Nghiên cứu khả năng sử dụng vật liệu vô cơ kết hợp hữu cơ để cố định enzyme glucoamylase và ứng dụng

2- NHIỆM VỤ LUẬN VĂN: · Tạo sự kết hợp giữa chất mang vô cơ và hữu cơ · Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định enzyme · Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng của enzym

ĐINH THỊ KIM LOAN

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SỬ DỤNG

VẬT LIỆU VÔ CƠ KẾT HỢP HỮU CƠ

ĐỂ CỐ ĐỊNH ENZYME GLUCOAMYLASE

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH

Cán bộ hướng dẫn khoa học : PGS-TS Đồng Thị Thanh Thu

- -oOo -

Tp HCM, ngày tháng năm

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ và tên học viên : Định Thị Kim Loan Giới tính : Nữ

Ngày, tháng, năm sinh : 19/09/1984 Nơi sinh : Đà Nẵng

Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học

Khoá (Năm trúng tuyển) : 2007

1- TÊN ĐỀ TÀI:

Khảo sát khả năng sử dụng vật liệu vô cơ kết hợp hữu cơ để cố định enzyme glucoamylase và ứng dụng

2- NHIỆM VỤ LUẬN VĂN:

· Tạo sự kết hợp giữa chất mang vô cơ và hữu cơ

· Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định enzyme

· Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng của enzyme cố định

· Khảo sát khả năng tái sử dụng của phức enzyme cố định

· Lựa chọn chất mang copolymer thích hợp nhất

· Khảo sát một số điều kiện bảo quản enzyme cố định

· Ứng dụng enzyme cố định

5- HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN : PGS-TS Đồng Thị Thanh Thu

Nội dung và đề cương Luận văn thạc sĩ đã được Hội Đồng Chuyên Ngành thông qua

(Họ tên và chữ ký)

Trải qua thời gian học tập và nghiên cứu, với sự hướng dẫn tận tình của các Thầy Cô, đến nay tôi đã hoàn thành Luận văn Cao học chuyên ngành Công nghệ

Sinh học với đề tài “Nghiên cứu khả năng sử dụng vật liệu vô cơ kết hợp hữu

cơ để cố định enzyme Glucoamylase và ứng dụng”

Tôi xin cảm ơn quý Thầy Cô trong bộ môn Công nghệ Sinh học, quý Thầy Cô phòng Sau Đại học Trường Đại học Bách Khoa T.p Hồ Chí Minh đã dành nhiều tâm huyết truyền đạt kiến thức quý báu từ sách bài giảng và các ứng dụng thực tế, tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn tất khóa học này

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS-TS Đồng Thị Thanh Thu, ThS.Huỳnh Ngọc Oanh đã hướng dẫn nhiệt tình trong suốt quá trình tôi tiến hành

đề tài này

Đồng gửi lời cảm ơn đến các bạn sinh viên thực tập tại Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Trường Đại học Bách Khoa TpHCM đã giúp đỡ tôi khi gặp những khó khăn trong quá trình tiến hành luận văn

Đinh Thị Kim Loan

Alginate, chitosan và silic, celite là những chất mang được sử dụng rất rộng rãi trong cộng nghệ cố định enzyme Bản thân mỗi chất mang thường có một số nhược điểm trong quá trình cố định enzyme Để khắc phục, người ta có xu hướng kết hợp vật liệu vô cơ và hữu cơ lại với nhau tạo thành chất mang copolymer Chúng tôi tìm hiểu khả năng kết hợp vật liệu vô cơ và hữu cơ để tạo ra chất mang copolymer mới đem lại hiệu quả cố định enzyme cao hơn

Vì mục đích đó, chúng tôi tiến hành luận văn với tên đề tài: “ Nghiên cứu khả năng sử dụng vật liệu vô cơ kết hợp hữu cơ để cố định enzyme Glucoamylase và ứng dụng”

Nội dung nghiên cứu của đề tài:

· Tạo sự kết hợp giữa chất mang vô cơ và hữu cơ

· Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định enzyme

· Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng của enzyme cố định

· Khảo sát khả năng tái sử dụng của phức enzyme cố định

· Lựa chọn chất mang copolymer thích hợp nhất

· Khảo sát một số điều kiện bảo quản enzyme cố định

· Ứng dụng enzyme cố định

Alginate, chitosan and silic, celite are used widely as supports for enzyme immobilization process Each one of these subtances has their own drawback in immobilization process In order to overcome this inconvernience, copolymers which is the combinations of inorganic and organic materials were invented

For this purpose, we carried out our thesis: "Possibility of combination

inorganic and organic materials to immobilize Glucoamylase enzyme and application"

The contents of our researchs:

- Enzyme immobilization process on copolymer

- Study of different parameters on the enzyme immobilization

- Study of different parameters on reaction of immobilized enzyme

- Study of possibility of reuse of immobilized enzyme complexe

- Selection of the most optimized copolymer support

- Study of the conservation conditions of immobilized enzyme

- Application of this research in hydrolysising starch

AMG : enzyme glucoamylase

ΣProkhông cđ : tổng lượng protein không được cố định

HđR Ecđ / HđR Etd (%) : Hoạt độ riêng của enzyme cố định so với hoạt độ riêng của

enzyme tự do ban đầu (tính theo phần trăm)

Hđ Ecđ / HđEbđ (%) : Hoạt độ của enzyme cố định so với hoạt độ enzyme ban đầu (%)

Hđ còn lại/Hđ max (%): Hoạt độ còn lại so với hoạt độ lớn nhất ban đầu trong quá

trình tái sử dụng

1 MỞ ĐẦU 1

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Enzyme amylase 3

2.1.1 Tính chất chung của amylase 3

2.1.2 Tổng quan về glucoamylase 4

2.2 Tổng quan về enzyme cố định 8

2.2.1 Định nghĩa về enzyme cố định 8

2.2.2 Phương pháp tạo enzyme không tan 8

2.2.3 Uu điểm của enzyme không tan 9

2.2.4 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về enzyme cố định nói chung 10

2.2.5.Một số nghiên cứu về cố định enzyme glucoamylase 11

2.2.6 Động học của enzyme cố định 16

2.2.7.Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ của enzyme cố định 17

2.3 Tổng quan về các loại chất mang 18

2.3.1.Chất mang polymer hữu cơ 19

2.3.2.Chất mang vô cơ 20

2.3.3.Chất mang sẽ sử dụng trong nghiên cứu 20

2.4 Các phương pháp cố định enzyme 29

2.4.1.Phương pháp nhốt enzyme 30

2.4.2.Phương pháp tạo liên kết enzyme với chất mang 31

2.4.3.Phương pháp hấp phụ 31

2.4.4.Phương pháp liên kết ion 31

2.4.5.Phương pháp liên kết kim loại 32

2.4.6.Phương pháp tạo liên kết đồng hóa trị 32

2.4.7.Phương pháp khâu mạch 32

3.1 Vật liệu 33

3.1.1.Nguyên vật liệu 33

3.1.2.Dụng cụ và thiết bị 33

3.2 Phương pháp nghiên cứu 34

3.2.1.Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry 34

3.2.2.Xác định hoạt độ enzyme AMG theo phương pháp xác định đường khử tạo thành 37

3.2.3 Xác định hoạt độ của glucoamylase 38

3.3.Phương pháp tiến hành thí nghiệm 42

3.3.1.Quá trình cố định enzyme AMG trên celite và alginate 42

3.3.2.Quá trình cố định enzyme AMG trên silic và alginate 46

3.3.3.Khảo sát số lần tái sử dụng enzyme bằng hệ thống cột phản ứng 47

4 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 50

4.1 Khảo sát chế phẩm enzyme AMG 300L (Enzyme thương mại) 50

4.1.1 Xác định đường chuẩn Albumin 50

4.1.2 Xác định hoạt độ enzyme AMG tự do 51

4.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định enzyme với chất mang hữu cơ là alginate 52

4.2.1 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định enzyme AMG trên celite-alginate 52

4.2.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định enzyme AMG trên silic-alginate 68

4.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định enzyme với chất mang hữu cơ là chitosan 82

4.4 Ứng dụng 83

4.4.1 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng lên hoạt độ AMG cố định 83

4.4.2 Phản ứng liên tục 84

4.4.3 Khảo sát một số yếu tố trong bảo quản enzyme AMG cố định 88

5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 91

5.1 Kết luận 91

5.1.2.Cố định AMG trên silic bọc alginate 91

5.1.3.Cố định AMG trên celite, silic bọc chitosan 92

5.1.4.Ứng dụng 92

5.2 Đề nghị 93

TÀI LIỆU THAM KHẢO 94

6.PHỤ LỤC 96

Hình 2.1.Các loại enzyme endoamylase và exoamylase 4

Hình 2.2.Cơ chế tổng quát khi sử dụng enzyme amylase để thủy phân tinh bột và dextrin 4

Hình 2.3 Cấu tạo phân tử glucoamylase 5

Hình 2.4 Phân cắt tinh bột bằng α-amylase và glucoamylase 7

Hình 2.5 Đồ thị biểu diễn tác động của nhiệt độ- pH đối với hoạt độ của enzyme 12

Hình 2.6 Tác động của nhiệt độ và pH đến hoạt độ enzyme tự do và enzyme cố định 14

Hình 2.7 Hoạt độ tương đối của enzyme cố định sau 30 lần tái sử dụng 15

Hình 2.8 Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt độ của enzyme AMG cố định 16

Hình 2.9 Hạt alginate 22

Hình 2.10 Cấu trúc alginate 22

Hình 2.11 Bột alginate 23

Hình 2.12 Hạt gel alginate 23

Hình 2.13 Cấu trúc mạng gel alginate khi tiếp xúc với CaCl 2 25

Hình 2.14 Công thức cấu tạo của chitosan 27

Hình 2.15 Các phương pháp cố định enzyme 29

Hình 2.16 Các phương pháp nhốt enzyme 31

Hình 2.17 Phương pháp hấp phụ enzyme- chất mang 31

Hình 2.18 phương pháp liên kết ion 32

Hình 2.19 Phương pháp tạo liên kết đồng hóa trị 32

Hình 2.20 Phương pháp khâu mạch bằng glutaraldehyd 32

Hình 3.1: Bơm định lượng (thiết bị tạo hạt) 34

Hình 3.2.Quá trình cố định enzyme bằng bơm nhu động 44

Hình 3.3 Hạt AMG- celite bọc alginate 45

Hình 3.4 Hạt AMG- silic bọc alginate 47

Hình 3.5 Hệ thống cột phản ứng 48

Hình 4.1 Đồ thị tương quan giữa ΔOD và nồng độ albumin 50

Hình 4.2 Đồ thị tương quan giữa ΔOD và nồng độ glucose 51

Hình 4.4 Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của lượng AMG lên hiệu suất cố định AMG trên alginate 53 Hình 4.5 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của tốc độ lắc lên hoạt độ AMG cố định trên celite-alginate 55 Hình 4.6 Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của tốc độ lắc lên hiệu suất cố định AMG trên celite-alginate 55 Hình4.7 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của nồng độ alginate lên hoạt độ AMG cố định trên celite- alginate 57 Hình 4.8 Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của nồng độ alginate lên hiệu suất cố định AMG trên celite- alginate 57 Hình4.9 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của nồng độ glutaraldehyd lên hoạt độ AMG cố định trên celite-alginate 58 Hình 4.10 Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của nồng độ glutaraldehyd lên hiệu suất cố định AMG trên celite-alginate 59 Hình4.11 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của thời gian hoạt hóa alginate lên hoạt độ AMG cố định trên celite-alginate 60 Hình 4.12: Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của thời gian hoạt hóa alginate lên hiệu suất cố định AMG trên celite-alginate 61 Hình4.13 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của thời gian cố định lên hoạt độ AMG cố định trên celite- alginate 62 Hình 4.14 Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của thời gian cố định lên hiệu suất cố định AMG trên celite-alginate 63 Hình4.15 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng lên hoạt độ AMG cố định trên celite- alginate 64 Hình 4.16 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của pH phản ứng lên hoạt độ AMG cố định trên celite- alginate 65 Hình 4.17 Mối tương quan giữa hoạt độ còn lại so với hoạt độ ban đầu của AMG cố định lên celite- alginate với số lần tái sử dụng 67 Hình 4.18 Đồ thị tương quan giữa hoạt độ enzyme AMG cố định và nồng độ AMG 68 Hình 4.19 Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của lượng AMG lên hiệu suất cố định AMG trên silic- alginate 69 Hình 4.20 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của tốc độ lắc lên hoạt độ AMG cố định trên silic-alginate 70

celite-Hình 4.22 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của nồng độ alginate lên hoạt độ AMG cố định trên alginate 72 Hình 4.23 Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của nồng độ alginate lên hiệu suất cố định AMG trên silic- alginate 72 Hình 4.24 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của nồng độ glutaraldehyd lên hoạt độ AMG cố định trên silic-alginate 74 Hình 4.25 Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của nồng độ glutaraldehyd lên hiệu suất cố định AMG trên silic-alginate 74 Hình4.26 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của thời gian hoạt hóa lên hoạt độ AMG cố định trên silic- alginate 75 Hình 4.27 Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của thời gian hoạt hóa lên hiệu suất cố định AMG trên silic-alginate 76 Hình 4.28 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của thời gian cố định lên hoạt độ AMG cố định trên silic- alginate 77 Hình 4.29 Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của thời gian cố định lên hiệu suất cố định AMG trên silic- alginate 78 Hình 4.30 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng lên hoạt độ AMG cố định trên silic- alginate 79 Hình 4.31 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của pH phản ứng lên hoạt độ AMG cố định trên silic- alginate 79 Hình 4.32 Mối tương quan giữa hiệu suất tương đối của AMG cố định lên silic-alginate với số lần tái

silic-sử dụng 81 Hình4.33 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của thời gian phản ứng lên hoạt độ AMG cố định trên celite-alginate 83 Hình 4.34 Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của thời gian phản ứng lên hiệu suất cố định AMG trên celite-alginate 84 Hình 4.35 Mối tương quan giữa hiệu suất tương đối của AMG cố định trên celite-alginate với số lần tái sử dụng khi cơ chất là tinh bột 0,5% 86 Hình 4.36 Mối tương quan giữa hiệu suất tương đối của AMG cố định trên celite-alginate với số lần tái sử dụng khi cơ chất là dextrin 88 Hình 4.37 Đồ thị tương quan giữa hoạt độ tương đối của enzyme cố định theo dung dịch bảo quản và thời gian bảo quản 90

Bảng 2.1 Tính chất của glucoamylase thu nhận từ các nguồn khác nhau 6

Bảng 2.2 Tính chất của glucoamylase thu nhận từ các nguồn khác nhau(tt) 7

Bảng 2.3 Một số ứng dụng của alginate 26

Bảng 3.1 Phương pháp tiến hành xây dựng đường chuẩn albumin 36

Bảng 3.2: Các bước tiến hành xây dựng đường chuẩn glucose 38

Bảng 3.3 : Các bước tiến hành xác định hoạt độ enzyme của dung dịch mẫu 39

Bảng 4.1: Mối tương quan giữa OD và nồng độ albumin chuẩn 50

Bảng 4.2: Mối tương quan giữa OD và nồng độ glucose chuẩn 51

Bảng 4.3: Sự thay đổi hoạt độ AMG cố định và hiệu suất cố định theo khi thay đổi lượng enzyme AMG tương ứng với 0,5 celite 52

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của lượng AMG đến hiệu suất hoạt độ enzyme AMG cố định trên celite-alginate 53

Bảng 4.5 Ảnh hưởng của tốc độ lắc lên khả năng cố định AMG trên celite-alginate 54

Bảng 4.7: Ảnh hưởng của nồng độ glutaraldehyd lên khả năng cố định AMG trên celite-alginate 58

Bảng 4.8 Ảnh hưởng của thời gian hoạt hóa alginate lên hoạt độ AMG cố định trên celite-alginate 60 Bảng 4.9 Ảnh hưởng của thời gian cố định AMG trên alginate lên hoạt độ AMG cố định trên celite-alginate 62

Bảng 4.10 Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng lên hoạt độ AMG cố định trên celite-alginate 64

Bảng 4.11 Ảnh hưởng của pH phản ứng lên hoạt độ AMG cố định trên celite-alginate 65

Bảng 4.12 Kết quả số lần tái sử dụng của AMG cố định trên celite-alginate với cơ chất là tinh bột 0,5% 66

Bảng 4.13 Sự thay đổi hoạt độ AMG cố định khi thay đổi lượng enzyme AMG tương ứng với 0,5g silic 68

Bảng 4.14 Sự thay đổi hiệu suất cố định khi thay đổi lượng enzyme AMG tương ứng với 0,5g silic 68 Bảng 4.15 Ảnh hưởng của tốc độ lắc lên hoạt độ AMG cố định trên silic-alginate 70

Bảng 4.16 Ảnh hưởng của nồng độ alginate lên hoạt độ AMG cố định trên silic-alginate 71

Bảng 4.17 Ảnh hưởng của nồng độ glutaraldehyd lên hoạt độ AMG cố định trên silic-alginate 73 Bảng 4.18 Ảnh hưởng của thời gian hoạt hóa alginate lên hoạt độ AMG cố định trên silic-alginate 75

Bảng 4.20 Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng lên hoạt độ AMG cố định trên silic-alginate 78

Bảng 4.21 Ảnh hưởng của pH phản ứng lên hoạt độ AMG cố định trên silic-alginate 79

Bảng 4.22 Kết quả số lần tái sử dụng AMG cố định với chất mang là silic-alginate 80

Bảng 4.23 Ảnh hưởng của thời gian phản ứng lên hoạt độ AMG cố định trên celite-alginate 83

Bảng 4.24 Kết quả hiệu suất tương đối về số lần tái sử dụng AMG cố định trên celite-alginate với cơ chất là tinh bột 0,5% 85

Bảng 4.25 Kết quả hiệu suất tương đối về số lần tái sử dụng của AMG cố định trên celite-alginate với cơ chất là dextrin 86

Bảng 4.26 Ảnh hưởng của dung dịch bảo quản và thời gian bảo quản đến enzyme AMG cố định 89

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 3.1 Quá trình hoạt hóa celite 42

Sơ đồ 3.2 Quá trình cố định enzyme AMG trên phức hợp celite-alginate 43

Sơ đồ 3.3 Quá trình cố định enzyme AMG trên phức hợp silic- (alginate, chitosan) 46

1 MỞ ĐẦU

Công nghệ sinh học hiện nay được xem là một trong những ngành công nghệ cung cấp những ứng dụng quan trọng trong đời sống cũng như trong các lĩnh vực công nghiệp khác như : y học, thực phẩm, chăn nuôi, nuôi trồng thủy hải sản, trồng trọt, Đặc biệt trong đó, công nghệ enzyme được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như y tế, môi trường, thực phẩm…

Enzyme là chất xúc tác sinh học không những có ý nghĩa trong quá trình sinh trưởng, sinh sản của sinh vật mà còn đóng vai trò quan trọng trong các ngành công nghiệp như công nghệ thực phẩm, kỹ thuật phân tích, công nghệ gen, bảo vệ môi trường,…

Việc nghiên cứu và sản xuất enzyme được phát triển rất mạnh từ đầu thế kỷ

XX đến nay và đã mang lại nhiều lợi ích kinh tế lớn.Việc sử dụng enzyme sao cho đem lại hiệu quả cao nhất và lợi ích về kinh tế là vấn đề được quan tâm hàng đầu trong quá trình sản xuất công nghiệp

Từ những nhu cầu cấp thiết đó, enzyme cố định đã được nghiên cứu trên nhiều nước và thu được những kết quả khả quan Trong khi các loại enzyme hòa tan không

có khả năng tái sử dụng, lẫn enzyme ở sản phẩm cuối làm cho sản phẩm kém tinh sạch và có thể bị biến tính dưới tác dụng của điều kiện môi trường thì enzyme cố định có thể khắc phục được những vấn đề trên Chính những ưu điểm enzyme cố định mà các nhà khoa học đã nghiên cứu cố định các loại enzyme khác nhau trên những chất mang khác nhau nhằm tạo ra enzyme cố định mang lại hiệu quả sử dụng enzyme cao nhất

Glucoamylase là một loại enzyme được ứng dụng nhiều trong quá trình sản xuất công nghiệp, đặc biệt là trong ngành công nghiệp thực phẩm Việc sản xuất glucoamylase được tiến hành theo nhiều cách khác nhau, tuy nhiên để sử dụng enzyme glucoamylase trong quy mô công nghiệp với lượng lớn mà vẫn có hiệu quả, làm giảm chi phí sản xuất nhằm hạ giá thành sản phẩm thì khâu cố định enzyme và việc sử dụng dạng cố định của enzyme glucoamylase cũng là một trong những vấn đề được đặt ra

Trong khi enzyme hòa tan không có khả năng tái sử dụng, dễ bị ảnh hưởng của điều kiện môi trường, sản phẩm cuối dễ lẫn tạp chất và enzyme, enzyme cố định đã giải quyết được các vấn đề đó, khả năng tái sử dụng có thể lên hơn 10 lần với hoạt độ giảm không đáng kể Với những ưu điểm đó chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu

“Khảo sát khả năng sử dụng vật liệu vô cơ kết hợp hữu cơ để cố định enzyme glucoamylase và ứng dụng của enzyme glucoamylase cố định” để chọn ra chất

mang kết hợp giữa vô cơ và hữu cơ thích hợp và khảo sát các nhân tố ảnh hưởng để tìm ra các điều kiện tối ưu nhằm cho ra sản phẩm enzyme glucoamylase cố định có hiệu quả hoạt độ cao nhất với số lần tái sử dụng nhiều lần, góp phần vào việc giảm chi phí cho các ngành công nghiệp có sử dụng nguồn enzyme glucoamylase

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Enzyme amylase [4, 17]

Amylase thuộc nhóm enzyme thủy phân xúc tác sự phân giải các liên kết glucoside nội phân tử trong các polysaccharide với sự tham gia của nước Amylase thủy phân tinh bột, glycogen và dextrin thành glucose, maltose và dextrin hạn chế Trong nước bọt của người có chứa enzyme amylase nhưng ở một số loài động vật có

vú thì không có như ngựa, chó, mèo

Amylase phân bố rộng rãi trong tự nhiên và là một trong những loại enzyme được ứng dụng rộng rãi nhất trong công nghiệp, y tế và nhiều lĩnh vực kinh tế khác, đặc biệt là trong các ngành công nghiệp thực phẩm để làm hỏng tinh bột Amylase được thu nhận từ hạt nảy mầm, nấm mốc, nấm men, vi khuẩn Trong đó amylase được thu nhận từ malt với số lượng nhiều nhất, chủ yếu dùng trong sản xuất bia

2.1.1 Tính chất chung của amylase

Người ta biết có sáu loại amylase, trong đó α-amylase, β-amylase, γ-amylase (hay glucoamylase) thủy phân các liên kết α-1,4-glucoside của tinh bột, glycogen và các polysaccharide cùng loại Các amylase còn lại: dextrin-6-glucanhydrolase, amylopectin-6-glycanhydrolase và oligodextrin-6-glucanhydrolase (hay dextrinase) thủy phân các liên kết α-1,6-glucoside Sáu loại amylase này được xếp thành hai nhóm: endoamylase (enzyme nội bào) và exoamylase (enzyme ngoại bào)

Endoamylase: gồm có α-amylase và nhóm enzyme khử nhánh Nhóm enzyme khử nhánh này được chia thành hai loại: khử trực tiếp là pullulanase và khử gián tiếp Các enzyme này thủy phân các liên kết bên trong của chuỗi polysaccharide

Enxoamylase: gồm có β-amylase và γ-amylase Đây là những enzyme thủy phân tinh bột từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide

Hình 2.1.Các loại enzyme endoamylase và exoamylase

Việc ứng dụng enzyme glucoamylase đã đem lại những thay đổi cơ bản trong

kỹ thuật sản xuất đường tinh bột So với phương pháp acid, phương pháp thủy phân bằng enzyme có những ưu điểm hơn hẳn, lượng glucose thu được cao hơn (5 - 10%),

Tinh bột

Dextrin

Maltose Glucose Dextrin

Amyloglucosidas

ee

β-amylase Pullulanase

Dextrin + oligosaccharid α-amylase

cho phép loại trừ khả năng tạo thành các sản phẩm phụ có vị đắng, yêu cầu về thiết bị đơn giản, kết quả cho phép thu được glucose với hiệu suất cao, chất lượng tốt và giá thành rẻ hơn lại làm giảm độc hại cho con người và môi trường

Glucoamylase thường được sản xuất từ nấm mốc Aspergillus niger Trong sản

xuất bánh kẹo người ta thường dùng glucose là sản phẩm thủy phân tinh bột bằng glucoamylase Chính glucoamylase, là yếu tố làm tăng hiệu suất trong sản xuất rượu Ngoài ra còn được ứng dụng công nghiệp dệt, chế phẩm glucoamylase được dùng để

rũ hồ vải trước khi tẩy trắng và nhuộm Glucomylase có tác dụng làm vải mềm, có khả năng nhúng ướt, tẩy trắng và bắt màu tốt Rũ hồ bằng enzyme không những nhanh, không hại vải, độ mao dẫn tốt mà còn đảm bảo vệ sinh, do đó tăng được năng suất lao động

Glucoamylase (AMG) [9]

● Đặc điểm tính chất của AMG

AMG còn được gọi là 1,4- glucanhydrolase, amyloglucosidase, amylase, 1,4 – D- glucanhydrolase, EC 3.2.1.3

α-Hình 2.3 Cấu tạo phân tử glucoamylase

Đa số AMG đều thuộc loại enzyme “acid” thể hiện hoạt lực tối đa ở pH 5,5 Nhiệt hoạt động tối ưu là 50-600C Hầu hết các AMG bị mất hoạt độ khi đun nóng đến trên 700C Hiện nay chúng ta mới biết được phân tử lượng của AMG tinh thể:

3,5-AMG tách ra từ A niger có phân tử lượng là 97.000Da, từ A awamori là 62.000 Da,

từ Bac Subtilis là 33.000 Da

So với α-amylase, AMG bền với acid hơn, nhưng lại kém bền hơn dưới tác dụng của rượu ethylic, acetone, và không được bảo vệ bằng Ca2+ Giống α-amylase, AMG bị các chất độc sulfurhydryl kìm hãm do chúng liên kết với nhóm –SH trong trung tâm hoạt động Các chế phẩm AMG của nấm sợi và của mô động vật có độ bền vững khác nhau đối với tác động của kim loại năng như Cu, Fe, Hg…

Bảng 2.1 Tính chất của glucoamylase thu nhận từ các nguồn khác nhau

Bảng 2.2 Tính chất của glucoamylase thu nhận từ các nguồn khác nhau(tt)

S Tính chất Glucoamylase hòa tan Glucoamylase không

● Cơ chế tác dụng của AMG

AMG thủy phân từng liên kết một, bắt đầu từ đầu không khử của amylase, amylasepectin và tách dần từng phân tử đơn vị glucose Không giống α-amylase, hầu hết AMG có thể thủy phân liên kết α-1,6 tại điểm nhánh của amylosepectin mặc dù tốc độ thủy phân chậm hơn α-1,4 AMG còn thủy phân liên kết α- 1,3- glucoside để tạo thành glucose Chính khả năng thủy phân mạnh mẽ cả α-1,4 lẫn α-1,6 và thậm chí

cả α-1,3-glucosie để tạo thành glucose đã đưa enzyme này lên vị trí hàng đầu về hoạt lực tinh bột

Nói chung AMG có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, glycogen, amylopectin, dextrin, isomaltose, maltose tới glucose

Hình 2.4 Phân cắt tinh bột bằng α-amylase và glucoamylase

AMG 300L ( amyloglucosidase Novo)

Là một chất exo-D-glucosidase-1,4-α (gluco-amylase) được sản xuất từ một

chủng vi sinh vật chọn lọc tên là Aspergillus niger bằng sự lên men chìm Tên theo hệ

thống là 1,4-α-D-glucan glucohydrolase (EC 3.2.1.3) Enzyme này thủy phân các cầu nối α- và 1,6- trong tinh bột

v Hình dạng: các sản phẩm lỏng (L) là những chế phẩm màu nâu trong, có

độ đặc chung 1.2g/ml Vi hạt AMG 300 MG là hạt màu trắng, không gây bụi, có một kích thườc hạt trung bình khoảng 300 micron

v Loại sản phẩm: AMG có sẵn với các cường độ tiêu chuẩn sau đây:

ü Dạng lỏng: AMG 200L………… 200 AGU/ml

AMG 300L………… 300 AGU/ml AMG 400L………400 AGU/ml

Enzyme cố định còn được định nghĩa là những enzyme hòa tan được gắn vào một chất mang bằng nhiều kỹ thuật khác nhau Nhờ quá trình gắn này mà enzyme từ trạng thái tan chuyển sang trạng thái không hòa tan

2.2.2 Phương pháp tạo enzyme không tan

Enzyme không tan được tạo thành bằng hai cách

- Liên kết trực tiếp: nối đồng hóa trị liên kết các phân tử enzyme riêng biệt thành

một liên hợp các phân tử không hòa tan

- Liên kết gián tiếp: kết hợp phân tử enzyme với chất mang thông một chất trung

gian (chất hoạt hóa) Cách này được sử dụng phổ biến

Phản ứng gồm hai giai đoạn:

+ Giai đoạn 1: Hoạt hóa chất mang

++

+ Giai đoạn 2: Kết gắn enzyme vào chất mang đã hoạt hóa

2.2.3 Ưu điểm của enzyme không tan [8, 9]

Enzyme có những ưu điểm chính:

- Enzyme không hòa tan có thể tái sử dụng được nhiều lần (đôi khi đến 60-70 lần), và hoạt độ ít giảm trong những lần tái sử dụng Điều này có ý nghĩa rất lớn trong kỹ thuật

- Enzyme không lẫn vào sản phẩm cuối của phản ứng enzyme, sản phẩm có độ tinh sạch cao Do đó sẽ không tốn chi phí cho việc tách enzyme ra khỏi sản phẩm

- Khi gắn enzyme vào chất mang có điện tích khác với điện tích của enzyme, cấu trúc không gian của enzyme có sự thay đổi nhất định Chính vì sự thay đổi đó mà

sự tương tác của enzyme với cơ chất chậm lại, phản ứng xảy ra yếu hơn Mức độ giảm hoạt độ của enzyme phụ thuộc vào mức độ thay đổi cấu trúc của enzyme khi gắn chúng vào chất mang

- Enzyme cố định hoàn toàn tuân theo định luật Michaelis-Menten Tuy nhiên, trong phản ứng giữa cơ chất với enzyme cố định có những sai khác nhất định: + Xảy ra hiện tượng cạnh tranh cơ chất với enzyme và chất mang

Chất mang được hoạt hóa

+

Chất mang được hoạt hóa

+

+ Hiện tượng cản trở sự khuếch tán cơ chất và các sản phẩm của phản ứng làm giảm tốc độ phản ứng

- Enzyme cố định bền nhiệt hơn enzyme hòa tan vì chúng được bảo vệ bởi chất mang

- Có thể điều chỉnh vận tốc phản ứng theo ý muốn dễ dàng và có thể ngừng phản ứng ở bất kỳ giai đoạn nào hoặc cũng có thể tạo ra sản phẩm trung gian theo mong muốn

- Có thể gắn đồng thời nhiều enzyme của một chuỗi phản ứng liên tục lên chất mang nên có thể thực hiện các chuỗi phản ứng trong cùng một thời gian

- Việc gắn enzyme tạo điều kiện dễ dàng cho cơ khí hóa, tự động hóa các quá trình sản xuất

- Đặc biệt enzyme cố định giữ hoạt độ được lâu hơn so với enzyme tự do

- Enzyme cố định có khả năng bảo quản tốt hơn enzyme hòa tan và có khả năng tái sử dụng nhiều lần trong khi enzyme hòa tan chỉ có thể sử dụng được một lần Đặc điểm này rất có ý nghĩa kinh tế khi chúng ta tiến hành phản ứng theo quy mô công nghiệp, đặc biệt có hiệu quả kinh tế đối với các loại enzyme quí hiếm, đắt tiền

2.2.4 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về enzyme cố định nói chung [22, 23]

Enzyme cố định đã được bắt đầu nghiên cứu từ những năm đầu của thế kỷ XX

Năm 1916, Nelson và Griffin quan sát được khả năng thủy phân đường saccharose của enzyme invertase của nấm men khi enzyme này được hấp phụ vào than hoạt độ

Năm 1953, Grubhofer và Schleith đã cố định được một số enzyme như carboxy peptidase, diastase, pepsin,… bằng liên kết đồng hóa trị và các nghiên cứu này được bắt đầu được ứng dụng

Perveen R, Rashid MH, Saleem M, Khalid AM, Rajoka MI (2006) nghiên cứu nhiệt động học của glucoamylase hòa tan của một loài nấm mesophilic

Kovalenko AMG, Perminova LV ( tháng 2/2008) nghiên cứu về khả năng cố định enzyme glucoamylase bằng vật liệu hút bám trên vật chống đỡ từ carbon và được ứng dụng trong việc thủy phân dextrin không hoàn toàn

Hãng Novo cố định Glucoamylase trên hạt silic xốp được sử dụng trong thiết bị cột nhồi và thiết bị tầng sôi để thủy phân tinh bột sắn sau khi đã dịch hóa

Ở Việt Nam, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã nghiên cứu cố định enzyme pectinase, urease, protease, amylase,…

Năm 1994-1995, Viện Sinh học Nhiệt đới TpHCM nghiên cứu cố định enzyme glucoisomerase trên các hạt silochrom B2 hoạt hóa bằng glutaraldehyd để chuyển glucose thành fructose có độ ngọt gấp hai lần

Cũng có một số nghiên cứu về amylase cố định, tuy nhiên các nghiên cứu này mới ở quy mô phòng thí nghiệm, chưa được ứng dụng trong công nghiệp

2.2.5 Một số nghiên cứu về cố định enzyme glucoamylase

● Nghiên cứu hoạt độ enzyme glucoamylase cố định bằng gel PhTES/TEOS [10]

Phương pháp bẫy (nhốt) enzyme trong gel là phương pháp phương pháp đơn giản và an toàn cho enzyme vì chúng không bị tác động hóa học Amyloglucosidase (glucoamylase, AMG) là một trong những enzyme quan trọng nhất trong nhiều nghành công nghiệp cơ bản (thức ăn, giấy, đồ uống…) và cả trong y học và công nghệ hóa học Trong nghiên cứu này, người ta sử dụng 2 vật liệu để cố định enzyme glucoamylase: PhTES (phenyltriethoxysilane) kết hợp với TEOS (tetraethoxysilane) với 2 tỉ lệ 1:1 và 1:2 hoặc sử dụng TEOS Người ta sử dụng 1,4 ml vật liệu cố định trộn với 0,780 ml dung dịch AMG trong đệm pH 4,6, 200µl 4% polyvinyl alcohol 22.000 ( PVA), 100µl NaF và 200µl isopropyl alcohol Sau vài phút, hỗn hợp trở nên đồng nhất và bắt đầu đặc lại Gel được để qua đêm ở 40C sau đó rửa và làm khô cũng

ở 40C

Phương pháp phân tích: sử dụng 0,5 ml tinh bột hòa tan (1%), 0,4 ml đệm citrate- phosphate pH 4,6 và 0,1 ml enzyme hòa tan hoặc 0,05g enzyme cố định để

yên trong 5 phút ở 250C sau đó cho thêm 1 ml DNS 1% Đem đun sôi dung dịch trong

10 phút rồi đo quang ở bước sóng 540 nm

Kết quả thu được: độ pH tối thích của enzyme tự do là 4,6, sau khi cố định cũng không thay đổi nhiều Cụ thể, đối với enzyme cố định bằng PhTES:TEOS theo tỉ

lệ 2:1 và cố định với TEOS có độ pH tối thích là 5, còn đối với enzyme cố định bằng PhTES:TEOS theo tỉ lệ 1:1 thì pH tối thích là 4 Còn về nhiệt độ, cả enzyme tự do và enzyme cố định bằng TEOS đều có nhiệt độ tối thích là 600C Trong khi đó, enzyme

cố định bằng TEOS kết hợp với PhTES lại có nhiệt độ tối thích là 370C, giảm 230C so với enzyme tự do

Hình 2.5 Đồ thị biểu diễn tác động của nhiệt độ- pH đối với hoạt độ của enzyme

Từ các kết quả trên, người ta đã xác định được các thông số động học cho enzyme:

Qua kết quả thực nghiệm cho thấy, enzyme cố định vẫn tuân theo định luật Michaelis-Menten, đồng thời cũng thu nhận được phức TEOS kết hợp với PhTES theo

tỉ lệ 1:2 là vật liệu cố định có lợi nhất cho enzyme glucoamylase cố định

● Nghiên cứu khả năng cố định enzyme glucoamylase lên cellulose từ bã mía [16]

Enzyme cố định được sử dụng trong công nghệ thực phẩm, hóa sinh, dược phẩm và cả phân tích Chúng cung cấp nhiều lợi ích hơn hẳn enzyme tự do như: khả năng tách riêng biệt giữa chất phản ứng và sản phẩm, khả năng tái sử dụng, khả năng tái phục hồi… phương pháp nhốt enzyme sử dụng liên hết đồng hóa trị là một phương pháp rất có hiệu quả trong việc giữ enzyme và đảm bảo enzyme có định vẫn có hoạt

độ cao Trong khi đó, phương pháp nhốt enzyme vào hệ sợi thì không đạt được như vậy

Enzyme cố định bằng phương pháp sử dụng liên kết đồng hóa trị cung cấp những ưu điểm sau:

+ Enzyme không dễ bị rò rỉ hay thoát ra khỏi vật liệu cố định trong suốt quá trình tái sử dụng vì chúng đã được liên kết rất chặt chẽ

+ Enzyme cố định dễ dàng tiếp xúc với cơ chất vì chúng chỉ bám vào bề mặt vật liệu cố định

+Tăng sự ổn định nhiệt độ vì sự tương tác chặt chẽ giữa enzyme và vật liệu cố

định

Vật liệu cellulose được sử dụng rộng rãi trong cố định enzyme Chúng dễ thấm nước, dễ tác động, rẻ tiền, dễ kiếm, có một số lượng lớn nhóm hydroxyl trên bề mặt Tuy nhiên, nhược điểm của chúng là chúng có độ bền cơ học thấp, dễ hư hỏng, thối rữa Enzyme có thể được cố định trên cellulose bằng nhiều cách khác nhau

Bã mía được làm sạch 3 lần bằng cách đun sôi trong acid sulfuric 1,25% và NaOH 1,25 %, sau đó được rửa sạch lại bằng cách chưng cất hơi nước (1 giờ mỗi lần) Sau đó làm khô và cắt thành từng miếng nhỏ 5 gram bã mía thu được đem ngâm vào 375ml 0,03 M acid ( bao gồm aicd sulfuric và metapeodate) Hỗn hợp được chỉnh đến

pH 3 Sau đó đem gia nhiệt đến 900C với tốc độ lắc 200 vòng/ phút trong 15 giờ Sau

đó, đem lọc và rửa sạch lại với nước vài lần trước khi đem làm khô và đi qua rây để thu được những hạt có kích thước từ 180-355 µm

Một gam bã mía sau khi xử lý được ngâm vào 30ml AMG và ủ có khuấy với tốc độ không đổi ở 500C trong 30 phút Sau đó chúng ta đem lọc để loại bỏ enzyme dư thừa và rửa sạch lại bằng nước 5 lần Sau đó đem phân tích theo phương pháp Bernfeld để xác định hoạt độ enzyme cố định Thu được kết quả: ở nhiệt độ 400C, khoảng pH hoạt động của enzyme tự do là 3,5-5,0 trong khi đó enzyme tự do có khoảng pH hoạt động rộng hơn: 3-5 Enzyme cố định lại có hoạt độ cao hơn trong khoảng pH 2,5-3,0 và 6,0-7,0 Nhiệt độ tối ưu cho cả enzyme tự do và cố định đều là 60-650C Tuy nhiên ở nhiệt độ 30-350C và 70-800 thì enzyme cố định lại có hoạt độ cao hơn so với enzyme tự do

Như vậy, nghiên cứu trên cho thấy hoạt độ của enzyme cố định cao hơn so với enzyme tự do trong cùng điều kiện phản ứng Bên cạnh đó, enzyme cố định còn có thể tái sử dụng đến 30 lần mà hoạt độ vẫn đạt trên 60% so với ban đầu Nghiên cứu này

đã phát triển hơn kĩ thuật tạo ra một loại vật liệu cố định enzyme vừa rẻ tiền vừa có thể sử dụng nhiều lần

Hình 2.6 Tác động của nhiệt độ và pH đến hoạt độ enzyme tự do và enzyme cố định

Hình 2.7 Hoạt độ tương đối của enzyme cố định sau 30 lần tái sử dụng

● So sánh hoạt độ của 2 loại enzyme glucoamylase cố định bằng 2 phương pháp khác nhau [10]

Trong nghiên cứu này người ta sử dụng copolymer glycidyl methacrylate- ethylene glycol dimethacrylate(GMA-co-EGDMA) để cố định AMG Polymer với kích thước từ 150-500µm được bổ sung 1M 1,2-diaminoethane ở 600C trong 4h tại pH10, sau đó đem rửa sạch với nước Hai phương pháp được sử dụng là:

Phương pháp sử dụng glutaraldehyde: polymer sau hoạt hóa đem ủ với

glutaraldehyde 2%(w/v) trong đệm Natri phosphate tại pH 8 trong 2h Sau đó đem rửa sạch bằng dung dịch đệm và ủ với enzyme AMG trong đệm pH 7,0 ở 40C trong 48h Sau đó đem rửa sạch bằng NaCl 1M trong đệm acetate ph 4,5 sau đó đem lưu ở nhiệt

độ 40C pH 4,5

Phương pháp oxy hóa: AMG bị oxy hóa sau đó đem ủ với polymer đã hoạt hóa với điều kiện đệm acetate pH 4,5 trong 48h Sau đó tiến hành rửa tương tự như trên

Kết quả:

Hình 2.8 Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt độ của enzyme AMG cố định

Như vậy, phương pháp oxy hóa đem lại enzyme cố định có hoạt độ cao hơn 1,5 lần so với enzyme cố định bằng glutaraldehyde, chúng đều có khả năng chịu nhiệt tốt hơn enzyme tự do

Các hằng số động học (Km, Vmax) của enzyme có thể bị biến đổi bởi quá trình

cố định là do những thay đổi về cấu trúc bên trong và giới hạn đường vào vị trí hoạt động của enzyme Vì thế tỷ lệ đặc trưng (K/Km) của enzyme có thể bị thay đổi tương đối so với enzyme hòa tan

Những ảnh hưởng về sự phân chia vùng điện tích

Các lớp phân chia xung quanh enzyme cố định ảnh hưởng do tương tác tĩnh điện và tương tác kỵ nước Kết quả là sẽ có sự phân chia vùng chứa điện tích trong môi trường

Đặc trưng của sự phân chia đó biểu thị bởi đại lượng hằng số lamda λ

Ảnh hưởng do khuếch tán

Quá trình này có hai giai đoạn khuếch tán bao gồm khuếch tán bên ngoài tới bề mặt enzyme theo sau quá trình khuếch tán bên trong Nồng độ cơ chất ở bề mặt enzyme cố định thấp hơn trong dung dịch làm cho khả năng phản ứng của enzyme

cố định thấp hơn enzyme hòa tan

2.2.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ của enzyme cố định [5]

Khi gắn lên chất mang, enzyme bị giới hạn trong một phạm vi môi trường xác định, cấu tạo không gian của phân tử có thể bị thay đổi, do đó có thể làm biến đổi một

số tính chất của enzyme ban đầu Enzyme cố định thường bền với các tác nhân biến tính hơn nhưng hoạt độ riêng thường thấp hơn enzyme hòa tan Một trong những nguyên nhân làm giảm hoạt độ là do tương tác protein-protein giữa các phân tử enzyme đã được liên kết Tuy nhiên, sự giảm hoạt độ hoàn toàn có thể được bù lại bằng khả năng bền vững lớn đối với các tác động khác nhau của enzyme cố định

2.2.7.1 Hoạt độ của enzyme cố định phụ thuộc vào bản chất của chất mang

Các tính chất của chất mang như: tính hòa tan, tính bền cơ học, độ trương, điện tích, tính háo nước và kỵ nước… đều có những ảnh hưởng lên lượng enzyme được liên kết, tính bền và hoạt độ sinh học của enzyme cố định Enzyme cố định thường có tính bền nhiệt cao so với enzyme hòa tan do kết quả của sự định vị enzyme tạo nên

2.2.7.2.Hoạt độ của enzyme cố định phụ thuộc vào sự khuếch tán của cơ chất, sản phẩm và các phân tử khác

Tốc độ khuếch tán của cơ chất, sản phẩm và các chất phụ thuộc vào các yếu tố:

- Kích thước lỗ gel của chất mang polymer

- Trọng lượng phân tử của cơ chất

- Sự chênh lệch nồng độ giữa vùng môi trường vi mô xung quanh enzyme và dung dịch tự do

Những giới hạn khuếch tán thể hiện ở hàng rào khuếch tán bên ngoài và bên trong Việc gia tăng tốc độ pha trộn sẽ làm giảm rào khuếch tán bên ngoài Chính vì vậy mà trong bất kỳ quy trình công nghệ nào, tốc độ khuấy đảo cũng đóng vai trò hết sức quan trọng

2.2.7.3 Hoạt độ của enzyme cố định phụ thuộc vào pH

Điện tích của chất mang có ảnh hưởng đáng kể đến pH tối ưu của enzyme cố định, pH tối ưu của enzyme cố định có thể bị dịch chuyển về phía kiềm hay phía acid

so với pH tối ưu của enzyme hòa tan pH tối ưu của enzyme liên kết đồng hóa trị với chất mang có điện tích âm sẽ chuyển dịch sang phía kiềm so với enzyme hòa tan, nếu enzyme liên kết đồng hóa trị với chất mang mang điện tích dương thì pH tối ưu sẽ chuyển dịch sang phía pH acid Còn khi lực ion lớn điện tích của chất mang được làm trung hòa bởi các ion trái dấu thì pH tối ưu của enzyme cố định gần giống như của enzyme hòa tan

2.3 Tổng quan về các loại chất mang [5]

Một chất mang lý tưởng cần có những tính chất sau đây:

- Một chất mang lý tưởng sử dụng trong cố định enzyme điều trước hết là cần phải

rẻ Điều này có liên quan đến hiệu quả kinh tế của quy trình công nghệ, đặc biệt có

ý nghĩa khi quy trình đó ứng dụng ở quy mô công nghiệp

- Chất mang phải có tính chất cơ lý bền vững, ổn định Nhờ đó mà chất mang mới chịu được các điều kiện của môi trường như khuấy trộn, áp lực trong các quy trình sản xuất

- Về mặt hóa học, chất mang phải bền vững, không tan trong môi trường phản ứng Chất mang không được làm mất hoạt độ enzyme Chất mang không gây ra những phản ứng hấp phụ không đặc hiệu

- Chất mang phải có tính kháng khuẩn cao, bền vững với sự tấn công của vi sinh vật

- Chất mang phải có độ trương tốt, có diện tích bề mặt tiếp xúc lớn Tính chất này của chất mang vừa tăng khả năng cố định của enzyme, vừa tăng khả năng tiếp xúc

của cơ chất với enzyme nhờ đó mà làm tăng hoạt độ của enzyme cố định và số lần tái sử dụng

- Chất mang có thể có cấu trúc lỗ xốp, siêu lỗ có thể ở dạng hạt, dạng màng, dạng phiên mỏng…

Chất mang dùng trong cố định enzyme được chia làm nhóm chất mang polymer hữu cơ và chất mang vô cơ

2.3.1 Chất mang polymer hữu cơ [7]

Được chia làm 2 nhóm là polymer tự nhiên và polymer tổng hợp

2.3.1.1 Chất mang là polymer tự nhiên

Là nhóm chất mang được sử dụng trong thương mại rộng rãi nhất hiện nay như: cellulose, agarose, sephadex và các dẫn suất của chúng

- Agarose là vật liệu ổn định, đồng nhất và dễ tạo hạt Tuy nhiên do vấn đề giá cả (agarose của hãng Sigma có giá thành khoảng 800-2000USD/kg) nên agarose chỉ được sử dụng trong nghiên cứu khoa học và mục đích y học chứ không sử dụng được trong quy mô công nghiệp

- Cellulose và các dẫn suất của chúng như CM-cellulose, DEAE-cellulose có tính chất

cơ lý khá tốt, giá rẻ nhưng lại không đồng nhất và ổn định nên chỉ được sử dụng ở dạng sợi hay vi hạt

- Alginate tạo gel trong dung dịch CaCl2 dùng trong việc nhốt tế bào, enzyme tuy nhiên gel lại không ổn định trong môi trường phosphate

- Tinh bột là loại vật liệu rất phong phú và rẻ tiền Từ lâu, tinh bột được dùng để đóng mạch, diethanolamin được dùng làm chất mang để cố định enzyme như lipase, trypsin, amylase Nhưng độ trương của tinh bột còn hạn chế và thiếu các nhóm chức năng Vì vậy, dẫn đến khả năng cố định và hoạt độ enzyme còn thấp

- Chitin và Chitosan là hai vật liệu có nhiều triển vọng trong việc cố định enzyme Chitin rất phổ biến trong tự nhiên, có cấu tạo tương tự cellulose, là một polymer của 2-acetomido-deoxy-β-D-glucose Chitin có trong cấu trúc vỏ tôm, cua, côn trùng, thành tế bào vi sinh vật

- Chitosan là dẫn xuất của chitin khi xử lý bằng kiềm đặc

- Chitin và chitosan có cấu trúc siêu lỗ, dễ tạo màng, tạo hạt, khả năng hấp phụ tốt, tính chất cơ lý bền vững, ổn định, thường được cố định qua cầu nối glutaldehyd và sodiumtriphotphate

Chất mang còn có thể là protein thường dùng như gelatin, kerarin, collagen, albumin rất dễ tạo màng, tạo hạt tuy nhiên lại kém bền và dễ nhiễm khuẩn, hay gây ra các phản ứng miễn dịch với cơ thể khi sử dụng trên người và động vật

2.3.1.2 Chất mang là polymer tổng hợp

Nhóm này thường gồm các chất như: polyester, polyvinylalcohol, polystyrene, polyethylene,…với ưu điểm là bền, tính chất cơ lý tốt, hoàn toàn trơ với sự tấn công của vi khuẩn, độ trương tốt Tuy nhiên, nhóm này cũng bộc lộ một số nhược điểm như giá thành cao (polyacrylic,polyacrylamide), có khả năng tương hợp kém và chính vì quá bền vững, không thể thủy phân trong tự nhiên nên cũng là lý do gây ô nhiễm môi trường Công nghệ sản xuất polymer cũng gây ô nhiễm nghiêm trọng Đây là một vấn

đề cần được chú ý hiện nay

2.3.2 Chất mang vô cơ [12]

Một số chất vô cơ cũng được sử dụng để làm chất mang như: sợi bông thủy tinh, silicum oxide, alluminium oxide Đây là nhưng dạng oxide có cấu trúc lỗ và có khả năng hấp phụ tốt Một đặc điểm trong những vật liệu có nguồn gốc từ silic là khá đắc tiền và tan trong dung dịch kiềm pH >7,5, để hạn chế điều này người ta phủ lên sợi bông thủy tinh hay silicum oxide một lớp ziconia để tạo một lớp ổn định với dung dịch kiểm

Celite cũng là một loại vật liệu vô cơ được sử dụng làm chất mang cố định enzyme Celite là loại vật liệu không đồng nhất, chứa nhiều ion kim loại, rẻ tiền nên rất thích hợp để chọn là chất mang và các ứng dụng trong công nghiệp.Thành phần cơ bản của Celite là SiO2 chiếm khoảng 89,6%, còn lại là Al2O3 4%, CaO 0,5%, Fe2O3 1,3%, Na2O3 và K2O 3,3%

2.3.3 Chất mang sẽ sử dụng trong nghiên cứu [3, 18, 24]

2.3.3.1 Celite

Celite hay diatomite được tìm thấy trong tự nhiên ở dạng đá phấn, mềm và dễ dàng vỡ vụn thành dạng bột màu trắng Loại bột này có khả năng chịu mài mòn giống

đá bọt, có nhiều lỗ xốp và có khả năng chịu nhiệt cao Celite được ứng dụng trong công nghiệp làm tác nhân lọc, làm chất mài mòn, sử dụng để hấp thu chất lỏng, thành phần thuốc nổ và nó cũng được sử dụng như tác nhân làm đông máu trong y học

Về mặt cấu tạo hóa học, celite là hỗn hợp của nhiều ocid kim loại gồm:

SiO2 : 89,4%; Al2O3 : 3,4%; Fe2O3 : 1,3%; TiO2 : 0,2%; CaO và MgO:1,1% còn lại là

từ natri othosilicat (Na2SiO4) hoặc Silic tetraclorua (SiCl4) Hiện nay silicagel có vai trò rất quan trọng trong công nghệ hóa học từ đơn giản đến phức tạp Silicagel được dùng rất nhiều làm xúc tác trong tổng hợp hữu cơ hóa dầu, lọc nước,

Trong đời sống hàng ngày, người ta thường đặt những gói nhỏ silicagel trong lọ thuốc tây, trong gói thực phẩm, trong sản phẩm điện tử Ở đó, silicagel đóng vai trò hút ẩm để giữ các sản phẩm trên không bị hơi ẩm làm hỏng Khi silicagel đã ngậm no nước, ta có thể tái sinh nó bằng cách giữ nó ở nhiệt độ khoảng 150°C trong khoảng nửa giờ hoặc cho tới khi nào nó trở về màu phớt xanh

Ngoài ra cũng có thể sử dụng nó làm chất mang để cố định enzyme bởi nó có những tính chất ưu việt như:

- Là một chất mang trơ

- Rẻ tiền

- Diện tích bề mặt lớn phù hợp với phương pháp cố định enzyme trên bề mặt

Đường kính lỗ: 20-30A Dung tích lỗ: 0.35-0.45ml/g Diện tích bề mặt:650m2/ g

Hình 2.9 Hạt alginate

2.3.3.3 Alginate [11, 14]

Alginate là một polymer được cấu tạo từ 2 monomer là: acid a-D-Mannuronic (M) và acid a-L-Guluronic (G), với các cầu nối là liên kết 1-4 glucoside, chúng chỉ khác nhau ở nhóm carboxyl nằm ở trên và dưới mặt phẳng của vòng pyranoza

Hình 2.10 Cấu trúc alginate

Alginate chủ yếu thu nhận từ trong tế bào và vách tế bào của tảo đỏ Nghiên cứu đầu tiên để chiết xuất alginate từ tảo được thực hiện bởi nhà hóa học người Anh E.C Stanford vào cuối thế kỷ XIX Hợp chất chiết ra từ tảo - đặt tên là algin có nhiều tính chất đặc biệt, algin được áp dụng thành công ở quy mô nhỏ, nhưng ở quy mô công nghiệp lớn thì mãi đến những năm 50 của thế kỷ XX mới có Ngoài ra alginate

còn được tổng hợp từ Azotobacter, Pseudomonas

Trong rong biển, acid alginic thường tồn tại dưới dạng muối alginate calci, magie, sắt… Chúng tham gia vào cấu trúc thành và màng tế bào, là một copolymer mạch thẳng được tạo thành từ 2 gốc Uronat: G, M, chúng thường tồn tại ở dạng G-G-G-G…; M-M-M-M…; hay G-M-G-M… Như vậy alginate được xem là copolymer

dạng khối, sự phân phối của thành phần M, G biến đổi nhiều theo loài, do đó có rất nhiều loại alginate và chúng có tính chất khác nhau

Alginate tồn tại ở nhiều dạng khác nhau, từ dạng bột, hạt nhỏ, hạt lớn hay dạng sợi, có màu sắc từ trắng sang vàng nâu

Hình 2.11 Bột alginate

v Tính chất

Alginate là một họ của các phân tử có độ polymer hóa, alginate có 2 tính chất quan trọng luôn được quan tâm đến là: độ nhớt và tính tạo gel Độ nhớt phụ thuộc vào trọng lượng phân tử của alginate, còn tính chất tạo gel phụ thuộc vào cấu trúc của alginate, mà cấu trúc này lại phụ thuộc vào quy trình sản xuất và nguồn gốc của alginate

Một trong những tính chất quan trọng của alginate là khả năng tạo gel trong những điều kiện nhất định Khi cho kết hợp với cation hóa trị cao, thường dùng nhất là

Ca2+, sẽ xuất hiện những vùng nối giữa các mạch trong phân tử alginate và tạo gel, gel

sẽ được tạo thành ở nhiệt độ phòng hay nhiệt độ bất kỳ nhỏ hơn 1000C

Hình 2.12 Hạt gel alginate

v Độ nhớt dung dịch [14]

Alginate có độ nhớt rất cao khi nó vẫn còn thuộc về tế bào, khi được tách chiết

độ nhớt giảm đáng kể Độ nhớt phụ thuộc vào phương pháp tách chiết và có Mannuronic (M) hay không Khi kết hợp với ion kim loại hóa trị 1 như Na+, K+,

a-D-NH4… sẽ làm alginate tan trong nước tạo dung dịch có độ nhớt cao Khi alginate có khối lượng trung bình càng lớn thì độ nhớt càng tăng

Khi nồng độ thay đổi, độ nhớt cũng thay đổi theo, ngoài ra độ nhớt còn phụ thuộc vào nhiệt độ: khi nhiệt độ tăng 10C thì độ nhớt giảm tương ứng 2,5%

Thời gian bảo quản: khi ở dạng bột thành phẩm, alginate tiếp tục bị phân hủy, sau một thời gian bảo quản, chất lượng giảm đáng kể Với alginate có độ nhớt trung bình thì sau một năm bảo quản chất lượng giảm 45%

Phụ thuộc vào pH: khi pH = 5, nhóm COO- bắt đầu bị proton hóa, làm lực đẩy tĩnh điện giữa các chuỗi giảm, vì thế chúng sẽ xích lại gần nhau và tạo liên kết hydro, dẫn đến tăng độ nhớt Nếu tiếp tục giảm pH xuống 3 ÷ 4 chúng sẽ tạo gel Độ nhớt không bị ảnh hưởng ở khoảng pH 5 ÷ 11, nhưng khi pH = 11, alginate bị depolymer hóa từ từ và làm giảm độ nhớt do liên kết glucoside dễ bị thủy phân trong môi trường kiềm

Cấu trúc gel

Theo phương pháp nhốt, ta nhỏ giọt alginate natri vào CaCl2, quá trình tạo gel diễn ra ngay khi alginate tiếp xúc với CaCl2 Khi chúng chuyển động và sắp xếp lại trong quá trình tạo gel, chúng kéo theo sự phân bố của enzyme Chính lớp vỏ của mạng gel cũng như cấu trúc 3 chiều của mạng lưới, các mắt lưới đan chéo nhau, các enzyme sẽ khó thoát ra trong quá trình sử dụng Theo cơ chế tạo gel, lớp gel bề mặt sẽ

có mật độ polymer cao hơn, do 2 hướng chuyển dịch: hạt gel có thể tích và phân tử alginate di chuyển từ trung tâm ra bên ngoài, điều này làm mật độ enzyme ở bề mặt lớn hơn ở trung tâm Do enzyme tập trung ở bề mặt gel nên việc phân tử cơ chất khuếch tán vào tế bào cũng như khuếch tán ra môi trường sẽ nhanh hơn tạo điều kiện cho quá trình trao đổi chất

Hình 2.13 Cấu trúc mạng gel alginate khi tiếp xúc với CaCl2

v Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo gel

Do quá trình được thực hiện bởi sự liên kết của alginate và Ca2+, nên nồng độ

Ca2+ sẽ ảnh hưởng đến khả năng tạo gel Tiếp theo đó là nồng độ và nguồn gốc alginate sử dụng Nồng độ alginate càng cao, sự co rút của gel càng ít, khi đó mạng lưới gel sẽ nhiều hơn, độ xốp sẽ nhiều hơn tạo khả năng giữ nước tốt hơn Khi khối lượng phân tử lớn hơn một giá trị nào đó, độ bền của hạt gel sẽ không còn phụ thuộc vào khối lượng phân tử

v Ứng dụng

Alginate có nhiều tính chất đặc trưng: tính tạo quánh, tạo gel, tính ổn định trong huyền phù… Do đó nó được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau: làm chất độn, chất ổn định, chất nhũ hóa, tạo gel… Trong đó ứng dụng gần đây nhất là việc sử dụng alginate vào lĩnh vực cố định enzyme và tế bào