Phân lập, xác định cấu trúc và xác định hoạt tính sinh học của các hoạt chất từ loài Sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu) (Luận văn thạc sĩ)

Phân lập, xác định cấu trúc và xác định hoạt tính sinh học của các hoạt chất từ loài Sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu) (Luận văn thạc sĩ)Phân lập, xác định cấu trúc và xác định hoạt tính sinh học của các hoạt chất từ loài Sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu) (Luận văn thạc sĩ)Phân lập, xác định cấu trúc và xác định hoạt tính sinh học của các hoạt chất từ loài Sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu) (Luận văn thạc sĩ)Phân lập, xác định cấu trúc và xác định hoạt tính sinh học của các hoạt chất từ loài Sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu) (Luận văn thạc sĩ)Phân lập, xác định cấu trúc và xác định hoạt tính sinh học của các hoạt chất từ loài Sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu) (Luận văn thạc sĩ)Phân lập, xác định cấu trúc và xác định hoạt tính sinh học của các hoạt chất từ loài Sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu) (Luận văn thạc sĩ)Phân lập, xác định cấu trúc và xác định hoạt tính sinh học của các hoạt chất từ loài Sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu) (Luận văn thạc sĩ)Phân lập, xác định cấu trúc và xác định hoạt tính sinh học của các hoạt chất từ loài Sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu) (Luận văn thạc sĩ)Phân lập, xác định cấu trúc và xác định hoạt tính sinh học của các hoạt chất từ loài Sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu) (Luận văn thạc sĩ)Phân lập, xác định cấu trúc và xác định hoạt tính sinh học của các hoạt chất từ loài Sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu) (Luận văn thạc sĩ)Phân lập, xác định cấu trúc và xác định hoạt tính sinh học của các hoạt chất từ loài Sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu) (Luận văn thạc sĩ)Phân lập, xác định cấu trúc và xác định hoạt tính sinh học của các hoạt chất từ loài Sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu) (Luận văn thạc sĩ)Phân lập, xác định cấu trúc và xác định hoạt tính sinh học của các hoạt chất từ loài Sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu) (Luận văn thạc sĩ)Phân lập, xác định cấu trúc và xác định hoạt tính sinh học của các hoạt chất từ loài Sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu) (Luận văn thạc sĩ)Phân lập, xác định cấu trúc và xác định hoạt tính sinh học của các hoạt chất từ loài Sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu) (Luận văn thạc sĩ)Phân lập, xác định cấu trúc và xác định hoạt tính sinh học của các hoạt chất từ loài Sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu) (Luận văn thạc sĩ)Phân lập, xác định cấu trúc và xác định hoạt tính sinh học của các hoạt chất từ loài Sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu) (Luận văn thạc sĩ)Phân lập, xác định cấu trúc và xác định hoạt tính sinh học của các hoạt chất từ loài Sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu) (Luận văn thạc sĩ)Phân lập, xác định cấu trúc và xác định hoạt tính sinh học của các hoạt chất từ loài Sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu) (Luận văn thạc sĩ)Phân lập, xác định cấu trúc và xác định hoạt tính sinh học của các hoạt chất từ loài Sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu) (Luận văn thạc sĩ)Phân lập, xác định cấu trúc và xác định hoạt tính sinh học của các hoạt chất từ loài Sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu) (Luận văn thạc sĩ)Phân lập, xác định cấu trúc và xác định hoạt tính sinh học của các hoạt chất từ loài Sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu) (Luận văn thạc sĩ)Phân lập, xác định cấu trúc và xác định hoạt tính sinh học của các hoạt chất từ loài Sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu) (Luận văn thạc sĩ)Phân lập, xác định cấu trúc và xác định hoạt tính sinh học của các hoạt chất từ loài Sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu) (Luận văn thạc sĩ)Phân lập, xác định cấu trúc và xác định hoạt tính sinh học của các hoạt chất từ loài Sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu) (Luận văn thạc sĩ)Phân lập, xác định cấu trúc và xác định hoạt tính sinh học của các hoạt chất từ loài Sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu) (Luận văn thạc sĩ)

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -

Nguyễn Thị Thu Minh

PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG VIÊM CỦA CÁC HOẠT CHẤT PHÂN LẬP TỪ LOÀI

SA NHÂN TÍM (AMOMUM LONGILIGULARE T.L.WU)

LUẬN VĂN THẠC SĨ: HÓA HỌC

Hà Nội - 2020

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -

Nguyễn Thị Thu Minh

PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG VIÊM CỦA CÁC HOẠT CHẤT PHÂN LẬP TỪ LOÀI

SA NHÂN TÍM (AMOMUM LONGILIGULARE T.L.WU)

Chuyên ngành: Hóa Hữu cơ

Mã số: 8440114

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : Hướng dẫn : TS Nguyễn Hải Đăng

Hà Nội - 2020

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của TS Nguyễn Hải Đăng Các kết quả thu được trong luận văn hoàn toàn trung thực và chưa được ai công bố trong bất kì công trình nào khác Toàn bộ trích dẫn trong luận văn đều chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Thu Minh

Lời cảm ơn

Luận văn này được hoàn thiện tại Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Trong quá trình nghiên cứu, tác giả đã nhận được nhiều sự giúp đỡ quý báu từ thầy cô, các nhà khoa học cũng như đồng nghiệp

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến TS Nguyễn Hải Đăng là người thầy đã hướng dẫn tận tình, chu đáo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện luận văn

Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể cán bộ phòng Tổng hợp hữu cơ - Viện Hóa sinh biển đã giúp đỡ và tạo điều kiện hỗ trợ tôi trong suốt quá trình làm luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ của Học viện Khoa học

và Công nghệ, Ban lãnh đạo viện Hóa sinh biển đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn đề tài nghiên cứu cơ bản: Nghiên cứu thành

phần hóa học và hoạt tính kháng viêm, đánh giá tác dụng trên các đích sinh học phân tử của một số loài thuộc chi Amomum Mã số 104.01-2017.307 do

TS Nguyễn Hải Đăng làm chủ nhiệm, đã hỗ trợ để tôi thực hiện thành công luận văn này

Tôi xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2020

Tác giả

Nguyễn Thị Thu Minh

Danh mục các kí hiệu và chữ viết tắt

13

C-NMR Carbon -13 nuclear magnetic resonance

spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13

1

H-NMR Proton nuclear magnetic resonance

spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

EtOAc Ethyl acetate

HMBC Heteronuclear mutiple bond correlation Phổ tương tác dị hạt nhân

qua nhiều liên kết HSQC Heteronuclear single quantum

Correlation

Phổ tương tác dị hạt nhân qua 1 liên kết

TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng

TNF Tumor necrosis factor Yếu tố hoại tử khối u s: singlet d: doublet t: triplet m: multiplet brs: broad singlet dd: doublet of doublets ddd: doublet of doublet of doublets

Danh mục bảng

Bảng 3.1 Số liệu phổ 1

H-NMR của hợp chất AL1 và chất tham khảo (*) [25] 30 Bảng 3.2 Số liệu phổ 1

H-NMR, 13C-NMR của hợp chất AL2 và chất tham khảo (*) [26] 31Bảng 3.3 Số liệu phổ 1

H-NMR, 13C-NMR của hợp chất AL4 và chất tham khảo (*) [28] 33Bảng 3.4 Số liệu phổ 1

H-NMR, 13C-NMR của hợp chất AL3 và chất tham khảo (*) [27] 34Bảng 3.5 Số liệu phổ 1

H-NMR, 13C-NMR của hợp chất AL5 và chất tham khảo (*) [29] 36Bảng 3.6 Số liệu phổ 1

H, 13C-NMR của AL6 và chất tham khảo (*) [30] 38Hình 3.12 Cấu trúc hợp chất AL7 và một số tương tác HMBC chính 38Bảng 3.7 Số liệu phổ 1

H-NMR, 13C-NMR của AL7 và chất tham khảo [31] 40Bảng 3.8 So sánh phổ 1

H-NMR (500MHz, CDCl3) của hợp chất AL7, AL8

và 7-epi-α-cyperone theo tài liệu tham khảo [32] 41

Bảng 3.9 Kết quả thử hoạt tính kháng viêm của các chất sạch phân lập từ Sa nhân tím trên dòng tế bào RAW264.7 43Bảng 3.10 Giá trị IC50 hoạt tính kháng viêm theo cơ chế ức chế sự sản sinh

NO của mẫu có hoạt tính 45

Danh mục các hình vẽ, đồ thị

Hình 1.1 Sa nhân tím (a - Thân và quả, b – Cây non Sa nhân tím) 5

Hình 2.1 Cây Sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu) 16

Hình 3.1 Sơ đồ tạo cặn chiết thân Sa nhân tím 23

Hình 3.2 Sơ đồ phân lập chất sạch từ cặn dichloromethane thân Sa nhân tím 24

Hình 3.3 Sơ đồ phân lập chất sạch từ cặn ethyl acetate thân Sa nhân tím 25

Hình 3.4 Sơ đồ tạo cặn chiết quả Sa nhân tím 26

Hình 3.5 Sơ đồ phân lập các chất sạch từ cặn methanol quả Sa nhân tím 27

Hình 3.6 Cấu trúc hợp chất AL1 29

Hình 3.7 Cấu trúc hợp chất AL2 30

Hình 3.8 Cấu trúc hợp chất AL3 31

Hình 3.9 Cấu trúc hợp chất AL4 32

Hình 3.10 Cấu trúc hợp chất AL5 và một số tương tác chính trên phổ HMBC 35

Hình 3.11 Cấu trúc hợp chất AL6 và tương tác HMBC và COSY 36

Hình 3.12 Cấu trúc hợp chất AL7 và một số tương tác HMBC chính 38

Hình 3.13 Cấu trúc của hợp chất AL8 41

Hình 3.14 Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được từ Sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu) 42

Hình 3.15 Kết quả đánh giá khả năng ức chế sản sinh NO và gây độc tế bào của 8 hợp chất (%UC: % ức chế sản sinh NO, %CS: % sống sót của tế bào) 44 Hình PL1 Phổ 1

H-NMR của chất AL1 PL-2 Hình PL2 Phổ khối ESI-MS mode positive của chất AL1 PL-2 Hình PL3 Phổ 1

H-NMR của chất AL2 PL-3 Hình PL4 Phổ 13

C-NMR của chất AL2 PL-3 Hình PL5 Phổ khối ESI-MS mode positive của chất AL2 PL-3 Hình PL6 Phổ 1

H-NMR của chất AL3 PL-4 Hình PL7 Phổ 1

H-NMR giãn của chất AL3 PL-4 Hình PL8 Phổ 13

C-NMR của chất AL3 PL-5

Hình PL9 Phổ DEPT của chất AL3 PL-5 Hình PL10 Phổ khối ESI-MS mode positive của chất AL3 PL-5 Hình PL11 Phổ 1

H-NMR của chất AL4 PL-6 Hình PL12 Phổ 1

H-NMR giãn của chất AL4 PL-6 Hình PL13 Phổ 13

C-NMR của chất AL4 PL-7 Hình PL14 Phổ HSQC của hợp chất AL4 PL-7 Hình PL15 Phổ HMBC của hợp chất AL4 PL-8 Hình PL16 Phổ HMBC giãn của hợp chất AL4 PL-8 Hình PL17 Phổ khối ESI-MS mode positive của chất AL4 PL-8 Hình PL18 Phổ 1

H-NMR của chất AL5 PL-9 Hình PL19 Phổ 1

H-NMR giãn của chất AL5 PL-9 Hình PL20 Phổ 13

C-NMR của chất AL5 PL-10 Hình PL21 Phổ HSQC của chất AL5 PL-10 Hình PL22 Phổ HMBC của chất AL5 PL-11 Hình PL23 Phổ HMBC giãn của chất AL5 PL-11 Hình PL24 Phổ khối ESI-MS mode positive của chất AL5 PL-12 Hình PL25 Phổ 1

H-NMR của chất AL6 PL-12 Hình PL26 Phổ 1

H-NMR giãn của chất AL6 PL-13 Hình PL27 Phổ 1

H-NMR giãn của chất AL6 PL-13 Hình PL28 Phổ 13

C-NMR của chất AL6 PL-14 Hình PL29 Phổ DEPT của chất AL6 PL-14 Hình PL30 Phổ COSY của chất AL6 PL-15 Hình PL31 Phổ COSY giãn của chất AL6 PL-15 Hình PL32 Phổ NOESY của chất AL6 PL-16 Hình PL33 Phổ NOESY giãn của chất AL6 PL-16 Hình PL34 Phổ HMBC của chất AL6 PL-17 Hình PL35 Phổ HMBC giãn của chất AL6 PL-17 Hình PL36 Phổ HSQC của chất AL6 PL-18 Hình PL37 Phổ HSQC giãn của chất AL6 PL-18

Hình PL38 Phổ khối ESI-MS mode positive của chất AL6 PL-19

Hình PL39 Phổ 1

H-NMR của chất AL7 PL-19 Hình PL40 Phổ 1

H-NMR giãn của chất AL7 PL-20 Hình PL41 Phổ 13

C-NMR của chất AL7 PL-20 Hình PL42 Phổ DEPT của chất AL7 PL-21 Hình PL43 Phổ HMBC của chất AL7 PL-21 Hình PL44 Phổ HMBC giãn của chất AL7 PL-22 Hình PL45 Phổ HMBC giãn của chất AL7 PL-22 Hình PL46 Phổ HSQC của chất AL7 PL-23 Hình PL47 Phổ HSQC giãn của chất AL7 PL-23 Hình PL48 Phổ NOESY của chất AL7 PL-24 Hình PL49 Phổ NOESY giãn của chất AL7 PL-24

Hình PL50 Phổ khối ESI-MS mode positive của chất AL7 PL-25

Hình PL51 Phổ 1

H-NMR của hợp chất AL8 PL-25 Hình PL52 Phổ 1

H-NMR giãn của hợp chất AL8 PL-26 Hình PL53 Phổ 1

H-NMR giãn của hợp chất AL8 PL-26

Hình PL54 Phổ khối ESI-MS mode positive của chất AL8 PL-26

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 5

1.1 TỔNG QUAN VỀ LOÀI SA NHÂN TÍM (Amomum longiligulare T.L.Wu) 5

1.1.1 Đặc điểm thực vật, phân bố 5

1.1.2 Công dụng và chủ trị 6

1.1.3 Các nghiên cứu nước ngoài về Sa nhân tím 6

1.1.3.1 Thành phần hóa học 6

1.1.3.2 Hoạt tính sinh học 9

1.1.4 Các nghiên cứu trong nước về Sa nhân tím 11

1.1.4.1 Nghiên cứu về thành phần hóa học 11

1.1.4.2 Nghiên cứu về hoạt tính sinh học 12

1.2 GIỚI THIỆU VỀ KHÁNG VIÊM 13

1.2.1 Giới thiệu về quá trình viêm 13

1.2.2 Các yếu tố tham gia vào quá trình viêm 15

CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 16

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 16

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất nghiên cứu 17

2.1.2.1 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất dùng trong phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất 17

2.1.2.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất dùng trong xác định hoạt tính kháng viêm 17

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.2.1 Phương pháp phân lập các hợp chất 18

2.2.1.1 Phương pháp chiết xuất 18

2.2.1.2 Phương pháp phân lập 18

2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất 19

2.2.2.1 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR 19

2.2.2.2 Phổ khối lượng MS 19

2.2.2.3 Độ quay cực [α] 20

2.2.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm 20

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

3.1 CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT 23

3.1.1 Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ thân Sa nhân tím 23

3.1.2 Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ quả Sa nhân tím 25

3.2 THÔNG SỐ VẬT LÝ VÀ DỮ LIỆU PHỔ CỦA CÁC HỢP CHẤT ĐÃ PHÂN LẬP ĐƯỢC 28

3.2.1 Hợp chất AL1: 4-methoxycinnamic acid 28

3.2.2 Hợp chất AL2: Methyl ferulate 28

3.2.3 Hợp chất AL3: 1,7-bis-(4-hydroxyphenyl)-1,4,6-heptatrien-3-one 28

3.2.4 Hợp chất AL4: 3-hydroxy-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-propan-1-one 28

3.2.5 Hợp chất AL5: 4,4’-dihydroxy chalcone 28

3.2.6 Hợp chất AL6: Nootkatone 28

3.2.7 Hợp chất AL7: 6β-hydroxy-7-epi-α-cyperone 29

3.2.8 Hợp chất AL8: 7-epi-α-cyperone 29

3.3 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC 29

3.3.1 Hợp chất AL1: 4-methoxycinnamic acid 29

3.3.2 Hợp chất AL2: Methyl ferulate 30

3.3.3 Hợp chất AL3: 1,7-bis-(4-hydroxyphenyl)-1,4,6-heptatrien-3-one 31

3.3.4.Hợp chất AL4: 3-hydroxy-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-propan-1-one 32

3.3.5 Hợp chất AL5: 4,4’-dihydroxy chalcone 35

3.3.6 Hợp chất AL6: Nootkatone 36

3.3.7 Hợp chất AL7: 6β-hydroxy-7-epi-α-cyperone 38

3.3.8 Hợp chất AL8: 7-epi-α-cyperone 40

3.4 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM VÀ GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA CÁC CHẤT SẠCH PHÂN LẬP ĐƯỢC 43

4.1 KẾT LUẬN 46

4.2 KIẾN NGHỊ 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

MỞ ĐẦU

Việt Nam là một nước nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên

có hệ thực vật đa dạng và phong phú Theo ước tính, nước ta có khoảng 13.000 loài thực vật bậc cao trong đó có khoảng hơn 4.000 loài được sử dụng làm thuốc Do sự đa dạng về thành phần chủng loại, nguồn dược liệu Việt Nam được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền để chữa trị nhiều bệnh, nhiều cây thuốc đã được khoa học hiện đại chứng minh về giá trị chữa bệnh của chúng Xu hướng nghiên cứu và tìm kiếm các hoạt chất tự nhiên có hoạt tính sinh học từ các dược liệu, từ các loài thực vật đang thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học bởi độc tính thấp, dễ hấp thu và chuyển hóa trong cơ thể

Sa nhân tím được sử dụng làm thuốc, làm gia vị hoặc tinh dầu chiết xuất được ứng dụng trong lĩnh vực y học, dược phẩm, công nghệ thực phẩm

Là dược liệu quý và có khả năng ứng dụng rộng rãi nên Sa nhân tím đã được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Các nghiên cứu trong và ngoài

nước về thành phần hóa học và hoạt tính sinh của loài Amomum longiligulare

cho thấy tiềm năng vô cùng lớn trong phát triển các dược chất thiên nhiên có hoạt tính kháng viêm, kháng khuẩn,…Tuy nhiên, các nghiên cứu ở nước ta mới chỉ tập trung vào đánh giá thành phần tinh dầu, các nghiên cứu về các nhóm hợp chất khác còn rất ít Hơn nữa, đánh giá về hoạt tính sinh học của loài Sa nhân tím chưa đầy đủ, hiện tại chưa có nghiên cứu nào đánh giá về hoạt tính kháng viêm và gây độc tế bào của loài này Do vậy, nghiên cứu về thành phần hóa học và đánh giá hoạt động kháng viêm của cây Sa nhân tím

Amomum longiligulare có ý nghĩa khoa học và thực tiễn, nghiên cứu sẽ cung

cấp thông tin về các nhóm hợp chất khác của loài này, tạo cơ sở dữ liệu cho các nghiên cứu về sau

Xuất phát từ nhu cầu thực tế trên, đề tài luận văn: “Phân lập, xác định cấu trúc và đánh giá khả năng kháng viêm của các hoạt chất phân lập từ loài sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu)” đƣợc thực hiện với những mục tiêu cụ thể sau:

- Phân lập đƣợc một số hợp chất từ loài Sa nhân tím (Amomum

longiligulare T.L.Wu), xác định đƣợc cấu trúc của các hợp chất

- Đánh giá khả năng kháng viêm của các chất sạch phân lập đƣợc

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ LOÀI SA NHÂN TÍM (Amomum longiligulare

T.L.Wu)

Sa nhân tím hay còn gọi là Sa nhân lưỡi lá dài, sa ngần, mề tré bà, tên

khoa học là (Amomum longiligulare T.L.Wu), thuộc chi Sa nhân (Amomum),

họ Gừng (Zingiberaceae) [1]

1.1.1 Đặc điểm thực vật, phân bố

Đặc điểm thực vật

Sa nhân tím là loại cây thân thảo sống lâu năm, cao 1,5 – 2,5 m Thân

rễ mọc bò lan trên mặt đất Lá mọc so le thành hai dãy, hình mác, dài 23 – 30

cm, rộng 5 – 6 cm, gốc hình nêm, đầu nhọn, mép nguyên, hai mặt nhẵn, mặt trên bóng, lưỡi bẹ mỏng, xẻ đôi; cuống lá dài 5 – 10 mm

Cụm hoa mọc từ thân rễ thành bông, có 5 – 7 hoa màu trắng; lá bắc ngoài hình bầu dục, màu nâu, lá bắc trong dạng ống; dài 1,5 cm, có 3 răng nhọn; tràng hình ống dài 1,3 – 1,5 cm, chia 3 thùy, mặt ngoài có lông thưa, thùy ở giữa hình trứng ngược, hai thùy bên hẹp; cánh môi gần tròn, đường kính 2 – 2,6 cm, lõm, mép màu vàng, giữa có sọc đỏ, đầu cánh môi xẻ hai thùy nhỏ gập ra phía sau, không có nhị lép, chỉ nhị dài hơn bao phấn; bầu hình trụ tròn, hơi phình ở giữa, có lông trắng

Quả hình cầu, màu tím, đường kính 1,3 – 2 cm, mặt ngoài có gai ngắn, chia 3 ô Hạt màu nâu sẫm, cứng Khối lượng các hạt tương đối nhỏ, mỗi quả

có 3 – 24, hạt có áo, đường kính 3 – 4 mm [1], [2], [3]

Hình 1.1 Sa nhân tím (a - Thân và quả, b – Cây non Sa nhân tím)

Phân bố

Sa nhân tím có vùng phân bố từ đảo Hải Nam (Trung Quốc), đến vùng Trung Lào và Việt Nam Ở Việt Nam, Sa nhân tím phân bố tập trung nhất tại các tỉnh Tây Nguyên Những điểm có nhiều Sa nhân tím nhất là huyện M′Đrắc (Đăk Lăk), An Khê và K′Bang (Gia Lai), Vĩnh Thạch (Bình Định), Sông Hinh (Phú Yên), Ba Tơ (Quãng Ngãi)…Ở đây Sa nhân tím mọc tương đối tập trung xen lẫn với loài Sa nhân trắng trên diện tích rừng lớn Ở các tỉnh phía Bắc như Phú Thọ, Thái Bình, Hòa Bình, Hải Dương, Sa nhân tím mọc với trữ lượng ít ở trạng thái mọc hoang hoặc trồng ở vườn [1]

Thu hoạch

Sa nhân tím có hoa quả gần như quanh năm, quả chỉ sinh ra ở gốc những cây sau 1 năm tuổi Ở vụ quả chính, hoa bắt đầu từ giữa tháng 3, quả già vào khoảng tháng 6 – 7 Vụ quả phụ bắt đầu khoảng tháng 7, quả già vào tháng 11 Thời điểm thu hoạch tốt nhất là khi vỏ quả chuyển sang màu vàng nhưng còn rắn Lúc này, hạt dễ tách, màu vàng có chấm đen hoặc nâu, vị chua, cay nồng [1]

1.1.2 Công dụng và chủ trị

Quả Sa nhân tím có vị cay, tính ấm, mùi thơm vào các kinh tỳ, vị, thận

Có tác dụng hành khí, tán hàn, tán thấp, khai vị, tiêu thực, kích thích tiêu hóa Quả Sa nhân tím được dùng trong trị bụng trướng đau, đầy bụng, ăn không tiêu; tả, lỵ do lạnh; nôn mửa, nghẹn nấc, chống viêm, có tác dụng an thai…Trong thực phẩm, Sa nhân tím được dùng làm gia vị, chế rượu mùi [1], [4]

Hạt Sa nhân tím phơi khô, giã thành bột, chấm vào chỗ răng đau, hoặc ngâm rượu cho đặc rồi ngậm có tác dụng chữa đau nhức răng [1]

1.1.3 Các nghiên cứu nước ngoài về Sa nhân tím

1.1.3.1 Thành phần hóa học

Qua những công trình nghiên cứu, nhiều hợp chất từ Sa nhân tím đã được phân lập Tinh dầu, flavonoid, terpenoid và diarylheptanoid là các thành phần hóa học chính trong quả Sa nhân tím [5], [6], [7] Các thành phần hóa học chính được phân lập từ phân đoạn dichloromethane của Sa nhân tím là flavonoid và diarylheptanoid [5]

Thành phần tinh dầu

Thành phần tinh dầu trong hạt Sa nhân tím (1,7-3%) chứa borneol (9)

19%, D-camphor 33%, bornyl acetate 26,5%, D-limonene 7%, α-phellandrene

(10) 2,3%, α-pinene 1,8%, linalool (11) [3]

Thành phần chính trong tinh dầu Sa nhân tím bao gồm α-pinene (1), pinene (2), 1,8-cineole (3), p-cymene (4), limonene (5), camphene (6), bornyl acetate (7) và camphor (8) [8]

dimethoxyflavone (13), 3,5,7-trihydroxy-4′-methoxyflavone (14),

genistein-7-O-β-D-glucoside (15), quercetin-3-O-β-D-glucopyranoside (16),

luteolin-8-C-α-L-arabinoside (17) và

kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1-4)-β-D-glucopyranoside (18) [6] Hợp chất (12), (13) và (14) cũng đƣợc phân lập từ

loài Amomum longiligulare bởi nhóm nghiên cứu Liu Jin Peng và cộng sự [7]

Nhóm hợp chất diarylheptanoid

Nhóm nghiên cứu của Hao Ying và cộng sự cũng đã xác định 8 hợp chất diarylheptanoid trong Sa nhân tím bằng kỹ thuật sắc ký cao tốc ngƣợc dòng và sắc ký lỏng cao áp, bao gồm: 3-hydroxy-7-(4′′-hydroxyphenyl)-1-(4′-

hydroxyphenyl) heptane (19),

1,5-epoxy-7-(3′′,4′′-dihydroxyphenyl)-1-(4′-hydroxyphenyl) heptane (20), methoxyphenyl)-1-(3′,4′-dihydroxyphenyl) heptane (21), 7-(4′′-hydroxyphenyl)-1-(4′-hydroxyphenyl)-5-hepten-3-one (22), 7-(4′′-

(4′′-hydroxy-3′′-hydroxyphenyl)-1-(4′-hydroxyphenyl)-3-heptanone (23),

3,5-dihydroxy-7-(4′′-hydroxyphenyl)-1-(3′,4′-dihydroxyphenyl) heptane (24),

7-(3″,4′′-dihydroxyphenyl)-1-(4′-hydroxyphenyl)-5-hepten-3-one (25), 7-(3′′,4′′-dihydroxyphenyl)-1-(3′,4′-dihydroxyphenyl) heptane (26) Trong đó, hợp chất 20, 22 và 25 là các hợp chất diarylheptanoid chính trong quả Sa nhân

3,5-diacetoxy-tím [6]

Nhóm nghiên cứu Liu Jin Peng và cộng sự đã phân lập đƣợc 8 hợp chất

diphenylheptanes từ loài Amomum longiligulare là: hợp chất (19), (20), (23),

(24), (26), 1,7-bis(4-hydroxyphenyl)-5-hepten-3-one (27),

1-(3,4-dihydroxyphenyl)-7-(4-hydroxyphenyl)-5-hepten-3-one (28), 1-(3,4-dihydroxyphenyl)-7-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl) heptane (29) [7]

Tinh dầu Sa nhân tím có tác dụng kháng khuẩn [3], [9]

Hoạt tính chống oxy hóa

Sa nhân tím có hoạt tính chống oxy hóa [5], [7] Lin Dong và cộng sự

đã đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của các cặn chiết từ quả Sa nhân tím thông qua hoạt động thu dọn gốc tự do DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)

và OH Các cặn chiết ethanol, dichloromethane, ethyl acetate của quả Sa nhân tím thể hiện tính hoạt tính thu dọn gốc tự do DPPH với giá trị IC50 lần lượt là 58,53; 51,69 và 43,49 µg/mL mạnh hơn so với cặn chiết ete dầu hỏa (IC50 = 259,05 µg/mL) và cặn chiết n-butanol (IC50 = 2463,68 µg/mL) [7] Cặn chiết ethyl acetate, dichloromethane thể hiện hoạt tính quét gốc tự do

OH● với giá trị IC50 là 0,79 và 0,75 mg/mL [5]

Nghiên cứu Liu Jin Peng và cộng sự cũng đã đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất phân lập được từ loài Sa nhân tím Trong đó, 3 hợp

chất flavonoid (11-13) và 8 hợp chất diphenylheptane là (20), (21), (24), (25), (27-30) đều thể hiện hoạt tính chống oxy hóa [7]

Hoạt tính tăng cường hoạt động của hooc môn ostrogen

Theo nghiên cứu của Hao Ying và cộng sự, các hợp chất diarylheptanoid được phân lập từ Sa nhân tím đóng vai trò quan trọng trong hoạt động tăng cường hoocmon kiểm soát sinh sản phát triển ở người [6]

Tác dụng chống viêm, giảm đau

Các thành phần tinh dầu Sa nhân tím thể hiện hoạt tính kháng viêm, giảm đau, tiềm năng trong điều trị các bệnh về tiêu hóa [5], [9]

α-pinene, β-pinene, 1,8-cineole, p-cymene, limonene, camphene, bornyl acetate và camphor là các thành phần chính trong tinh dầu Sa nhân tím [8].Wu X và cộng sự đã đánh giá tác dụng giảm đau, chống viêm của bornyl actetate trên chuột thí nghiệm Kết quả nghiên cứu cho thấy bornyl actetate có tác dụng giảm đau, kháng viêm, làm giảm phản ứng quằn quại do acetic acid gây ra và giảm đau trên mô hình gây đau bằng tấm nóng ở chuột, giảm sưng tai do dimethylbenzene ở chuột [10]

α-pinene được báo cáo cho thấy có vai trò tiềm năng trong kiểm soát cơn đau do viêm và đau do nguyên nhân thần kinh gây ra; 1,8-cineole và

limonene có hoạt tính kháng viêm [11] Đánh giá tác dụng kháng viêm của

cineole trên chuột bị phù chân do carrageenan được điều trị với

1,8-cineole ở các liều 100, 200 và 400 mg/kg cho thấy tác dụng giảm phù chân ở

mức 26%, 26% và 46% [11] Juergens và cộng sự cũng đã nghiên cứu hiệu

quả chống viêm của 1,8-cineole trong việc ức chế sản sinh cytokine Ở nồng

độ 0,15 μg/mL, 1,8-cineole ức chế đáng kể quá trình sản sinh TNF-α (77%), IL-1β (61%) bởi bạch cầu đơn nhân Nghiên cứu khẳng định 1,8-cineole là chất ức chế mạnh TNF-α và IL-1β, được đề nghị trong điều trị lâu dài bệnh

hen suyễn, viêm xoang và bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính [11]

Nghiên cứu của Yuchen Xiao và cộng sự chỉ ra rằng chiết xuất từ Sa nhân tím giảm tổn thương niêm mạc dạ dày chuột và cơ chế liên quan đến cải thiện sự biểu hiện của TFF1 ở mức độ protein và RNA (có chức năng bảo vệ niêm mạc khỏi chấn thương, ổn định lớp chất nhầy) [12]

1.1.4 Các nghiên cứu trong nước về Sa nhân tím

1.1.4.1 Nghiên cứu về thành phần hóa học

Thành phần tinh dầu

Trần Đình Thắng và cộng sự đã nghiên cứu thành phần tinh dầu loài Sa

nhân tím (Amomum longiligulare) cho thấy các thành phần tinh dầu chủ yếu

được phát hiện từ lá, thân và rễ (46, 45 và 39 hợp chất được phát hiện lần lượt trong lá, thân và rễ) Thành phần tinh dầu chính trong tinh dầu từ lá sa nhân

tím là β-caryophyllene (26,6%), α-pinene (15,6%), humulene epoxide II (14,8%) và α-humulene (12,5%) Các hợp chất chính trong tinh dầu chiết xuất

từ thân là β-caryophyllene (37,4%), α-humulene (16,5%) và

hexahydrofarmesyl acetone (10,0%) Camphene (15,7%), hexadecanoic acid (10,0%), octadecanoic acid (8,6%) và bornyl acetate (7,8%) là thành phần chính trong tinh dầu từ rễ loài Sa nhân tím [13]

Theo nghiên cứu của Đào Lan Phương, hàm lượng tinh dầu tính theo trọng lượng tươi cao nhất ở quả (1,90%), thấp ở lá (0,40%), thân khí sinh (0,03%) và thân rễ (0,04%) Thành phần tinh dầu chính của quả Sa nhân tím bao gồm camphor (37,4%), bornyl acetate (36,1%), borneol (6,4%), camphen (7,4%) và limonen (6,3%); thành phần tinh dầu chính của lá α-pinen (14,2%), β-pinen (59,1%), bornyl acetate (8,5%); trong thân khí sinh thành phần tinh dầu chủ yếu là β-pinen (27,7%), camphor (21,5%), α-pinen (10,5%) và

limonen (9,4%); tinh dầu trong rễ chủ yếu là bornyl acetate (14,6%) và terpineol (5,2%) [14]

α-Thành phần hóa học khác

Nghiên cứu về thành phần hóa học khác ngoài tinh dầu mới chỉ có nghiên cứu của Đỗ Thị Hoa Viên và cộng sự Nghiên cứu đã phân lập được ba hợp chất có trong phần không bay hơi của hạt Sa nhân tím hai hợp chất thuộc

nhóm flavonoid là epicatechin (33) và quercitrin

(quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranoside) (34), một hợp chất monoterpene glycoside là

(+)-angelicoidenol-2-O-β-D-glucopyranoside (35) Ngoài ra, nghiên cứu cũng xác

định được trong hạt Sa nhân tím có chứa saponin-steroid với hàm lượng 0,63%, tanin; 15 nguyên tố đa lượng và vi lượng, trong đó đáng kể là các nguyên tố sắt, kẽm, mangan, kali, canxi, natri, photpho và magie [15]

1.1.4.2 Nghiên cứu về hoạt tính sinh học

Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm

Tinh dầu Sa nhân tím có tác dụng kháng khuẩn [1], [3], [6], [11] Tinh dầu Sa nhân tím có khả năng kháng khuẩn tương tự sa nhân trắng: ức chế hoạt

động của các loại vi khuẩn theo thứ tự hoạt tính giảm Bacillus subtillis,

Bacillus mycoides, Dipcoccus pneumoniae, Mycobacterrium tuberculosis, Proteus vulgaris, Shigella dysenteriae, Salmonella typhi và có tác dụng diệt

amip trên Entamoeba moshkowskii [1]

Nghiên cứu của Đỗ Thị Hoa Viêncho thấytinh dầu Sa nhân tím và dịch chiết ethanol từ hạt Sa nhân tím có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm với 3

chủng: Staphylococcus aureus, Escherichia coli và Candida stellatoides, dịch nước sắc Sa nhân tím có tác dụng kháng Escherichia coli và Staphylococcus

aureus Khả năng kháng khuẩn và kháng nấm của tinh dầu Sa nhân tím khá

mạnh so với chất đối chứng [6]

Phân đoạn bay hơi của hạt Sa nhân tím (chiết bằng dung môi dichloromethane) có hoạt tính chống oxy hóa và có tác dụng kháng khuẩn,

kháng nấm đối với 5 chủng: Escherichia coli, Staphylococcus aureus,

Candida stellatoides, Candida albicans và Cladosporium curcumerinum

Phân đoạn không bay hơi (được chiết với methanol sau khi chiết với dichloromethane) có tác dụng chống oxy hóa và tác dụng kháng nấm đối với

hai chủng vi khuẩn Escherichia coli và Staphylococcus aureus [6]

Hợp chất (+)-angelicoidenol-2-O-β-D-glucopyranoside (34) được phân

lập từ Sa nhân tím có tác dụng kháng nấm đối với hai chủng Cladosporium

cucumerinum và Candida albicans [6]

Hoạt tính chống oxy hóa

Nghiên cứu của Đỗ Thị Hoa Viên phân đoạn bay hơi của hạt Sa nhân tím (chiết bằng dung môi dichloromethane) có hoạt tính chống oxy hóa [6]

Như vậy, các nghiên cứu về Sa nhân tím (Amomum longiligulare

T.L.Wu) còn chưa nhiều Các nghiên cứu ở nước ta cho đến nay chủ yếu tập trung vào thành phần tinh dầu, các nghiên cứu về thành phần khác còn khá ít Nghiên cứu về đánh giá về hoạt tính sinh học của Sa nhân tím còn khá ít, hiện chưa có nghiên cứu nào về hoạt động kháng viêm

Thực hiện đánh giá sơ bộ hoạt tính kháng viêm của dịch chiết từ quả Sa nhân tím cho kết quả dịch chiết Sa nhân tím thể hiện hoạt tính kháng viêm thông qua ức chế sản sinh NO tương đối mạnh (ức chế 75% và 93% ở nồng

độ thử 30 µg/mL và 100 µg/mL) Do vậy, việc nghiên cứu về thành phần hóa

học và hoạt tính kháng viêm của loài Sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu) là cần thiết, sẽ mở ra khả năng phát hiện các hoạt chất mới tiềm

năng

1.2 GIỚI THIỆU VỀ KHÁNG VIÊM

1.2.1 Giới thiệu về quá trình viêm

Viêm được coi là cơ chế phòng vệ sinh lý chủ yếu, giúp cơ thể chống lại nhiễm trùng, bỏng, hóa chất độc hại, chất gây dị ứng hoặc kích thích độc hại khác Quá trình gây viêm thường kèm theo các triệu chứng sưng, nóng đỏ

và đau do các mạch máu giãn nở, đưa nhiều máu và các tế bào bạch cầu đến nơi tổn thương Viêm không kiểm soát được có thể như một yếu tố dẫn đến các bệnh mãn tính Hiện nay, thuốc kháng viêm giảm đau là các thuốc thuộc dòng nacotics, các thuốc không thuộc dòng steroid và các corticosteroid Hầu như tất cả các loại thuốc này đều có tác dụng phụ

Trong quá trình viêm, những tế bào được kích hoạt (bạch cầu trung tính, bạch cầu ái toan, thực bào đơn nhân và đại thực bào) tiết ra một lượng lớn nitric oxide (NO), prostaglandin E2 (PGE2) và các cytokine tiền viêm như IL-1β, IL-6, TNF-α để giúp tiêu diệt hoặc gây ức chế sự tăng trưởng của vi sinh vật xâm nhập hoặc mô ung thư Lipopolysaccharide là một thành phần chính của màng tế bào vi khuẩn Gram âm Nó có thể kích hoạt các đại thực bào tiết ra các cytokine tiền viêm và chất trung gian gây viêm như NO Sự sản sinh NO được điều khiển bởi nitric oxide synthase (NOS), trong đó bao gồm nitric oxide synthases cảm ứng (iNOS), nitric oxide synthases nội bào (eNOS)

và nitric oxide synthases thần kinh (nNOS) NO được sinh ra từ quá trình chuyển hóa L-Arginine thành L-citruline, xúc tác bởi iNOS Tuy nhiên việc sản sinh ra quá nhiều hợp chất này không chỉ gây ra sự tổn thương mô và tế bào, mà còn là nguyên nhân quan trọng gây bệnh thấp khớp và viêm gan mãn tính [16]

PGE2 là một trung gian viêm quan trọng khác và được sản xuất từ các chất chuyển hóa arachidonic acid bởi sự xúc tác của cyclooxygenase-2 (COX-2) [17] Cyclooxygenases (COX) nhường 2 phân tử oxy cho arachidonic acid

để tạo thành prostaglandin G2 (PGG2) bởi peroxidation, sau đó lần lượt chuyển hóa thành prostaglandin H2 (PGH2) dẫn đến sự hình thành của PGE2, thông qua kích hoạt phối hợp của PGE synthanse (PGES) Trong các đại thực bào, sự có mặt của LPS sẽ kích hoạt các dẫn truyền tín hiệu cho quá trình phiên mã các gen COX-2, iNOS, từ đó gây nên các đáp ứng viêm đặc trưng

Do vậy, sự thay đổi nồng độ NO và PGE2 thông qua sự ức chế hoạt động của

iNOS và COX-2 là một phương tiện quan trọng để đánh giá hiệu quả của các hoạt chất kháng viêm

1.2.2 Các yếu tố tham gia vào quá trình viêm

Đại thực bào: là các tế bào bạch cầu có vai trò quan trọng trong hệ

miễn dịch không đặc hiệu cũng như hệ miễn dịch đặc hiệu của động vật có xương sống Khi đại thực bào được hoạt hóa bởi sự hiện diện của các tác nhân gây bệnh như vi khuẩn, endotoxin, leukotrien… nó sẽ giải phóng một loạt các cytokine Đại thực bào sản xuất 5 loại cytokine chính là IL-1, IL-6, IL-12, IL-

18 và TNF-α

Nitric oxide: là một trung gian tiền viêm, một phân tử tín hiệu đóng vai

trò quan trọng trong quá trình sinh bệnh của viêm NO liên quan đến đáp ứng miễn dịch bởi các đại thực bào kích hoạt cytokine NO ở nồng độ cao gây ra chứng viêm quá mức trong các tình huống bất thường Do đó, ức chế sản sinh

NO là yếu tố quan trọng trong việc điều trị các bệnh viêm

Yếu tố nhân kappa B (NF-κB): NF-κB là một yếu tố sao mã thiết yếu

kiểm soát quá trình biểu hiện gan mã hóa các cytokine tiền viêm trong quá trình sinh lý bệnh viêm NF-κB tác động lên các gen quy định các cytokine, lên các chemokine có lợi cho quá trình viêm, lên các gen quy định các thụ thể miễn dịch Trong bệnh lý viêm, TNF-α có thể kích hoạt yếu tố NF-κB và NF-

κB thể hiện như một nhân tố điều hòa gen quan trọng đối với các gen liên quan đến viêm, nhiễm trùng, đáp ứng miễn dịch bao gồm iNOS, IL-1B, IL-6

và TNF-α

Các cytokine: Các cytokine là các protein tham gia vào các phản ứng

miễn dịch và phản ứng viêm Các cytokine có vai trò truyền tin qua lại giữa các bạch cầu với nhau và giữa các bạch cầu với các tế bào khác Phần lớn các cytokine được gọi là interleukin dựa theo vai trò của nó trong việc truyền thông tin giữa các tế bào bạch cầu Những cytokine đáp ứng viêm như IL-1, IL-6, IL-8, IL-12 và TNF-α Chúng có tác dụng tại chỗ và toàn thân, có vai trò dẫn truyền tín hiệu giữa các tế bào và cho phép hoạt hóa các hệ thống khác nhau Các cytokine tiền viêm như IL-1, IL-6, TNF-α có vai trò ưu thế trong điều hòa các đại thực bào, chúng cũng tham gia vào khả năng kết dính với các

tế bào nội mạc, di tản đến ổ viêm, thực bào [18]

CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu thân và quả Sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu) được

thu hái tại Yên Bái vào tháng 10/2018 Mẫu được định danh bởi TS Nguyễn Thế Cường, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật – Viện Hàn lâm Khoa học

và Công nghệ Việt Nam Mẫu tiêu bản kí hiệu AM-02 được lưu giữ tại Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Hình 2.1 Cây Sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu)

Mô tả đặc điểm thực vật:

Cây thân thảo, cao 1,5 – 2,5 m Thân rễ mọc bò lan trên mặt đất Lá mọc so le thành hai dãy, hình mác, dài 23 – 30 cm, rộng 5 – 6 cm, gốc hình nêm, đầu nhọn, mép nguyên, hai mặt nhẵn, mặt trên bóng, lưỡi bẹ mỏng, xẻ đôi; cuống lá dài 5 – 10 mm

Quả hình cầu, màu tím, đường kính 1,3 – 2 cm, mặt ngoài có gai ngắn, chia 3 ô Hạt màu nâu sẫm, cứng, có áo, đường kính 3 – 4 mm

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất nghiên cứu

2.1.2.1 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất dùng trong phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất

- Bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck)

- Silica gel pha thường với kích thước hạt 0,040-0,063 mm (240-430 mesh); hạt Diaion HP-20; Sephadex LH-20)

- Thiết bị đo phổ NMR: Phổ 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) được đo trên máy Brucker Avance 500 MHz (chất chuẩn nội là Tetrametyl Silan - TMS) tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Thiết bị đo độ quay cực: Máy JASCO P-2000 polarimeter, tại Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Thiết bị đo phổ khối lượng: Hệ thống LC/MS Agilent 1260 Series Single Quadrupole LC/MS Systems (Agilent, Mỹ) tại Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Dụng cụ, thiết bị tách chiết, phân lập: bể rung siêu âm (Daihan Scientific), hệ thống cất quay chân không (Buchi R300), hệ thống hứng mẫu

tự động (EYELA fraction collector DC-1200), đèn tử ngoại hai bước sóng

254 nm và 365 nm, cột sắc ký, bình triển khai sắc kí và các dụng cụ thí nghiệm khác

- Hóa chất: các dung môi methanol, n-hexane, ethyl acetate,

dichloromethane, acetone, thuốc thử ceri sulphate,

2.1.2.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất dùng trong xác định hoạt tính kháng viêm

Thiết bị, dụng cụ:

- Máy đọc phiến 96 giếng (Bio-Rad Laboratories, Mỹ), bể ổn nhiệt thiết lập nhiệt độ 37oC, buồng đếm hemocytometer, máy đếm tế bào (improved Neubauer), tủ ủ CO2 (MMM Group, Đức), nồi hấp khử trùng, tủ sấy

- Đĩa nuôi cấy đã xử lý bề mặt, phiến 96 giếng đã xử lý bề mặt (SPL Life Sciences, Hàn Quốc); micropipetes, pipettes đa kênh; đầu tip micropipet (Isolab, Đức), eppendrof 1,5 và 2 mL

Hóa chất:

- DMEM (Dullbecco’s modified Minimum Essential Medium), RPMI

1640, PBS (phosphate bufferred saline), FBS (Fetal bovine serum, huyết thanh nhau phôi bò), penicillin, streptomycin (Gibco, Mỹ), MTT (Duchefa biochemie, Hà Lan), LPS (Sigma, Mỹ), sulfanilamide (BDH Chemical, Anh), N-alpha-naphthyl-ethylenediamine (BDH Chemical, Anh)

- Dimethyl sulfoxide (DMSO) (Merck), nước cất 2 lần (máy lọc MilliQ, Merck, Đức), methanol, isopropanol (Merck)

- Chất đối chứng dương Cardamonin trong đánh giá hoạt tính ức chế sản sinh NO

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp phân lập các hợp chất

2.2.1.1 Phương pháp chiết xuất

Mẫu sau khi thu hái được xử lý loại tạp, thái nhỏ rồi phơi khô hoặc sấy khô ở nhiệt độ 50-60ºC đến khô Sau đó mẫu được xay nhỏ thành bột, được ngâm chiết với dung môi thích hợp để thu cao chiết tổng sau đó chiết phân bố bằng các dung môi có độ phân cực khác nhau để thu các cao chiết phân đoạn hoặc bột mẫu được chiết lần lượt bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần

để thu cao chiết các phân đoạn

2.2.1.2 Phương pháp phân lập

Sắc ký cột

Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel pha thường hoặc pha đảo, diaion…Chất hấp phụ được nhồi lên cột (phổ biến nhất là cột

thủy tinh) Trong sắc ký cột, tỷ lệ giữa quãng đường đi của chất cần tách so

với quãng đường đi được của dung môi được gọi là Rf, mỗi một chất sẽ có một giá trị Rf khác nhau Chính nhờ sự khác nhau đó mà người ta tách được

các chất riêng biệt ra khỏi hỗn hợp

Sắc ký lớp mỏng

Săc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien

60 F254 Phát hiện bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc

dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10%, dung dịch ceri sulphate được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng đến khi hiện màu

Sắc ký lớp mỏng điều chế

Phương pháp này dùng để điều chế, thu chất trực tiếp Quá trình thực hiện tương tự sắc ký lớp mỏng và sau khi triển khai xong, soi đèn UV để xác định vết rồi cạo lấy lớp silica gel chứa chất cần điều chế, tiến hành rửa giải để thu chất

2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất

Cấu trúc hóa học của các hợp chất được xác định dựa trên cơ sở sử dụng các phép xác định thông số vật lý và các phương pháp đo phổ bằng các thiết bị hiện đại đồng thời kết hợp với phân tích và tra cứu tài liệu tham khảo Các phương pháp đo được sử dụng gồm có:

Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân được sử dụng bao gồm:

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1D-NMR): 1H-NMR, 13

tử ESI (Electrospray Ionization)

2.2.2.3 Độ quay cực [α]

Độ quay cực được đo trên máy JASCO P-2000 polarimeter của Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.2.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm

Nguyên tắc đánh giá hoạt tính ức chế sản sinh NO:

Hoạt tính kháng viêm được đánh giá qua tác dụng ức chế sản sinh gốc

tự do nitric oxide (•NO) Gốc tự do •NO được sản sinh ở nhiều loại tế bào khác nhau Dạng •NO xuất tiết có mặt ở các tế bào như đại thực bào, nguyên bào sợi hay tế bào gan thường được sản sinh với lượng lớn khi xuất hiện đáp ứng viêm [22]

Phương pháp được sử dụng để xác định gián tiếp •NO là đo màu các thành phần sản phẩm của nó (nitrte và nitrite) Phản ứng này đòi hỏi nitrate (NO3

-) đầu tiên được chuyển thành nitrite (NO2

) Nitrite được phát hiện và phân tích thông qua phản ứng tạo phức màu hồng đỏ khi mẫu thử có chứa

-NO2

- với thuốc thử Griess (sulfanilamide và ethylenediamine trong môi trường axit) Phương pháp này được thực hiện trên dòng tế bào đại thực bào RAW264.7

N-alpha-naphthyl-Cách tiến hành:

- Nuôi tế bào: Tế bào RAW264.7 nuôi cấy ở 37oC trong môi trường DMEM có bổ sung huyết thanh nhau phôi bò 10% (FBS), 100 U/mL penicillin và 100 µg/mL streptomycin trong tủ nuôi cấy CO2 5% trong 24 giờ

- Sau đó chúng được nuôi cấy trong giếng phiến 96 với thể tích là

200 µL, mật độ 2 x 104

tế bào/giếng Ủ 30 phút ở 37oC, 5% CO2

- Tế bào được kích thích với 2 µL LPS (0,1 mg/mL) trong 24 giờ với sự có mặt của các hợp chất thử ở nhiều nồng độ khác nhau, được pha sẵn trong DMSO Ủ ở 37oC, 5% CO2

- Hút 100 µL dịch nổi của tế bào phản ứng với 100 µL thuốc thử Griess NaNO2 ở các nồng độ khác nhau được sử dụng để xây dựng đường chuẩn Độ hấp thụ được đo ở 570 nm Cardamonin được sử dụng làm mẫu đối chứng dương [23]

- Giếng không được ủ mẫu mà chỉ sử dụng dung dịch pha mẫu, không cho LPS được coi là đối chứng âm Đối chứng dương được sử dụng là Cardamonin

- Phần tế bào còn lại sau khi đã sử dụng để đánh giá khả năng gây độc tế bào bằng phương pháp MTT

Nguyên tắc đánh giá gây độc tế bào:

Khả năng gây độc tế bào được suy ra từ việc đánh giá khả năng sống sót của tế bào RAW264.7 sử dụng phương pháp MTT Đây là một phương pháp so màu, đo độ suy giảm màu vàng của MTT để đánh giá khả năng sống sót của tế bào Ở tế bào sống, MTT tham gia phản ứng oxi hóa khử với ty thể của tế bào và tạo thành các formazan dạng tinh thể Lượng formazan tạo thành được hoà tan bởi dung môi hữu cơ (DMSO, isopropanol) và đo độ hấp thụ ở bước sóng 570 mm Khả năng gây độc tế bào được suy ra từ việc đánh giá khả năng sống sót của tế bào [24]

Cách tiến hành:

Phần tế bào còn lại sau khi đã sử dụng để đánh giá hoạt tính ức chế sản sinh NO được bổ sung 20 µL dung dịch MTT (0,5 mg/mL pha trong PBS), ủ trong 4 giờ ở 37oC và 5% CO2 Sau đó hút bỏ hết môi trường trên bề mặt, kết tủa formazan được hòa tan trong isopropanol Độ hấp thụ được đo ở 570 nm

Khả năng sống sót của tế bào CS% (% Cell Survival) được tính theo công thức:

[

Giá trị CS: là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ ban đầu của mẫu thử

OD: giá trị mật độ quang

σ: độ lệch tiêu chuẩn, được tính theo công thức:

√ ∑ ̅

Trong đó: xi : giá trị OD tại giếng i

̅: giá trị OD trung bình n: số giếng thử lặp lại Hàm lượng nitrite của mẫu thí nghiệm được xác định nhờ vào đường cong NaNO2 và được so sánh % với mẫu đối chứng âm (LPS)

Khả năng ức chế sản sinh NO được xác định theo công thức:

2016 và Graphpad Prism 6.0

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT

3.1.1 Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ thân Sa nhân tím

Thân Sa nhân tím được sấy khô, xay nhỏ (1 kg), sau đó chiết siêu âm với 5L methanol/lần x 3 lần ở 40o

C, trong 1 giờ, cất loại dung môi thu được cặn chiết methanol (30 g) Cặn chiết methanol được hòa tan trong nước cất và

chiết lần lượt với dung môi n-hexane (5 lần x 500 mL), dichloromethane (5

lần x 500 mL) và ethyl acetate (5 lần x 500 mL) Cất loại dung môi thu được

cặn chiết n-hexane (HAL 3,91 g), cặn chiết dichloromethane (DAL 5,76 g) và

cặn chiết ethyl acetate (EAL 2,22 g)

Hình 3.1 Sơ đồ tạo cặn chiết thân Sa nhân tím

Cất loại dung môi

Cất loại dung môi

Cất loại dung môi

Cặn chiết dichloromethane (DAL 5,76 g) đƣợc phân tách trên cột sắc

ký silica gel với hệ dung môi n-hexane:EtOAC gradient (100:0 → 0:100, v/v)

thu đƣợc 7 phân đoạn nhỏ kí hiệu từ F1 đến F7 Phân đoạn F2 (0,85 g) kết

tinh thu đƣợc tinh thể hình kim màu trắng kí hiệu AL1 (420 mg), phần dịch

sau khi kết tinh đƣợc tinh chế tiếp trên cột Sephadex với hệ dung môi

MeOH:CH2Cl2 9:1 thu đƣợc 5 phân đoạn F2.1 đến F2.5 Tiến hành phân tách

phân đoạn F2.5 (0,10 g) trên cột sắc kí silica gel với hệ dung môi

MeOH:CH2Cl2:EtOAC tỉ lệ 50:47:3 (v/v/v) thu đƣợc chất sạch AL2 (11 mg)

Phân đoạn F6 (2,28g) tiến hành phân tách trên cột Sephadex với dung

môi MeOH sau đó tinh chế tiếp trên cột sắc ký silica gel với hệ dung môi

n-hexane:CH2Cl2:EtOAC (60:37:3, v/v/v) thu đƣợc 2 chất sạch kí hiệu AL3 (5

mg) và AL4 (6 mg)

Hình 3.2 Sơ đồ phân lập chất sạch từ cặn dichloromethane thân Sa nhân tím

1, CC, Sephadex LH-20 MeOH

2, CC, Silica gel H:D:E (60:37:3, v/v/v)

F1

0,86 g

F2 0,85 g

F3 0,73 g

F5 0,18 g

F40,23 g

F6 2,28 g

AL3

(5 mg)

Cặn dichloromethane DAL (5,76 g)

CC, Silica gel H:E gradient, 100:0 → 0:100, v/v

F7 0,41 g

Cặn chiết ethyl acetate (EAL 2,22 g) đƣợc tiến hành phân lập trên sắc

ký cột silica gel với hệ dung môi n-hexane:acetone gradient từ 100:00:100

(v/v) thu đƣợc 12 phân đoạn, kí hiệu từ F1 đến F12 Phân đoạn F9 (8,5 mg)

tinh chế trên sắc kí lớp mỏng điều chế với hệ dung môi n-hexane:acetone 9:1

(v/v) thu đƣợc chất sạch AL5 (3 mg)

Hình 3.3 Sơ đồ phân lập chất sạch từ cặn ethyl acetate thân Sa nhân tím

3.1.2 Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ quả Sa nhân tím

Mẫu quả Sa nhân tím đƣợc sấy khô, xay nhỏ (1,2 kg), sau đó chiết siêu

F10F12

TLC điều chế H:A (9:1, v/v)

AL5

(3 mg)

H: n-Hexane

A: Acetone CC: Sắc ký cột TLC: Sắc ký lớp mỏng

Hình 3.4 Sơ đồ tạo cặn chiết quả Sa nhân tím Cặn chiết methanol đƣợc tiến hành phân lập trên sắc kí cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2:MeOH gradient (100:0→0:100, v/v) thu đƣợc 8 phân đoạn F1 đến F8

Phân đoạn F2 (0,57 g) đƣợc tiến hành sắc kí trên cột Sephadex LH-20 với hệ dung môi MeOH:CH2Cl2 (9:1, v/v) thu đƣợc 5 phân đoạn F2.1 đến

F2.5 Phân đoạn F2.3 tiến hành sắc ký cột silica gel với hệ dung môi

n-hexane:CH2Cl2 (2:1, v/v), sau đó chạy bản mỏng điều chế với hệ dung môi

n-hexane:CH2Cl2 (2:1, v/v) thu đƣợc chất AL6 (20 mg)

Tiến hành sắc ký cột silica gel phân đoạn F3 (0,32 g) với hệ dung môi

n-hexane:EtOAc (4:1, v/v) thu đƣợc 6 phân đoạn F3.1 đến F3.6 Phân đoạn

Bột quả Sa nhân tím

(1,2 kg)

Chiết siêu âm với n-hexane

5L/lần ở 40oC, 1 giờx 3 lầnCất loại dung môi

Cặn n-Hexane

ALH (5,5 g)

BãChiết siêu âm với ethyl acetate5L/lần ở 40oC, 1 giờ x 3 lầnCất loại dung môi

Cặn ethyl acetate

ALE (8,84 g)

BãChiết siêu âm với methanol 5L/lần ở 40oC, 1 giờ x 3 lầnCất loại dung môi

Cặn methanol

ALM (18,47 g)

Bã

F3.4 đƣợc tinh chế trên bản mỏng điều chế với hệ dung môi

n-hexane:CH2Cl2:aceton (60:37:3, v/v/v) thu đƣợc chất AL7 (8 mg)

Phân đoạn F6 (0,23 g) đƣợc tinh chế trên trên cột sephadex LH-20 với dung môi methanol thu đƣợc 4 phân đoạn F6.1 đến F6.4 Phân đoạn F6.2 (141

mg) đƣợc phân lập trên cột silica gel với hệ dung môi

n-hexane:CH2Cl2:acetone (37:60:3, v/v/v) thu đƣợc chất AL8 (4,2 mg).

Hình 3.5 Sơ đồ phân lập các chất sạch từ cặn methanol quả Sa nhân tím

Cặn methanol ALM

(18,3 g)

CC, Silica gel D:M gradient, 100:0 → 0:100, v/v

F1

0,73 g 0,57 gF2

F4 0,29 g

F5 0,30 g 0,32 gF3 0,47 gF7 0,86 gF8

F6 0,23 g

CC, Sephadex LH-20 D:M (9:1, v/v)

F3.4

18 mg

F3.1-F3.3 F3.5, F3.6 F3.3 TLC điều chế H:D:A (60:37:3, v/v/v)

AL7

8 mg

CC: sắc ký cột TLC: sắc ký lớp mỏng D: Dichloromethane E: Ethyl acetate

H: n-Hexane

M: Methanol A: Acetone

CC, Sephadex LH-20

MeOH

F6.1, F6.3, F6.4

F6.2

141 mg

CC, Silica gel H:D:A

(37:60:3, v/v/v)

AL8

4,2 mg

3.2 THÔNG SỐ VẬT LÝ VÀ DỮ LIỆU PHỔ CỦA CÁC HỢP CHẤT ĐÃ PHÂN LẬP ĐƢỢC

3.2.1 Hợp chất AL1: 4-methoxycinnamic acid

Chất rắn màu trắng, công thức phân tử: C10H10O3, M= 178,18

Phổ ESI-MS: m/z 179 [M+H]+

Số liệu phổ 1

H-NMR xem bảng 3.1

3.2.2 Hợp chất AL2: Methyl ferulate

Chất rắn màu trắng, công thức phân tử: C11H12O4, M = 208,21

Phổ ESI-MS: m/z 209 [M+H]+

Số liệu phổ 1

H-NMR và 13C-NMR xem bảng 3.2

3.2.3 Hợp chất AL3: one

1,7-bis-(4-hydroxyphenyl)-1,4,6-heptatrien-3-Chất bột màu vàng, công thức phân tử: C19H16O3, M= 292,33

Phổ ESI-MS: m/z 293 [M+H]+

Số liệu phổ 1

H-NMR và 13C-NMR xem bảng 3.3

3.2.4 Hợp chất AL4: propan-1-one

3-hydroxy-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-Chất rắn màu trắng, công thức phân tử: C10H12O4, M = 196,07

MS cho pic ion giả phân tử proton hóa ở m/z 179 [M+H]+ Phổ 1H-NMR của hợp chất thấy xuất hiện tín hiệu của proton vòng thơm hệ A2B2 ở δH 7,41 (2H,

dd, J = 2,0; 7,0 Hz); 6,85 (2H, dd, J = 2,0; 7,0 Hz), ngoài ra xuất hiện hai proton olefine định hướng trans ở δH (ppm) 7,64 (1H, d, J = 16,0 Hz); 6,30 (1H, d, J = 16,0 Hz) và tín hiệu singlet của một nhóm methoxy ở phía trường thấp δH 3,81 (3H, s, OCH3) Dựa vào dữ liệu phổ (bảng 3.1) kết hợp

so sánh với tài liệu tham khảo cho phép xác định hợp chất AL1 là methoxycinnamic acid [25]

Chất AL2 được phân lập dưới dạng chất rắn màu trắng Phổ ESI-MS

cho pic ion giả phân tử ở m/z 209 [M+H]+ Trên phổ 1H-NMR của hợp chất

AL2 xuất hiện tín hiệu của 3 proton vòng thơm hệ ABX ở δH 7,07 (1H, dd, J

= 2,0; 8,0 Hz, H-6); 7,03 (1H, br.d, J = 2,0 Hz; H-2); 6,92 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5); 2 nhóm methoxy ở δH (ppm) 3,93 (3H, s, OCH3-3); 3,80 (3H, s, OCH3-

3′) Ngoài ra, có tín hiệu doublet của proton olefin ở δH 7,62 (1H, d, J = 16,0

Hz, H-1′), 6,29 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-2′), hai proton này có hằng số tương tác lớn J = 16,0 Hz chứng tỏ ở vị trí trans

Trên phổ 13

C-NMR thấy xuất hiện tín hiệu của 11 nguyên tử cacbon trong đó có 2 nhóm methoxy, 5 nhóm methin sp2, 3 cacbon không liên kết trực tiếp với hydro và 1 nhóm carbonyl ở δC 167,7 Dựa vào dữ liệu phổ NMR

(bảng 3.2) kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo cho phép xác định AL2 là methyl ferulate [26]

1,7-bis-(4-hydroxyphenyl)-1,4,6-heptatrien-3-Hình 3.8 Cấu trúc hợp chất AL3 Chất AL3 được phân lập dưới dạng chất bột vô định hình màu vàng Phổ ESI-MS cho pic ion giả phân tử ở m/z 293 [M+H]+