đại

4 Thu nhận sinh khối nấm men

5 Thu nhận lipase thô từ dịch nuôi cấy bằng kết tủa cồn lạnh

6. Nghiên cứu một vài đặc điểm của lipase P.anomala

7 Bổ sung lipase thu được vào một số bột giặt trên thị trường

1 RSM-CCD: Response surface methodology- Central composite designs: phương pháp bề mặt đáp ứng – các thiết kế cấu trúc có tâm

2 Tổng quan các nghiên cứu liên quan

2.1. Tổng quan nghiên cứu nấm men P.anomala

Nấm men P.anomala (E.C Hansen) Kurtzman đã được phân lập ở ổ khu trú tự

nhiên và nhân tạo (Kurtzman, 1999) Nó thường được tìm thấy trong nước uống và

thực phẩm lên men tự nhiên (Masoud và cs., 2004; Sujaya và cs., 2004) và thuộc về nhóm non-Saccharomyces trong rượu vang (Rojas và cs., 2003) P.anomala có thể

phát triển dưới điều kiện môi trường khắc nghiệt như pH thấp và pH cao, hoạt tính

nước thấp, điều kiện áp suất thẩm thấu cao và điều kiện yếm khí (Fredlund và cs.,

2002) Nhờ vào các đặc tính này, nấm men này có thể gây hư hỏng những thực

phẩm có độ đường cao (Tokuoka và cs., 1985; Lanciotti và cs., 1998) P.anomala

cũng được tìm thấy trong lâm sàng và được coi như vi sinh vật nhiễm trùng cơ hội (Hazen, 1995) Mặc dù có thể phát triển trong khoảng pH rộng và áp suất thẩm thấu

cao, nhưng P.anomala lại không có khả năng kháng ethanol và acetate (Kalathenos

và cs., 1995; Fredlund và cs., 2002) P.anomala có khả năng ngăn chặn nhiều loại

nấm mốc khác nhau và đem lại khả năng điều khiển sinh học nấm mốc trên cây nho

và quá trình bảo quản sau thu hoạch của táo và ngũ cốc (Jijakli và Lepoivre, 1998;

Petersson và Schnurer, 1998; Masih và cs., 2000; Druvefors và cs., 2002) Sinh lý học và di truyền của P.anomala còn ít được nghiên cứu Báo cáo đầu tiên về các đặc

điểm sinh lý, di truyền, thao tác di truyền của P.anomala, đã được công bố

(Grevesse và cs., 2003; Naumov và cs., 2001; Fredlund và cs., 2004)

P.anomala (tên cũ Hansenula anomala; đồng hình dạng với Candida pelliculosa

Redaelli, một số tên đồng nghĩa và các đặc điểm khác [phụ lục 1]) thuộc nhóm nấm men bào tử túi, hình thành từ 1 đến 4 bào tử có dạng mũ (Wickerham và Burton,

1954; Dũng và cs., 2006) Nó được phân lập và miêu tả lần đầu tiên bởi Hansen vào năm 1894; Hansen đặt tên là Saccharomyces anomalusi Hansen Sau đó, Hansen phân loại lại và chuyển S.anomalus Hansen cùng với S.saturnus Klocker thành một giống nấm men Willia mới Tuy nhiên, năm 1919, Sydow đã xếp toàn bộ các loài trong giống Willia thành một giống Hansenula mới Giống Hansenula và Pichia lúc

đầu được chia theo khả năng đồng hóa nitrate như là nguồn nitơ duy nhất Tuy nhiên, sự khác nhau về khả năng đồng hoá nitrate không đủ để sắp xếp vào hai

giống Các loài của giống Hansenula tạo bào tử hình mũ được phân loại lại thành giống Pichia (Kurtzman, 1984) Sự phân loại lại hiện nay đã được chấp nhận rộng

rãi, tuy nhiên, nhiều báo cáo vẫn đề nghị dùng H anomala và đề nghị phục hồi lại tên Hansenula (Yamada và cs., 1994; Naumov và cs., 2001) Sự đề nghị này dựa

trên sự nghiên cứu phát sinh loài của 500 nấm men bào tử túi, trong đó hầu hết các

nấm men trong giống Hansenula (bao gồm cả P.anomala) hình thành một nhánh

phát sinh (Kurtzman và Robnett, 1998)

Hiện nay, trên thế giới chỉ có một vài kết quả nghiên cứu về di truyền của

P.anomala P.anomala phân lập từ tự nhiên thường ở dạng nhị bội (Naumov và cs.,

2001) Naumov và cs (2001) chỉ ra khả năng hình thành giới tính và bào tử hoá

giữa các dòng P.anomala khác nhau Akira (1970) cho rằng số lượng nhiễm sắc thể (NST) của H.anomala là 2n=4 Tuy nhiên, Naumov và cs (2001) đã xác định rằng

số lượng NST của P.anomala khoảng 9–12 NST với kích thước từ 850 đến 3500kb Tương tự như các loài khác (Scherer và Magee, 1990; Passoth và cs., 1992; Bai và

cs., 2000), nhiễm sắc thể của các dòng P.anomala thể hiện tính đồng hình cao (Aragao và cs., 2001; Naumov và cs., 2001; Zagorc và cs., 2001; Recek và cs., 2002) Nhiều gen của P.anomala đã được tạo dòng và được phân tích

Ogata và cs (1995) lần đầu tiên mô tả hệ thống biến nạp trên cơ sở của dòng đơn bội ura3 phân lập từ quá trình xử lý nước thải Hệ thống biến nạp khác được phát triển bởi Grevesse và cs (2003) cũng dựa trên cơ sở tính tương đồng của đột

biến ura3

Hoạt tính của độc tố giết được thể hiện trong nhiều dòng P.anomala (Fredlund

và cs., 2002) Các độc tố khác nhau sẽ khác nhau đáng kể về hoạt tính, đặc tính phân tử, trọng lượng phân tử, thành phần acid amin, pH và nhiệt độ tối ưu, mức độ glycosyl hóa và điểm đẳng điện Độc tố chịu nhiệt duy trì hoạt tính sau 5 giờ ủ ở

60oC và chỉ mất hoạt tính ở 100oC/25 phút

P.anomala sản xuất ethanol trong môi trường hạn chế nguồn ôxy, trong điều kiện nuôi cấy hiếu khí hoàn toàn chỉ một ít ethanol được tạo thành Acetate đuợc sản xuất trong quá trình hô hấp nhưng không sản xuất dưới điều kiện thiếu ôxy

(Fredlund và cs., 2004) P.anomala sản xuất một lượng nhỏ các hợp chất bay hơi,

trong đó phần lớn là ethyl acetate và các hợp chất khác như: ethyl propanoate, phenyl ethanol và 2-phenylethyl acetate (Westall, 1999) Các con đường chuyển

hóa này chịu tránh nhiệm tổng hợp các ester ở P.anomala có sự khác biệt so với ở

Saccharomyces cerevisiae Ở S.cerevisiae, ethyl acetate được tạo ra từ

acetyl-coenzyme A và ethanol bằng phản ứng của enzym alcohol acetyl transferase

(Yoshioka và Hashimoto, 1981) Ngược lại, P.anomala thường tổng hợp ester từ

acetate và ethanol theo phản ứng esterase ngược (Yoshioka và Hashimoto, 1981;

Rojas và cs., 2002) Ethyl acetate được sản xuất bởi P.anomala khi có mặt glucose

và có độ thoáng khí khác nhau Sự gia tăng ôxy làm giảm ethyl acetate tạo thành

(Gray, 1949; Tabachnick và Joslyn, 1953; Fredlund và cs., 2004) Khi thay đổi từ

điều kiện hiếu khí đến giảm nguồn ôxy, tỷ lệ các sản phẩm đặc biệt được gia tăng

hơn 10 lần (Fredlund và cs., 2004) Ngược lại, Rojas và cs (2001) nhận thấy có sự

giảm ethyl acetate trong điều kiện thiếu ôxy khi so sánh với điều kiện hiếu khí Ethyl acetate cũng có hiệu quả kháng nấm và có thể góp phần vào hoạt động điều

khiển sinh học của P.anomala trong quá trình bảo quản ngũ cốc (Fredlund và cs., 2004; Druvefors và cs., 2005) Khi P.anomala phát triển trên hạt lượng ester đáng

kể đã được tạo thành (Fredlund và cs., 2004; Druvefors và cs., 2005)

Do đặc điểm sinh lý của P.anomala mà chúng có thể phát triển trong điều kiện

áp suất thẩm thấu cao và khoảng pH rộng (Kagiyama và cs., 1988; Fredlund và cs.,

2002), nó là sinh vật thông thường trong sữa và các sản phẩm nướng, bia, môi

trường có nồng độ muối cao và thức ăn gia súc (Kagiyama và cs., 1988; Kitamoto

và cs., 1999; Frohlich-Wyder, 2003) Mặt khác, nấm men này cũng ứng dụng trong

thực phẩm; tạo hương cho thực phẩm và sản phẩm nhũ hóa sinh học (Shepherd và

cs., 1995; Chen và cs., 1998a) P.anomala thường có mặt trong đồ uống, rượu vang (Mora và Mulet, 1991; Regueiro và cs., 1993; Manzanares và cs., 1999; Zagorc và

cs., 2001) P.anomala thường làm gia tăng hương vị rượu vang bằng cách tạo ra các

hợp chất bay hơi, chủ yếu là ethyl acetate, nhưng cũng có thể sản xuất ra

glycosidase và xylosidase (Manzanares và cs., 1999, 2000; Rojas và cs., 2001) Tuy

nhiên, nồng độ ethyl acetate quá cao (200mg/L) làm rượu vang có vị khó chịu

P.anomala có trên trái cây, nước ép trái cây (Deak và Beuchat, 1993; Oyewole,

2001; Las Heras-Vazquez và cs., 2003) và các loại nước từ nho, cam Cazorla và cs., 2003) P.anomala thể hiện vai trò quan trọng trong nhiều loại thực

(Mingorance-phẩm lên men truyền thống như lên men “brem” (rượu gạo của người Balinese), cà

phê, cacao (Sujaya và cs., 2004), “Hamei” (men sản xuất rượu gạo ở Manipur, Ấn

độ) (Jeyaram và cs., 2008) P.anomala cũng được dùng để sản xuất ribonucleotide

và nucleoside dùng để điều vi trong thực phẩm (Kim và cs., 2002; Lee và cs., 2004)

P.anomala có thể ức chế những vi sinh vật có hại ở những môi trường khác nhau như một tác nhân điều khiển sinh học (Bjornberg và Schnurer, 1993; Petersson và

Schnurer, 1995, 1998; Petersson và cs., 1998, 1999; Boysen và cs., 2000; Druvefors

và cs., 2002; Druvefors và Schnurer, 2005) P.anomala ức chế Botrytis cinerea trên

táo và trên nho do tiết enzym ly giải vách tế bào (Jijakli và Lepoivre, 1998; Masih

và cs., 2000; Santos và cs., 2004) Hoạt tính kháng nấm của P.anomala do nhiều

yếu tố, sự đứt gãy gen PaEXG2 mã hóa một enzym exoglucanse ngoại bào không

làm giảm hoạt tính kháng nấm của dòng P.anomala tái tổ hợp (Jijakli và Lepoivre, 1998) Druvefors và Schnurer (2005) đã xác định P.anomala là một trong số 60 loài khác nhau có khả năng ức chế Penicillium roqueforti Nhiều nấm men phát triển ở mức tương tự P.anomala mà không có khả năng ức chế nấm mốc Cơ chế kháng nấm chính của P.anomala không phải do cạnh tranh về không gian và dinh dưỡng

Tăng dinh dưỡng trong điều kiện thí nghiệm điều khiển sinh học không làm suy

giảm hoạt tính kháng nấm của P.anomala Tăng lượng glucose làm gia tăng hoạt tính kháng nấm của P.anomala J121 mà không thay đổi sinh khối nấm men

Glucose khi thêm vào môi trường nuôi cấy không ức chế nấm mốc kiểm chứng

(P.roqueforti) Sản phẩm từ chuyển hóa glucose có hoạt tính kháng nấm (Druvefors

và cs., 2005) Nấm bị ức chế do sự gia tăng nồng độ và hoạt tính kháng nấm của

ethyl acetate (Fredlund và cs., 2004; Druvefors và cs., 2005) Dòng đơn bội

P.anomala CBS 1984 nuôi cấy ở độ hoạt động của nước aw0,95 sản xuất ít ethyl acetate hơn aw0,98 và giảm khả năng kháng nấm P.roqueforti (Fredlund và cs.,

2004) Một cơ chế kháng nấm khác trên ngũ cốc có thể do hình thành ethanol, tiêu thụ ôxy và sản xuất CO2 (Druvefors, 2004; Druvefors và cs., 2002, 2005) Độc tố giết của P.anomala cũng có một khả năng chống lại các nấm mốc và nấm men không mong muốn (Walker và cs., 1995) Độc tố giết của P.anomala chống lại các nấm men gây hư hỏng rượu vang (Comitini và cs., 2004)

Khi phát triển trên hạt ngũ cốc, nó có thể tăng một phần giá trị của hạt do nó là nguồn pprotein và vitamin (Litchfield, 1983) Với khả năng đồng hóa nhiều loại hợp chất nitơ, nó có thể chuyển hợp chất nitrate và ammonium thành protein để

dùng trong chăn nuôi (Mo và cs., 2004) P.anomala sinh tổng hợp lượng lớn

phytase (myoinositol hexaphosphate phosphohydrolase, E.C 3.1.3.8 và 3.1.3.26 phân cắt phytate, hợp chất phosphate dự trữ trong thực vật, tạo nên giá trị dinh

dưỡng cho động vật Vì vậy, P.anomala có thể cải thiện giá trị dinh dưỡng của thức

ăn và giảm gánh nặng cho môi trường bằng cách giảm lượng phospho chứa trong phân bón (Vohra và Satyanarayana, 2004)

P.anomala là vi sinh vật nhiễm trong nhiều loại thực phẩm và thức ăn gia súc khác nhau Tuy nhiên, nó kh ng gây hại đến sức khỏe con người nấm men này

k ông sản x ất ra mycotoxinn (Fleet, 1992) P.anomala được xác định như là tác

nhân không gây bệnh (vi sinh vật an toàn sinh học cấp 1 – ATCC [phụ lục 2]), không có bất cứ sự giới hạn nào trong sản phẩm và không có bất cứ mối nguy nào cho sức khỏe con người (DeHoog, 1996)

Kết quả nghiên cứu lipase sinh tổng hợp bởi P.anomala đã được báo cáo (Hou, 1994; González và cs., 2004) nhưng chưa nhiều P.anomala cũng có vai trò quan trọng trong lên men dầu ô liu (López và cs., 2008)

Tại việt nam, đã có nghiên cứu phân lập P.anomala từ bánh men rượu (Dung và

cs., 2007; Thanh và cs., 2008)

2.2 Tổng quan nghiên cứu lipase nấm men

Lipase (EC 3.1.1.3) [phụ lục 5] được tổng hợp bởi: vi khuẩn, nấm mốc và các

loại tế bào thực vật và động vật (Sztajer và cs., 1988; Rapp và Backhaus, 1992; Olson và cs., 1994; Ohnish và cs., 1994) Lipase thực hiện phản ứng thuỷ phân các

liên kết ester giữa glycerol và acid béo Lipase tác động lên nhiều cơ chất khác nhau: dầu tự nhiên, các triglyceride và các liên kết ester của acid béo Lipase tác động đến nhiều vị trí khác nhau trên các cơ chất, do đó, nó được ứng dụng nhiều trong công nghiệp: thực phẩm, hoá học, dược phẩm, mỹ phẩm, thuộc da và công

nghiệp tẩy rửa (Starace, 1983; Tatara và cs., 1985; Reetz và Jäeger, 1998; Yoshikiko Yasohara và cs., 2001)

2.2.1 Nguồn gốc và ứng dụng lipase nấm men

Các lipase được sản xuất bởi nhiều nấm men khác nhau Hou (1994) đã nghiên cứu 143 loài nấm men có khả năng sinh enzym lipase (trong tổng số 479 nấm men được kiểm tra) về mức độ chịu pH và mức độ chịu nhiệt Trong nghiên cứu này, Hou đã xác định Bốn chủng nấm men sản sinh lipase hoạt động ở pH 7,5 mà không hoạt động ở pH 5,5 Hai mươi ba (23) chủng nấm men sản sinh lipase hoạt động ở

pH 5,5 mà không hoạt động ở pH 7,5 Chín mươi (90) chủng nấm men sản sinh lipase hoạt động ở cả pH 5,5 và 7,5 Hai mươi sáu (26) chủng nấm men sản sinh

lipase hoạt động ở pH 9,0 ở 60oC [phụ lục 3] Tuy nhiên, trong nghiên cứu của mình, Hou chỉ khẳng định các chủng nấm men không sinh tổng hợp ở pH 9,0 và tại

60oC; ở nhiệt độ khác không có kết luận gì Năm 1997, Hou đã xác định một số đặc điểm của một số nấm men này

Lipase C.rugosa nhanh chóng trở thành một trong những enzym được dùng

nhiều nhất trong công nghiệp Đó là bởi vì sự hoạt động linh hoạt của nó trong cả

thủy phân và sinh tổng hợp (Redondo và cs., 1995) Một công ty Nhật Bản đã dùng lipase C.rugosa để sản xuất acid béo cuối năm 1985 (Macrae và Hammond, 1985)

Pandey và cs (1999) đã thử nghiệm sản xuất chất mùi trong sữa đặc và kem bằng

cách dùng lipase vi sinh vật Lipse cố định Candida antarctica AY30 được dùng để

ester hoá các phenol chức năng để tổng hợp chất chống ôxy hoá lipophillic dùng

cho dầu hướng dương (Pandey và cs., 1999)

Bảng 2.1

Chủng nấm men sinh tổng hợp lipase

Tên nấm men Tác giả và năm công bố

Arxula adeninivorans Boer và cs., 2005

Candida albicans Hube và cs., 2000; Stehr và cs., 2004; David A Schofield

và cs., 2005; Attila Gacser và cs., 2007

Candida antarctica

Svendsen và cs., 1994; Høegh và cs., 1995; Patkar và cs., 1998; Rotticci và cs., 2001; Jan Pfeffer và cs., 2006; Larsen và cs., 2008; Suhyun Jung & Seongsoon Park

2008

Candida curvata Montet và cs., 1985

Candida cylindracea Lee và Choo 1989; Hirofumi Nakano và cs., 1991

Candida deformans

CBS 2071

Muderhwa và cs., 1985 Bigey và cs., 2003

Candida ernobii Pignede và cs., 2000a; Pignede và cs., 2000b

Candida entomophila Fujimoto và cs., 1996

Candida lipolytica Padmini và cs., 1990

Candida parapsilosis

CBS 604

Bri và và cs., 1995 Neugnot và cs., 2002

Candida paralipolytica Vecozola và Bekers 1978

Benjamin và Pandey, 2001 Veeraragavan và Gibbs, 1989

Fadiloglu và Erkmen 2002; Shaw và cs., 2006; Chiun Lee và cs., 1999;

Guan-Candida rugosa Fusetti và cs., 1996; Zhao và cs., 2008

Candida utilis Fujino và cs 2006

Bảng 2.1 (tiếp theo)

Chủng nấm men sinh tổng hợp lipase

Tên nấm men Tác giả và năm công bố

Geotrichum sp FO401B Ota và cs., 2000

Jacobsen và Poulsen 1992

Geochitrum candidum E Vandamme và cs., 1987

Kurtzmanomyces sp I-11 Kakugawa và cs., 2002

Kluyveromyces lactis Oishi và cs.,1999

Pichia burtonii Sugihara và cs., 1995

Pichia anomala Hou 1994

Rhodotorula rubra Rapp và Backhaus 1992

Rhodotorula glutinis Papaparaskevas và cs., 1992

Saccharomyces cerevisiae Oishi và cs.,1999

Saccharomycopsis fibuligera Pandey và cs.,1999

Saccharomycopsis lipolytica Ruschen và Winkler 1982

Schizosaccharomyces pombe Smerdon và cs., 1998

Trichosporon asteroids Dharmsthiti và Ammaranond 1997

Trichosporon cutaneum Chen và cs.,1993

Trichosporon fermentans

WU-C12

Chen và cs., 1992; Chen và cs., 1993; Chen và cs., 1994; Arai và cs., 1997

Yarrowia lipolytica Hadeball và cs., 1991; Ota và cs., 1982; Destain và cs.,

1997; Pignede và cs., 2000a; Pignede và cs., 2000b

M ột số nấm men khác xin xem thêm phụ lục 3

Uppenberg và cs (1994) đã dùng lipase tái tổ hợp của C.antarctica trong chất tẩy rửa Lipase ngoại bào của C.cylindracea ATCC 14830 (CCL/CRL) thuỷ phân

các triglyceride không đặc hiệu, tác động cả vào vị trí của phân tử glycerol và cả trong acid béo tự nhiên được giải phóng Sự đặc trưng linh động này có quan hệ với

các lipase khác tạo tính hữu dụng đặc biệt của CCL/CRL ứng dụng trong công nghiệp (Lotti và cs., 1993)

Trong công nghiệp tẩy rửa, lipase C.cylindracea và C.lypolytica (hiện nay gọi là

Y.lipolytica ) được dùng để phân cắt vết lipid (Pierce và cs., 1990; Batenburg và cs.,

1991) Polyglycerol và các ester của carbohydrate và acid béo sản xuất bằng xúc tác lipase được dùng rộng rãi trong công nghiệp tẩy rửa và nhũ hóa trong các thực phẩm khác nhau (thực phẩm ít béo, kem, mayonaise) Gần đây, Unichem International đã bắt đầu sản xuất isopropyl myristate, isopropyl palmitate và 2-

ethylpalmitate để làm mềm các sản phẩm chăm sóc cá nhân Các hợp chất này được

sản xuất bằng xúc tác enzym lipase C.cylindracea trong bioreactor

Một hứa hẹn trong một lĩnh vực mới là dùng lipase vi sinh vật như các

biosensor Lipase được dùng để xác định lipid trong lâm sàng (Pandey và cs., 1999)

Nguyên lý cơ bản là dùng lipase để sinh ra glycerol từ triacylglycerol và định lượng glycerol được giải phóng hoặc acid béo tự do bằng phương pháp hoá học và enzym Nguyên tắc này cho phép các bác sỹ chân đoán chính xác các bệnh nhân bị bệnh tim

mạch Các lipase không đặc hiệu, đặc biệt C.rugosa với hoạt tính đặc hiệu cao đã

được chọn lựa cho phép nhanh chóng phóng thích glycerol

Sự ứng dụng lipase trong tổng hợp hữu cơ rất to lớn Chọn lọc lập thể của lipase

để hoà tan hỗn hợp acid racemic trong hệ thống hai pha không trộn lẫn vào nhau đã được chứng minh Hiệu qủa động học các quá trình hoà tan đang thịnh hành trong tổng hợp Niknomycin-B, thuốc kháng viêm (không phải steroid Naproxen), ibuprofen, suprofen và ketoprofen, tác nhân kháng virus lamividine (chống lại HIV), tổng hợp đặc hiệu đối hình các tác nhân alkaloid kháng ung thư, các kháng

sinh và các vitamin (Pandey và cs., 1999) Hernaiz và cs (1997) đã phân lập hai dạng lipase đồng phân chọn lọc lập thể A và B từ C.cylindracea Sản xuất các amin

có hoạt tính quang học là các chất trung gian trong sản xuất dược chất và chất bảo

vệ thực vật đã được miêu tả bởi Smidt và cs (1996) Lipase C antarctica với đặc

hiệu lập thể các N-acylamine là thích hợp nhất Hoạt tính chọn lọc lập thể của lipase

C.rugosa xúc tác hình thành dạng S các dẫn xuất của acid propionic Dạng S sau đó được biến đổi thành dạng R có hiệu quả chống lại côn trùng Tetramuchus (Pandey

và cs., 1999) Các triglyceride, các ester steryl, các acid resin, các acid béo và các sterol được chiết tách từ gỗ nhờ phản ứng thuỷ phân lipid (dầu hắc ín hoặc nhựa

thông) có tác động xấu đến quá trình sản xuất và chất lượng của giấy (Nguyen và

cs., 2008) Kontkanen và cs (2004) trong nghiên cứu của họ đã kiểm tra 19 loại enzym thương mại làm phá hủy các ester của steryl Họ đã thấy lipase

Pseudomonas sp., Chromobacterium viscosum và C.rugosa được thể hiện có hoạt tính esterase steryl cao nhất Tất cả ba loại enzym trên có thể thuỷ phân ester steryl hoàn toàn khi có mặt chất hoạt động bề mặt Kontkanen và cs (2004) cho rằng nhờ

vào đặc tính sơ cấp các lipase nấm men đã biết, lipase C.rugosa (CRL) có tiềm năng

nhất trong công nghiệp

Lipase đã được dùng để sản xuất và biến đổi polymer (Gubitz và Paulo 2003),

tổng hợp chất kháng khuẩn đường ester (Ferrer và cs., 2005) Để sản xuất polymer

từ các vật chất cellulose, một cách tiếp cận mới đã được phát triển bởi Gustavsson

và cs (2004) Họ dùng lipase B C.antarctica kết hợp với cellulose để xúc tác

polymer hoá mở vòng của ε-caprolactone ngay trên bề mặt của sợi cellulose Wang

và cs (2003) đã chứng minh hiệu quả xúc tác sinh học lipase B của C.antarctica

(CAL B) trong thủy phân 1-hoặc 2-hydroxyalkanephosphonate

2.2.2 Tinh sạch protein và các thuộc tính hoá sinh

Giống như nhiều lipase vi sinh vật khác, lipase nấm men cũng được tinh sạch bằng hai kỹ thuật chính i) kỹ thuật kết tủa (dùng muối, cồn, …) và ii) kỹ thuật sắc

ký (ion, tương tác kỵ nước, ái lực và rây phân tử)

Đã có nhiều báo cáo về sự đa dạng lipase được sản xuất từ vi sinh vật (đặc biệt

từ nấm men - eukaryotes) Sự đa dạng này là do sự tồn tại của các gen khác nhau, quá trình cải biến sau phiên mã, sau dịch mã, sự khử glycosylation hoá, v.v Các

nấm men C.albicans, C.antarctica, C.rugosa, G.asteroids, C.candidium,

T.fermentans, S lipolytica, Y.lipolytica, v.v đã được báo cáo sản xuất ra nhiều dạng lipase khác nhau

2.2.2.1. Lipase từ nấm men Pichia

Lipase từ Pichia burtonii đã được nghiên cứu (Sugihara và cs., 1995) Các loài

Pichia khác cũng đã được phát hiện sinh tổng hợp lipase (Hou, 1994) Đặc biệt,

lipase Pichia có khả năng chịu kiềm và chịu nhiệt tốt [11 dòng chịu nhiệt ở 60oC và

pH 9,0-phụ lục3] (Hou, 1994) Lipase P.anomala vẫn chưa được nghiên cứu nhiều

P muscicola Y-7005 +++ + +++ +++++ Ngẫu nhiên

P holstii Y-7914 ++ + +/- +/- Ngẫu nhiên

P muscicola Y-7006 ++ - - + 1,3-

P petersanii YB-3808 +++ - ++ +++++ 1,3-

P sydowiorum Y-7130 ++ - ++ ++ 1,3-

Hou (1994) đã nghiên cứu xác định hai dòng P.anomala Y366 và Y993 có khả

năng tổng hợp lipase hoạt động ở cả pH 5,5; 7,5 và chưa đi sâu nghiên cứu về các

lipase này (trao đổi cá nhân với Hou) Mười năm sau, González và cs., (2004) cũng

đã xác định hai dòng P.anomala có khả năng sinh tổng hợp lipase khi họ xác định hoạt tính enzym của một số loài nấm men Năm 1997, Hou đã xác định tính đặc

hiệu cơ chất của một số dòng Pichia (Bảng 2.2)

2.2.2.2. Lipase từ các nấm men khác

Nhiều dòng C.rugosa/C.cylindracea (L.1754, ATCC 14830, DSMZ 2031) đã

được ứng dụng để sản xuất lipase Sự tinh sạch và đặc điểm của một số enzym đó

đã được báo cáo Hai lipase khác nhau từ C.rugosa (C cylindrcea L.1754) đã được xác định và tách bằng cột sắc ký trao đổi ion độ phân giải cao (mono Q) sau khi tủa lipase bằng cồn Lipase I được rửa giải ở 0,05M NaCl ngược lại lipase II được rửa giải ở 0,15M NaCl từ cột này Tính anion tự nhiên kém của lipase I được xác định khi điện di trên gel polyacryamide tự nhiên và điện di điểm đẳng điện Các protein

có trọng lượng phân tử 58kDa/SDS-PAGE Điểm đẳng điện của lipase I và II lần lượt là 5,8 và 5,6 (Veeraragavan và Gibbs, 1989) Shaw và Chang (1989) đã chứng

minh có ba lipase khác nhau A, B và C trong sản phẩm lipase C.rugosa thương mại

được cung cấp bởi Sigma Tất cả ba loại này đều thể hiện hoạt tính thủy phân lipid một cách đáng tin cậy Tất cả ba lipase này đều gắn với DEAE-Sepharose đã được cân bằng với đệm phosphate 0,1M ở pH 6,8 nhưng lipase A gắn yếu với cột này và

có thể được rửa giải bằng 0,2M–0,25M NaCl Lipase B và C cùng được rửa giải bằng 0,3M–0,6M NaCl Shaw và Chang (1989) đề nghị rằng lipase A và C tương ứng với lipase II và I được báo cáo bởi Veeraragavan và Gibbs (1989) Trọng lượng phân tử của lipase A, B và C đã được xác định là 362, 200 và 143 KDa Kết quả SDS-PAGE thể hiện lipase A và C được cấu tạo từ các tiểu phân tử 62KDa (lipase A-hexamer, B-trimer, C-dimer) Lipase A có nhiệt độ phản ứng tối ưu cao hơn và bền với nhiệt hơn so với lipase C pH tối ưu cho lipase A và C lần lượt là 7,0 và 5,0 Lipase A và C thể hiện hoạt tính thuỷ phân lipid cao trên các ester với chuỗi acyl trung bình Hiện tại vẫn chưa có nhiều thông tin về thuộc tính của lipase B và mối liên hệ của nó với lipase I đã được báo cáo bởi Veeraragavan và Gibbs (1989) Chang và cs (1994) đã công bố bản PAGE của enzym thủy phân lipid thu được từ

ba mẫu lipse C.rugosa thương mại từ ba nhà cung cấp Họ đã nghiên cứu ảnh hưởng

của điều kiện nuôi cấy trên việc sản xuất lipase từ C.rugosa ATCC 14830 và cho

rằng điều kiện nuôi cấy khôn chỉ ảnh hưởn đến việc sản sin ipase mà còn ảnh hưởng đến sự đa dạng của c c ipasee Họ đã dùng tween 20 và 80 trong môi trường

nuôi cấy C.rugosa kết quả sản xuất ra nhiều dạng lipase khác nhau về tính đặc hiệu

cơ chất và khả năng bền với nhiệt Họ cho rằn ính đặc hiệu và sự ổn định của

l pase có hể được điều chỉn bằng điều kiện n ôicấy Chang và cs (1994) cho rằng

sự đa dạng là kết quả sự thay đổi sự biểu hiện của gen, tỷ lệ liên kết với carbohydrate, sự proteolysis một phần và sự cải biến sau phiên mã Cho đến nay, 5

gen mã hoá cho lipase đã được phân lập từ C.rugosa, điều này thể hiện rằng sự đa

dạng của lipase mà Chang và cs (1994) đã xác định là kết quả của sự thay đổi về cách biểu hiện gen

Lotti và cs (2001) đã nghiên cứu lipase từ C.rugosa/C.cylindracea Họ đã thực hiện nghiên cứu đánh giá quá trình sinh tổng hợp sản phẩm của tế bào C.rugosa trên

các môi trường khác nhau Nấm men sinh ra một loạt lipase khác nhau do sự hiện diện của các gen mã hóa đa lipase, sự biểu hiện của c c gen này được điều chỉnh

chất kìm hãm như glucose, sorbi ol Các cơ chất trung tính có thể sử dụng trong hai bước lên men, trong đó, bước đầu là phát triển sinh khối (cơ chất trung tính) sau đó cảm ứng gen biểu hiện lipase (cơ chất đặc hiệu)

Các lipase C.rugosa được dùng rộng rãi trong biến đổi sinh học với khả năng

bền với nhiệt và đặc hiệu cơ chất Tỷ lệ và bản chất của nhóm carbohydrate gắn vào

có vai trò quan trọng trong tương tác cấu trúc của glycoprotein với bề mặt chung dầu và nước, khả năng bền với nhiệt, tương tác kỵ nước và toàn bộ hoạt tính xúc tác của lipase Loại bỏ các nhánh đường làm giảm hoạt tính enzym trong phản ứng thuỷ phân tributyrin, trong tổng hợp heptyl oleate và giảm độ bền với nhiệt Trạng thái cân bằng của enzym này với lactose hoặc với dextran tạo ra sự tái kích hoạt một phần của xúc tác sinh học Benjamin và Pandey (2001) đã phân lập và mô tả ba

dạng khác nhau của lipase từ C.rugosa (DM - 2031), được sản xuất bằng lên men

rắn Ba dạng lipase ngoại bào khác nhau (lipA, lipB và LipC) đã được phân lập bằng cách tủa với ammonium sulphate, thẩm tích, siêu lọc và lọc gel dùng Sephadex-200 Sự tinh sạch tăng gấp 43 lần SDS- PAGE của lipase đã được tinh sạch có ba dải khác nhau có trọng lượng phân tử 64, 62 và 60kDa Tất cả ba dạng

này hoạt động tối ưu ở 35-40ºC và pH 7-8 Cá o Ag+ và Hg2+ ức chế mạnh mẽ

h ạt tnh của ất cả c c dạng đồng phân ngược ại Ca2+ và Mg2+ gia ăn h ạt t nh của ipase Hoạt tính của ba dạng này hoàn toàn bị ức chế bởi chất ức chế protease serin gọi là dichloroisocoumarin và pefabloc Phenylmethanesulphonyl fluoride ức chế một phần hoạt tính của chúng

Lopez và cs (2004) đã so sánh ba loại enzym đồng phân của C.rugosa (CRL:

Lip1 , Lip2 và Lip3) về sự chọn lọc và độ phản ứng của chúng trong môi trường nước và môi trường hữu cơ Nghiên cứu này chỉ ra rằng Lip1 và Lip3 có độ ổn định như nhau và thấp hơn Lip2 Tuy nhiên, trong môi trường nước, Lip3 thuỷ phân ester p-niotrophenyl mạnh nhất và Lip1 thể hiện hoạt tính thuỷ phân triacylglyceride

trong môi trường nước cao nhất Sự khác nhau rõ rệt của các đồng phân thể hiện khi thuỷ phân triacylglyceride Các chuỗi acyl ngắn, trung bình, dài của triacylglyceride

lần lượt là các cơ chất thích hợp cho Lip3, Lip1 và Lip2

Các đồng phân CRL rất khó tách riêng để mô tả như những protein tinh khiết

CRL 1 được biểu hiện quá mức ở P.pastoris, có hoạt tính cao trên các cơ chất có

chuỗi dài trung bình (C8-C10) khi thuỷ phân các ester methy và triglyceride, ngược

lại, CRL4 và CRL2 tái tổ hợp biểu hiện trong P.pastoris hoạt động tốt trên các phân

tử lớn (C16-C18) CRL3, có hoạt tính đáng kể trên cơ chất hoà tan có chuỗi ngắn và

khả năng thuỷ phân các ester của cholesterol có chuỗi acid béo dài Hoạt tính

esterase cholesterol của CRL2 cũng đã được chứng minh (Brocca và cs., 2003) Tsujisaka và cs (1973) đã tinh sạch lipase G.candidum Link bằng phân đoạn

(NH4)2SO4, sắc ký DEAE – Sephadex, lọc gel sephadex G-100 và G-200 Trọng lượng phân tử của enzym được ước lượng là 55kDa và điểm đẳng điện 4,33 Tinh thể có chứa khoảng 7% carbohydrate và một lượng nhỏ các lipid Lipase này hoạt động trên dầu ôliu ở pH 5,6 và 7,0 ở 40ºC Enzym này vẫn duy trì hoạt tính ở pH 4,2 – 9,8 trong 24 giờ Enzym vẫn duy trì hoạt tính ở nhiệt độ thấp hơn 55ºC trong

15 phút

Hai dạng lipase đã được phân lập từ G.candidum ATCC 34614 kết hợp giữa tủa

cồn và sắc ký trên cột trao đổi ion Sephacryl HR và đa đệm trao đổi 94 Trọng lượng phân tử của các enzym khoảng 56KDa Giá trị pH tối ưu và điểm đẳng điện của các đồng phân lần lượt là 6,8; 6,0 (lipase I) và 4,46; 4,56 (lipase II) Các enzym

có thể bền vững trong pH 6,0 – 8,0 Ion h á rị 1 có ản hưởng yếu đến hoạt t nh

của cả hai enzym, ngược ại ion hoá rị hai ở nồng độ rên 50mM ức chế h ạt t nh enzym Ở nồng độ ít hơn 10mM, ion sodium dodecyl sulphate hoàn toàn ức chế

hoạt tính của lipase (Veeraragavan và cs., 1990) Giống như Candida, G.candidum

cũng sản sinh nhiều dạng lipase Sự inh sạch và đặc ính của c c dạng đ ng phân

l pase khá n au được sản x ất bởi c c d ng G.candidum khá nhau hì khó xáđịnh do sự chồng chéo về đặc ính h á sinh và vật lý của chúng Sự hỗn tạp này có thể do sự glycosyl hóa khác nhau sau dịch mã Các công bố xuất hiện gần đây khi chọn lọc cơ chất của các đồng phân lipase có vẻ như mâu thuẫn nhau Shimada và

cs (1990) cho rằng không có sự khác biệt đáng kể nào trong chọn lọc cơ chất của

hai dạng đồng phân lipase từ G.candidum ATCC 34614 mặc dù hai dạng này có sự

khác nhau chút ít về độ bền và đặc tính sinh hoá Ngược lại, các dạng đồng phân

lipase (gọi là lipase A và B) từ G.candidum CMICC 335426 có sự khác nhau rõ rệt

về tình đặc hiệu cơ chất (Sidebottom và cs., 1991)

Các nhà nghiên cứu cũng phân lập được hai đồng phân lipase từ dòng ATCC

34614 thể hiện tính chọn lọc tương tự hai đồng phân lipase đã được phân lập từ dòng CMICC 335426 So sánh sâu hơn về tính đặc hiệu và một phần trình tự peptide thể hiện rằng lipase A tương tự lipase II và lipase B tương tự lipase I Kết

q ả rái n ược về chọn ọc cơ chấtcủa c c đồn phân enzym k á nhau có hể do sự

k á nhau về điều kiện n ôi cấy của c c nhà ng iên cứu khá nhau Điều kiện nuôicấy iên q an đến sản ượng ipase được sản xuất bởi G.candidum Mặt khác, sự

hiện diện của nhiều gen, sự biểu hiện khác nhau của gen mã hoá cho lipase có đặc điểm sắc ký đồ tương tự không thể bác bỏ Hai enzym thủy phân lipid đã được phân

lập từ dịch nuôi cấy của các loài Geotrichum, G.asteroides bởi Kazanina và cs (1981) Lipase sản xuất ra bởi Trichosporon heteromorphum ATCC 20001 (hiện nay gọi là Geotrichum klebahnii) đã được nghiên cứu trong môi truờng có chứa dầu

và cặn đậu nành Dùng sắc ký lỏng hiệu năng cao Jacobsen và Poulsen (1992) đã phân lập được hai protein có hoạt tính thuỷ phân lipid có trọng lượng MW ~61KDa

và ~57kDa từ phân đoạn Sephadex G-100 lipase ngoại bào của G.candidum ATCC

66592 Lipase đã tinh sạch giống nhau về tính miễn dịch nhưng khác nhau về đặc hiệu cơ chất

Trichosporon là một loại nấm men khác được nghiên cứu chi tiết về lipase cho đến nay Có 4 loài của giống này được báo cáo là sản sinh lipase Chen và cs

(1992) đã phân lập T.fermentans WU–C12 từ đất và sản sinh lipase tối đa 1 8U/mll sau 4 ngày nuôi cấy ở 30ºC Nhiều nguồn C đã được kiểm tra sự ảnh hưởng của chúng lên sự phát triển và sản lượng lipase, dùng dầu tung và dầu ôliu 3%w/v sản phẩm lipase lần lượt là 1 6U/ml và 126U/mll Ngược ại khi nu i cấy T ermenta s

glucose vào môi trườn nước chiết bắp và dầu ôlu giảm sản lượng l pase ở

Trichosporon, điều này n ược ại với trườn hợp của Y ip lyt ca a (thường gọi là

C.paralypolytica, S.lipolytica ) và G.candidum Các kết quả này chỉ ra rằng lipase

được sản xuất bởi T.fermentans WU-C12 là lipase bản chất T.fermentans WU-C12 được công bố sản xuất hai loại lipase ngoại bào và ba loại lipase nội bào (Chen và

cs., 1993) Họ đã chiếu UV T ermentans WU-C12, kết quả à sản ượng ipase

n oại bào c o hơn d ng cha mẹ Họ cho rằng sự gia tăng lipase trong thể đột biến

có thể bởi vì có thể cải thiện sự chuyển hoá nhiều loại n- alkane, tính thấm của

lipase và hoạt tính sản phẩm trên 1 tế bào Hiệu quả của chất hoạt động bề mặt lên

sản phẩm lipase của T.fermentans WU-C12 đã được nghiên cứu Thêm các chất hoạt

động bề mặt gia tăng 2-3 lần hoạt tính lipase ngoại bào Hoạt tính lipase ngoại bào

và nội bào cũng bị ảnh hưởng bởi sự kết hợp của các chất hoạt động bề mặt và dầu

hoả như nguồn cacbon (Chen và cs., 1994) Họ cũng đã tinh sạch hai loại lipase ngoại bào, lipase I và lipase II từ dòng Trichosporon bằng sự kết hợp giữa tủa

acetone với sắc ký liên tục butyl-toyopearl 650M trên Toyopearl HW-55 và Q – Sepharose FF Trọng lượng phân tử của lipase I là ~53kDa/SDS-PAGE và ~160 KDa bằng lọc gel trong khi lipase II là ~55 kD/SDS-PAGE và ~60KDa bằng lọc gel Cả hai lipase này đều bền ở pH 4,0 – 8,0 trong 24 giờ ở 30ºC Hai lipase này dường như là lipase chịu nhiệt Lipase I bền vững ở 40ºC trong 30 phút ở pH 5,5 và lipase II dưới cùng điều kiện vẫn duy trì hoạt tính lên đến 50ºC Tính đặc hiệu cơ chất của chúng ở vị trí 1, 2, 3 của triolein và cắt tất cả ba liên kết ester Lipase

T.fermentans WU-C12 (TFL I) hầu hết gống với lipase I và II G.candidum về cấu trúc bậc ba G.candidum ATCC 34614 cấu tạo từ 2 hoặc 4 đơn phân ngược lại lipase I của T.fermentans WU C12 là tam phân với trọng lượng xác định bằng lọc

gel là 160KDa Sự khác nhau về số lượng tiểu đơn vị trong lipase có hoạt tính của

cả hai giống dẫn đến sự khác nhau về đặc hiệu cơ chất Ngoài ra sự khác nhau của

ba gốc acid amin và/hoặc sự glycosyl hoá có thể có một ảnh hưởng trên đơn vị cấu trúc của TFL GCL, II và I

Các lipase được sản xuât từ các loài khác của Trichosporon đã được phân lập từ sữa nguyên liệu bị nhiễm Trichosporon bởi Dharmsthiti và Ammaranond (1997)

Lipase được tinh sạch thuần nhất (8 lần) dùng các kỹ thuật khác nhau bao gồm tủa phân đoạn (NH4)2SO4 và lọc gel Sephadex G200 Trọng lượng của lipase này

~37KDa với nhiệt độ và pH tối ưu lần lượt là 60ºC và 5,0 Nó vẫn duy trì hoạt tính

ở khoảng pH 3,0-10 và ở nhiệt độ nhỏ hơn 70ºC Nó khôn phải là một protein metalo vìc c chấtio chelat kim oạikh ng ức chế hoạtt nh enzym Sự h hồi sau

k i t n sạch hấp một c ch đáng ưu ý vì có hể sự kết tụ ự nhiên của enzym dẫn đến giảm h ạt t nh enzym Bản mẫu lọc gel của enzym chỉ thị nó có trọng lượng

200kDa trái ngược so với khi xác định bằng SDS-PAGE Sự k á nhau này có hể

d sự ích ụ của phân ử ipase góitrun âm hoạt đ ng vào rong

Nhiều enzym được tiết bởi Y.lipolytica (trước đây S.lipolytica, C.lipolytica,

C.paralipolytica) và hoạt tính lipase, esterase đã được xác định và phân tích trong

nhiều nghiên cứu khác nhau (Ota và Yamada, 1966; Sugiura và cs., 1976; Ota và

cs., 1982) Y.lipolytica (Mycotorula lipolytica) tiết lipase lần đầu được công bố vào

1948 bởi Peters và Nelson (Pignede và cs., 2000) Hoạt tính của một loại lipase

ngoại bào và hai loại bám vào bề mặt tế bào tương ứng với lipase I (39 kDa) và

lipase II (44 kDa) đã được miêu tả bởi Ota và cs (Sugiura và cs., 1976; Ota và cs.,

1982) Enzym bao quanh tế bào được tinh sạch với tổng thu hồi 8% bằng sắc ký trên CM -Sepharose CL-6B, DEAE - Seharose CL-6B và cột Sephadex G-100

Lipase inh sạch cần a id oleic để huỷ p ân riglyc ride và ric pryl n Dưới điều kiện thực nghiệm pH tối ưu để thủy phân cơ chất dầu ôliu khoảng 8,0 Các enzym vẫn duy trì hoạt tính sau 20 phút ở dưới 37ºC và pH 4,5-8,0 trong 22 giờ ở 5ºC (Ota

và cs., 1982) Lipase n oạibào cần a id oleic như à á nhân hoạthoá sự bền vững,, ngược lại lipase bao quanh tế bào không cần hoạt hoá và có nhiều đặc điểm khác

biệt so với lipase ngoại bào (Ota và cs., 1984) Sản phẩm ipase ngoại bào và ipase bao q anh ế bào được báo c o à phụ h ộc vào hành p ần N và C rong môitrườn Lipase ngoạibào chỉ được xá định ro g môitrường có nguồn N hữu cơ và mức đ ipase được điều chỉnh heo hình hái tế bào Trong môi trường tối thiểu bổ

sung N-acetylglucosamine hoặc đệm citrate lượng lipase bao quanh tế bào cao hơn

Tuy nhiên, không có mối liên hệ rõ ràng được xác lập giữa trạng thái lưỡng hình và

sản phẩm lipase (Novotny và cs., 1994) Giống như nhiều tác giả khác, Ota và cs.(198 ) đã chứng minh rằng kỹ h ật môi trường có hể dẫn đến sự gia ăng ipase

n oạibào Lipase II và I được tinh sạch lần lượt gần 69 và 58 lần Lipase I có pH tối

ưu 8,2 khi thủy phân dầu ôliu và 7,5 khi thủy phân tributyrin Lipase II có pH tối ưu 8,0 khi thủy phân dầu ôliu, 7,5 khi thủy phân tributyrin và 7,0 khi thuỷ phân triolein Ota và cs (1982) kết luận rằng không có sự khác biệt đáng kể trong đặc tính enzym học của lipase II và I Họ đề x ất rằng enzym này được biến đổi từ enzym kia và sự biến đ i do phản ứng enzym hoặc do nối thêm c c hành phần

k á Điểm đặc biệt là l pase ng ại bào cũng n ư hai lpase bao quanh ế bào đã được inh sạch cần a id oleic như à á nhân hoạt hoáá cho thuỷ phân bên ngoài

triglyceride nhưng lipase bao quanh tế bào định vị trên tế bào nấm men sống không cần điều này Trình tự acid amin đầu N của lipase ngoại bào đã tinh sạch 39kDa (gọi là lipase A) đã được xác định bởi Kuno và Ota, 1996 Destain và cs (1997) đã

phân lập các dòng Y.lipolytica sản xuất quá mức lipase ngoại bào Lipase được tiết

ra có trọng lượng 38,5kDa, có ba điểm đẳng điện (pI) 5,0; 5,2 và 5,4 Trình tự 49aa đầu tiên của đầu N đã được xác định và giống với lipase A Trình tự này tương tự với lipase I bao quanh tế bào; tuy nhiên lipase ngoại bào và lipase I được coi là khác nhau về thành phần acid amin (Kuno và Ota, 1996)

Kluyveromyces lactis là một nấm men khác sản sinh phospholipase B ngoại

bào(PBL) (Oishi và cs., 1999) enzym đã được tinh sạch từ môi trường nuôi cấy có

mức độ glycosyl cao với trọng lượng phân tử 160-250kDa Enzyme này có hai giá trị pH tối ưu là 2,0 và 7,5 Enzym này được công bố có pH acid và thủy phân tất cả các phospholipid khôn cần on kim oại Mặt khác ở pH kiềm nó đặc hiệu với phosphatidylcholine và lysophosphatidylcholine và cần Ca2+, Fe3+ hoặc Al3+ để hoạt hoá Hoạtt nh kiềm gia ăng 2 ần k icó Al3+ so vớisự có mặt của Ca2+

Một lipase ngoại bào được sản xuất bởi nấm men sản xuất glycolipid

Kurtzmanomyces sp I-11 được tinh sạch bằng cách tủa (NH4)2SO4 và sắc ký cột

trên DEAE-Sephadex A-25, SP-Sephadex C-50 và Sephadex G-100 (Kakugawa và

cs., 2002) Trọng lượng phân tử khoảng 49kDa/SDS-PAGE và nhiệt độ tối ưu 75ºC Hoạt tính rất bền ở nhiệt độ dưới 70ºC; pH 1,9 – 7,2 và bền ở pH dưới 7,1 Trình tự

đầu N lipase Kurtzmanomyces tương tự với lipase A C.antarctica, mặc dù thực tế

pH của hai lipase này có sự khác biệt rõ rệt (Kakugawa và cs., 2002)

Trong các loài của Pichia thì P.pastoris được dùng phổ biến như là một vật chủ

để biểu hiện gen mã hoá lipase từ các vi sinh vật khác (Passolunghi và cs., 2003;

Pfeffer và cs., 2006; Shu-Wei Chang và cs., 2006; Larsen và cs., 2008; Hea và cs.,

2008) Nhiều thành công đã đạt được khi biểu hiện gen mã hoá lipase trong

P.pastoris Gen lip từ các Pichia hiện nay vẫn chưa được tạo dòng nhiều (CSDL

của Stuttgart http://www.led.uni-stuttgart.de/organisms.html truy cập ngày 28/11/2008)

2.2.3.2 Các nấm men khác

Lotti và cs (1993) đã công bố rằng các lipase C.cylindracea được mã hoá bởi

trình tự đa gen, hiện nay trên cơ sở tương đồng DNA-DNA các nhà khoa học đã xác định có ít nhất 7 gen Brocca và cs (1995) đã phân lập và tạo dòng 5 dạng lipase

khác nhau từ các loài Năm gen lipase nằm trong họ gen lipase của C.rugosa tương

đồng 80-88% về trình tự nucleotide Tất cả các gen mã hoá cho các enzym đồng phân này định vị trên cùng nhiễm sắc thể Sự biểu hiện gen được tạo dòng ở

Candida đòi hỏi một codon bias mạnh mẽ như codon phổ biến CUG mã hoá cho

leucine được dùng cho serine (Ohama và cs., 1993) CUG được dùng với tần số cao (3% codon) trong vùng phản ứng của LIPI C.cylindracea Phân tích trình tự cho

thấy có 5 trình tự gen sự tương đồng giữa bất cứ hai gen lipase nào là 88% Điều này cho thấy rằng 5 gen này là các dạng đột biến của cùng một gen Các trình tự

CRL này tương ứng với các đồng phân của dòng ATCC 14830 Sự trái ngược trong thuộc tính xúc tác giữa các phòng thí nhiệm khác nhau là do thành phần và tỷ lệ các

protein lipase khác nhau của C.cylindracea phụ thuộc vào dòng nấm men và thành phần môi trường sử dụng Sự đa dạng lipase Candida spp đã được công bố (Chang

và cs., 1994) Lotti và Alberghina (2003) chỉ ra rằng gen mã hoá CRL lệ thuộc vào

sự điều khiển ở mức độ phiên mã và phụ thuộc vào thành phần môi trường nuôi cấy

và đặc tính sinh lý của giống Tuy nhiên, vai trò về sự đa dạng của các lipase cho sự

phát triển của C.rugosa cho đến nay vẫn chưa rõ ràng

Nhu cầu biểu hiện các gen CRL trong các tế bào chủ đang được mong muốn

không chỉ bởi vì có hể sản xuấtlượn ớn enzym inh khiết mà còn bởivìnó dường

n ư à mộtc ch duy n ấtđể hu được ừng đ ng p ân inh khiếtcủa CRL mà kh ng cần bất cứ kỹ huật t nh sạch rắc rối nào để á h c c protein giống nhau So với các

enzym thương mại, LIPI tái tổ hợp thể hiện hoạt tính theo hướng các triacylglyceride chuỗi acyl dài và các ester methyl chuỗi acyl dài (Brocca và cs., 1998) Gen lipase I C.rugosa biểu hiện trong P.pastoris đã tiết được 200µg lipase

trong 1mL môi trường cơ bản có bổ sung sorbitol trong điều kiện nuôi cấy theo mẻ

(Passolunghi và cs., 2003) Họ cũng nhận thấy một lượng lớn protein tái tổ hợp

được giữ lại trong tế bào Protein huỳnh quang màu xanh (GFP) đã được gắn vào protein đích để theo dõi vị trí và số lượng sản phẩm khi biểu hiện và phiên mã Gen

mã hoá lipase được phân lập từ nấm men gây bệnh C.albicans ATCC 36082 được tạo dòng trong S.cerevisiae và sàng lọc hoạt tính thủy phân lipid (Fu và cs., 1997)

Hai dòng thể hiện hoạt tính thuỷ phân lipid đã được xác định Phân tích trình tự nucleotide của chúng cho thấy khung đọc mở (ORF) mã hoá một protein có 351 acid amin Trình tự này chứa mot f Gly-X-Ser X-Gly- được ìm hấy rong ất cả

c c ipase của prokaryotc và eu aryotc, điều này thể hiện sự tương đồng hoạt tính c

Phân tích Southern, dùng lipase này như mẫu dò, thể hiện rằng gen lipase có thể

hiện diện trong C.glabrata, Y.lipolytica (C.parapsilosis), C.tropicalis, C.krusci mà không ở C.pseudotropicalis hoặc S.cerevisiae Phân tích Northern blot chỉ ra rằng

sự biểu hiện của LIPI chỉ được xá định k i C.albica s phát triển rên môi trường

có chứa we n 80, c c twe n khá hoặc c c riglyc ride n ư à nguồn c rb n.Ngược ại Sab uraud Dextrose ỏn hoặc ye st peptone/dextrose và c rbo ydrate

ức chế sự biểu hiện LIPI Hube và cs (2000) đã tạo dòng và mô tả 10 gen lipase của

C.albicans ORF của tất cả các lipase C.albicans dài 1281-1416bp và mã hoá các protein tương đồng trình tự acid amin lên đến 80% Lip3 – Lip6 được biểu hiện

trong tất cả các môi trường ở các thời điểm phát triển khi kiểm tra bằng phân tích Northern blot và PCR Lip , 2, 4, 5, 6 và 8 được biểu hiện rong môi trường có

thiếu hụt c c ipid Sự dịch mã của hầu hết c c gen ipase được xá định rong khi

nấm men ch yển sang dạn sợii Lip5, 6, 8 và 9 được tìm thấy khi gây nhiễm vào

chuột Điều này thể hiện sự biểu hiện gen không phụ thuộc vào lipid, sự mềm dẻo

trong biểu hiện in-vitro và invivo, sự linh hoạt của đa số các gen lip góp phần vào tính độc của C.albicans Stehr và cs (2004) đã nghiên cứu kiểu mẫu gen C.albicans

dùng phản ứng phiên mã ngược trong gây nhiễm thực nghiệm và trong các mẫu

bệnh nhân bị nhiễm Candida

Lipase ngoại bào C.deformans CBS 2071 đã được tạo dòng trong S.cerevisiae (Bigey và cs., 2003) Ba loại khác của họ gen lipase CdLIP1, CdLIP2 và CdLIP3 đã

được tạo dòng và mô tả Số liệu thu được từ MADLI-TOF chỉ ra rằng nó là lipase

ngoại bào LIPI Mỗi trình tự lipase có một motif bảo tồn Glu-His-Ser-Leu-Gly-

(Gly-/Ala)-Ala, tám gốc cysytein và trình tự đầu N Các lipase này rất giống với

lipase từ nấm men Y.lipolytica Sự tương đồng được tìm thấy ở một số nấm men và

nấm mốc khác Neugnot và cs (2002) tạo dòng và biểu hiện quá mức gen mã hoá

lipase từ C.parapsilosis CBS 604 Hai khung đọc mở (CpLIP1 và CpLIP2) được

phân lập và trình tự protein 465 acid amin chứa motif G-X-S-X-G So sánh tương đồng thể hiện rằng CpLIP2 tương đồng về nguyên tắc với 11 lipase được sản xuất

bởi C.albicans (42-61%) và lipase A từ C.antarctica (31%) nhưng không tương

đồng với các trình tự lipase khác Cả CpLIP1 và CpLIP2 đều được biểu hiện trong

S.cerevisiae , nhưng chỉ CpLIP2 mã hoá cho một protein hoạt động Tính đặc hiệu

cơ chất và thói quen xúc tác của CpLIP2 tái tổ hợp được tinh sạch, có hoặc không

có đoạn cài histidine đầu C, không thay đổi so với lipase tự nhiên của chúng

Hai loại lipase A và B trong nấm men C.antarctica đã được tạo dòng và biểu hiện bởi Høegh và cs (1995) trong Aspergillus oryzae Lipase A C.antarctica cũng

được tạo dòng và biểu hiện ở P.pastoris dưới điều khiển của promoter AOX1 bởi Rotticci- Mulder và cs (2001)

Nấm men G.candidum sản sinh các enzym đồng phân trong môi trường nuôi cấy

thể hiện đặc tính sinh hoá sinh lý gần gũi nhưng khác tính đặc hiệu cơ chất được nghiên cứu Shimada và cs (1989) đã phân lập dòng cDNA mã hoá lipase của

G.candidum ATCC 34614 (Geo) bằng lai khuẩn lạc Thư viện này được dò bởi các

nhãn oligonucleotide 32P tương ứng với từng phần trình tự acid amin của enzym này Trình tự nucleotide của cDNA này được xác định bởi phương pháp dideoxy Trình tự acid amin được suy ra từ cDNA trùng với trình tự của protein cDNA được

tạo dòng mã hoá một protein 554 acid amin và một trình tự tín hiệu kỵ nước 19 acid

amin Lipase Geotrichum có chứa mot f Gly-X-Ser X-Glyy, trình tự này được tin là thành phần của vùng nhận biết phân pha lipid Dùng các cDNA này như mẫu dò

trong khi phân tích Southern DNA của bộ gen G.candidum cho thấy có hai gen trên

nhiễm sắc thể của nấm men Trong thực tế đã phân lập và tinh sạch hai dạng lipase (lipase I và II) từ nấm men này Hai lipase đồng phân có thành phần acid amin tương tự nhưng khác về trình tự đầu mút đã không được phát hiện trong cấu trúc sơ cấp của lipases I suy từ cDNA Điều này đã xác nhận sự hiện diện của hai gen lipase khác nhau và bác bỏ khả năng hình thành nhiều dạng được quan sát thấy là

do hoạt tính thủy phân protein (Sugihara và cs., 1990) Shimada và cs (1990) đã tạo dòng và giải trình tự cDNA của lipase II G.candidum Họ thấy toàn bộ chiều dài của

hai lipase giống nhau và đồng nhất 84% Kết quả so sánh sự tương đồng thể hiện

lipase G.candidum và C.cylindracea tương đồng và là một trong những lipase của

họ cholinesterase Nagao và cs (1993) dùng các cDNA của lipase I và II được phân

lập trước đó như mẫu dò để phân lập các gen lipase Lip1 và 2 trên hai nhiễm sắc

thể, mã hoá lipase I và II Cả hai gen được công bố có chứa vùng 5’- và 3’- thêm vào vùng mã hoá Cả hai vùng mã hoá không chứa intron và tương đồng trình tự nucleotide 86% Vernet và cs (1993) đã tạo dòng và giải trình tự gen mã hoá lipase

II của G.candidum ATCC 34614 (GCLII) sau khi khuếch đại bằng PCR Gen lipase

ít intron được biểu hiện ở S.cerevisiae và tiết ra khoảng 5mg/L môi trường nuôi cấy

GCLII tái tổ hợp đã được tinh sạch bằng sắc ký ái lực và được miêu tả dùng cơ chất kết hợp với phương pháp phân tích độc lập Bertolini và cs (1994) đã công bố rằng

các dạng lipase đồng phân cũng có thể hiện diện trong các dòng Geotrichum, nhưng

sự tinh sạch và phân lập chúng khó thực hiện khi trùng lấp về sinh lý sinh hoá Bertolini và cs (1994) đã định vị được sự hiện diện của gen lipase trong 4 dòng

G.candidum (ATCC 34614, NRCC 205002, NRRLY-552 và NRRLY -553) bằng tạo dòng phân tử trong phản ứng PCR Mỗi dòng có chứa hai gen lipase có quan hệ

chặt chẽ với lipase I và II của G.candidum ATCC 34614 Mỗi họ gen lipase thể hiện

sự biến đổi trình tự (sự đa hình), được xác định bởi phân tích southern Chỉ hai gen được tìm thấy trong mỗi dòng được kiểm tra và các nghiên cứu sinh hoá cũng chỉ ra

sự tồn tại của lipase với ít nhất hai cơ chất đặc hiệu khác nhau Hầu hết các tacid amin hay thế nằm trên bề mặt protein; một vài hiện diện trong đặc điểm cấu trúc có

thể liên quan đến sự xác định đặc hiệu cơ chất Sự mâu thuẫn của các công bố về sự tồn tại của hơn hai dạng đồng phân có thể xuất phát từ sự biểu hiện khác nhau của các gen trong điều kiện nuôi cấy khác nhau, sự phát sinh biến dị do cải biến sau phiên mã và hiệu quả tinh sạch khác nhau Catoni và cs (1997) đã nghiên cứu

lipase A và B của G.candidum ATCC 335426 được biểu hiện trong P.pastoris

Trình tự mã hoá cho lipase thực thụ được dung hợp với trình tự tín hiệu yếu tố µ và được biểu hiện dưới điều khiển của promoter AOX1 Sản phẩm lipase ngoại bào lipases A và B phụ thuộc vào các dòng thu được lần lượt từ 1U/mLL đến 23U/mLL và

từ 1U/mLL đến 50U/mLL Nghiên cứu tối ưu sản phẩm lipase B tái tổ hợp gia tăng hoạt tính đến 200U/mLL môi trường nuôi cấy

Arai và cs (1997) đã phân lập cDNA mã hóa lipase ngoại bào T.fermentans

WU-C12 (TFL I) sử dụng đoạn 0,8kb khuếch đại bằng PCR với mồi nucleotide tương ứng với phần acid amin của TFL I cDNA này có chứa 1689 base dọc theo

ORF và mã hoá 563 acid amin từ codon khởi đầu ATG Hai vùng có khả năng cho glycosyl hoá đầu N được tìm thấy ở enzym này Số liệu đầy đủ thể ra sự tương đồng

cao giữa TFL và lipase G.candidum ATCC 34614 Lipase I (TFL I) của

T.fermentans WU-C12 tương đồng 84% với GCLI và 99,5% với GCLII ở mức độ acid amin và ở mức độ trình tự nucleotide lần lượt là 86,1% và 99,9% (Arai và cs., 1997) Có sự khác nhau của chỉ ba gốc acid amin ở vị trí 23-25 giữa TFL GCLII và

I Trình tự acid amin của TFL I giống tới 41% và 42,3% so với lipase III và IV từ

C.cylindracea được tạo dòng trước đó bởi Lotti và cs

Nhiều lipase của Y.lipolytica đã được xác định ở dạng nội bào, bám vào thành tế bào và ngoại bào Ba gen mã hoá lipase trong Y.lipolytica đã được phân lập, Lip1

mã hoá cho lipase 486aa và Lip3 mã hóa cho lipase 498aa Gen LIP1 và LIP3 được công bố là enzym nội bào, trong khi LIP2 được phân lập bởi Pignede và cs., 2000a

và Pignede và cs., 2000b, thuộc về lớp lipase ngoại bào Phân tích PCR và Southern chỉ ra rằng không giống như C.rugosa và G.candidum có nhiều gen tương đồng hiện diện, Y.lipolytica có một gen mã hoá lipase ngoại bào Điều này cũng được

chứng minh bằng hoạt tính lipase ngoại bào thấp (<0,5%U/mLL) (Pignede và cs., 2000) cDNA mã hoá phospholipase Kluyveromyces lactis được xác định bằng sự kết hợp của nhiều quy trình và trình tự đã được đặt tên là kiplb Gen kiplb mã hoá một protein 640 acid amin Trình tự acid amin tương đồng 66,7% với PLB

T.delbrueckii Trình tự acid amin có mot f G-X-S-X-GG và motf xúc tá a id aspartc Lipase của Arxula adeninivorans, gen aLip1 được phân lập dùng đoạn c

lipase thu được từ phản ứng cắt bằng trypsin cho các mồi oligonucleotide trong

sàng lọc PCR (Boer và cs., 2005) Gen chứa trong một ORF 1347bp mã hoá protein

420 acid amin nặng 50kDa trước một trình tự tiết 28 prepro đầu N Trình tự acid

amin tương tự với lipase C.albicans và C.parapsilosis (giống 34-38%) và khác biệt

hơn với các lipase khác Trình tự có chứa mot f 5 pept de bảo hủ Gly- X-Ser X-Glyy hình thành một phần vùng nhận biết phân pha lipid ở lipase Sự biểu hiện của gen được điều khiển bởi nguồn C Khi bổ sung tween 20 vào môi trường, sự cảm ứng

gen aLip1 và tự tích tụ của lipase trong môi trường đã được quan sát, vì thế chứng

minh sự điều hoà gen bởi hợp chất lipid Enzym là dạng nhị trùng với pH tối ưu 7,5

và nhiệt độ tối ưu 30ºC

Các lipase nấm men khá liên quan đến công nghiệp công nghệ sinh học và thu hút sự chú ý đặc biệt vì sản phẩm nấm men được coi như là an toàn và tự nhiên Cá

l pase nấm men phần ớn à enzym ngoại bàoo (glycoprotein đơn phân tử) mặc dù có

một vài công bố cho rằng hai trong số ba enzym lipase của Y.lipolytica bao quanh tế

bào và trong nội bào một cách tự nhiên Trong lượng phân tử của các lipase nấm men khác nhau được công bố trong khoảng 33 đến 65kDa Nghiên cứu sự tương đồng trình tự nucleotide của các lipase được tạo dòng khác nhau từ các nấm men chỉ ra rằng các đồng phân lipase được sản xuất bởi các gen khác nhau Sự biến đổi sau phiên mã và dịch mã cũng làm gia tăng đồng phân của các enzym Hai lipase

sản sinh từ C.rugosa và G.candidum đã được nghiên cứu rộng rãi Các gen lipase

định vị trên cùng nhiễm sắc thể Các kết quả này làm loé lên sự suy đoán, các gen

mã hoá lipase khác nhau có thể là kết qủa của sự nhị bội hoá Hơn 5 % đồn phân

l pase nấm men được mã h á bởi c c gen khá n au ạo hành c c họ gen ipase.Giống như n iều sin vật khá bao gồm cả độn vật có vú,sự hiện diện của c c họ gen ipase khá phổ biến rong nấm men và dẫn đầu à C.albica s với 1 gen mã h á

l pase

2.3 Nghiên cứu lipase các vi sinh vật khác

Jäeger và cs (1994) đã chia lipase vi khuẩn theo gram âm và gram dương Trong đó, lipase vi khuẩn gram âm chia làm ba nhóm dựa trên sự gia tăng trọng lượng phân tử Sau đó, Arpigny và Jäeger (1999) chia lipase vi khuẩn thành 8 họ

dựa vào sự tương đồng của chuỗi acid amin, so sánh cấu trúc ba chiều và đặc tính sinh hoá đã được công bố Noble và cs (1994) đã nghiên cứu cấu trúc lipase của

P.gluma

Lipase vi sinh vật đã được nhiều nhà nghiên cứu quan sát và nghiên cứu từ rất

sớm Năm 1901, lipase từ S.marcerscens, Pseudomonas aeruginosa và

Pseudomonas fluorescens (Jäeger và cs., 1994) đã được nghiên cứu và chiết tách, sau đó, lipase từ Bacillus spp cũng được nghiên cứu (Neill và Fleming 1927; Lowenstein và cs., 1928) Lipase đã được thu nhận, chiết tách và tinh sạch từ

S.aureus (Kotting và cs., 1983, Rollof và cs., 1987), S.epidermidis (Simons và cs., 1998), Bacillus subtilis, Bacillus thermocatenulatus và Bacillus sp (Westers và cs., 2005; Dartois và cs., 1994; Jorgensen và cs., 1991; Lesuisse và cs., 1993; Rúa và

cs., 1997; Dharmsthiti và Luchai 1999; Martýn và cs., 2008), Pseudomonas (Stuer

và cs., 1986; Scholefield và cs., 1978) Enzym lipase tinh khiết từ Pseudomonas đã

được thu nhận (Mencher và Alford 1967; Finkelstein và cs., 1970; Dring và Fox

1983; Fox và Stepaniack 1983; Gilbert và cs., 1991b) hoặc thu nhận lipase có lẫn các thành phần lipid (Mencher và Alford 1967; Stuer và cs., 1986; Kordel và cs., 1991) Chủng P.aeruginosa PAC 1R có thể tổng hợp nên lipase lipopolysaccharide (Stuer và cs., 1986)

Vi sinh vật sinh tổng hợp lipase được phân lập từ đất và nơi chứa dầu thực vật Nhiều lipase có những tính chất đặc biệt sinh tổng hợp bởi những vi sinh vật phân

lập từ Nam cực (Feller và cs., 1990), suối nước nóng (Gowland và cs., 1987; Lee D.W và cs., 1999), các đống phân xanh (Gowland và cs., 1987; Rathi và cs., 2000)

và những nơi có nồng độ đường hoặc muối cao (Elwan và cs., 1985; Ghanem và cs.,

2000)

Ngày nay, các gen mã hóa cho lipase từ vi sinh vật đã được các nhà khoa học giải trình tự Do đó, các nghiên cứu tập trung vào việc phân lập, giải trình tự gen, tạo dòng và biểu hiện gen lipase ở các tế bào chủ đồng thời thu nhận, tinh sạch và

cố định lipase trên các chất mang khác nhau

Năm 1992 gen mã hóa lipase Pseudomonas glumae đã được tạo dòng và xác

định được trung tâm họat động là Ser-87, Asp-241 và His-285 (Frenken và cs., 1992) Schmidt và cs (1994, 1996, 1997) đã sàng lọc, tạo dòng, giải trình tự, tinh sạch và xác định tính chất của lipase kiềm chịu nhiệt sinh tổng hợp bởi

B.thermocatenulatus Gen mã hóa lipase Pseudomonas đã biểu hiện thành công ở E

coli (Jorgensen và cs., 1991; Chung và cs., 1991; Johnson và cs., 1992; Tan và Miller., 1992; Ihara và cs., 1995) H.K Kim và cs (1998); Kim và cs (2000) biểu hiện gen mã hóa lipase kiềm chịu nhiệt B.sterothermophilus trong E.coli đạt

4 8.00 U/g proteinn Jorgensen và cs (1991) dùng B.subtilis làm tế bào chủ nhận nguồn gen từ Pseudomonas cepacia Gen lipase Rhizopus niveus đã được biểu hiện

ở S.cerevisiae (Kohno và cs., 1998) đạt được 530U/ml Gen lipase Bacillus

thermoleovorans ID-1 đã được tạo dòng, giải trình tự và biểu hiện trong E.coli (Cho

và cs., 2000) Lorenzo và cs (2005) đã chuyển gen lipase từ Rhiropus oryzae vào

E.coli Báo cáo gần đây nhất là gen lipase chịu nhiệt Thermotoga maritima đã được tạo dòng và biểu hiện ở E.coli (Kakugawa và cs., 2007) Hai lipase Streptomyces

coelicolor A3(2) đã được tạo dòng và tinh sạch (Côté và Shareck 2008)

Bompensieri và cs (1998) đã nghiên cứu tinh sạch lipase từ Acinetobacter

calcoaceticus. Bornscheuer và cs (1994) cũng đã tiến hành tinh sạch lipase từ

P.cepacia Trong quá trình tinh sạch lipase, một số tác giả đã xử lý với các chất hoạt động bề mặt như Triton X-100 (Chartrain và cs., 1993; Stuer và cs., 1986) hoặc

dùng dung môi isopropanol (Dünhaupt và cs., 1992)

Nghiên cứu tinh sạch lipase C.viscosum bằng sắc ký tương tác kỵ nước trên dẫn xuất cellulose, sepharose đã được thực hiện (Horiuti và Imamura, 1977; Diogo và

cs., 1999)

Enzym cố định gia tăng lượng enzym trên một đơn vị diện tích, gia tăng hiệu quả phản ứng Giống như các enzym khác, lipase cố định có những lợi điểm như sử dụng lặp lại nhiều lần, điều khiển quá trình tốt hơn, gia tăng tính bền, enzym không

lẫn vào sản phẩm (Rahman và cs., 2005), gia tăng sự ổn định trong cơ chất phân

cực, thay đổi phương trình nhiệt động theo hướng tổng hợp ester hơn hướng thủy phân, giảm sữ phụ thuộc vào nước giống như các phản ứng thủy phân, không bị vấy nhiễm vi sinh vật và có khả năng dùng trực tiếp trong các quá trình hoá học Khi

hiện diện trong dung môi hữu cơ, lipase cố định gia tăng hoạt tính (Ye và cs., 2005)

Sự cố định các lipase đã được thực hiện bởi nhiều phương pháp như hấp thu, nhốt và tạo liên kết nối dùng các chất mang khác nhau Đối với phương pháp tạo

liên kết, chất mang silica thường được hoạt hoá với glutaraldehyde (Ulbrich và cs.,

1991) Trong trường hợp cố định không tạo liên kết, lipase có thể được hấp phụ trên

nhựa trao đổi ion resin với hoạt tính rất tốt (Ison và cs., 1990) Đối với cố định

không liên kết, tương tác ion và tương tác kỵ nước giữa lipase và các chất mang đóng vai trò quan trọng Các polymer như polyvinyl alcohol (PVA), carboxymethyl cellulose (CMC), polyethylene oxide (PEO) và hỗn hợp CMC/PVA có thể được

dùng cho cố định lipase (Dalla-Vecchia và cs., 2005) Phân tích hình thái bề mặt

màng phim bằng kính hiển vi quét cho thấy bề mặt polymer thích hợp để cố định

các lipase (Crespo và cs., 2005) Dalla-Vecchia và cs (2005) đã cố định 10 loại

lipase khác nhau trên polyvinyl alcohol, carboxymethyl cellulose và hỗn hợp

PVA/CMC (50:50% m/m) và lipase Mucor javanicus (MJL) và lipase R.oryzae (ROL) có hoạt tính cao nhất Các enzym cố định có thể tái sử dụng nhiều lần:

C.antarctica B (Novozym 435) được cố định trên silica với octyltriethoxysilane và

nó duy trì hoạt tính trong 15 chu kỳ (Blanco và cs., 2004) Calcium carbonate thích hợp cho hấp thu lipase thô từ R.oryzae và đặc hiệu với chuỗi acid béo dài (Ghamgui

và cs., 2004) Lipase từ P.cepacia được nhốt trong gel bởi sự trùng ngưng

tetramethoxy silane đã thủy phân và iso-butyltrimethoxy silane và được sử dụng lặp

lại mà không mất hoạt tính (Noureddini và cs., 2005)

Việc sử dụng enzym cố định có hai thuận lợi quan trọng: i) khả năng tái sử dụng enzym và ii) khả năng thực hiện các quá trình liên tục Nhiều bài tổng quan đã được

xuất bản (Fukuda và cs., 2001; Shimada và cs., 2002; Shah và cs., 2003) Nhiều phương pháp cố định lipase trên các chất mang cũng đã được công bố (Adlercreutz

và cs., 1996) Trong số các phương pháp này, phương pháp nhốt enzym trong sol gel kỵ nước có lẽ là tốt nhất (Reetz, 1997) hoặc phương pháp hấp thụ lên các chất mang kỵ nước như polypropylene (Bosley và Peilow, 1997; Salis và cs., 2003) Các lipase thương mại đã được bán ở cả dạng bột có chứa các thành phần khác ngoài

lipase (Salis và cs., 2005b) và đã cố định Lipase đã cố định thường được dùng cho sản xuất dầu biodiesel là lipase B từ C.antarctica (Nelson và cs., 1996; Shimada và

cs., 1999; Samukawa và cs., 2000; Watanabe và cs., 2000; Watanabe và cs., 2001;

Bélafi-Bakó và cs., 2002; Köse và cs., 2002; Watanabe và cs., 2002; Chen và Wu, 2003; De Oliveira và cs., 2004; Du và cs., 2004b; Tuter và cs., 2004; Chang và cs.,

2005; Lai và cs., 2005) Enzym này được cung cấp bởi novozyme dưới tên thương

mại Novozym 435 (trước đây gọi là SP435) được cố định trên nhựa acrylic resin

Lipase thương mại Mucor miehei (Lipozyme IM60 - Novozyme) được cố định trên

nhựa trao đổi ion (Mittlebach, 1990; Nelson và cs., 1996; Selmi và Thomas, 1998;

Dossat và cs., 1999; Shieh và cs., 2003; De Oliveira và cs., 2004) Mặc dù các

enzym cố định đã có sẵn, nhưng việc tìm hiểu, phát hiện các chất mang mới vẫn là

một đề tài hấp dẫn Lipase P.fluorescens được cố định trên kaolinite (Toyonite

200-M) mang lại tỷ lệ chuyển hoá propyl oleate và butyl oleate cao so với các lipase thu được từ P.cepacia, M.javanicus, C.rugosa và R.niveus Lipase P.cepacia (PS-30) được cố định trên chất mang phyllosilicate ở dạng sol-gel hoạt động mạnh hơn so

với lipase C.antarctica và Thermomyces (Humicola) lanuginosa cố định trên hat

silica Lipase PS-30 cố định trong kaoline cho sản lượng ester cao hơn thể hiện rằng việc nhốt lipase PS-30 góp phần bảo vệ nó khỏi sự bất hoạt của methanol Cố định lipase trên bề mặt các hạt không bảo vệ enzym khỏi sự bất hoạt của các cơ chất phân cực (như methanol) vì chúng chỉ hấp thụ trên chất mang (Hsu và cs., 2002) Lipase T.lanuginosa và P.cepacia được cố định trên chất mang phyllosilicate ở

dạng sol-gel thực hiện phản ứng tổng hợp ester (80–90% sản lượng) từ mỡ có chứa

các acid béo tự do 2,6 đến 36% (Hsu và cs., 2004) Việc lựa chọn chất mang dường như ảnh hưởng đến sự methanol hoá triolein trong n-hexane Lipase P.fluorescens

hoạt động mạnh hơn khi cố định trên polypropylene EP100 so với celite Hai chất mang này khác nhau về hình thái như bề mặt, kích thước các lỗ và bản chất hoá học

(Bosley và Peilow, 1997; Barros và cs., 1998) Các thông số này ảnh hưởng mạnh

mẽ đến khả năng xúc tác của enzym Shah và cs (2004) đã cố định lipase

C.viscosum trên Celite 545 để ethanol hoá dầu Jatropha và thấy rằng việc cố định

gia tăng sản lượng ester từ 62% (lipase tự do) lên 71%

Quy trình cố định lipase P.cepacia đã được để xuất bởi Noureddini và cs

(2005) Lipase được nhốt trong gel bởi sự trùng ngưng tetramethoxysilane đã thuỷ

phân và iso-butyltrimethoxysilane Lipase cố định xúc tác chuyển hoá hoàn toàn

triglyceride trong thời gian ngắn (30 phút), nó rất bền và mất ít hoạt tính khi dùng

lặp lại

2.4 Ứng dụng của lipase vi sinh vật

Lipase xúc tác các phản ứng sinh học linh hoạt và thể hiện nhiều phản ứng biến đổi sinh học: thủy phân, nội ester hoá, ester hoá, Lipase hoạt động trong các điều kiện khá “êm dịu” Chúng có thể phản ứng trong các dung môi hữu cơ khác nhau và thường thể hiện tính chọn lọc qua từng loại phản ứng Lipase có thể thay

thế tốt cho nhiều kỹ thuật hữu cơ cổ điển trong việc biến đổi các phân tử phức tạp Chúng có nhiều đặc tính xúc tác sinh học rất quý Khi so sánh với các công nghệ truyền thống, việc sử dụng lipase có thể giảm được chi phí về năng luợng và độc

chất trong sản phẩm (Jansen và cs., 1996) Các lipase kiềm ưa nhiệt được sử dụng

rộng rãi trong công nghệ tẩy rửa Nhiều loại vết thực phẩm và các huyết thanh người có chứa các triglyceride sẽ được lipase thủy phân thành các acid béo, monoglyceride và diglyceride Các sản phẩm này dễ dàng loại khỏi các vật liệu (vải,

quần, áo, gỗ, ) hơn là các chất triglyceride chưa thủy phân (Fuji và cs., 1986)

2.4.1 Ứng dụng lipase trong công nghiệp thực phẩm

Lipase đã trở thành một phần quan trọng của công nghiệp thực phẩm hiện đại

(Jäeger và cs., 1994; Kirk và cs., 2002; Jäeger và Eggert; 2002).Việc sử dụng lipase

để cải thiện quá trình chế biến hoá học trong sản xuất thực phẩm đã được phát triển

trong những năm gần đây Yoneda và cs (1996) đã dùng lipase Pseudomonas ứng

dụng trong quá trình chế biến thực phẩm và sản xuất dầu ăn Alcoholysis của dầu gan cá tuyết để sản xuất omega-3 là một acid béo để chống lại sự hình thành

cholesterol Điều này đã được khám phá khi dùng lipase của Pseudomonas (Zuyi và

Ward 1993) Một vài loài vi khuẩn sản sinh ra ester tạo mùi ứng dụng trong công

nghiệp phomai Sản phẩm mùi do lipase của vi khuẩn Staphylococcus warneri và

Staphylococcus xylosus cũng đã được miêu tả bởi Talon và cs (1996) Lipase của vi khuẩn C.viscosum giúp cho việc tích trữ hương vị tốt hơn khi tích trữ trong vòng

một tháng Trong trường hợp này, hoạt động của lipase ngay lập tức cải thiện quá

trình khử nước (Carlile và cs., 1996) Nhiều hợp chất hương (Yadav và cs., 2008), chất hoạt động bề mặt phi ion (Yu và cs., 2008) chất nhũ hoá đã được tổng hợp nhờ xúc tác của lipase Ricinoleic acid estolide (Bódalo và cs., 2008), monoacylglycerol (Esmelindro và cs., 2008; Kittikun và cs., 2008) đã được tổng hợp để điều chỉnh độ

nhớt của chocolate và nhũ hoá cho magarin Xin và cs (2009) đã dùng lipase xúc tác tổng hợp olein ferulyl có tác dụng như là chất chồng oxi hoá trong thực phẩm đồng thời có tác dụng ngăn chăn bệnh tim, chống viêm và chống ung thư

Các polymer sinh học đã được tổng hợp nhờ xúc tác lipase Các polymer này được ứng dụng trong công nghệ thực phẩm làm các màng bao kỵ nước

Nhiều dạng enzym đã được thương mại hóa dùng trong công nghệ thực phẩm Freshzyme®, Lipopan®, Noopazyme®, Palatase®, Novozym® 871 Một số sản