Nghiên cứu xử lý chất thải từ quá trình sản xuất nấm ăn để sản xuất phân hữu cơ vi sinh

Ảnh hưởng của hàm lượng cám và trấu trong môi trường đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase của T3 ...22 III.3.2.2.. Ảnh hưởng của hàm lượng cám và trấu trong môi trường đến khả n

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

-

TẠ THỊ HIỀN

NGHIÊN CỨU XỬ LÝ CHẤT THẢI

TỪ QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT NẤM ĂN

ĐỂ SẢN XUẤT PHÂN HỮU CƠ VI SINH

Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Mã số: 60.42.80

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 08 năm 2009

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH

Cán bộ chấm nhận xét 1 :

Cán bộ chấm nhận xét 2 :

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại :

HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

Ngày tháng năm 2009

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc

Tp HCM, ngày 03 tháng 08 năm 2009

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Đồng

Chuyên ngành : Công Nghệ Sinh Học

1- TÊN ĐỀ TÀI: “ Nghiên cứu xử lý chất thải từ quá trình sản xuất nấm ăn để sản xuất phân hữu cơ vi sinh”

2- NHIỆM VỤ LUẬN VĂN:

9 Tuyển chọn chủng Trichoderma reesei có hoạt tính CMCase cao

9 Tối ưu hóa điều kiện nhân giống Trichoderma reesei

9 Xác định các điều kiện tối ưu để xử lý mạt cưa sau trồng nấm

9 Thử nghiệm và đánh giá chất lượng phân đươc sản xuất

3- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: Tháng 02/2009

4- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: Tháng 07/2009

5- HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

PGS.TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG

Nội dung và đề cương Luận văn thạc sĩ đã được Hội Đồng Chuyên Ngành thông qua

(Họ tên và chữ ký)

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cám ơn quí Thầy Cô thuộc bộ môn Công Nghệ Sinh Học, trường đại học Bách Khoa TP.HCM đã hết lòng dạy bảo và hướng dẫn cho tôi trong một thời gian dài học tập tại trường Nhờ đó mà tôi nâng cao được kiến thức

và khả năng chuyên môn để giúp ích cho bản thân tôi trong cuộc sống và có ích cho xã hội trong tương lai

Tôi xin chân thành cảm ơn thầy PGS.TS.NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG đã hướng

dẫn tận tình và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn này

Một lần nữa xin chân thành cám ơn Thầy và kính chúc Thầy Cô vui khỏe, và gia đình luôn hạnh phúc

Tôi xin cảm ơn tất cả bạn bè và những người cộng tác với tôi đã giúp đỡ và động viên tôi hoàn thành tốt luân văn này

Nấm ăn gồm nhiều loại như nấm bào ngư, nấm rơm, nấm mèo, nấm đông cô, … Nguyên liệu trồng nấm rất đa dạng và phong phú chủ yếu là từ các loại phế phẩm nông lâm nghiệp như xơ dừa, rơm rạ, bả mía, vỏ cây đậu, cùi bắp, mạt cưa… Với nhu cầu trồng nấm ngày một gia tăng, thì lượng chất thải sau mỗi vụ thu hoạch nấm ngày một nhiều Ước tính hàng năm số lượng chất thải lên tới hàng triệu tấn, phần lớn là mạt cưa sau trồng nấm Trong chất thải đó có hàm lượng chất hữu cơ vẫn duy trì ở mức cao khoảng 90% Cùng với các thành phần khó phân hủy như cellulose, chiếm từ 35% đến 45%, nên quá trình phân hủy tự nhiên trong đất sẽ tốn thời gian rất dài

Trong đề tài này chúng tôi sử dụng mạt cưa thải ra sau mỗi vụ thu hoạch nấm

bào ngư (có tỉ lệ C/N là 49.1), được xử lý bằng Trichoderma reesei, sau 14 ngày

hàm lượng cellulose còn lại 18.14%, và C/N là 19.5

Qua kết quả đánh giá chất lượng phân cho thấy sản phẩm sau phân giải bởi

Trichoderma đạt tiêu chuẩn của phân hữu cơ vi sinh như thành phần nitơ 1.89 %,

Đề tài này có ý nghĩa trong việc xử lý phế thải ô nhiễm và tạo sản phẩm xã hội

có giá trị, góp phần cải thiện môi trường, tiến đến một nền nông nghiệp sinh thái bền vững

There are many kind of mushrooms such as peziza, volvariella, pleurotus, auricularia spp, flammulina velutipes Materials for mushroom manufacturing is very plentiful and variety from the wastes of the agriculture and forestry include straw, sawdust, bagasse, comcob, coconut fiber, etc The increase in mushroom manufacturing goes together with the release of the waste matters In the estimation, the waste matters after every mushroom harvest were released came up to millions

of tons, the main is sawdust In that waste matters still have a lot of organic matter about 90 percent And the percentage of cellulose is about 35 to 45, so the natural degradation processes for this component takes along time and cause environment contaminated

In our research, sawdust from pleurotus mushroom manufacturing with C/N is

49.1 was treated with Trichoderma reesei which can produce cellulase with strong

activities by fermentation technology As a result, the remain of cellulose percent is 18.14 and the rate of C/N is 19.5 This product is meet the standard of micro-organisms fertilizer with nitrogen 1.89 %, potassium 2.71%, phosphore 0.73 %,etc

On the other hand, this research is also helpful to reuse polluted wastes to make new social products useful for human being Its also contributes to the improvement the environment for a better long lasting ecological agriculture

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN

LỜI CẢM ƠN

TÓM TẮT MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

PHẦN I MỞ ĐẦU 1

II.1 Cellulase 3

II.1.1 Phân loại và danh pháp quốc tế 3

II.1.2 Cấu tạo hóa học và cấu trúc không gian 3

II.1.3 Tính chất cellulase 4

II.1.4 cơ chế tác dụng 4

II.1.4.1.giới thiệu cellulose – cơ chất của cellulase 4

II.1.4.2 Tính chất chung của cellulose 4

II.1.4.3 Cơ chế tác dụng cellulase 5

II.1.5 Điều kiện hình thành cellulase ở sinh vật 6

II.1.6 Ảnh hưởng của yếu tố dinh dưỡng đối với quá trình sinh tổng hợp enzym cellulase của vi sinh vật 6

II1.6.1 Ảnh hưởng của nguồn cacbon 6

II.1.6.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ 7

II.1.6.3 Ảnh hưởng của nguyên tố vi lượng 7

II.1.6.4 Ảnh hưởng bởi những yếu tố khác 7

II.1.6.7 Nguồn thu nhận 8

II.2 Trichoderma 9

II.2.1 Đặc điểm sinh học của Trichoderma .9

II.2.1.1 Vị trí phân loại 9

II.2.1.2 Đặc điểm hình thái 10

II.2.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 10

II.2.2.1 Đặc điểm sinh thái 10

II.2.2.2 Môi trường sống 10

II.2.2.3 Môi trường nhân sinh khối 11

II.2.3 Một số nghiên cứu ứng dụng vi nấm Trichoderma 12

II.2.3.1 Trong lĩnh vực bảo vệ thực vật và cải thiện năng suất cây trồng 12

II.2.3.2 Trong lĩnh vực xử lý môi trường 13

II.2.3.3 Trong các lĩnh vực khác 13

II.2.4 Tình hình nghiên cứu trong nước 13

II.4 Giới thiệu phân hữu cơ – vi sinh 15

II.4.1 Phân hữu cơ 16

II.4.2 Phân vi sinh 16

II.4.2.1 Định nghĩa 16

II.4.2.2 Phân loại 16

PHẦN III 18

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

III.1.2 Phế thải sau trồng nấm: 18

III.1.3 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật 18

III.1.4 Hóa chất và thiết bị 18

III.1.4 1 Các hóa chất làm môi trường 18

III.1.4 2 Các hóa chất phân tích 19

III.2 Dụng cụ, thiết bị 20

III.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

* Phương pháp bố trí thí nghiệm 20

III.3.1.Tuyển chọn chủng Trichoderma có khả năng sinh trưởng và sinh

tổng hợp cellulose cao .20

III.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy ban đầu đến hoạt tính cellulose trên môi trường bán rắn .22

III.3.2.1 Ảnh hưởng của hàm lượng cám và trấu trong môi trường đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase của T3 22

III.3.2.2 Ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase của T3 23

III.3.2.3 Ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase của T3 23

III.3.2.4 Tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy để thu nhận chế phẩm có hoạt tính CMCase cao 24

III.3.2.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến hoạt tính CMCase của chế phẩm 25

III.3.3 Xác định ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy ban đầu để xử lý mạt cưa sau trồng nấm 26

III.3.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng lượng giống Trichoderma reesei đến khả năng phân giải mạt cưa sau trồng nấm 26

III.3.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng phân giải mạt cưa sau trồng nấm của T.reesei 27

III.3.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng phân giải mạt cưa sau trồng nấm của T reesei .28

III.3.3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đến sự phân giải mạt cưa sau trồng nấm của T reesei .28

III.3.3.5 Thử nghiệm và đánh giá chất lượng phân được sản xuất .29

III.3.4 Các phương pháp hóa lý 29

III.3.4.1 Phương pháp xác định pH 29

III.3.4.2 Phương pháp xác định độ ẩm 30

III.3.5 Các phương pháp hóa sinh 30

III.3.5.1 Phương pháp xác định hoạt tính CMCase 30

III.3.5.2 Phương pháp xác định tro và tổng hữu cơ 33

III.3.5.3 Phương pháp xác định hàm lượng cellulose 33

III.3.5.4 Phương pháp xác định nitơ tổng số 34

III.3.6 Các phương pháp vi sinh vật 35

III.3.6.1 Phương pháp cấy chuyển và giữ giống 35

III.3.6.2 Phương pháp gieo cấy nấm mốc 35

III.3.6.4 Phương pháp xác định số tế bào vi sinh vật 36

III.3.6.5 Phương pháp xác định lượng sinh khối tạo thành 36

III.3.7 Phương pháp xử lý số liệu 36

PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 37

IV.1 Xác định thành phần chính trong mạt cưa sau trồng nấm 37

IV.2 Tuyển chọn chủng Trichoderma có khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp cellulose cao .37

IV.3 Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy ban đầu đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase của T3 39

IV.3.1 Ảnh hưởng của hàm lượng cám và trấu trong môi trường đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase của T3 39

IV.3 2 Ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase của T3 40

IV.3.3 Ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase của T3 41

IV.4 Tối ưu hóa các điều kiện ảnh hưởng đến khả năng phân giải cellulose của Trichoderma reesei 43

IV.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến hoạt tính CMCase của chế phẩm.45 IV.5.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính CMCase của chế phẩm 45

IV.5.2 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính CMCase của chế phẩm 47

IV.6 Xác định ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy ban đầu để xử lý mạt cưa sau trồng nấm .49

IV.6.1 Nghiên cứu ảnh hưởng lượng giống T reesei đến khả năng phân giải mạt cưa sau trồng nấm 49

IV.6.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng phân giải mạt cưa sau trồng nấm của T.reesei 51

IV.6.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng phân giải mạt cưa sau trồng nấm của Trichoderma reesei 52

IV.6.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đến sự phân giải mạt cưa sau trồng nấm của Tichoderma reesei 54

IV.7 Thử nghiệm và đánh giá chất lượng phân được sản xuất 56

IV.7.1 Đánh giá cảm quan 56

IV.7.1.1 Mùi 56

IV.7.1.2 Màu sắc 56

IV.7.1.3 Các thành phần đa lượng và vi lượng và tổng số vi sinh vật phân giải cellulose 57

PHẦN V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59

Bảng II.1 Một số loài nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp cellulase 10

Bảng III.1: Thành phần hóa học của cám gạo 24

Bảng III.2: Thành phần khoáng chất và vitamin của cám gạo 24

Bảng III 3: Ảnh hưởng của thời gian đến sự sinh trưởng của Trichoderma 27

Bảng III 4: Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt tính CMCase 27

Bảng III 5: Ảnh hưởng của hàm lượng cám và trấu đến hoạt tính CMCase 28

Bảng III 6: Ảnh hưởng của pH ban đầu đến hoạt tính CMCase 29

Bảng III 7: Ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu đến hoạt tính CMCase 29

Bảng III.8 Biến số thí nghiệm 30

Bảng III.9 Ma trận các nghiệm thức 30

Bảng III 10: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính CMCase 31

Bảng III 11: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của hoạt tính CMCase 31

Bảng III 12: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính CMCase 32

Bảng III 13: Ảnh hưởng của pH đến độ bền của hoạt tính CMCase 32

Bảng III.14: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến khả năng giảm cellulose của mạt cưa sau trồng nấm 33

Bảng III.15: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến khả năng gãy vỡ của mạt cưa sau trồng nấm 33

Bảng III.16: Ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng giảm cellulose của mạt cưa sau trồng nấm 34

Bảng III.17: Ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng gãy vỡ của mạt cưa sau trồng nấm 34

Bảng III.18: Ảnh hưởng của pH đến khả năng giảm cellulose của mạt cưa sau trồng nấm 35

Bảng III.19: Ảnh hưởng của pH đến khả năng gãy vỡ của mạt cưa sau trồng nấm 35

Bảng III.20: Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng gãy vỡ của mạt cưa sau trồng nấm 35

Bảng III.21: Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng giảm cellulose của mạt cưa sau trồng nấm 36

Bảng III.22: Ảnh hưởng của thời gian đến tỷ số C/N của mạt cưa sau trồng nấm 36

Bảng IV.1 Các thành phần chính trong mạt cưa sau trồng nấm 46

Bảng IV.3: Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình sinh trưởng của Trichoderma 48

Bảng IV.4: Ảnh hưởng của hàm lượng cám và trấu đến hoạt tính CMCase 49

Bảng IV 5: Ảnh hưởng của pH ban đầu đến hoạt tính CMCase 51

Bảng IV.6: Ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu đến hoạt tính CMCase 52

Bảng IV.7 Ma trận các nghiệm thức 53

Bảng IV.8 Bảng thí nghiệm leo dốc 55

Bảng IV.9: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính CMCase 56

Bảng IV.10: Ảnh hưởng của pH đến độ bền của hoạt tính CMCase 57

Bảng IV.11: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính CMCase 58

Bảng IV.12 Ảnh hưởng của pH đến độ bền của hoạt tính CMCase 60

Bảng IV.13: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến khả năng gãy vỡ của mạt cưa sau trồng nấm 60

Bảng IV.I4: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến khả năng giảm cellulose của mạt cưa sau trồng nấm 61

Bảng IV.I5: Ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng gãy vỡ của mạt cưa sau trồng nấm 62

Bảng IV.I6: Ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng giảm cellulose của mạt cưa sau trồng nấm 63

Bảng IV.17: Ảnh hưởng của pH đến khả năng gãy vỡ của mạt cưa sau trồng nấm 64

Bảng IV.18: Ảnh hưởng của pH đến khả năng giảm cellulose của mạt cưa sau trồng nấm 65

Bảng IV19: Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng gãy vỡ của mạt cưa sau trồng nấm 66

Bảng IV.20: Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng giảm cellulose của mạt cưa sau trồng nấm 67

Bảng IV.21: Ảnh hưởng của thời gian đến tỷ số C/N của mạt cưa sau trồng nấm 68

Bảng IV.22: Thành phần đa lượng của sản phẩm sau lên men 70

Bảng IV.23 Các chỉ tiêu hóa học và vi sinh của sản phẩm sau lên men 71

Bảng IV.24: Đỉểm nhiệt chết của một số VSV gây bệnh 72

Hình II.1: Tác động enzym cellulase lên cellulose theo Mandels & Reesei 6

Hình II.2 : Tác động enzym cellulase lên Cellulose theo Ogawa & Toyona 6

Hình II.3: Trichoderma reesei 12

Hình IV.1: Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt tính CMCase của Trichoderma 47

Hình IV.2: Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình sinh trưởng của Trichoderma 48 Hình IV.3: Ảnh hưởng của hàm lượng cám và trấu đến hoạt tính CMCase 50

Hình IV 4: Ảnh hưởng của pH ban đầu đến hoạt tính CMCase 51

Hình IV 5: Ảnh hưởng của pH ban đầu đến hoạt tính CMCase 52

Hình IV.6:Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính CMCase 56

Hình IV.7: Ảnh hưởng của pH đến độ bền của hoạt tính CMCase 57

Bảng IV.8: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính CMCase 58

Hình IV.9 Ảnh hưởng của pH đến độ bền của hoạt tính CMCase 59

Hình IV.10: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến khả năng gãy vỡ của mạt cưa sau trồng nấm 61

Hình IV.11: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến khả năng giảm cellulose của mạt cưa sau trồng nấm 62

Hình IV.12: Ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng gãy vỡ của mạt cưa sau trồng nấm 63

Hình IV.13: Ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng giảm cellulose của mạt cưa sau trồng nấm 64

Hình IV.14: Ảnh hưởng của pH đến khả năng gãy vỡ của mạt cưa sau trồng nấm 65

Hình IV.15: Ảnh hưởng của pH đến khả năng giảm cellulose của mạt cưa sau trồng nấm 66

Hình IV.16: Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng gãy vỡ của mạt cưa sau trồng nấm 67

Hình IV.17: Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng giảm cellulose của mạt cưa sau trồng nấm 68

Hình IV.18: Ảnh hưởng của thời gian đến tỷ số C/N của mạt cưa sau trồng nấm 68

PHẦN I MỞ ĐẦU

Ở nước ta, chỉ hơn 10 năm trở lại đây, ngành trồng nấm phát triển mạnh, được coi như một

nghề mang lại hiệu quả kinh tế cao Nấm được nuôi trồng trên khắp 61 tỉnh, thành phố Ở các tỉnh phía Nam như: Đồng Nai – Kiên Giang - Bến Tre; chủ yếu trồng nấm bào ngư, nấm rơm

và mộc nhĩ, sản lượng các loại nấm trồng đạt hàng chục ngàn tấn mỗi năm Và các tỉnh phía Bắc như Hải Dương, Hà Tây, Ninh Bình đã có nhiều cơ sở quốc doanh, tập thể, hộ gia đình trồng nấm Tổng sản lượng đạt trên 10 ngàn tấn/năm Mặc dù đứng thứ 3 thế giới về xuất khẩu nấm nhưng theo đánh giá chung của nhiều chuyên gia, việc sản xuất, chế biến nấm ở nước ta chưa tương xứng với tiềm năng và giá trị của nó Do ngành sản xuất nấm ăn đem lại nhiều lợi ích thiết thực (tận dụng các phế liệu trong nông nghiệp, lâm nghiệp và công nghiệp nên các kết quả nghiên cứu của Trung tâm công nghệ sinh học thực vật về nấm đã được nhiều địa phương

áp dụng nhanh chóng Đến nay, sản lượng nấm nước ta đạt trên 1 triệu tấn/năm, sử dụng khoảng 6 triệu tấn phế liệu, phụ phẩm nông nghiệp cho nuôi trồng nấm

Đi đôi với việc gia tăng sản lượng thì lượng chất thải từ quá trình trồng nấm cũng gia tăng không kém Hiện nay lượng chất thải đó chưa được tận dụng một cách có hiệu quả Một phần chất thải sau trồng nấm được tái sử dụng để trồng lại nấm nhưng năng suất kém, hoặc chất thải

đó được dùng để chôn lấp làm phân nhưng thời gian ủ rất lâu, và phần còn lại của chất thải được thải ra môi trường gây ô nhiễm môi trường Mà nguyên vật liệu để làm nấm chủ yếu bao gồm mạt cưa từ gỗ cây vườn, cây rừng, gỗ tạp Ngoài ra còn sử dụng rơm, rạ, bả mía, bông phế liệu, cùi bắp, bẹ chuối khô, lục bình Những nguyên liệu này có thành phần chính là cellulose, rất khó phân hủy trong điều kiện tự nhiên

Chính vì thế việc nghiên cứu xử lý chất thải sau trồng nấm một cách hiệu quả là rất cần thiết Hơn nữa, nhu cầu sử dụng phân bón hữu cơ vi sinh ngày càng tăng; thay thế dần việc bón phân hóa học trên đồng ruộng, đất trồng trọt mà vẫn đảm bảo được nâng cao năng suất thu hoạch

Sử dụng phân bón hữu cơ vi sinh về lâu dài sẽ dần dần trả lại độ phì nhiêu cho đất như làm tăng lượng phospho và kali dễ tan trong đất canh tác, cải tạo, giữ độ bền của đất đối với cây trồng nhờ khả năng cung cấp hàng loạt các chất chuyển hoá khác nhau liên tục do nhiều quần thể vi sinh vật khác nhau tạo ra Giá thành hạ, nông dân dễ chấp nhận, có thể sản xuất được tại địa phương và giải quyết được việc làm cho một số lao động, ngoài ra cũng giảm được một phần chi phí ngoại tệ nhập khẩu phân hoá học

Từ nhu cầu rất thiết thực đó, chúng tôi chọn đề tài “nghiên cứu xử lý chất thải từ quá trình sản xuất nấm ăn để sản xuất phân hữu cơ vi sinh” Trong phạm vi đề tài chúng tôi chỉ nghiên cứu

xử lý chất thải từ quá trình trồng nấm bào ngư từ mạt cưa và tập trung giải quyết những vấn đề sau:

9 Xác định thành phần chủ yếu của mạt cưa sau trồng nấm

9 Tuyển chọn chủng Trichoderma reesei có hoạt tính CMCase cao

9 Tối ưu hóa điều kiện nhân giống Trichoderma reesei

9 Xác định các điều kiện tối ưu để xử lý mạt cưa sau trồng nấm

9 Thử nghiệm và đánh giá chất lượng phân đươc sản xuất

PHẦN II TỔNG QUAN LÝ THUYẾT

II.1 Cellulase

Trong thiên nhiên không gặp enzyme cellulase ở dạng tinh khiết mà nằm trong một phức hệ các enzyme khác hemicellulase, pentozanase mà chúng có một tên chung là xitolase Enzyme này được vi sinh vật tổng hợp nên, đặc biệt là hệ sản sinh enzyme có hoạt lực rất cao Cho đến nay người ta cũng chưa tách riêng cellulase ra khỏi hệ enzyme để sản xuất theo qui mô công nghiệp Đây là một enzyme có ý nghĩa thực tiễn rất lớn trong công nghiệp rượu bia và các thức uống lên men từ dịch chiết trái cây Trong công nghiệp sản xuất thức ăn cho gia súc và một hướng sản xuất mới trong xử lý rác, phế phụ liệu nông nghiệp

II.1.1 Phân loại và danh pháp quốc tế

Có thể chia cellulase thành 3 enzyme như sau :

Trong loại này có thể chia ra làm 2 loại enzyme nhỏ :

a Cellobiohydrolase (CBH) có tên khác là exo-β-1,4 Glucanase hay exocellulase có mã số E.C 3.2.191 ; CAS 37329-65-0

b.Endoglucanase có tên khác là endo β-1,4-D-glucanase hay β-1,4-glucan-4-glucanohydrolase

có mã số E.C.3.2.1.4: CAS 9012-54-8

3 β- glucozitase có tên khác là β-D-glucozit-glucohydrolase, hay cellobiase có mã số E.C.3.2.1.21: CAS 9001-22-3

II.1.2 Cấu tạo hóa học và cấu trúc không gian

Cellulase có bản chất là protein được cấu tạo từ các đơn vị acid amin bởi liên kết peptit NH-, tuy nhiên trong cấu trúc có gắn phần phụ khác Cấu trúc không gian cellulase bao gồm một trung tâm xúc tác và một đuôi không gian, phần đuôi này xuất phát từ trung tâm xúc tác nhưng được gắn thêm vùng glycosil hóa và cuối đuôi này là vùng gắn kết với cellulose Vùng gắn kết với cellulose có cấu tạo khác với liên kết thông thường -CO-NH-của protein và việc thay đổi chiều dài của vùng glycosil hóa có ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme Trọng lượng của enzym cellulase thay đổi từ 30-110 Kda (Beguin 1990; Gilkes và cọng sự 1991) Cấu trúc không gian khoảng 280-600aa nhưng chiều dài cellulase thường khoảng 300 - 450aa (Gilkes và cộng sự 1991) và trung tâm xúc tác cỡ khoảng 250aa

–CO-II.1.3 Tính chất cellulase

Theo sự hiểu biết, cho đến ngày nay thì quá trình phân hủy cellulose trong tự nhiên được thực

như bông, giấy,…vv, trương lên và chuẩn bị cho tác động của enzyme tiếp theo (Whiterker

dụng biến đổi cellulose nhưng khi tách ra thì tác dụng này không còn thấy rõ

* Enzyme Cx còn gọi là enzym β-glucanase, enzyme này thủy phân cellulose thành cellobiose Chữ x có nghĩa đây là loại enzyme có nhiều thành phần khác nhau Người ta chia

nó làm hai loại :

- Exo- β-1,4 glucan cellobiohydrolase: đây là một exocellulase thực hiện phản ứng cắt liên kết β-1,4 glucozit giải phóng cellobiose từ đầu không khử của chuỗi cellulose (chuỗi glucan và cellodestrine)

- Endo- β-1,4 glucane cellobiohydrolase: đây là endocellulase thực hiện phản ứng cắt liên kết β-1,4 glucozit ở bất kỳ chổ nào trong chuỗi cellulose

của nhóm enzyme thứ ba Tuy nhiên có tác giả Ogawa và Toyama (1967) cho rằng còn có một

tan Enzyme sẽ tiếp tục thủy phân các loại cellodestrine này thành cellobiose

* Enzyme β-glucosidase: hay có tên khác là cellobiase, đây là enzyme phân cắt đặc hiệu cellobiose, cellodestrine thành D-glucose

II.1.4 Cơ chế tác dụng

II.1.4.1.Giới thiệu cellulose – cơ chất của cellulase

Hằng năm có khoảng 232 tỷ tấn hữu cơ được thực vật tổng hơp nhờ quá trình quang hợp Trong số này có 172 tỷ tấn được hình thành ở đất liền và 60 tỷ tấn hình thành trong đại dương Trong số này có 30% là màng thực vật mà thành phần chủ yếu là cellulose Hàm lượng cellulose trong thực vật thường thay đổi lớn 40 - 80%, ví dụ trong bông chiếm đến 80% nhưng trong gỗ khô chiếm 40 – 50%

II.1.4.2 Tính chất chung của cellulose

Cellulose là một trong những hợp chất khá bền, không tan trong nước, nhưng có thể hút nước

và trương nở lên Tuy nhiên, chúng có thể bị phân hủy trong điều kiện nước có nhiệt độ cao và

áp suất lớn, hay trong dung dịch có chứa tác nhân axid hay kiềm mạnh

enzyme cellulase

bột và cho màu nâu với Iot

Trong tế bào thực vật cellulose liên kết chặt chẻ với hemicellulose, pectin, lignin Điều này ảnh hưởng rất lớn đến sự phân hủy cellulose của enzyme Trong tự nhiên không có vi sinh vật nào

có đầy đủ tất cả các hệ enzyme vì thế để phân hủy cellulose thì đòi hỏi có sự kết hợp của nhiều VSV khác nhau

Dạng kết tinh vô định hình dễ bị phân hủy bởi enzyme vi sinh vật, nhưng dạng kết tinh thì có cấu trúc rất chặt chẻ nên khó bị phân hủy Ở các loại gỗ càng có nhiều kết tinh thì gỗ càng chắc Muốn phá hủy hoàn toàn cellulose thì trước tiên phải chuyển chúng sang dạng vô định hình nhờ các loại enzyme khác có ở vi sinh vật

II.1.4.3 Cơ chế tác dụng cellulase

Theo nhiều tác giả khác nhau thì cơ chế tác động của hệ enzyme cellulase có nhiều kiểu tác động khác nhau

+ Theo Mandels và Resee (1964) thì:

Cellulose cellulose hoạt động cellobiose glucose

Hình II.1: Tác động enzym cellulase lên cellulose theo Mandels & Reesei

Cellulose Cellulose trương Các sản phẩm hòa tan cellulose

Hình II.2 : Tác động enzym cellulase lên Cellulose theo Ogawa & Toyona

II.1.5 Điều kiện hình thành cellulase ở sinh vật

Enzyme tạo ra ở vi sinh vật không chỉ phụ thuộc vào hoạt tính riêng của từng loại vi sinh vật

mà còn phụ thuộc vào nhiều thành phần, môi trường , điều kiện nuôi cấy (pH, nhiệt độ…) nên

sự hiện diện của chất cảm ứng trong môi trường là điều quan trọng nhất [4]

Enzyme thủy phân của vi sinh vật đều là enzyme cảm ứng, khi môi trường nuôi cấy có một chất khó đồng hóa thì vi sinh vật phải tiết vào trong môi trường hoặc những enzyme tương ứng

để thuỷ phân chất đó thành chất đơn giản hơn là sinh vật có thể sử dụng Chính vì thế mà người ta đã đưa ra môt định nghĩa tổng quát : “ Một quá trình sinh tổng hợp enzyme cảm ứng nếu như nó xảy ra với mức độ đáng kể khi trong môi trường có chất đặc hiệu của enzyme này hoăc các chất có cấu trúc tương tự, các enzyme thuộc loại này gọi là enzyme cảm ứng Các chất kích thích trong quá trình tổng hợp này gọi là chất cảm ứng”

Để tổng hợp cellulase thì nhất thiết phải có chất cảm ứng, thông thường là chất cellulsoe 1% Các nguồn cacbon khác: glucose, cellobiose, acetat, citrat, succinate và những sản phẩm trung gian của chu trình Krebs có tác dụng làm kiềm hãm sinh tổng hợp celluosase, song song môi trường có nồng độ rất ít chất kích thích sự phát triển sinh khối vi sinh vật và tạo ra các chất enzyme [25]

II.1.6 Ảnh hưởng của yếu tố dinh dưỡng đối với quá trình sinh tổng hợp enzym cellulase của vi sinh vật

II1.6.1 Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Thực tế cho thấy sự tổng hợp cellulase mang tính chất cảm ứng Cellulose gây cảm ứng cho việc hình thành cellulase ở nhiều loại nấm khác nhau Một số tác giả nhận thấy các chất gây cảm ứng đối với enzyme này, ngoài cellulose còn có cellobiose , acetat, lactat,…Nghiên cứu

của Tozamacho biết cellulose nội bào của Trichoderma viride và Trichoderma konigi được tạo

thành khá nhiều Khi được nuôi cấy trên môi trường có cám tiểu mạch (mùn cưa, mùn ở 3-4

quá trình tổng hợp enzyme phân giải cellulose Acid citric và nhiều sản phẩm trung gian của chu trình Krebs là chất ức chế đối với sự tổng hợp cảm ứng cellulase ở Allenaria lenni Chaetomium globosum

Nấm Aspergillus gumigatus và các loại nấm ưa nhiệt thì nguồn C thích hợp là: Bột rơm nghiền, giấy lọc Còn Trichoderma reesei lại thích hợp trong nguồn cám bã củ cải đường [24] Tác giả Lê thị Hồng Mai khi nghiên cứu cellulase ở Asp Niger VS-1 trên môi trường đặc nhận

thấy: cám gạo là cơ chất thích hợp nhất để thu nhận enzyme từ chủng này [11]

II.1.6.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Nguồn nitơ trong môi trường nuôi cấy ảnh hưởng rõ rệt đến việc tạo thành cellulase ở nấm Theo Sin và Sinden (1951), khi sử dụng hết 1 g nitơ, nhiều vi sinh vật phân giải cellulose sẽ phân gỉải được khoảng 24-35 g cellulose Nitrat là nguồn nitơ thích hợp để tổng hợp cellulase

ở nhiều loài nấm khác nhau Điều này có thể giải thích như sau: Nitrat làm cho môi trường kiềm hóa, tạo điều kiện thuận lợi cho sự tạo thành cellulase (12)

Nói chung các muối amôn có tác dụng nâng cao hoạt lực enzyme này, thậm chí còn ức chế quá trình tổng hợp, vì rằng trong môi trường các muối này làm cho môi trường axit hóa, điều này

có thể làm mất hoạt tính enzyme khi tạo thành [20]

Các hợp chất nitơ có ảnh hưởng khác nhau trong sinh hoạt tổng hợp cellulase điều này phụ thuộc đặc tính sinh lý của từng chủng giống

Tác giả Lê Thị Hồng Mai cũng đã so sánh ảnh hưởng của nguồn nitơ lên sự tổng hợp CMC-ase

trên môi trường dịch thể Với chủng Asp, niger VS-1, tác giả nhận thấy: Trái với môi trường

II.1.6.3 Ảnh hưởng của nguyên tố vi lượng

Trong số các nguyên tố vi lượng thì Fe, Mn, Zn, Co là những nguyên tố ảnh hưởng nhiếu nhất đến việc tạo cellulase Nồng độ thích hợp nhiều nhất với nhiều loại nấm là 0,11-2,2mg/l (Zn : 2-10mg/l ; Fe : 3,1-21,2mg/l)

II.1.6.4 Ảnh hưởng bởi những yếu tố khác

* Nhiệt độ nuôi cấy [23]

Nhiệt độ nuôi cấy với sinh trưởng và tích lũy cellulase của nhiều loại nấm khác nhau là 28 –

Những chủng nấm có khả năng phân giải cellulose cao (như Trichoderma viride, Trichoderma

Koningi, Asp Niger…) đều là các loại nấm ưa nấm, chúng phát triển thích hợp nhất ở nhiệt độ

Stutgenberger và cộng sự (1971) cho biết trong số các vi sinh vật phân giải cellulose phân lập được từ phân rác ủ thì chiếm ưu thế là loài xạ khuẩn ưa nhiệt Thermonospora curvata Loài này

môi trường nuôi cấy chứa cellulose và tinh thể (Avicel) và cao nấm men

* pH ban đầu của môi trường [5]

Nhiều loại nấm thích hợp phát triển và hình thành mạnh mẻ cellulase ở pH = 4.6, Fusarium

osysporum và Tr Koningi có thể tiếp tục phát triển và phân hủy cellulose ngay cả ở những môi

II.1.6.7 Nguồn thu nhận

Enzyme cellulase là một hệ enzyme khá phổ biến ở hầu hết các loài vi sinh vật như xạ khuẩn, nấm mốc, vi khuẩn Popov (1875) là người đầu tiên xác nhận khả năng phân giải cellulose của một số VSV kỵ khí Người đầu tiên phát hiện khả năng phân giải cellulose của các vi khuẩn hiếu khí là G Va Iterson (1903) Về sau các nghiên cứu về vi khuẩn được phát triển lên rất nhiều nhờ các công trình nghiên cứu sâu sắc của S.N Vinogradskii và của A.A Imtcheniezkii Những vi sinh vật có hoạt tính cellulase cao ngoài xạ khuẩn còn phải kể đến nấm mốc, và một

số đại diện khác

Những chủng nấm có hoạt tính phân giải cellulose như Trichoderma viride, Trichoderma

Komingi, Asp, niger, Myrotheciun verrucaria…đều là các loại nấm ưa ấm, chúng phát triển

Bảng II.1 Một số loài nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp cellulase

Những nấm mốc có khả năng sinh nhiều cellulase thuộc các giống Aternaria, Trichoderma,

Mychrotecium, Asperilllus, Penicillium, Cladosporium,… Chúng được tách từ đất xung quanh

vùng rễ cây, từ các mẫu thực vật, từ than bùn và các nguồn tự nhiên khác có quá trình phân

hủy cellulase Trong giống Alternaria tenuis thấy có 150 chủng có thể phân hủy giấy lọc tới 80%, 100 chủng Alternaria circinans phân hủy được 85% và 130 chủng Clodosporium

herbarum 8% [20]

II.2 Trichoderma

II.2.1 Đặc điểm sinh học của Trichoderma

II.2.1.1 Vị trí phân loại

Trichoderma là một trong những nhóm vi nấm gây nhiều khó khăn cho công tác phân loại do

còn nhiều đặc điểm cần thiết cho việc phân loại vẫn còn chưa được biết đầy đủ

Harman and Kubicek (1998) đã phân loại Trichoderma như sau :

Giống : Trichoderma

Ainsworth, G.S and Sussman, A.S (1968) lại cho rằng Trichoderma thuộc lớp

Deuteromycetes, bộ Moniliales, họ Moniliaceae Trong lúc đó theo hai nhà khoa học Elisa

Esposito và Manuela da Silva đã phân Trichoderma thuộc họ Hypocreaceae, lớp túi Ascomycetes; loài Trichoderma được phân thành 5 nhóm : Trichoderma, Longibrachiatum,

Saturnisporum, Pachibasium và Hypocreanum Trong đó, 3 nhóm Trichoderma, Pachibasium, Longibrachiatum có giai đoạn teleomorph (hình thái ở giai đoạn sinh sản hữu tính) là Hypocrea Nhóm Hypocreanum hiếm khi gặp dưới dạng teleomorph độc lập; nhóm

Saturnisporum không tìm thấy hình thái teleomorph

Hình II.3: Trichoderma reesei

II.2.1.2 Đặc điểm hình thái

Trichoderma sinh sản vô tính bằng đính bào tử từ khuẩn ty Khuẩn ty của vi nấm không màu,

cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều, ở cuối nhánh phát triển thành một khối tròn mang các bào

tử trần không có vách ngăn, không màu, liên kết nhau thành chùm nhỏ ở đầu cành nhờ chất nhầy Bào tử hình cầu, hình elip Khuẩn lạc nấm có màu trắng hoặc từ lục trắng đến lục, vàng,

xanh, lục xỉn đến lục đậm Các chủng của Trichoderma có tốc độ phát` triển nhanh, chúng có

II.2.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

II.2.2.1 Đặc điểm sinh thái

II.2.2.2 Môi trường sống

Trichoderma sp Là nhóm vi nấm phổ biến ở đất nông nghiệp, đồng cỏ, rừng, đầm muối và đất

sa mạc Hầu hết chúng là những vi sinh vật hoại sinh, nhưng chúng cũng có khả năng tấn công

các loại nấm khác Trichoderma rất ít tìm thấy trên thực vật sống và không sống nội ký sinh

với thực vật Chúng có thể tồn tại trong tất cả các vùng khí hậu từ miền cực Bắc đến những vùng núi cao cũng như miền nhiệt đới Tuy nhiên, có một sự tương quan giữa sự phân bố các

loài và các điều kiện môi trường

Trichoderma polysporum và Trichoderma viride có mặt ở vùng khí hậu lạnh, trong khi

Trichoderma hazianum có ở các vùng khí hậu nóng Điều này tương quan với nhu cầu nhiệt độ

tối đa cho từng loài

Các loài Trichodema thường xuất hiện ở đất acid, và Gochenaur (1970) cho rằng có thể có tương quan giữa sự hiện diện của Trichoderma viride với đất acid trong vùng khí hậu rất lạnh

ở Peru Trichoderma phát triển tốt ở bất cứ pH nào nhỏ hơn và có thể phát triển tốt ở đất kiềm

Tricoderma là vi nấm ưa độ ẩm, chúng đặc biệt chiếm ưu thế ở những nơi ẩm ướt, những khu

rừng khác nhau Trichoderma hamatum và Trichoderma pseudokoningi có thể chịu điều kiện

có độ ẩm cao hơn so với những loài khác Tuy nhiên, Trichoderma sp Thường không chịu được độ ẩm thấp mà điều này được cho là một yếu tố góp phần làm cho số lượng Tricoderma giảm rõ rệt trong những nơi có độ ẩm thấp, song các loài Trichoderma sp Khác nhau thì yêu

cầu vế nhiệt độ và độ ẩm cũng khác nhau

II.2.2.3 Môi trường nhân sinh khối

Kết quả thí nghiệm trong phòng thí nghiệm cho thấy nấm Trichoderma có khả năng ức chế một số nấm bệnh và sinh tổng hợp nhiều enzyme trong đó có enzyme cellulase phân giải

cellulose rất tốt Để mở rộng khả năng ứng dụng của chúng trong sản xuất thì vấn đề nhân sinh khối để tạo lượng lớp chế phẩm đã được đặt ra

Trichoderma có thể phát triển và hình thành bào tử trên môi trường có nhiều cellulose như: Bã

đậu phụ, lõi ngô, cám gạo, thóc , bã mía…Đặc biệt là trên môi trường bã đậu phụ nấm phát

chế phẩm này gặp rất nhiều khó khăn do độ ẩm Thay vào đó có môi trường thóc tuy lượng bào

hơn

Trong thời gian nuôi nhân sinh khối cần điều kiện thoáng khí, sau khi vô trùng cần làm cho môi trường xốp bằng cách lắc, không để cho chúng kết lại thành mảng, nếu bị kết mảng bào tử hình thành rất ít thậm chí sợi nấm không lan vào được

Các thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ, lượng nước, nguyên liệu làm môi trường cho thấy môi trường thóc là thích hợp cho việc nhân nuôi nấm [Nguyễn văn Tuất và Lê văn Thuyết, 2001]

II.2.3 Một số nghiên cứu ứng dụng vi nấm Trichoderma

II.2.3.1 Trong lĩnh vực bảo vệ thực vật và cải thiện năng suất cây trồng

* Bảo vệ thực vật [34]

Một trong những nghiên cứu ứng dụng của Trichoderma được quan tâm nhiều nhất đó là khả

năng đối kháng một số vi sinh vật gây bệnh ở thực vật Các nhà nghiên cứu đã sử dụng nhiều

loại Trichoderma khác nhau để kiểm soát có hiệu quả nhiều loại nấm gây bệnh khác nhau Ví dụ: Rhizoctonia sp : Gây mục rễ, thân và hạt,… Penicillium diditatum: Hỏng trái ở chanh và

chuối

Hiện nay người ta đã sử dụng nhiều chủng Trichoderma trong các chế phẩm sinh học thương mại như: GlioGard là chế phẩm để ngăn chặn sự úng thối của cây con Chế phẩm Trichodex với thành phần chính là Trichoderma harzianum là thành phần chính được dùng để chống lại

sự thối rửa của táo sau thu hoạch Trichoderma harzianum còn được kết hợp với Trichoderma

polysorum trong việc sản xuất Binabt để trị các vết thương bị nhiễm trùng ở cây trồng

Trong nước đã có nhiều công trình nghiên cứu sử dụng các chủng nấm Tricoderma xử lý đất

trước khi gieo trồng bắp hay trộn nấm mốc với phân chuồng loại mục trước khi bón ruộng

5-10 ngày, rồi rãi lên ruộng trước khi gieo hạt có tác dụng hạn chế bệnh khô vằn hai bắp [22]

* Cải thiện năng suất cây trồng

Cũng như thuốc trừ sâu, phân bón hóa học lâu ngày sẽ làm cho đất canh tác bị thoái hóa, chai sạn; các loại giun đất không phát triển được, làm hạn chế độ xốp, đồng thời độ thông khí cho cây cũng bị thiếu hụt Vì vậy các nước có nền nông nghiệp phát triển trên thế giới có xu hướng

sử dụng các loại phân bón hữu cơ thế hệ mới – thực chất là sự kết hợp giữa phân bón vi sinh và thuốc trừ sâu sinh học, dựa trên cơ sở đấu tranh sinh học Các loại phân bón vi sinh này có tác dụng như sau :

- Phòng ngừa bệnh gây thối mốc, bệnh héo rũ, bệnh chết cỏ, bệnh nấm sương mai, bệnh đốm

nâu….và hạn chế các tác hại nguy hiểm do các nấm gây mục gỗ nhờ khả năng bất hoạt enzyme của các nấm gây bệnh, đồng thới bảo vệ cây trồng khỏi các côn trùng đục phá thân [26]

- Đẩy mạnh tốc độ tăng trưởng của cây trồng nhờ khả năng giúp cây trồng tạo ra hệ rễ cứng

cáp hơn Gần đây, khi khảo sát các loài Tricoderma spp ở các lớp đất sâu, người ta còn tìm thấy Tricoderma spp, làm tăng số lượng các rễ sâu (các rễ cách mặt đất khoảng 1m) Điều này

góp phần giúp cho các cây lương thực như ngô hay các loài dùng để trang trí cỏ lát có khả

năng chống chịu tốt với hạn hán [40] Vài loài Trichoderma có khả năng kích thích sự nẩy

mầm và sự ra hoa đã cho nhiều công trình khoa học chứng minh rằng Tricoderma harzinum và

Tricoderma koningi kích thích sự nẩy mầm và tăng trưởng của cây Đối với các loài hoa được

trồng trong nhà kính, Tricoderma harzianum đẩy nhanh sự ra hoa bằng cách rút ngắn ngày ra

hoa hay tăng số lượng hoa [39]

- Cải thiện cấu trúc và thành phần của đất, đẩy mạnh sự phát triển của vi sinh vật và nốt sần cố định trong đất, duy trì sự cân bằng của các vi sinh vật hữu ích trong đất, bảo toàn và tăng độ phì nhiêu, dinh dưỡng cho cây trồng

- Phân giải từ từ cellulose có trong phân hữu cơ và đất trồng nên tăng cường dinh dưỡng và kích thích tăng trưởng của cây

- Tăng sức đề kháng của cây trồng, một số chủng Tricoderma harzianum còn có thể xâm nhập

vào mô bào cây, làm tăng tính chống chịu bệnh của cây trồng

Như vậy, các chủng nấm Tricoderma spp trong các chế phảm phân hữu cơ vi sinh không

những cung cấp một nguồn phân bón an toàn, hiệu quả mà còn kiềm chế các bệnh gây hại cây trồng và tạo đựơc những ổ sinh thái phòng bệnh lâu dài trong tự nhiên

II.2.3.2 Trong lĩnh vực xử lý môi trường

Tricoderma harzianum 2023 (Khoa sinh lý thực vật Trường Đại học California) có thể phân

giải DDT, endosulfan, pentacholoroitropenzen và pentacholorophenol Nấm này phân giải endosulfan trong nhiều điều kiện dinh dưỡng khác nhau trong suốt quá trình sống của nó

Tricoderma harzianum CCT-4790 phân giải 60% thuốc diệt cỏ Duirion trong dất trong 24 giờ,

đây là một tiềm năng tốt để xữ lý sinh học các chất gây ô nhiễm trong đất và đầm lầy

Một công trình nghiên cứu khác để xử lý nấm mốc Tricoderma reesei RUT-30 để xử lý chất

thải sinh họat đô thị hứa hẹn một nền sản xuất enzyme cellulase rẻ tiền, đồng thời giảm lượng rác thải Các enzym cellulase thu được từ đây được đánh giá là tốt hơn và kinh tế hơn so với enzyme celluase được lấy từ các nguồn cơ chất cellulose tinh chế

II.2.3.3 Trong các lĩnh vực khác

Tricoderma spp.là nguồn sản xuất hiệu quả các enzym cellulase ngoại bào Chúng được sử

dụng để sản xuất cellulase và những enzyme khác để làm giảm tính phức tạp của polisa charide Các enzyme này được sử dụng rất nhiều trong lương thực và trong công nghiệp sợi,

do chúng có thể làm cho vải bông mềm và trắng hơn [40]

L.Grange và cộng sự đã biểu hiện Gen-xylanase (XYN) của Tricoderma reesei ở

Saccharomyces cersvisiae để bổ sung vào thức ăn của gia cầm, tăng khả năng tiêu hóa hemicellulose trong lúa mạch và các cây lương thực khác [38]

II.2.4 Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam việc nghiên cứu nấm Trichoderma được bắt đầu từ năm 1990 bộ môn bệnh cây

Viện Bảo Vệ Thực Vật đã tiến hành phân lập các chủng Trichoderma từ các nguồn khác nhau

và xác định khả năng ức chế của nấm Trichoderma đối với một số nấm gây bệnh, tìm phương pháp nuôi cấy để tạo chế phẩm đưa ra sản xuất trên qui mô lớn Các chủng nấm Trichoderma

đã thu nhập có hiệu quả ức chế cao từ 67,7 – 85,5% đối với các nấm gây bệnh như :

Rhizoctonia,splani, Sclerotium rolfssi, Fusarium ssp.,Aspergillus spp.,

Nhóm nghiên cứu Cao Cường và Nguyễn Đức Lượng (Trường ĐHBK Tp HCM,2003) đã :

“khảo sát quá trình cảm ứng Enzyme kitinase và cellulase của Tricoderma harzianum - ảnh

hưởng của hai enzyme này lên nấm bệnh Sclerotium rolfssi “ bài viết đã chứng minh hai enzyme trên có tác động phân hủy vách khuẩn ty của nấm Sclerotium rolfssi làm khuẩn ty

nấm bệnh nhăn nheo, đứt vụn và biến dạng Tricoderma harzianum có khả năng kháng nấm bệnh và nhờ tiết enzyme ngoại bào trong đó dặc biệt quan trọng là cellulase và chitinase

Nhiều công trình nghiên cứu đã mang lại kết quả tốt trong việc dùng nấm Trichoderma chống

bệnh cho nhiều loại cây trồng; thối rễ ở cây hòa thảo, thối đen rễ ở cây bắp cải, cà chua, dưa leo, bầu bí, bệnh chêt ẻo ở cây họ đậu, bệnh chết rạp ở cây thuốc lá,…và hàng loạt các bệnh khác do nấm gây ra [24]

II.3 Chất thải từ quá trình sản xuất nấm ăn

Chất thải từ quá trình sản xuất nấm ăn là những chất còn lại sau khi thu hoạch nấm

Trước những đòi hỏi mới của ngành nông nghiệp về năng xuất, chất lượng, hiệu quả sản xuất của các vùng sinh thái và bảo vệ môi trường là những đòi hỏi cơ bản của một nền nông nghiệp hữu cơ Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh hoc và công nghệ vi sinh trong sản xuất phân bón vi sinh từ chất thải sau trồng nấm là hợp lý

Việc tận dụng gỗ khúc, mạt cưa, rơm rạ, bã mía, võ cây đậu, cùi bắp, mụn gỗ, giàu chất xơ (cellulose) để trồng nấm, vừa giải quyết môi trường, cung cấp phân hữu cơ, sau mỗi đợi thu hoạch nấm, mang lại hiệu quả kinh tế cao

Tham khảo một số tỉnh thành trong cả nước, cho chúng ta thấy được, ở nước ta khí hậu không đồng đều giống nhau, vì vậy người ta có thể trồng nấm quanh năm với hàng chục loại nấm ăn

và nấm dược liệu khác nhau Vì vậy ngành sản xuất các loại nấm ngày càng tăng, như vậy chất thải từ sau những vụ thu hoạch nấm ngày càng nhiều

Tổng sản lượng nấm trồng trên toàn thế giới đã gia tăng 21 lần chỉ trong vòng 36 năm qua từ

350 ngàn tấn (năm 1965) lên đến 7,5 triệu tấn ( năm 2000) Trung Quốc là nước sản xuất chính (3,9 triệu tấn năm)

Có những trại trồng nấm có qui mô khá lớn như: Bình Chánh (Tp HCM) - Hóc Môn – Củ Chi – Bình Dương – Đồng Nai – Bà Rịa – Vũng Tàu - Bến tre – Kiên Giang – Cần Thơ – Lâm Đông….(Mỗi bịt phôi cân nặng từ 1kg – 1,2kg cho ra khoảng 650g đến 700g nấm tươi )

Điều đó có thể nói lên được rằng: việc tận dụng chất thải sau trống nấm để sản xuất phân vi

sinh là việc làm thiết thực để bảo vệ môi trường, đồng thời để đáp ứng nhu cầu phân bón vi

sinh cho nông dân để bảo vệ cây trồng và cải tạo đất trồng sau nhiều năm dài sử dụng các loại

phân hóa học đã làm cho đất hóa khô khan cằn cỗi, cạn kiệt chất dinh dưỡng cho cây trồng,

Ước tính hàng năm, số lượng chất thải hỗn hợp mạt cưa sau trồng nấm, tương đương với số

lượng nấm được thu hoạch qua các vụ mùa, có thể lên tới hàng trăm ngàn tấn chất thải hỗn

hợp, có thành phần lớn là mạt cưa

Trong chất thải hỗn hợp đó hàm lượng hữu cơ duy trì ở mức cao chiếm khoảng 87,76 %

Cùng với các thành phần khó phân hủy khác như: Cellulose chiếm tỉ lệ chủ yếu là 32,16%,

37,66% và 41,54% Nên quá trình phân hủy trong đất sẽ còn phải kéo dài thêm một khoảng

thời gian bình quân khoảng 12 tháng Cho đến khi mùn hóa trong đất để biến dạng sang một

hình thái khác

Hoạt động này, nhờ vào men thủy giải mạnh và đa dạng như: cellulase thủy giải cellulose;

hemicellulase thủy giải hemicellulose; xylanase thủy giải xylan; thủy giải lignin….để đạt tỉ lệ

C/N tốt nhất ở khoảng 20 – 30

Tóm lại, không nằm ngoài mục đích nhằm vào chất thải hổn hợp sau trồng nấm để tiến hành

khảo cứu một số đặc điểm cơ bản về chi tiêt sinh lý – hóa về hổn hợp chất thải trong đó có

thành phần lớn là mạt cưa để sản xuât phân bón vi sinh, và cải tạo môi trường ngày càng sạch

hơn

Dựa trên những hiệu quả về nguyện liêu, về hiệu quả kinh tế, về giá trị còn lai của chất thải sau

khi trồng nấm và đồng thời căn cứ vào những điều kiện cụ thể việc tiến hành sản xuất phân

bón vi sinh trên chất thải hỗn hợp mạt cưa theo đánh giá của chúng tôi là rất phù hợp và hoàn

toàn có thể thực hiện được

Hiện nay cũng đã có các công trình nghiên cứu để xử lý chất thải sau trồng nấm như sử

dụng mạt cưa sau trồng nấm để nuôi trùn quế để làm phân vi sinh Tuy nhiên khả năng sống

sót của trùn chỉ khoảng 40% [41] Do đó lượng chất thải từ quá trình sản xuất nấm ăn vẫn chưa

được xử lý một cách hiệu quả

II.4 Giới thiệu phân hữu cơ – vi sinh

Phân bón là những cây cung cấp dinh dưỡng cho cây hoặc bổ sung độ màu mỡ cho đất Chúng

là phương tiện tốt nhất để tăng sản lượng và chất lượng cây trồng Tuy nhiên phân bón phải

được sữ dụng hợp lý để bảo vệ môi trường

Hiện nay phân hữu cơ vi sinh là loại phân đang được thế giới quan tâm và sử dụng để tiến tới

một nền nông nghiệp bền vững Khái niệm này có thể mỡ rộng hơn là phân sinh học bao gồm:

Phân chuồng, phân ủ, phân xanh các loại, phân vi sinh Các nước lớn như Ấn Độ, Trung Quốc

tận dụng tất cả chất thải nông nghiệp (phân chuồng, rơm rạ, phân xanh, khô dầu…) và thành phố (rác sinh hoạt, rác từ nhà máy, xí nghiệp…) để ủ compost Không những các nước nói trên

mà trên thế giới trước thế kỉ 19 và cả Việt Nam chỉ sữ dụng phân hữu cơ Tuy nhiên các nhà nghiên cứu thấy rằng nguồn dinh dưỡng từ phân hữu cơ không đáp ứng nỗi nhu cầu cho cây trồng đạt năng suất cao mà phải dùng phân hóa học bổ sung với số lượng lớn

II.4.1 Phân hữu cơ

Tùy từng địa phương và cơ sở sản xuất cụ thể mà có thể lựa chọn nguyên liệu để sản xuất phân hữu cơ khác nhau như : than bùn (phân chấp), mùn rác thành phố (phân rác lên men) phân bắc (phân hầm cầu) phân gà công nghiệp, phân đại gia súc (trâu bò), phân từ nguồn phế thải chế biến nông – lâm - công nghiêp của các nhà máy Bí quyết của việc thành công trong công việc này là phải sản xuất ra được nguyên liệu khử mùi hôi, tạo nguồn năng lượng lớn (nhiệt độ khi ủ) để kích thích quá trình lên men., diệt các mầm bệnh, các vi sinh vật có hại Yếu tố quan trọng thứ hai là phải có được các hổn hợp vi sinh tạo mùn để phân giải phân sống thành phân hữu cơ Phân hữu cơ có thể là một hoặc vài thành phần như đã nêu trên Chúng được xem như

là chất nền vì thế trước khi đưa vào phối trộn phải xác định thành phần hóa học

II.4.2 Phân vi sinh

II.4.2.1 Định nghĩa

Theo Tiêu chuẩn Việt Nam năm 1996 (TCVN 6168-1996), phân bón VSV được định nghĩa: "Phân vi sinh vật (phân vi sinh) là sản phẩm chứa các vi sinh vật sống, đã được tuyển chọn có mật độ phù hợp với tiêu chuẩn ban hành, thông qua các hoạt động sống của chúng tạo nên các chất dinh dưỡng mà cây trồng có thể sử dụng được (N, P, K, S, Fe ) hay các hoạt chất sinh học, góp phần nâng cao năng suất và (hoặc) chất lượng nông sản Phân vi sinh vật phải bảo đảm không gây ảnh hưởng xấu đến người, động, thực vật, môi trường sinh thái và chất lượng nông sản"

Đây là một loại phân cùng với phân vi lượng được quan tâm rất ít ở Việt Nam Nếu cứ tiếp tục sản xuất theo phương thức như hiện nay đất sẽ bị khô cằn, nghèo kiệt và mất cân bằng dinh dưỡng, hệ vi sinh vật đất bị biến đổi và suy kiệt

II.4.2.2 Phân loại

Từ các mối quan hệ sinh vật – đất – không khí – cây trồng, các nhà nghiên cứu đã định hướng sản xuất các phân vi sinh có tính năng sử dụng cơ bản như sau :

* Sử dụng khí nitơ trong khí quyển mà cây trồng không sử dụng được, tạo nên các hợp chất nitơ như một dạng phân đạm cung cấp cho cây trồng

* Góp phần phân giải chất vô cơ, hữu cơ thành nguồn dinh dưỡng dể tiêu N, P, K vi lượng để cây trồng hấp thụ, qua đó giảm các tổn thất to lớn do bay hơi, rữa trôi gây ra

* Cung cấp cho cây trồng các hợp chất có tác dụng kích thích tăng trưởng (gibberenllin, a uxin, axit indol axetic, ) các enzyme và vitamin…

* Nâng cao khả năng chống chịu của cây trồng bởi các chất kháng sinh do vi sinh vật tiết ra hay nhờ khả năng cạnh tranh cao mà mật độ vi sinh vật gây bệnh trong vùng rễ của cây trồng giảm đi

b) Phân loại theo công nghệ sản xuất phân bón:

Tùy theo công nghệ sản xuất, người ta có thể chia phân vi sinh vật (VSV) thành hai loại như sau:

sinh vật/g (ml) và mật độ vi sinh vật tạp nhiễm thấp hơn 1/1000 so với vi sinh vật hữu ích Phân bón dạng này được tạo thành bằng cách tẩm nhiễm sinh khối vi sinh vật sống đã qua tuyển chọn vào cơ chất đã được xử lý vô trùng bằng các phương pháp khác nhau Phân bón vi sinh vật trên nền chất chất mang đã khử trùng được sử dụng dưới dạng nhiễm hạt, hồ rễ hoặc tưới phủ với liều lượng 1-1,5 kg (lit)/ha canh tác

- Phân vi sinh vật trên nền chất mang không khử trùng được sản xuất bằng cách tẩm nhiễm trực tiếp sinh khối vi sinh vật sống đã qua tuyển chọn, vào cơ chất không cần thông qua

vật/g (ml) và được sử dụng với số lượng từ vài trăm đến hàng nghìn kg (lít)/ha

Đối với phân bón vi sinh vật trên nền chất mang không khử trùng, tùy theo thành phần các chất chứa trong chất mang mà phân bón VSV dạng này được phân biệt thành các loại:

- Phân hữu cơ VSV là sản phẩm phân hữu cơ có chứa các VSV sống đã được tuyển chọn có mật độ phù hợp với tiêu chuẩn ban hành, thông qua các hoạt động sống của chúng tạo nên các chất dinh dưỡng mà cây trồng có thể sử dụng hay các hoạt chất sinh học góp phần nâng cao năng suất,chất lượng nông sản

- Phân hữu cơ khoáng VSV là một dạng của phân hữu cơ VSV, trong đó có chứa một lượng nhất định các dinh dưỡng khoáng

PHẦN III NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

III.1 NGUYÊN LIỆU

III.1.1 Giống vi sinh vật

Chủng Trichoderma reesei được nhận từ phòng vi sinh, khoa Công Nghệ Thực Phẩm, trường

đại học Nông Lâm Tp.HCM (ký hiệu là T1 và T2) và Sở khoa học công nghệ Tp.HCM (ký

hiệu là T3)

III.1.2 Phế thải sau trồng nấm: Chúng tôi sử dụng mạt cưa sau trồng nấm bào ngư của một

trại nấm thuộc huyện Đức Trọng, tỉnh Lâm Đồng

Ngoài ra còn có than bùn thuộc tổng công ty khoáng sản Đồng Tháp Maren, tỉnh Long An

III.1.3 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật

a Môi trường giữ giống (PGA)

Để chuẩn bị chất chiết khoai tây, đun sôi 200 g khoai tây xắt lát, không gọt vỏ trong

1 lít nước cất trong 30 phút Lọc qua vải thưa, giữ lại phần lỏng, đó là chất chiết khoai tây

Trộn với các thành phần khác rồi đun sôi để hòa tan Hấp tiệt trùng trong 15 phút ở 121 độ C

b Môi trường nhân giống

Dùng môi trường PGA nhưng không cho thêm thạch Bổ sung thêm 10g/l cao nấm men và 1%

CMC

III.1.4 Hóa chất và thiết bị

III.1.4 1 Các hóa chất làm môi trường

1 Cám gạo

Chúng tôi sử dụng cám gạo trong quá trình thí nghiệm vì cám gạo chứa nhiều khoáng chất và

vitamin

Bảng III.1: Thành phần hóa học của cám gạo

Bên cạnh đó cám gạo còn chứa nhiều vitamin và khoáng chất, đặc biệt là vitamin nhóm B và E

– kích thích sự sinh trưởng của vi sinh vật

Bảng III.2: Thành phần khoáng chất và vitamin của cám gạo

2 Trấu

Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng trấu tại nhà máy xay xát gạo ở quận 2, Tp.HCM Theo

một số nghiên cứu cho thấy trấu là nhân tố kích thích hệ enzyme cellulose rất tốt ở cấc loài

nấm mốc

3 Agar

Chúng tôi sử dụng agar được sản xuất bởi công ty đồ hộp Hạ Long

III.1.4 2 Các hóa chất phân tích

- CMC (Sodium carboxymethyl cellulose)

- Thuốc thử DNS là dung dich bao gồm acid 3,5 dinitrosalicylic NaOH, potassium tartrate

tetrahydrate, nước cất

- Nước cất

- NaOH

- HCl đậm đặc

3 chủng Trichoderma T1, T2, T3 được cấy chuyền và nuôi cấy trên môi trường thạch nghiêng

PGA Sau 4 ngày, khi toàn bộ mặt thạch được phủ một lớp xanh sẫm Chúng tôi tiến hành làm

này vào 100ml môi trường PGA dịch thể để ở chế độ lắc 200 vòng/phút, hằng ngày kiểm tra hàm lượng sinh khối và hoạt tính CMCase

Bảng III 3: Ảnh hưởng của thời gian đến sự sinh trưởng của Trichoderma

Hàm lượng sinh khối khô (mg/ml) Thời gian (ngày)

Bảng III 4: Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt tính CMCase

Hoạt tính CMCase (UI/ml) Thời gian (ngày)

III.3.2.1 Ảnh hưởng của hàm lượng cám và trấu trong môi trường đến khả năng sinh

tổng hợp enzyme cellulase của T3

Mục đích: Xác định hàm lượng cám, trấu thích hợp cho sự sinh tổng hợp enzyme cellulose của

có hàm lượng cám và trấu đảm bảo độ thoáng khí để nấm có thể mọc tốt và có hoạt tính

enzyme cao

III.3.2.2 Ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase của T3

Theo phương pháp nuôi cấy bề mặt thì pH rất ít thay đổi trong suốt quá trình nuôi cấy, vì vậy

pH ban đầu có ý nghĩa rất lớn đến phát triển và sinh tổng hợp enzyme của nấm Do đó chúng tôi điều chỉnh pH ban đầu của môi trường là 4,5; 5; 5,5; 6

pH thích hợp nhất là pH mà tại đó dịch enzyme thô có hoạt tính cao nhất

Môi trường được điều chỉnh độ ẩm về 55%, pH thay đổi từ 4,5 đến 6,0 đem thanh trùng ở

ngày, sau đó xác định hoạt tính CMCase bằng cách đo mật độ quang ở bước sóng 540nm

Bảng III 6: Ảnh hưởng của pH ban đầu đến hoạt tính CMCase

∆OD Hoạt tính

CMCase (UI/g)

III.3.2.3 Ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase

của T3

Môi trường nuôi cấy được điều chỉnh độ ẩm ban đầu là 45%, 55%, 65% và 75% đem thanh

gian 5 ngày, sau đó xác định hoạt tính CMCase bằng cách đo mật độ quang ở bước sóng 540nm

Bảng III 7: Ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu đến hoạt tính CMCase

Độ ẩm ban đầu

(%)

45 55 65 75

∆OD Hoạt tính

CMCase (UI/g)

III.3.2.4 Tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy để thu nhận chế phẩm có hoạt tính CMCase cao

Thí nghiệm được thưc hiện theo phương pháp qui hoạch thực nghiệm với ba yếu tố độ ẩm ban

đầu, pH ban đầu và tỷ lệ cám, trấu của môi trường

Phương trình hồi qui tuyến tính có dạng:

Y = b0 + b1X1+ b2X2 + b3X3

Do không có thí nghiệm lặp lại nên phải thực hiện thêm 3 thí nghiệm tại tâm để xác định phương sai tái hiện

Tổng cộng có 11 thí nghiệm được thực hiện

Bảng III.8 Biến số thí nghiệm

trên

Khoảng biến thiên Môi trường

8 + + + +

Từ kết quả thí nghiệm này, chúng tôi sẽ tìm ra phương trình hồi quy và biết được mức độ

tương tác của các yếu tố đến hoạt tính cellulose của Trichoderma reesei và tìm ra được điều

kiện tối ưu nhất để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo

III.3.2.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến hoạt tính CMCase của chế phẩm

III.3.2.5.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính CMCase

Chế phẩm thô được đem thử hoạt tính CMCase bằng phương pháp DNS Cố định pH = 5, tiến

Sau đó chúng tôi tiến hành kiểm tra khả năng chịu nhiệt của Trichoderma theo thời gian

Bảng III 11: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của hoạt tính CMCase

III.3.2.5.2 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính CMCase

Tiến hành các thao tác cần thiết để thu được dịch enzyme thô, sau đó đem thử hoạt tính

các pH khác nhau từ 4 đến 6

pH thích hợp nhất cho hoạt động của enzyme cellulase là pH mà tại đó dịch Enzyme thô có

hoạt tính cao nhất

Bảng III 12: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính CMCase

Cấy giống vi sinh vật vào môi trường nhân giống đã xác định các thành phần tối ưu như trên Nuôi trong thời gian 5 ngày cho mốc sinh bào tử cực đại, sau đó cấy vào các bình tam giác chứa mạt cưa với tỷ lệ giống là 1%, 3%, 5%, 7% Mạt cưa trong bình tam giác được điều chỉnh

độ ẩm ban đầu là 65%, pH = 5 Sau 7 ngày sẽ xác định tỷ lệ gãy vỡ, khả năng giảm cellulose

Bảng III.14: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến khả năng giảm cellulose của mạt cưa sau trồng nấm