Nghiên cứu thu nhận sinh khối nấm men rhodotorula trên môi trường lên men bán rắn, tạo chế phẩm thức ăn cho gia cầm

Nhiều công trình nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới đã xác định các loài nấm men đỏ thuộc giống Rhodotorula có khả năng sinh tổng hợp carotenoid cũng như enzyme phytase nên c

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

NGUYỄN ĐÌNH THỊNH

NGHIÊN CỨU THU NHẬN SINH KHỐI

NẤM MEN RHODOTORULA TRÊN MÔI

TRƯỜNG LÊN MEN BÁN RẮN, TẠO CHẾ

PHẨM THỨC ĂN CHO GIA CẦM

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM & ĐỒ UỐNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS TS ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO

Cán bộ chấm nhận xét 1: GS TS DƯƠNG THANH LIÊM

Cán bộ chấm nhận xét 2: TS NGUYỄN HỮU PHÚC

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại:

HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

Ngày 20 tháng 08 năm 2008

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ và tên học viên: NGUYỄN ĐÌNH THỊNH Giới tính: Nam

Ngày, tháng, năm sinh: 28/05/1982 Nơi sinh : Tp HCM

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM & ĐỒ UỐNG

Khóa (Năm trúng tuyển): K2006

1 TÊN ĐỀ TÀI: “NGHIÊN CỨU THU NHẬN SINH KHỐI NẤM MEN

RHODOTORULA TRÊN MÔI TRƯỜNG LÊN MEN BÁN RẮN, TẠO CHẾ

PHẨM THỨC ĂN CHO GIA CẦM”

2 NHIỆM VỤ LUẬN VĂN

Trên cơ sở giống nấm men Rhodotorula đã được phân lập từ lá lúa lấy tại

huyện Tân An, Long An; nghiên cứu tạo bột canh trường giàu beta-carotene và

enzyme phatase để sử dụng làm chế phẩm thức ăn cho gia cầm giúp hấp thu tốt

photpho và các chất dinh dưỡng Nhiệm vụ cụ thể:

¾ Tối ưu các điều kiện nuôi cấy nấm men Rhodotorula trên môi trường bán rắn

¾ Khảo sát sự thay đổi các thành phần theo thời gian nuôi cấy

¾ Tạo chế phẩm bột màu từ canh trường nuôi cấy bán rắn

¾ Thử nghiệm hiệu quả của chế phẩm trên chuột

Nội dung và đề cương Luận văn thạc sĩ đã được Hội Đồng Chuyên Ngành thông qua

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN

(Họ tên và chữ ký)

LỜI MỞ ĐẦU

ĐẶT VẤN ĐỀ

Xã hội ngày càng phát triển, kéo theo sự phát triển của các ngành khoa học

kỹ thuật Công nghệ sinh học đã và đang trở thành một trong những ngành được quan tâm hàng đầu trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng Công nghệ sinh học phát triển nhanh chóng tương tự ngành công nghệ thông tin, đang tạo ra một cuộc cách mạng sinh học trong các ngành nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm, làm thay đổi phương thức sản xuất trong các ngành y dược, vật liệu mới, năng lượng khai khoáng và bảo vệ môi trường

Việc tận dụng các phế phẩm và những nguồn nguyên liệu rẻ tiền để tạo ra những sản phẩm có chất lượng cao, giảm nguy cơ ô nhiễm môi trường, mang lại hiệu quả kinh tế cho xã hội

Vitamin A có vai trò rất quan trọng trong đời sống con người và vật nuôi Nguồn nguyên liệu thực vật và vi sinh vật được xem là các nguồn cung cấp dồi dào sắc tố carotenoid nói chung và tiền vitamin A nói riêng

Enzyme phytase, một loại enzyme rất cần thiết trong việc hấp thu dưỡng chất

và P cũng có mặt nhiều trong thực vật và vi sinh vật

Các vật nuôi như tôm, cá, gà, heo,… trong thức ăn cũng rất cần bổ sung carotenoid thiên nhiên cũng như enzyme phytase Chúng cần cho sự phát triển, tăng trọng, tăng hệ miễn dịch chống lại nhiều bệnh tật, cho lượng thịt, trứng, sữa cao hơn

và chất lượng hơn

Nhiều công trình nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới đã xác định

các loài nấm men đỏ thuộc giống Rhodotorula có khả năng sinh tổng hợp

carotenoid cũng như enzyme phytase nên chúng được dùng làm đối tượng để sản xuất carotenoid tự nhiên từ vi sinh vật

Từ các vấn đề đã được đề cập như trên, Đề tài “Nghiên cứu thu nhận sinh

khối nấm men Rhodotorula trên môi trường lên men bán rắn, tạo chế phẩm

thức ăn cho gia cầm” được thực hiện nhằm mục đích nghiên cứu ứng dụng việc

nuôi cấy nấm men Rhodotorula trên môi trường tấm gạo dùng trong chăn nuôi để

tạo ra chế phẩm thức ăn giàu giá trị dinh dưỡng và đặc biệt là có thêm sắc tố carotene (carotenoid) và enzyme phytase rất cần thiết cho sự phát triển vật nuôi cũng như góp phần giảm thiểu sự ô nhiễm môi trường Đề tài được thực hiện với mong muốn góp phần vào sự đa dạng hóa các sản phẩm thức ăn dùng trong chăn nuôi, nâng cao giá trị dinh dưỡng, cải thiện nâng suất và chất lượng của vật nuôi và gia cầm

beta-MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU

Trên cơ sở giống nấm men Rhodotorula, chúng tôi tiến hành nuôi cấy trên

môi trường bán rắn sử dụng các phụ phẩm và phế liệu của các nhà máy nông nghiệp

và thực phẩm như tấm gạo, bã đậu nành,…để tạo ra chế phẩm dạng bột từ canh trường nuôi cấy trên mà có thể được sử dụng trực tiếp hoặc làm cơ sở để tạo các sản phẩm thức ăn cho gia cầm và vật nuôi nhằm mục đích tăng cường dưỡng chất, phòng ngừa bệnh thiếu vitamin A cũng như tăng khả năng hấp thu P trong cơ thể của gia cầm và vật nuôi

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Trong phạm vi luận văn này, chúng tôi nghiên cứu những vấn đề sau:

¾ Tối ưu các điều kiện nuôi cấy nấm men Rhodotorula trên môi trường

bán rắn

¾ Khảo sát sự thay đổi các thành phần theo thời gian nuôi cấy

¾ Tạo chế phẩm bột màu từ canh trường nuôi cấy bán rắn

¾ Thử nghiệm hiệu quả của chế phẩm trên chuột

TẠO CHẾ PHẨM THỨC ĂN CHO GIA CẦM TÓM TẮT

Mục đích của nghiên cứu này là tối ưu các thông số trong quá trình nuôi cấy

bán rắn nấm men Rhodotorula Bằng phương pháp qui hoạch thực nghiệm của Box

và Hunter, chúng tôi đã thành công khi tìm ra các thông số tối ưu của quá trình:

Nồng độ khoáng (µg/100g cơ chất): N = 3500; P = 1000; S = 700

Và các thông số ban đầu pH = 5,5; độ ẩm = 60% và mật độ cấy giống

= 7,265x107 CFU/g cơ chất

Sau quá trình tối ưu, chúng tôi tiến hành sấy toàn bộ canh trường ở nhiệt độ

40 – 450C trong khoảng 24 giờ và đi nghiền, chúng tôi thu được chế phẩm bột canh

trường nấm men Rhodotorula có độ ẩm 12,63% với các thành phần (% chất khô)

bổ sung chế phẩm bột canh trường có sự tương đồng hoặc tốt hơn so với thức ăn kiểm chứng của Viện Pasteur Đặc biệt là sự tăng lên có ý nghĩa của hàm lượng P trong xương cho thấy khả năng hấp thu tốt P của thức ăn có bổ sung chế phẩm, nổi bật lên hiệu quả của hoạt tính enzyme phytase khi làm tăng sự hấp thụ P cũng như

ABSTRACT

The purpose of this research is to optimize parameters in the culture of the

solid-state fermentation of the Rhodotorula yeast Using Box and Hunter

experimental design, we have succeeded in finding the optimal parameters:

Mineral contents (µg/100g substances): N: 3500; P: 1000; S: 700 And initial parameters: pH: 5.5; the culture’s moisture: 60%; the yeast density: 7.625x107 CFU/g substances

After drying at 40 – 450C in about 24 hours and grinding, we have produced the powdered feeds (the β – carotene riched powder: βCR powder) with moisture of12.63% and the ingredients (% dried powder) as follow:

™ Phytase activity : 87.00 UI/g dried powder;

™ And beta-carotene : 181.22 µg/g dried powder

The βCR powder is created from the culture of solid-state fermentation of the

Rhodotorula yeast has been directly tested on lab mice When comparing 2 kinds of

feeds, there is a similarity between the feeds with 50% of the βCR powder and the controlling feeds of Pasteur Institute in gain weighting, hemoglobin content, erythrocyte and leucocyte counts, calcium and phosphorus contents Especially, the increase of phosphorus content in mice’s bone significantly showed the good potential absorption of phosphorus when using the feeds with 50% of the βCR powder This is the effect of phytase activity in enhancing potential absorption of

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

A CAROTENOID

1.1 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA NẤM MEN RHODOTORULA 3

1.1.1 Phân loại 3

1.1.2 Phân bố 4

1.1.3 Hình thái, kích thước tế bào 5

1.1.4 Đặc điểm sinh hóa 6

1.1.5 Cấu tạo và sinh sản của nấm men Rhodotorula 7

1.1.5.1 Cấu tạo 7

1.1.5.2 Sinh sản 9

1.1.6 Các nghiên cứu về nấm men Rhodotorula 9

1.2 PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN BÁN RẮN 11

1.2.1 Đặc điểm của phương pháp lên men bán rắn 12

1.2.2 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến quá trình lên men bán rắn 12

1.2.2.1 Ảnh hưởng của nguồn nitơ 12

1.2.2.2 Ảnh hưởng của nguồn carbon 14

1.2.2.3 Vai trò của các muối 15

1.2.3 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến quá trình lên men bán rắn (Solid State Fermentation: SSF) 15

1.2.3.1 Độ ẩm và hoạt độ nước a w 16

1.2.3.2 pH ban đầu 16

1.2.3.3 Nhiệt độ và sự truyền nhiệt 16

1.2.3.4 Ảnh hưởng của môi trường không khí 17

1.2.3.5 Ảnh hưởng của ánh sáng 17

1.3.4 Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp lên men bán rắn so với lên men dịch thể 17

1.4.2 Cơ chế sinh tổng hợp sắc tố carotenoid 19

B ß-CAROTENE 1.5 ß-CAROTENE VÀ TẦM QUAN TRỌNG CỦA NÓ 22

1.5.1 Giới thiệu về ß-Carotene (tiền vitamin A) 22

1.5.2 Tầm quan trọng của ß-Carotene đối với sức khỏe 22

1.6 CƠ CHẾ MẤT MÀU CỦA CAROTENOID 23

1.6.1 Đồng phân hóa 23

1.6.1.1.Đồng phân do nhiệt độ, ánh sáng 23

1.6.1.2 Đồng phân epoxyt 23

1.6.2 Biến đổi do enzyme 23

1.6.2.1 Peroxidase làm giảm chất lượng carotenoid, theo con đường trực tiếp và cả gián tiếp 24

1.6.2.2 Lipoperoxidase chỉ hoạt động khi có mặt acid béo không no bị oxy hóa bởi lipoxidase 24

1.6.3 Biến đổi không do enzyme 24

1.6.3.1 Sự oxy hóa chất màu 24

1.6.3.2 Sự nhiễm bẩn do ion kim loại 25

C ENZYME PHYTASE 1.7 ENZYM PHYTASE 26

1.7.1 Định nghĩa 26

1.7.2 Phân loại 27

1.7.3 Đặc điểm cấu tạo 27

1.7.4 Đặc điểm xúc tác 28

1.7.4.1 Trung tâm hoạt động 28

1.7.4.2 Cơ chế hoạt động 29

1.7.5.2 pH 32

1.7.5.3 Ảnh hưởng của ion kim loại và một số chất hóa học lên hoạt tính của phytase 32

1.7.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp phytase ở vi sinh vật 33

1.7.7 Vai trò của enzym phytase trong việc tiêu hóa phospho và các chất dinh dưỡng khác 34

1.8 ỨNG DỤNG CỦA PHYTASE 35

1.8.1 Trong công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc 35

1.8.2 Trong thực phẩm 35

D SINH LÝ CHUỘT VÀ SINH LÝ MÁU 1.9 ĐẶC ĐIỂM SINH LÝ CHUỘT NHẮT TRẮNG 36

1.9.1 Khái quát về chuột nhắt trắng 36

1.9.2 Điều kiện sinh trưởng và phát triển của chuột 39

1.9.2.1 Nhiệt độ và độ ẩm 39

1.9.2.2 Ánh sáng 39

1.9.2.3 Sự thông gió 40

1.9.2.4 Tiếng ồn 40

1.9.3 Nhu cầu dinh dưỡng của chuột nhắt trắng 40

1.10 SINH LÝ MÁU 42

1.10.1 Huyết tương 43

1.10.2 Hồng cầu 43

1.10.3 Hemoglobin 44

1.10.4 Bạch cầu 45

CHƯƠNG II: NGUYÊN VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN LIỆU – GIỐNG VI SINH VẬT & MÔI TRƯỜNG 46

2.1.2.1 Nguồn giống 47

2.1.2.2 Môi trường giữ giống nấm men 48

2.1.2.3 Môi trường hoạt hóa nấm men 48

2.1.2.4 Môi trường nuôi cấy bán rắn 49

2.1.2.5 Môi trường khảo sát khả năng hình thành sinh khối nấm men 49

2.1.2.6 Giống chuột nhắt trắng 49

2.1.2.7 Thức ăn cho chuột 50

2.1.2.8 Hóa chất 50

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 51

2.2.1 Sơ đồ nuôi cấy bán rắn nấm men 51

2.2.2 Thuyết minh quy trình 52

2.2.2.1 Ngâm gạo 52

2.2.2.2 Hồ hóa 52

2.2.2.3 Phân phối 52

2.2.2.4 Thanh trùng 52

2.2.2.5 Cấy vi sinh vật 52

2.2.2.6 Nuôi cấy 52

2.2.2.7 Tạo chế phẩm bột canh trường nấm men Rhodotorula 53

2.2.3 Các phương pháp phân tích 53

2.2.3.1 Phương pháp xác định ẩm theo TCVN 4326:1986 53

2.2.3.2 Phương pháp phân tích hàm lượng protein bằng phương pháp Kjeldahl theo TCVN 4328:2001 53

2.2.3.3 Phương pháp phân tích hàm lượng lipit thô bằng phương pháp trích ly theo TCVN 4331:2001 54

2.2.3.4 Phương pháp xác định hàm lượng tro theo TCVN 4327:1986 54

2.2.3.7 Phương pháp xác định pH 55

2.2.3.8 Phương pháp đếm khuẩn lạc xác định mật độ tế bào nấm men Rhodotorula theo Sato et al (1985) 55

2.2.3.9 Phương pháp xác định hàm lượng beta-carotene 55

2.2.3.10 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme phytase 56

2.2.4 Tối ưu các yếu tố trong quá trình sinh tổng hợp sinh khối nấm men Rhodotorula sp.CBS10104 56

2.2.4.1 Khảo sát chọn điểm ở tâm 56

2.2.4.2 Tối ưu các yếu tố khoáng 58

2.2.4.3 Tối ưu các yếu tố độ ẩm, pH và mật độ cấy giống ban đầu 59

2.2.5 Các test thử trên chuột 61

2.2.5.1 Phương pháp đếm số lượng hồng cầu 61

2.2.5.2 Phương pháp đếm số lượng bạch cầu 61

2.2.5.3 Xác định hàm lượng hemoglobin 62

2.2.5.4 Bố trí thí nghiệm trên đàn chuột 63

2.2.5.5 Phương pháp cho chuột ăn và xác định trọng lượng chuột 63

2.2.5.6 Phương pháp thu nhận chất thải từ lồng nuôi chuột 63

2.2.5.7 Phương pháp thu nhận xương chuột 63

2.2.5.8 Phương pháp xác định hàm lượng Calcium 64

2.2.5.9 Phương pháp xác định hàm lượng P 64

2.2.5.10 Phương pháp thu nhận máu 64

2.2.6 Phương pháp xử lý số liệu 64

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ & BÀN LUẬN 3.1 ĐƯỜNG CHUẨN SINH KHỐI NẤM MEN 66

3.2 KHẢO SÁT SƠ BỘ CHỌN ĐIỂM Ở TÂM 66

3.3.2 Kiểm định sự tương thích của phương trình hồi qui 70

3.3.3 Các điểm tối ưu của phương trình hồi qui 70

3.3.4 Kết luận và nhận xét 71

3.3.4.1 Kết luận 71

3.3.4.2 Nhận xét 71

3.4 TỐI ƯU pH, ĐỘ ẨM VÀ MẬT ĐỘ CẤY GIỐNG THEO QUI HOẠCH THỰC NGHIỆM BOX VÀ HUNTER 71

3.4.1 Phương trình hồi qui 72

3.4.2 Kiểm định sự tương thích của phương trình hồi qui 73

3.4.3 Các điểm tối ưu của phương trình hồi qui 73

3.4.4 Kết luận và nhận xét 74

3.4.4.1 Kết luận 74

3.4.4.2 Nhận xét 74

3.5 KHẢO SÁT THỜI GIAN SINH KHỐI CỰC ĐẠI 75

3.6 KHẢO SÁT LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ (GLUCOSE) THEO THỜI GIAN 76

3.6.1 Đường chuẩn glucose 76

3.6.2 Sự thay đổi hàm lượng đường khử (glucose) theo thời gian 77

3.7 KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG CHẾ PHẨM BỘT MÀU TỪ CANH TRƯỜNG NUÔI CẤY BÁN RẮN NẤM MEN RHODOTORULA 78

3.7.1 Độ ẩm 78

3.7.2 Đạm tổng 79

3.7.3 Lipit tổng 79

3.7.4 Tinh bột 79

3.7.5 Xơ tổng 79

3.7.6 Tro tổng 79

3.7.8.1 Đường chuẩn beta-carotene 81

3.7.8.2 Hàm lượng beta-carotene 81

3.8 CÁC KẾT QUẢ THỬ TRÊN CHUỘT KHI ĂN BẰNG THỨC ĂN CÓ BỔ SUNG CHẾ PHẨM VÀ THỨC ĂN VIỆN PASTEUR 82

3.8.1 So sánh về sự tăng trọng 82

3.8.2 So sánh về hemoglobin 84

3.8.3 So sánh về số lượng hồng cầu 86

3.8.4 So sánh về số lượng bạch cầu 88

3.8.5 So sánh về hàm lượng canxi trong xương 90

3.8.6 So sánh hàm lượng P trong xương 92

3.8.7 So sánh hàm lượng P trong phân 94

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN & KIẾN NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN 97

4.1.1 Các thông số tối ưu cho quá trình nuôi cấy nấm men Rhodotorula 97

4.1.2 Khảo sát các thành phần theo thời gian 97

4.1.3 Chất lượng chế phẩm bột canh trường nuôi cấy nấm men Rhodororula 97

4.1.4 Các test thử trên chuột 98

4.2 KIẾN NGHỊ 99

TÀI LIỆU THAM KHẢO 100 PHỤ LỤC

βCR Chế phẩm bột canh trường giàu beta-caroten

HPLC High Performance Liquid Chromatography (sắc ký lỏng cao áp)

IU (UI) International Unit (đơn vị hoạt độ)

tổng hợp chất béo của nấm men Rh glutinis 13

Bảng 1.2 Ảnh hưởng của nồng độ (NH4)2SO4 trong môi trường đến sự phát triển và khả năng tổng hợp chất béo của nấm men Rh glutinis 14

Bảng 1.3 Một số đặc điểm sinh lý của chuột nhắt trắng 37

Bảng 1.4 Khoảng nhu cầu dinh dưỡng của chuột nhắt trắng 40

Bảng 1.5 Số lượng hồng cầu ở một số động vật (triệu/mm3) 43

Bảng 1.6 Số lượng bạch cầu ở động vật (ngàn/mm3) 45

Bảng 2.1 Thành phần gạo tấm sử dụng 46

Bảng 2.2 Thành phần bã đậu nành của Vinamilk 47

Bảng 2.3 Mức khảo sát của các yếu tố khoáng 57

Bảng 2.4 Bố trí thí nghiệm khảo sát 57

Bảng 2.5 Mức biến thiên của các yếu tố khoáng 58

Bảng 2.6 Ma trận qui hoạch thực nghiệm phương án quay bậc 2 ba yếu tố N , P và S của Box – Hunter 59

Bảng 2.7 Mức biến thiên của các yếu tố khoáng 60

Bảng 2.8 Ma trận qui hoạch thực nghiệm phương án quay bậc 2 ba yếu tố pH, độ ẩm và mật độ cấy giống của Box – Hunter 60

Bảng 3.1 Số khuẩn lạc theo độ đục OD 66

Bảng 3.2 Số CFU/g CT khô theo số liệu thực nghiệm chọn điểm ở tâm 67

Bảng 3.3 Số CFU/g CT khô theo số liệu thực nghiệm tối ưu khoáng 69

Bảng 3.4 Các hằng số bj tính theo các số liệu thực nghiệm tối ưu khoáng 69

Bảng 3.5 Các hệ số hồi qui tj tính theo các số liệu thực nghiệm tối ưu khoáng 69

Bảng 3.6 Các phương sai và F theo các số liệu thực nghiệm tối ưu khoáng 70

Bảng 3.7 Số CFU/g CT khô theo số liệu thực nghiệm tối ưu pH, độ ẩm và mật độ cấy giống ban đầu 72

Bảng 3.8 Các hằng số bj theo số liệu thực nghiệm tối ưu pH, độ ẩm và mật độ cấy giống ban đầu 72 Bảng 3.9 Các hệ số hồi qui tj theo số liệu thực nghiệm tối ưu pH, độ ẩm và mật độ cấy

Bảng 3.12 OD đo theo nồng độ glucose 76

Bảng 3.13 Hàm lượng đường khử (glucose) theo thời gian 77

Bảng 3.14 Độ ẩm của bột canh trường 78

Bảng 3.15 Hàm lượng đạm tổng của bột canh trường 79

Bảng 3.16 Hàm lượng lipit tổng của bột canh trường 79

Bảng 3.17 Hàm lượng tinh bột của bột canh trường 79

Bảng 3.18 Hàm lượng xô thô của bột canh trường 79

Bảng 3.19 Hàm lượng tro tổng của bột canh trường 80

Bảng 3.20 Nồng độ photpho theo độ đục OD 80

Bảng 3.21 Hoạt tính phytase của bột canh trường 80

Bảng 3.22 Độ OD theo hàm lượng beta-carotene chuẩn 81

Bảng 3.23 Hàm lượng beta-carotene của bột canh trường 82

Bảng 3.24 Sự tăng trọng của chuột 82

Bảng 3.25 OD của hemoblogin trong 2 lô chuột 84

Bảng 3.26 Số lượng hồng cầu/mm3 máu của chuột 86

Bảng 3.27 Số lượng bạch cầu/mm3 máu của chuột 88

Bảng 3.28 Thể tích chuẩn độ (ml) canxi trong xương chuột 90

Bảng 3.29 Hàm lượng P (µg) có trong xương 0.1g xương 92

Bảng 3.30 Hàm lượng P (µg) có trong 1g phân 94

Bảng 4.1 Thành phần của chế phẩm bột canh trường 98

Bảng 4.2 So sánh các chỉ tiêu trên chuột đối chứng và chuột ăn chế phẩm 98

Hình 1.2 Tế bào nấm men Rhodotorula glutinis 6

Hình 1.3 Con đường sinh tổng hợp carotenoids 20

Hình 1.4 Các giai đoạn của quá trình sinh tổng hợp carotenoids 20

Hình 1.5 Các phản ứng dehydro hóa trong quá trình sinh tổng hợp caroteniods 21

Hình 1.6 Tổng hợp carotenoid có vòng từ lycopene 21

Hình 1.7 Beta-carotene trong không gian 3 chiều 22

Hình 1.8 Phản ứng phân giải phytat bởi enzym phytase 26

Hình 1.9 Sản phẩm phân giải phytat bởi enzym phytase 26

Hình 1.10a Cấu trúc phytase của E.coli (gồm hai tiểu phần) 28

Hình 1.10b Cấu trúc phytase của A.niger (gồm một tiểu phần) 28

Hình 1.11 Sự gắn acid phytic vào trung tâm hoạt động của phytase Bacillus 29

Hình 2.1 Gạo tấm phụ phẩm 46

Hình 2.2 Bã đậu nành của công ty Vinamilk 47

Hình 2.3 Chủng nấm men Rhodotorula sp.CBS10104 (MN12) 48

Hình 2.4 Cấy chuyền giữ giống trên môi trường thạch malt trong ống nghiệm 48

Hình 2.5 Sơ đồ tiến hành thí nghiệm 51

Hình 3.1 Đường chuẩn sinh khối nấm men Rhodotorula 66

Hình 3.2 Sinh tổng hợp sinh khối theo các nồng độ khoáng 68

Hình 3.3 Quá trình sinh tổng hợp sinh khối theo thời gian 75

Hình 3.4 Đường chuẩn glucose 76

Hình 3.5 Hàm lượng đường khử (glucose) thay đổi theo thời gian 77

Hình 3.6 Đường chuẩn nồng độ photpho 80

Hình 3.7 Đường chuẩn beta-carotene 81

Hình 4.1 Chế phẩm bột canh trường nấm men Rhodotorula 98

1 SỐ HÌNH ẢNH QUÁ TRÌNH NUÔI CẤY RHODOTORULA PHỤ LỤC 4

CHƯƠNG I § TỔNG QUAN

A NẤM MEN RHODOTORULA

Nấm men Rhodotorula là một trong rất ít các loại nấm men có khả năng tổng

hợp một lượng lớn sắc tố carotenoid trong đó chủ yếu là β-carotene, torulene, torularhodin Một số chủng đã được nghiên cứu về khả năng tạo sinh khối, tích lũy carotenoid, chất béo đặc biệt là các acid béo không no có giá trị sinh học cao trên

Rhodotorula thuộc lớp nấm bất toàn và nhóm không sinh bào tử [14] Tuy nhiên

theo hệ thống phân loại của Lodder và Kreger-Van_Rij (1952): Rhodotorula thuộc

họ Cryptococcaeae, họ này chia làm ba họ phụ (subfamily) là: Cryptococcoideae,

Trichosporpodeae và Rhodotorulaideae Trong đó Rhodotorulaideae chỉ gồm một

giống duy nhất là Rhodorotorula Cơ sở để xếp Rhodotorula vào một nhánh riêng là

sự hiện diện của sắc tố carotenoid có các màu từ vàng đến đỏ trong tế bào của nấm

men Rhodotorula và không có khả năng đồng hóa nguồn inositol trong khi inositol

đóng vai trò là nguồn cơ chất carbon duy nhất để nấm men phát triển [3], [23], [57]

Theo khóa phân loại của Lodder (1990) giống nấm men Rhodotorula có đặc

điểm sau [23]:

- Tế bào nẩy chồi, không có khuẩn ty giả

- Vệt màu hồng hay vàng do sinh sắc tố carotenoid, không lên men

- Không đồng hóa inositol

- Không hình thành hợp chất loại tinh bột

Dựa vào khóa phân loại của Harrison thì giống nấm men Rhodotorula gồm

34 loài, trong đó phổ biến là ba loài: Rh glutinis, Rh minuta và Rh mucilaginisa Harrison mô tả đặc điểm phân loại giống nấm men Rhodotorula sp như sau [67]:

rubra, loài này sinh enzyme urease, không đồng hóa nitrate, không phát triển trên

cycloheximide hoặc ở nhiệt độ trên 400C và loài Rh.rubra thực ra chỉ là một dạng riêng của loài Rh glutinis, tên gọi Rh rubra ở một số tài liệu hiện nay không còn nữa và đã được thay bằng tên mới là Rh mucilaginosa [75]

1.1.2 Phân bố [12], [24], [34], [38]

Như các loại nấm men khác, Rhodotorula thuộc cơ thể đơn bào Chúng phân

bố rộng rãi ở khắp nơi và thực tế trên thế giới cũng như ở Việt Nam, người ta đã

tiến hành phân lập được Rhodotorula ở mọi nơi trên mặt đất và trong không khí

Ở thực vật: nấm men Rhodotorula (Rh glutinis, Rh municlaginosa,…) là

giống thường sinh sống trên bề mặt lá cây Nấm men có nhiều sắc tố trên bề mặt lá

và theo Dickinson chính các sắc tố từ vi sinh vật có khả năng bảo vệ bề mặt lá dưới tác dụng trực tiếp của ánh sáng mặt trời Cũng theo Dickinson (1976, 1982) nấm

men Rhodotorula thường cư trú trên các loại hoa, mật hoa do các loại hoa có hàm

lượng đường cao nên rất thích hợp cho sự sống của nấm men này

Cho đến nay chưa có tài liệu nào nói về độc tố của nấm men Rhodotorula Tuy nhiên, đối với thực vật Rhodotorula glutinis thường gây ra bệnh đỏ ở táo, rượu táo Theo Thomas J Burr loại nấm men Rh glutinis thường sống trên táo (cùng với

Theo Wiles nấm men Rhodotorula cùng với các nấm men dại như

Hansenula, Candida, Torulopsis, Pichia và Brettanomyces là những nấm men

không mong muốn làm ảnh hưởng đến chất lượng bia Carr và cộng sự (1979 – 1980) cho biết các nấm men phân lập từ hạt ca cao thu được từ quá trình lên men

hạt ca cao tươi có sự hiện diện của Rhodotorula sp Khi khảo sát ảnh hưởng của các

yếu tố như: độ thoáng khí, pH, nồng độ ethanol, nồng độ cơ chất thích hợp cho quá trình lên men ca cao, Carr cho rằng trong tự nhiên có nhiều nấm men có khả năng

lên men ca cao, trong số đó có Rhodotorula sp có khả năng lên men bán rắn

Trong đất: giống nấm men Rhodotorula thường sống nhiều trong đất, đặc

biệt là đất bị nhiễm dầu hay ngay trong nguồn dầu mỏ, các hydrocarbon mạch dài Ngoài ra, chúng ta cũng có thể tìm thấy chúng trên da ẩm, xung quanh môi trường sống như từ các thảm trải, vữa từ bồn tắm và bàn chải đánh răng

1.1.3 Hình thái, kích thước tế bào

Khuẩn lạc phát triển nhanh, bề mặt trơn nhẵn, bóng sáng hoặc mờ đục, đôi khi ghồ ghề, mịn và nhớt Mép khuẩn lạc không có răng cưa Khuẩn lạc có màu từ kem, hồng đến đỏ san hô cũng có khi có màu vàng và đỏ cam Kích thước khuẩn lạc tùy thuộc vào môi trường dinh dưỡng và nhiệt độ nuôi cấy Quan sát dưới kính hiển

vi không thấy có sự hình thành sợi nấm, một số loài có sinh sợi nấm giả nhưng rất

kém phát triển, không hình thành bào tử túi [3], [4], [18], [23], [42], [67]

Hình 1.1 Khuẩn lạc Rh mucilaginosa và Khuẩn lạc Rh glutinis [11]

Rhodotorula có nhiều hình dạng khác nhau tùy thuộc vào điều kiện nuôi cấy

Hình dạng của nó gồm: hình trứng, hình dài, elip, hình tròn cầu và hình gậy

Rhodotorula có khuẩn lạc trơn, mềm, có màu từ kem đến vàng hoặc đỏ

Tế bào nấm men Rhodotorula ở dạng đơn bào, quan sát dưới kính hiển vi có

dạng hình tròn, oval, elip đến dạng thon dài hoặc hình gậy Kích thước tế bào dao động trong khoảng 2 – 5 μm chiều rộng; 2,5 – 10 μm chiều dài [4], [67]

Hình 1.2 Tế bào nấm men Rhodotorula glutinis [11]

1.1.4 Đặc điểm sinh hóa

Nấm men Rhodotorula có một số đặc tính sinh hoá sau:

- Không lên men các loại đường như: D-glucose, D-galactose, maltose, α-D glucoide, saccharose, trehalose và nhiều loại đường khác nhưng chúng lại sử dụng các loại đường này để cung cấp nguồn carbon cho việc xây dựng tế bào Vài nấm

men thuộc giống Rhodotorula có khả năng lên men sinh ra CO2 (khí gây ra hiện tượng sủi bọt) và có hoạt tính polygalacturonase – enzyme có khả năng thủy phân pectin (Vaughn et al., 1969; Vaughn et al., 1972) [58], [66], [67]

- Tạo ra ezyme urease

- Đồng hoá DBB (Diazonium Blue B)

- Không tạo thành hợp chất loại tinh bột

- Không tạo ra acid acetic

- Không đồng hoá được inositol, đây là nét đặc trưng cơ bản nhất của

Rhodotorula khác với các giống nấm men Cryptococus, Candida [23], [65]

- Có hoạt tính protease ngoại bào trên các nguồn cơ chất khác nhau

- Không sinh enzyme alpha-amylase, amyloglusidase và enzyme thủy phân xellulose [32], [46]

- Có chứa enzyme D-amino-acid oxidase (EC 1.4.3.3) [59], [70], [72]

- Có chứa các enzyme khử bão hòa (desaturase) đặc biệt có khả năng chuyển hóa acid oleic (C 18:1) thành acid linolenic (C18:3) [71]

- Khả năng sinh tổng hợp sắc tố carotenoid

Nấm men Rhodotorula còn được gọi là vi sinh vật sinh sắc tố carotenoid (carotengensis) Các sắc tố carotenoid chính trong nấm men Rhodotorula là: β-

carotene, torularhodin và torulene Đã có nhiều công trình nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp sắc tố carotenoid trên nhiều các nguồn cơ chất khác nhau

1.1.5 Cấu tạo và sinh sản của nấm men Rhodotorula [12]

Manan là hợp chất cao phân tử của D – manose, mỗi phân tử thường chứa

200 – 400 thành phần manose Thường manan liên kết với protide theo tỷ lệ 2:1 Manan thường có mối liên kết α – 1,6; α – 1,3; β – 1,6 Phân tử lượng của chúng khoảng 5.104

• Glucan:

Glucan là hợp chất cao phân tử của D – glucose Đó là một polysaccharide phân nhánh có liên kết β – 1,3 và β – 1,6 Cả hai thành phần này phân bố đều trên thành tế bào

Thành phần gồm: nước, protide, lipide, glucide, muối khoáng và enzyme

Tế bào chất luôn luôn chuyển động, thường chuyển động một chiều xung quanh thành tế bào Ngoài ra, nó còn phụ thuộc vào trạng thái của nấm men, khi hô hấp thì đồng nhất và khi lên men thì lổn nhổn

™ Nhân:

Ở nấm men Rhodotorula thì đã có nhân thật, nhân hình bầu dục hay hình

cầu, nó được bao bọc bởi lớp màng bên trong là lớp dịch nhân

™ Các thành phần khác:

Không bào là nơi chứa đựng protease

Volutin không phải là thành phần cấu trúc tế bào, chúng xuất hiện ở những điều kiện đặc biệt như khi nuôi cấy trên môi trường carbohydrate và phosphate vô cơ Số lượng volutin còn phụ thuộc vào tỷ lệ C:N và sự có mặt của S cũng như của vitamin Volutin đóng vai trò quan trọng sau:

¾ Là chất dự trữ năng lượng cho tế bào

¾ Tham gia điều hòa sinh trưởng, phát triển của tế bào

¾ Làm nguồn năng lượng cho tế bào

1.1.5.2 Sinh sản

Đa số nấm men Rhodotorula sinh sản bằng cách nảy chồi đa cực, trừ một số loài như: Rh pilimanae, Rh pilati, Rh javanti, Rh ingniosa, Rh difuens và Rh

bogoriensis là nảy chồi có cực Ngoài ra, Rhodotorula còn sinh sản theo kiểu hữu

tính Tốc độ sinh sản của Rhodotorula nhanh, thời gian để số tế bào tăng gấp đôi là

từ 2 – 6 giờ [23], [67] Quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm men gồm bốn giai đoạn: giai đoạn thích nghi, giai đoạn phát triển, giai đoạn ổn định và giai đoạn diệt vong Đầu tiên hạch dài ra và bắt đầu thắt lại ở giữa Tế bào mẹ bắt đầu phát triển một chồi con Một phần hạch chuyển động vào chồi, một phần ở tế bào mẹ, đồng thời một phần nguyên sinh chất cũng sang chồi con Chồi con lớn dần, khi chồi con bằng chồi mẹ nó tách ra sống riêng lẻ Từ một tế bào mẹ tạo một hoặc nhiều chồi con, các chồi con sắp xếp trên tế bào không nhất thiết cùng một vị trí

Thời gian sinh trưởng tốt nhất của Rhodotorula trong khoảng 24 – 96 giờ tùy

loài, tùy thuộc vào thành phần môi trường dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy Trong

mối quan hệ cộng sinh với các vi sinh vật khác, nấm men Rhodotorula có thể đạt

tốc độ tăng trưởng cực đại sau 5 – 6 ngày [33], [39] Theo các tài liệu sự sinh tổng hợp carotenoid thường song song với sự phát triển của tế bào và đạt cực đại vào cuối giai đoạn cân bằng [38], [43]

1.1.6 Các nghiên cứu về nấm men Rhodotorula [6], [11], [12], [24], [25], [40]

Nguyễn Thị Minh Nguyệt (2001) đã nghiên cứu về đặc điểm sinh học và khả

năng tạo sinh khối từ rỉ đường mía của chủng nấm men Rhodotorula sp Đã tối ưu

• Thời gian nuôi cấy 36 giờ

Sinh khối thu được đạt hiệu suất 10,9 g/l môi trường, có hàm lượng protein 55,76 g/100g sinh khối khô và có mặt hầu như đầy đủ các acid amin không thay thế Sinh khối thu được có hàm lượng chất béo cao (3,034 g/100g sinh khối khô) trong

đó các acid béo không no (C 18:1 và C 18:2) chiếm tỷ lệ cao

Phạm Xuân Hưng (2003) đã khảo sát các thành phần sinh hóa trong sinh khối

nấm men Rhodotorula sp và thử nghiệm bổ sung vào bột dinh dưỡng trẻ em

Hayman Ernest P (1994) nuôi cấy men Rh glutinis trong môi trường gồm:

5% glucose và 0,5% chất chiết nấm men, ở 280C Đặt thiết bị lên men ở phòng lạnh nhiệt độ 40C và nuôi cấy trong 24 giờ Thu nhận tế bào bằng ly tâm và rửa nhiều lần bằng nước cất Tế bào sau khi rửa tạo lại dịch huyền phù bằng cách khuấy trong dung dịch nước muối 0,85% Sau đó phá vỡ tế bào bằng cách sấy chân không và nghiền bằng bột thủy tinh (có đường kính trung bình 120μm), quá trình phá vỡ thực hiện trong hệ dung môi gồm acetone: light petroleum (tỷ lệ thể tích là 75:25) Lắc đều trong 20 phút Trích ly nhiều lần trong hệ dung môi acetone: light petroleum, dùng phương pháp phân tích HPLC để phân tích carotenoide

Theo Bhosale Prakash, R.V.Gadre (2003) đã làm tăng lượng β-carotene bằng

chủng đột biến từ chủng Rh glutinis NCIM 3353 với các tác nhân đột biến là tia

UV, nuôi trong môi trường nước biển, lượng carotenoide tổng thu được là 86mg/l so với môi trường nước cất là 70mg/l Lượng β-carotene tăng gấp 3 lần nhưng đồng thời lượng torulene lại giảm 2,3 lần Đây là kết quả đáng quan tâm vì β-carotene công dụng hơn nhiều so với torulene (Edge et al., 1997; Hennekens 1997)

Trong điều kiện môi trường muối theo tài liệu (Zalashko et al., 1984) cho thấy làm gia tăng hàm lượng acid béo, sterol và triglycerides nhưng đây là công bố đầu tiên về sự gia tăng hàm lượng β-carotene Điều này có thể là do sự tạo vòng γ - carotene sang β-carotene được kích thích bởi các muối kim loại

Theo Bindu S và cộng sự (1998), đã xác định được hoạt tính của phytase

trong nấm men Rhodotorula gracilis bằng phương pháp lạnh đông và sốc nhiệt với

hoạt tính 77,26 UI/g tế bào có thể dùng làm nguồn phytase bổ sung trong thức ăn vật nuôi làm tăng khả năng hấp thu photpho

Buzzini và cộng sự (2001) đã công bố kết quả nghiên cứu sản xuất

carotenoide trên môi trường nước mật ngô bằng cách nuôi cấy nấm men Rh glutinis

DBVPG 3853 kết hợp với nấm men có khả năng thuỷ phân tinh bột là Debaryomyces castellii 3503 theo phương pháp lên men gián đoạn và bán liên tục

1.2 PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN BÁN RẮN [11]

Các công bố về khả năng lên men bán rắn của giống nấm men Rhodotorula

không nhiều Tuy nhiên theo các tài liệu thu được bước đầu cho thấy giống nấm men này có khả năng lên men bán rắn Nghiên cứu gần nhất là của Jacob (1991) đã

thành công khi lên men bán rắn nấm men Rhodotorula gracilis trên môi trường cơ chất là cám mì có bổ sung dinh dưỡng Theo Jacob nấm men dầu Rh gracilis có khả

năng hình thành lượng sinh khối cao hơn (13,7g/l) và chất béo (20,3%) trên môi trường nghèo nitrogen, rẻ tiền và mang lại hiệu quả kinh tế cao đó là rỉ đường không chứa dịch chiết nấm men bằng phương pháp lên men chìm Tuy nhiên khi tiến hành lên men bán rắn trên cơ chất cám mì có bổ sung các nguồn dinh dưỡng khác nhau có ảnh hưởng đến lượng sinh khối, protein tạo thành, sự hình thành dầu,

sự hiện diện của các acid béo và tỷ lệ giữa acid béo bão hòa và không bão hòa Hàm lượng lipid ban đầu trong môi trường điều khiển là 3,5% trong khi với môi trường cám mì, mật rỉ có bổ sung khoáng chất tăng lên đến 69,8% Sản phẩm sau lên men bán rắn chứa sắc tố đỏ carotenoide, tiền vitamin B12 và một số acid béo bão hòa

1.2.1 Đặc điểm của phương pháp lên men bán rắn [11]

Theo Johns và Stuart, khi nuôi cấy chủng Monascus trên môi trường bán rắn

sẽ cho lượng sắc tố nhiều hơn trong môi trường dịch thể, nguyên nhân là do sắc tố được giải phóng ra khỏi sợi nấm ở môi trường rắn tốt hơn trong môi trường lỏng, quá trình tạo sắc tố trong môi trường rắn là do sự khuếch tán của các sắc tố nội bào vào trong vùng bao quanh thể rắn

Phương pháp lên men bán rắn có nhiều thuận lợi khi sản xuất sắc tố của

Monascus bởi vì lên men bán rắn cho môi trường dinh dưỡng đầy đủ hơn, sắc tố

được tạo ra nhiều và chi phí thực hiện thấp Phương pháp này có lợi nhất vì sắc tố thu được còn có thể chứa những cơ chất thừa như tinh bột và chất xơ trong chính bản thân sợi nấm

Trong lên men bán rắn, sắc tố của Monascus tạo ra tăng gấp 3 lần so với môi

trường dịch thể với cùng điều kiện Với các tài liệu tổng quan được về khả năng

sinh tổng hợp sắc tố đỏ từ mốc Monascus, chúng tôi thử nghiệm nghiên cứu về khả

năng hình thành sinh khối tế bào cũng như sinh tổng hợp chất màu beta-carotene

trên môi trường bán rắn đối với nấm men Rhodotorula

Hiện nay các công bố về nuôi cấy bán rắn nấm men Rhodotorula là hầu như

không có; do đó đây là hướng nghiên cứu được xem là khá mới

1.2.2 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến quá trình lên men bán rắn

Quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm men Rhodotorula chịu ảnh

hưởng của nhiều yếu tố thuộc môi trường dinh dưỡng (nguồn carbon, nguồn nitrogen, nguồn khoáng đa lượng và vi lượng) và điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, pH, ánh sáng, hàm lượng oxy hòa tan ); do đó cần tìm hiểu các ảnh hưởng của các yếu

tố này để điều khiển quá trình nuôi cấy theo mục tiêu đặt ra

1.2.2.1 Ảnh hưởng của nguồn nitơ [39]

Theo nghiên cứu của nhiều tác giả thì ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sự tổng

hợp carotenoide của nấm men Rhodotorula có quan hệ đặc biệt với khả năng sử

dụng các nguồn nitơ

Nakagawa và Tatsumi (1960) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn

nitrogen khác nhau và nhận thấy nấm men Rh-100 cho sản lượng carotenoide cao

nhất với nguồn nitrogen là valine, leucine và asparagine, tỷ lệ nguồn C/N tốt nhất là

50 Vecher và cộng sự khi dùng nguồn nitrogen là lysine và glutamic acid cho thấy

loài Rh gracilis phát triển và hình thành carotene tốt Theo Dyr và Praus (1955) khả

năng sinh tổng hợp carotene của nấm men Rh gracilis chịu ảnh hưởng bởi nguồn

nitrogen là ammonium nitrate nhưng không bị ảnh hưởng bởi glycine, valine,

asparagines và leucine Khaled M.Ghanem và cộng sự (1990) hàm lượng nitrogen

trong môi trường nuôi cấy ảnh hưởng lớn đến hàm lượng chất béo tạo thành và chất

béo đạt cực đại khi nồng độ (NH4)2SO4 là 5g/l, tuy nhiên lượng chất béo tạo thành

bị giảm đi khi tăng nitrogen Điều này tương tự với quá trình trao đổi chất được ghi

nhận ở nhiều loài nấm men và nấm mốc khác nhau [56]

Bảng 1.1 Ảnh hưởng của nguồn nitrogen trong môi trường đến sự phát triển và

khả năng tổng hợp chất béo của nấm men Rh glutinis [11]

Chất béo Nguồn

nitrogen

pH sau cùng

Tiêu thụ đường (%)

Trọng lượng khô (mg) Trọng lượng khô (mg) Sinh khối khô %

Asparagine 7,0 81,3 1756 416 23,7 11,5 L-cystine 6,5 86,6 2125 312 14,7 8,1

Ghi chú: LCC*: Hệ số chuyển hóa chất béo (The lipid conversion coefficient) Hệ

số chuyển hóa chất béo = (mg lipid /mg đường tiêu thụ) x100

Hàm lượng nitrogen trong môi trường nuôi cấy ảnh hưởng lớn đến lượng

lipid tạo thành và lipid đạt cực đại khi nồng độ (NH4)2SO4 là 5g/l

Bảng 1.2 Ảnh hưởng của nồng độ (NH 4 ) 2 SO 4 trong môi trường đến sự phát triển và

khả năng tổng hợp chất béo của nấm men Rh glutinis [11]

Chất béo Lượng

(NH 4 ) 2 SO 4

(g/l)

Hàm lượng đường tổng (%)

1.2.2.2 Ảnh hưởng của nguồn carbon [36], [38], [39]

Nguồn carbon ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của khuẩn lạc, khả năng

tổng hợp và thành phần các sắc tố carotenoide cũng như sự tích lũy sinh khối, các

acid béo của giống nấm men Rhodotorula Theo Wittmann (1957) nấm men Rh

rubra cho hiệu suất tổng hợp torularhodin trên môi trường có nguồn nitrogen là

asparagine và nguồn carbon là glycerol, nhưng với nguồn carbon là sucrose cho

hiệu suất cao nhất là torulene, β -carotene, γ-carotene và sản lượng carotene cao

nhất phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy Nấm men Rh rubra có khả năng cho hàm

lượng sinh khối tế bào cao nhất trên nguồn carbon là glucose nhưng khi sử dụng

đường fructose, glycerol và sucrose thu được hàm lượng torularhodin và β

-carotene cao hơn so với khi dùng glucose, ngược lại glycerol lại kém hơn glucose ở

khả năng hình thành torulene Một số nghiên cứu cho thấy nấm men Rhodotorula có

khả năng sử dụng nguồn carbon là các hydrocarbon mạch thẳng (Nikolaev và cộng

sự, 1966; Vaskivnyuk và Kvasnikov, 1968)

1.2.2.3 Vai trò của các muối [23], [43], [56]

Theo Zalashko và cộng sự (1984) cho rằng trong môi trường, muối làm gia

tăng hàm lượng acid béo, sterol và triglyceride Các tác giả Bhosale P., Grade R.V

cũng kết luận rằng chủng đột biến Rh glutinis mutant 32 cần phải được cung cấp

thêm các khoáng chất là K2HPO4 và MgSO4.7H2O vào môi trường nhân giống lẫn môi trường nuôi cấy khi tiến hành lên men nuôi cấy thu nhận sắc tố carotenoide

Một số loài nấm men thuộc giống Rhodotorula bị ức chế ở nồng độ muối

trên 5%, hiện tượng này đã giải thích vì sao khả năng lên men của các nấm men càng thấp khi ở nồng độ muối càng cao Các tài liệu cho thấy nhiều loài nấm men

thuộc giống Rhodotorula khá thích hợp với môi trường nước biển, môi trường muối

kim loại kiềm

Khi môi trường không có NaH2PO4 nấm men phát triển yếu và hàm lượng lipid thấp Ở nồng độ NaH2PO4 0,5g/l hiệu suất lên men cao nhất Mặt khác thay đổi hàm lượng các muối K2SO4, ZnSO4.7H2O và FeCl3 (cùng một thời điểm) trong môi trường nuôi cấy hầu hết các thí nghiệm cho thấy các muối này không ảnh hưởng đến hoạt lực lên men Ở các nồng độ muối MgSO4.7H2O bổ sung vào môi trường nuôi cấy cũng không có dấu hiệu cho thấy muối này ảnh hưởng nhiều đến hoạt lực men Điều này có thể giải thích là beet molasses (BM) đã có sẵn các loại muối này

và đủ để cung cấp cho hoạt động trao đổi chất bình thường của nấm men, do đó không cần bổ sung thêm vào môi trường nuôi cấy

1.2.3 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến quá trình lên men bán rắn (Solid

State Fermentation: SSF) [11]

Quá trình lên men bán rắn liên quan đến sự phát triển vi sinh vật xảy ra trong các phần tử rắn nhỏ ẩm của lớp cơ chất, trong đó có một phần hay nhiều phân tử nước tự do trên bề mặt của các phần tử cơ chất rắn Cơ chất rắn sử dụng trong lên men bán rắn là những vật liệu hỗn hợp không đồng nhất, thường là các phế phụ phẩm của ngành công nghệ thực phẩm Nuôi cấy bán rắn thường tiến hành trên các khay, các túi nhựa plastic hay các ống hình trụ và không nhất thiết phải thanh trùng

môi trường Quá trình SSF cho đến nay vẫn chưa được công bố rõ ràng về các quy luật của kỹ thuật sinh học, hóa sinh, vi sinh và sinh học phân tử

1.2.3.1 Độ ẩm và hoạt độ nước a w

Hàm lượng nước sử dụng trong SSF có ý nghĩa thực tiễn cao trong công nghiệp do giảm được lượng nước thải rất nhiều so với lên men dịch thể Trong phương pháp SSF có thể xem sự tăng trưởng và phát triển của vi sinh vật trên cơ chất rắn không có sự hiện diện của nước tự do Nước trong hệ thống tồn tại dưới dạng phức trong cơ chất hoặc chỉ là một lớp mỏng được hấp phụ trên bề mặt của phân tử hoặc được liên kết nhẹ trong vùng mao mạch của cơ chất Khi nước trong

cơ chất quá cao sẽ hình thành nước tự do Hàm ẩm trong SSF ảnh hưởng đáng kể đến sự tăng trưởng của vi sinh vật, không có mức độ ẩm tối ưu cho toàn bộ cơ chất

và vi sinh vật, thường độ ẩm thay đổi từ 50 – 85% Do đó đòi hỏi hàm lượng nước của vi sinh vật thể hiện ở dạng hoạt độ (aw) Việc giảm aw sẽ ảnh hưởng đến tăng trưởng của vi sinh vật, pha lag kéo dài, giảm tỷ lệ tăng trưởng và kết quả dẫn đến

lượng sinh khối bị thấp (Oriol et al., 1988)

1.2.3.2 pH ban đầu

Chưa có tài liệu công bố về lên men bán rắn với nấm men Rhodotorula Tuy

nhiên theo ghi nhận được từ lên men dịch thể, cho thấy nấm men Rhodotorula thích

hợp ở pH hơi acid từ 4 – 6 tùy theo điều kiện nuôi cấy

1.2.3.3 Nhiệt độ và sự truyền nhiệt

Do cơ chất rắn có khả năng truyền nhiệt kém nên khi vi sinh vật phát triển sẽ

tạo ra một gradient về nhiệt Sự tích tụ nhiệt và làm tăng hàm lượng ẩm của các chất rắn hữu cơ trong SSF đã gây ra những khó khăn trong sự phân bố nhiệt, ẩm đồng đều Tìm ra biện pháp giảm nhiệt là yếu tố chủ yếu của SSF theo quy mô công nghiệp Do cơ chất rắn dẫn nhiệt kém nên các phương pháp làm lạnh bằng dẫn truyền hay bằng đối lưu thường không phù hợp Phương pháp làm lạnh bằng bốc hơi có khả năng làm giảm nhiệt độ của môi trường hiệu quả nhất do làm thông khí,

cung cấp oxy cho vi sinh vật tăng trưởng và loại bỏ CO2 Ngoài ra, nó còn có chức năng trong việc truyền hơi ẩm và nhiệt giữa các lớp cơ chất và không khí

1.2.3.4 Ảnh hưởng của môi trường không khí [24], [38], [39]

Sự thông khí trong SSF thực hiện 4 chức năng sau: duy trì điều kiện hiếu khí;

đuổi CO2 ra khỏi môi trường; duy trì nhiệt độ cho cơ chất; điều hòa mức độ ẩm Năm 1992, Han và Mudgett nhận thấy rằng mức cân bằng của O2 và CO2

trong không khí có ý nghĩa rất lớn đến sự tạo thành sắc tố và cũng ảnh hưởng đến

sự tăng trưởng của nấm men khi nuôi trên môi trường bán rắn

Nấm men này không thể sống trong điều kiện kỵ khí khi sử dụng glucose như cơ chất Tuy nhiên có thể sống trong điều kiện O2 thấp Trong điều kiện thiếu oxy, có sự tạo thành nhiều ethalnol, CO2 và lượng sắc tố được tạo ra ít hơn

1.2.3.5 Ảnh hưởng của ánh sáng [57]

Các sắc tố trong tế bào nấm men Rhodotorula được tạo thành bắt đầu vào

cuối giai đoạn phát triển và phụ thuộc vào ánh sáng Ở nhiệt độ thấp khoảng 200C hàm lựơng β -carotene khi được chiếu sáng tăng không đáng kể so với khi không

được chiếu sáng Theo Tada Mikiro và cộng sự (1982) nấm men Rhodotorula

minuta là loài ít có khả năng sinh tổng hợp sắc tố carotenoid trong tối, khi tế bào

được chiếu sáng sự hình thành carotenoid và sinh khối tế bào tăng gần như tuyến tính sau 70 giờ nuôi cấy

1.3.4 Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp lên men bán rắn so với lên men dịch thể [62]

Khó khăn trong quá trình kiểm soát về pH, hàm lượng không khí,…

1.4 CƠ CHẾ SINH TỔNG HỢP SẮC TỐ CAROTENOID Ở VI SINH VẬT 1.4.1 Khả năng sinh tổng hợp sắc tố carotenoid

Theo công bố của Dur – Prans (1955), Bujak (1961), Trophimenco (1963), Krauze (1966), Bhuyan và Rahman (1984), Cabello-Valasco (1986), Costa (1987),… giống nấm men này được xem là hướng nghiên cứu khả thi của các nhà khoa học về khả năng sinh tổng hợp carotenoid và đặc biệt là beta-carotene Cho đến nay vẫn còn nhiều nghiên cứu đang thực hiện về khả năng sinh tổng hợp sắc tố này trong các môi trường khác nhau Các sắc tố carotenoid chính trong nấm men

Rhodotorula là: β-carotene, torularhodin và torulene

Từ trước, việc thu nhận carotenoid của nấm men Rhodotorula hầu hết đều nuôi cấy trong môi trường dịch thể và chủ yếu nghiên cứu ở các loài Rh glutinis,

Rh rubra, Rh gracilis Do nấm men Rhodotorula gần như không có hệ enzyme

thủy phân tinh bột nên chúng rất khó khăn trong việc đồng hóa nguồn nguyên liệu giàu tinh bột, tuy nhiên các nghiên cứu gần đây của Buzzini và cộng sự đã khắc phục được khó khăn này bằng phương pháp nuôi cấy phối hợp giống nấm men

Rhodotorula với một giống nấm men khác có khả năng thủy phân tinh bột cao Cho

đến nay chưa tìm thấy công bố nào về nghiên cứu sản xuất carotenoid trên môi trường bán rắn, tuy nhiên trên cở sở các tài liệu tổng kết được nuôi cấy phối giống

nấm men Rhodotorula với một vi sinh vật khác có khả năng thủy phân tinh bột theo

hướng làm tăng đáng kể hàm lượng carotenoid đặc biệt là beta-carotene từ các nguồn nguyên liệu thô là một hướng nghiên cứu mới

1.4.2 Cơ chế sinh tổng hợp sắc tố carotenoid

Toàn bộ quá trình sinh tổng hợp sắc tố carotenoid của nấm men có thể chia thành 3 giai đoạn: giai đoạn cảm ứng ánh sáng (tối thiểu 12 giờ), giai đoạn tổng hợp enzyme – giai đoạn này xảy ra trong tối và giai đoạn tổng hợp carotenoid phụ thuộc vào ánh sáng Điều này phù hợp với nghiên cứu của Kocková-Kratochvílova và cộng sự là màu của nấm men sinh sắc tố tăng lên rất nhiều so với màu của các giống nấm men trắng khi sống ở vùng có tia cực tím mạnh Tuy nhiên ở cường độ bức xạ

quá cao, các sắc tố carotenoid không có khả năng che chở cho cơ thể sinh vật [52]

Giai đoạn đầu tiên hình thành các tiền terpenoids gồm 5 carbon ban đầu Giai đoạn hai là giai đoạn hình thành các hợp chất C40 Giai đoạn cuối cùng là thay đổi chuỗi C40 trong hệ thống các carotenoids Có nhiều hệ enzyme khác nhau được sử dụng vào giai đoạn cuối của quá trình tổng hợp các sterol và carotenoid, chúng có

chung con đường là thông qua farnesyl pyrophosphate Giống Rhodotorula thông

qua tổng hợp acid mevalonic phù hợp với sự hình thành carotene của nấm men và tương tự với con đường tổng hợp carotene của các vi sinh vật sinh sắc tố carotenoid khác (Scharf và Simpson, 1968)

Zopf (1890) là người đầu tiên định ra tính chất các sắc tố tan trong chất béo

các nấm men đỏ Lederer (1933) đã trích ly sắc tố từ nấm men Rh rubra và tìm ra

bốn sắc tố: một sắc tố có tính acid (sau này có thể là torularhodin); torulin (torulene); β-carotene và một sắc tố không bền Lederer (1933) đề nghị công thức torulene là 3,3’-dimethoxy-γ-carotene Sau đó Ruegg và cộng sự (1961) đã tổng hợp được torulene và đã xác định 3’,4’-dehydro-γ-carotene Lúc đầu torularhodin được cho là một apocarotene (C47), nhưng Ruegg và cộng sự (1958) đã tổng hợp được và xác định là 3’,4’-dehydro-17’-γ-carotenoic acid Thêm vào đó, các tác giả này phát hiện ra một lượng lớn γ-carotene và lycopene Kết quả này trùng với các nghiên cứu sau này bằng phân tích HPLC để xác định các sắc tố chính có trong nấm men

Rhodotorula [27], [37]

Carotenoid là một loại hợp chất isoprenoid được sinh tổng hợp từ acetyl

được dẫn ra trong hình [1.3] và [1.4] Giai đoạn tạo các carotenoid bắt đầu với sự tạo thành hợp chất C40 đầu tiên, phyotene, từ hai phân tử geranylgeranyl diphosphate (GGDP)

Hình 1.3 Con đường sinh tổng hợp carotenoid

Phyotene tạo thành ở dạng đồng phân 15C, có 3 nối đôi liên hợp, không có màu, sẽ chuyển hóa tiếp tục bằng những phản ứng dehydro hóa, tạo sản phẩm cuối cùng là lycopene Sơ đồ chuyển hóa theo hình [1.5]

Hình 1.5 Các phản ứng dehydro hóa trong quá trình sinh tổng hợp caroteniod

Sau cùng, lycopene tiếp tục đóng vòng ở một hoặc hai đầu tạo ra các sản phẩm carotene như γ-carotene, δ-carotene (đơn vòng), β-carotene, α-carotene, ε-carotene (hai vòng) Sơ đồ theo hình [1.6]

Hình 1.6 Tổng hợp carotenoid có vòng từ lycopene

Các hợp chất carotene chứa nhóm chức chứa oxy như hydroxyl, epoxy, methoxy, thường tổng hợp vào giai đoạn cuối cùng Ngoài ra, cũng có thể xảy ra phản ứng cắt một phần đầu phân tử carotene để tạo thành apocarotenoid

B ß-CAROTENE

1.5 ß-CAROTENE VÀ TẦM QUAN TRỌNG CỦA NÓ

1.5.1 Giới thiệu về ß-Carotene (tiền vitamin A) [76]

Hình 1.7 Beta-carotene trong không gian 3 chiều

Beta – carotene thường được biết đến dưới tên gọi là tiền vitamin A Năm

1907, công thức phân tử của beta – carotene được Willstatter và Mieg đưa ra:

1.5.2 Tầm quan trọng của ß-Carotene đối với sức khỏe [76]

ß-Carotene hay còn gọi là tiền vitamin A mà phân tử vitamin A khi oxy hóa gốc aldehyt của nó sẽ hình thành nên một chất mới có tên là opsin, là chất tham gia vào cấu tạo của mắt Do đó, ß-Carotene có ảnh hưởng tốt đến thị lực

Ngoài ra, ß-Carotene còn tham gia quá trình sinh tổng hợp glycoprotein, chất

mà nếu thiếu hụt trong cơ thể dẫn đến sự phát triển không bình thường của xương

ß-Carotene còn được tìm thấy trong huyết tương người Các nghiên cứu về sức khỏe y học đã cho thấy những người có lượng β-carotene đưa vào cơ thể cao và

có một lượng lớn β-carotene trong huyết tương thì có khả năng giảm thiểu các mối