Nghiên cứu chiết xuất epigallocatechin gallate (agcg) từ trà xanh (camellia sinensis) bằng phương pháp sắc ký cột với hệ dung môi ethanol

EGCG được phân tách bằng phương pháp sắc ký cột, rửa giải gradient với hệ dung môi ethanol/nước, pha tĩnh là các loại nhựa trao đổi ion: Amberlite IR120, IR122, Wofatit AD41, Purolite C1

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH

Xác nhận của Chủ tịch hội đồng đánh giá luận văn và Bộ môn quản lý chuyên ngành sau khi luận văn được sữa chữa (nếu có)

Chủ tịch Hội đồng đánh giá luận văn Bộ môn quản lý chuyên ngành

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

PHÒNG ĐÀO TẠO SĐH

CÔNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc



Tp Hồ Chí Minh, ngày … tháng … năm 2010

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

A TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu chiết xuất Epigallocatechin gallate (EGCG) từ trà

xanh (Camellia sinensis), dùng phương pháp sắc ký cột với hệ dung môi

ethanol/nước

B NHIỆM VỤ LUẬN VĂN:

- Xây dựng qui trình chiết xuất EGCG từ lá trà xanh, dùng hệ dung môi ethanol/nước Hàm lượng EGCG trong sản phẩm khoảng 50%

- Dùng phương pháp sắc ký cột trao đổi ion để phân tách EGCG Xây dựng qui trình đối với 5 loại nhựa trao đổi ion có tính chất khác nhau (Amberlite IR120, IR122, Purolite C100H, A100, Wofatit AD41), và qui trình đối với nhựa hấp phụ Amberlite XAD 7HP

C NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 05/11/2009

D NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 05/07/2010

E HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: Ts Phạm Thành Quân

Nội dung và đề cương Luận văn thạc sĩ đã được Hội Đồng Chuyên Ngành thông qua

QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH

KHOA QUẢN LÝ CHUYÊN

NGÀNH

Ts Phạm Thành Quân

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đề tài này, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, định hướng nghiên cứu của Ts Phạm Thành Quân; sự giúp đỡ, chỉ bảo của các thầy cô trong bộ môn Hữu Cơ, Khoa Công Nghệ Hóa Học, Trường Đại Học Bách Khoa; sự hỗ trợ của Công ty DOMESCO và sự động viên, giúp đỡ của gia đình, bè bạn Tôi xin gửi lời cảm ơn đến tất cả mọi người đã cùng tôi hoàn thành luận văn này

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ

- Khoa học đã chứng minh phần lớn các tác dụng có lợi cho sức khỏe mà trà xanh mang lại là do hoạt tính chống oxy hóa của các catechin có trong trà

Đề tài này xây dựng qui trình chiết xuất Epigallocatechin gallate (EGCG),

catechin có hoạt tính chống oxyhóa cao nhất, từ trà xanh (Camellia

sinensis) - để sử dụng trong sản xuất các sản phẩm thực phẩm, dược phẩm,

mỹ phẩm

- Dung môi sử dụng trong qui trình là hệ ethanol/nước Phương pháp chiết xuất đun hoàn lưu với dung dịch ethanol 60% (tỉ lệ 6:1) trong 30 phút, loại tạp bằng phương pháp kết tủa do tác dụng của ethanol nồng độ cao EGCG được phân tách bằng phương pháp sắc ký cột, rửa giải gradient với hệ dung môi ethanol/nước, pha tĩnh là các loại nhựa trao đổi ion: Amberlite IR120, IR122, Wofatit AD41, Purolite C100H, Purolite A100 và nhựa non-ion Amberlite XAD7HP làm đối chứng

- Sản phẩm tốt nhất thu được khi phân lập với cột anionit Wofatit AD41, có hàm lượng EGCG 48.2%, lượng caffeine 2% Hiệu quả so với nhựa non-ion Amberlite XAD7HP là tương đương nhau Tuy nhiên, khả năng ứng dụng của nhựa anionit vào sản xuất công nghiệp cao hơn do sự tiện lợi trong việc tái khôi phục khả năng hoạt động, giảm chi phí

ABSTRACTS

- The health benefits of green tea are brought by the antioxidant activity of the catechins in tea This project building processes that extract

Epigallocatechin gallate (EGCG) from green tea (Camellia sinensis), for

use in the manufacture of foods, pharmarceuticals, cosmetics

- Solvent used in process is the ethanol / water Dried green tea leaves were extracted for 30 minutes with solvent (ratio 6:1) at 80oC Contaminants were precipitated by the effect of hight ethanol concentrations EGCG was separated by ion-exchange chromatography procedure; mobile phase is the ethanol/water with different concentration, station phase is ion-exchange resins: Amberlite IR120, IR122, Wofatit AD41, Purolite C100H, Purolite A100 and non-ionic resin Amberlite XAD7HP as confronting

- The best product was obtained when isolated with anionit Wofatit AD41 column, containing by weight 48.2% EGCG, 2% caffeine, equal to non-ionic Amberlite XAD7HP column However, the applicability of anionits is higher than non-ionic resins due to the convenience of regenaration and cost efficiency

Mục lục

Mục lục i

Danh sách các hình v

Danh sách các bảng vi

Danh sách các từ viết tắt vii

PHẦN MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN 4

I.1 Các hợp chất hữu cơ trong cây 4

I.2 Sơ lược lý thuyết flavonoids 6

I.2.1 Cấu trúc, phân loại 6

I.2.2 Lý tính 8

I.2.3 Hóa tính 8

I.2.4 Chiết xuất: 9

I.2.5 Phân lập: 9

I.2.6 Một số phản ứng tạo phức màu với ion kim loại 10

I.3 Hợp chất hữu cơ trong lá trà xanh 10

I.3.1 Các polyphenols 10

I.3.2 Các hợp chất hữu cơ khác trong trà 13

I.3.3 Thành phần các chất trong lá trà tươi 13

I.4 Nhựa trao đổi ion [1, 37, 47] 14

I.4.1 Phân loại, một số tính chất 14

I.4.2 Cơ chế trao đổi ion 16

I.5 Sắc ký lỏng [19] 18

I.5.1 Phân loại 18

I.5.2 Các thông số đặc trưng của sắc ký lỏng 21

I.6 Lược khảo các công trình nghiên cứu 25

I.6.1 Xử lý nguyên liệu 25

I.6.2 Chiết xuất catechins từ trà xanh 25

I.6.3 Phân tách catechins từ dịch chiết trà xanh 28

I.6.4 Các phương pháp phân tích catechins 30

CHƯƠNG 2 : THỰC NGHIỆM 32

II.1 Mục tiêu nghiên cứu 32

II.2 Giả thiết và nội dung nghiên cứu 32

II.2.1 Giả thiết 32

II.2.2 Nội dung nghiên cứu 33

II.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 34

II.4 Qui trình thực nghiệm 34

II.4.1 Xử lý nguyên liệu 34

II.4.2 Chiết xuất 35

II.4.3 Loại tạp 35

II.4.4 Kiểm tra hàm lượng polyphenol tổng 36

II.4.5 Sản phẩm sau khi loại tạp 37

II.4.6 Chuẩn bị cột 37

II.4.7 Khảo sát thể tích dung môi rửa giải 38

II.4.8 Ảnh hưởng của nồng độ dung môi lên sự phân tách các hợp chất 39

II.4.9 Sản phẩm sau khi tinh chế 40

II.5 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu 40

II.5.1 Phương pháp so màu UV-vis 40

II.5.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 41

II.5.3 Phương pháp xử lý số liệu thực nghiệm 42

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - BÀN LUẬN 43

III.1 Đường chuẩn trên máy Helios Epsilon UV/VIS Spectrophotometer 43

III.2 Lượng polyphenol hấp thu tối đa của nhựa 43

III.3 Hàm lượng polyphenol tổng sau giai đoạn loại tạp 45

III.4 Lượng dung môi rửa giải 45

III.5 Phương pháp rửa giải gradient 49

III.5.1 Amberlite XAD 7 HP 49

III.5.2 Amberlite IR120, IR122 51

III.5.3 Purolite C100H 53

III.5.4 Wofatit AD41 54

III.5.5 Purolite A100 55

III.5.6 Sản phẩm đầu ra ở các phân đoạn dung môi khác nhau 56

III.5.7 Tóm tắt qui trình phân lập các catechin cho từng trường hợp 57

III.6 Kết quả phân tích HPLC 58

III.6.1 Amberlite XAD 7HP 58

III.6.2 Amberlite IR120 59

III.6.3 Amberlite IR122 60

III.6.4 Wofatit AD41 61

III.6.5 Purolite A100 62

III.6.6 Nhận xét 63

CHƯƠNG 4 : KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 66

IV.1 Kết luận 66

IV.2 Đề nghị 67

Tài liệu tham khảo I Phụ lục V

1 Đường chuẩn của phương pháp so màu trên máy Jenway 6505 UV/VIS

Spectrophotometer [2] V

2 Đặc tính kỹ thuật của các loại nhựa V

3 Phương pháp hồi phục các loại nhựa VII

4 Phổ HPLC của các sản phẩm VIII

5 Bảng thành phần hóa học trong trà: XXI

Danh sách các hình

Hình I-1: Phân loại các hợp chất trong cây 5

Hình I-2 : Cơ chế quá trình trao đổi ion 17

Hình I-3 : Sơ đồ quá trình sắc ký rây phân tử (SEC) 20

Hình II-1: Phổ chuẩn của phương pháp so màu 36

Hình III-1 : Đường chuẩn phương pháp so màu 43

Hình III-2: Đồ thị khảo sát lượng dung môi rửa giải đối với XAD 7HP 46

Hình III-3 : Đồ thị khảo sát lượng dung môi rửa giải đối với IR120, IR122 46

Hình III-4 : Đồ thị khảo sát lượng dung môi rửa giải đối với Purolite C100H 47

Hình III-5 : Lượng dung môi rửa giải với Purolite A100 và Wofatit AD41 47

Hình III-6 : Đồ thị rửa giải gradient, trường hợp nhựa Amberlite XAD 7HP 49

Hình III-7 : Đồ thị rửa giải gradient, trường hợp nhựa Amberlite IR120, IR122 51

Hình III-8 : Đồ thị rửa giải gradient, trường hợp Purolite C100H 53

Hình III-9 : Đồ thị rửa giải gradient, trường hợp Wofatit AD41 54

Hình III-10 : Đồ thị rửa giải gradient, trường hợp Purolite A100 55

Hình III-11 : HPLC trường hợp Amberlite XAD7HP 58

Hình III-12 : HPLC trường hợp Amberlite IR120 59

Hình III-13 : HPLC trường hợp Amberlite IR122 60

Hình III-14 : HPLC trường hợp Wofatit AD41 61

Hình III-15 : HPLC trường hợp Purolite A100 62

Hình IV-1 : Sơ đồ qui trình chiết xuất, phân lập EGCG 66

Danh sách các bảng

Bảng I-1 : Phân loại eu-flavonoids theo cấu trúc cơ bản 6

Bảng I-2 : Các catechins 10

Bảng I-3 : Các theaflavins chính 11

Bảng I-4 : Các flavonols chính 12

Bảng III-1 : Khả năng hấp thu polyphenol của các loại nhựa 44

Bảng III-2 : Lượng dung môi rửa giải của các loại nhựa 48

Bảng III-3 : Bảng các chế độ qui trình phân lập polyphenol 57

Bảng III-4 : Tổng hợp kết quả HPLC của XAD7HP, IR120, IR122 63

Bảng III-5 : Tổng hợp kết quả HPLC trường hợp Wofatit AD41, Purolite A100 63

Danh sách các từ viết tắt

SC-CO2 : supercritical carbon dioxide

UAE : ultrasonic – assisted extraction

PHẦN MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, việc đẩy mạnh phát triển các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên đã trở thành xu thế chung trên thế giới Trong số đó, sản

phẩm từ trà (Camellia sinensis) là những sản phẩm được nhiều người quan

tâm Bởi vì trước hết, trà là một thức uống đã có truyền thống lâu đời trong nhiều nền văn hóa trên thế giới- người ta thừa nhận trà được dùng đầu tiên

ở Trung Quốc từ những năm 2737 trước công nguyên [12]

Từ đó đến nay, con người đã dần dần khám phá và hiểu rõ hơn về những ích lợi cho sức khỏe từ trà Tài liệu đầu tiên nói về công dụng của trà được viết năm 59 TCN, quyển sách đầu tiên mô tả việc phân bố, thu hái, chế biến, cũng như công dụng, cách dùng… của trà một cách hệ thống, được LuYu viết năm

780 sau công nguyên Năm 1753, C.Linne đã đặt tên khoa học cho cây trà là

Camellia sinensis [12]

Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học, người ta đã xác định được các thành phần hóa học và mối liên hệ với các tác dụng của trà Những thành phần chính tạo nên tác dụng của trà là các hợp chất polyphenols, caffeine, và các amino acids Catechins là các polyphenol thuộc nhóm flavonoids – là các chất có tính chất chống oxi hoá, mang lại nhiều tác dụng có lợi cho sức khỏe con người [35] Qua các kết quả nghiên cứu, người ta thu được các bằng chứng khoa học chứng tỏ catechins trong trà có khả năng chống oxi hoá cao hơn vitamin E, C, tocopherol, carotene; làm tăng hoạt tính của các detoxifying enzymes như glutathione peroxidase, glutathione reductdase, catalase, quinine reductdase ở ruột non, gan, phổi Ngoài ra, trà cũng thể hiện khả năng kháng và hỗ trợ điều trị nhiều loại ung thư khác nhau; làm giảm nguy cơ mắc các bệnh tim mạch; chữa một số bệnh hô hấp; chống lão hóa da; chữa một số bệnh về tiêu hóa; phòng bệnh tiểu đường; tăng cường sức khỏe răng miệng; phòng ngừa cách bệnh về gan; tăng cường khả năng miễn dịch; chữa bệnh viêm khớp; giảm béo [35]

Thành phần tác dụng chính của trà là các catechins, trong đó Epigallocatechin gallate (EGCG) là catechins có hàm lượng lớn nhất [2, 12-13]

và có hoạt tính chống oxi hoá cao [31]

Hiện nay, người ta cũng thường dựa vào hàm lượng EGCG để đánh giá về chất lượng và kiểm soát chất lượng các sản phẩm dược phẩm, thực phẩm chức năng từ trà Do đó, việc nghiên cứu phương pháp chiết xuất cũng như nâng cao hàm lượng EGCG là một hướng nghiên cứu cần thiết cho việc phát triển các sản phẩm này

Trong các phương pháp phân tách các hợp chất hữu cơ từ thiên nhiên, phương pháp sắc ký cột là phương pháp được dùng nhiều vì những ưu điểm như độ phân giải cao, ổn định cao, không yêu cầu thiết bị quá phức tạp khi

áp dụng ở qui mô lớn, giá thành rẻ… Khi phân tách các catechins từ dịch chiết trà, phương pháp sắc ký cột chưa được áp dụng nhiều vì nguyên nhân chính là do các catechins có ái lực mạnh với pha tĩnh phân cực, thường bị giữ lại ở đầu cột trong phương pháp sắc ký cột pha thuận thông thường Để khắc phục nhược điểm này, người ta dùng phương pháp sắc ký cột pha đảo Tuy nhiên để áp dụng phương pháp pha đảo vào sản xuất công nghiệp qui

mô lớn sẽ rất tốn kém vì chất nhồi cột pha đảo thường là những vật liệu đắt tiền, quá trình rửa giải khôi phục phức tạp, hao tốn nhiều dung môi Do vậy, sắc ký cột pha đảo thường chỉ được dùng trong phân tích để định lượng các catechins

Những ưu điểm của phương pháp sắc ký cột là rất lớn nên người ta đã tiến hành nhiều nghiên cứu khác nhau để tách các catechins theo phương pháp này như sử dụng cột lignocellulose [34, 45], hay các loại nhựa hấp phụ

và trao đổi ion…[14, 21, 44, 48]; đã thu được các kết quả có tính hệ thống, chứng

tỏ khả năng có thể áp dụng để phân tách các catechins nói chung và EGCG nói riêng

Đề tài này tiến hành khảo sát phân tách EGCG trong dịch chiết trà

xanh bằng phương pháp sắc ký cột với pha tĩnh là một số loại nhựa trao đổi ion khác nhau Cơ sở lý thuyết dựa vào mô hình phân bố ngẫu nhiên

của phương pháp sắc ký trao đổi ion thường được áp dụng trong phân tách protein [42-43]

Mặt khác, hiện nay các sản phẩm sản xuất trong nước có thành phần EGCG, đều phải mua nguyên liệu từ các nhà cung cấp ngoài nước, phần lớn

là ở Trung Quốc Trong khi đó, nguồn nguyên liệu trà trong nước rất dồi dào nhưng chưa có phương pháp chiết xuất EGCG hiệu quả Một trong các nguyên nhân là các qui trình thường sử dụng những dung môi độc hại, tiềm

ẩn nguy cơ về an toàn vệ sinh thực phẩm, an toàn cháy nổ và ảnh hưởng

môi trường Do đó, đề tài nghiên cứu này lựa chọn sử dụng hệ dung môi

ethanol/nước, là hệ dung môi tương đối an toàn về mặt vệ sinh thực phẩm,

môi trường cũng như phù hợp với điều kiện an toàn của phần lớn cơ sở sản xuất; để xây dựng một qui trình chiết xuất, phân tách phù hợp, có thể phát triển ứng dụng thực tế nhằm tận dụng nguồn nguyên liệu trong nước, góp phần nâng cao hiệu quả kinh tế cho cây trà

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN

I.1 Các hợp chất hữu cơ trong cây

Các hợp chất hữu cơ có trong cây cỏ có thể phân loại như sau [10]

Halogenated Chlorosilphanol…

Alcohols

Fatty acids

Sulfides glucosinolates

Aldehydes ketones

ursolic acid, oleanic acid

Aromatics Non-phenolic aromatics chlorophylls, cytochromes, phytochromes,

gallic acid benzoquinone, napthoquinone

Amino acids , nonprotein amino acids and protein

Nucleosides, nucleotides, nucleic acids

Hình 0-1: Phân loại các hợp chất trong cây

I.2 Sơ lƣợc lý thuyết flavonoids

I.2.1 Cấu trúc, phân loại

Trong bài này, khi nói flavonoid là đề cập đến eu-flavonoid

- Phân loại các eu-flavonoids theo cấu trúc cơ bản [3, 5, 40]

Bảng 0-1 : Phân loại eu-flavonoids theo cấu trúc cơ bản

Flavones

I.2.2 Lý tính

- Trạng thái: flavonoid thường được phân lập dưới dạng

o Genin/glycoside: flavon(ol), flavanones, chalcones

o Chủ yếu genin: flavanonols, catechins, LACs

o Chủ yếu là glycoside: AC

- Màu sắc

o Flavanon(ol), dihydrochalcon (DHC): không màu

o Catechin, LAC: không màu

o Flavon, isoflavon: không màu – vàng nhạt

o Flavonol: vàng nhạt – vàng

o Chalcon, auron: vàng – đỏ cam

o Anthocyanidin: vàng, cam, đỏ, tím…

 trong cùng nhóm, càng ít nhóm -OH màu càng nhạt

- Độ bền các genin: flavon(ol) > flavanon(ol), chalcon, auron > catechin

- Độ tan của các genin: tan trong dung môi phân cực vừa đến phân cực mạnh (EtOAc, EtOH…) Kém tan trong dung môi kém phân cực Càng nhiều nhóm -OH càng khó tan trong dung môi kém phân cực Tan trong dung dịch kiềm loãng, kém tan trong dung dịch acid

- Độ phân cực: kém hơn đường, tannin; xấp xỉ saponosid, anthraglycoside; mạnh hơn sapogenin, anhthraquinon, phytosterol, coumarin, tinh dầu, chất béo Trong flavonoid, càng nhiều nhóm –OH độ phân cực càng mạnh

I.2.3 Hóa tính

- Mức độ oxi hóa các eu-flavonoids tăng dần theo thứ tự sau:

o catechin

o flavanonol, flavonon, leuco-anthocyanidyn (LAC)

o anthocyanidin (AC), flavon

o flavonol

- Nhóm –OH: tính acid yếu Độ acid của –OH giảm nếu ở gần nhóm carbonyl

- Nhóm –OH tạo glycoside với đường, tạo muối với dung dịch kiềm loãng,

tạo phức với ion kim loại (đặc biệt ở C3 và C5 hoặc ortho-diol ở vòng B)

- Vòng C(ɣ-pyron): có tính kiềm yếu, với acid tạo muối kém bền

- Vòng A, B: có thể tham gia phản ứng thế azoic với p-nitroanilin… trong môi trường kiềm yếu

I.2.4 Chiết xuất:

- Dùng ROH + nước: thu được glycoside, genin phân cực và tạp phân cực  loại tạp kém phân cực bằng dung môi kém phân cực  kết tinh, tủa trong dung môi thích hợp

- Dùng dung môi phân cực trung bình (CHCl3, CH2Cl2 ): thu được các genin + tạp kém phân cực (chất béo, chlorophyll)  loại tạp tiếp bằng các phương pháp thích hợp

- Dùng dãy dung môi:

- Trong sắc ký hấp phụ pha đảo: flavonoid ra sau đường, tannin (là các chất phân cực hơn flavonoid) – dung môi sử dụng là dung môi phân cực

- Sắc ký gel (rây phân tử): M lớn ra trước, M nhỏ ra sau

I.2.6 Một số phản ứng tạo phức màu với ion kim loại

- Với dung dịch FeCl3 loãng:  phức xanh (nâu, lá, đen): càng nhiều nhóm

-OH màu càng đậm Đặc biệt 3 nhóm OH ở C số 3’, 4’, 5’ (gallocatechin, gallocatechingallate, epigallocatechin, EGCG) cho màu xanh đen

- Với dung dịch chì acetate kiềm (polyphenol), hay trung tính

(ortho-diol-phenol) cho tủa màu vàng nhạt đến sậm

- Dung dịch AlCl3/ROH: thuốc thử tăng màu, quan sát dưới UV365nm

- Thuốc thử Martini Bettolo (SbCl5 / CCl4)

- Thuốc thử diazonium: flavonoids / Na2CO3  đỏ cam, đỏ

I.3 Hợp chất hữu cơ trong lá trà xanh

- Người ta thường phân loại hợp chất hữu cơ trong trà như sau

o Các hợp chất polyphenols: chiếm số lượng lớn, là những hợp chất có hoạt tính chính của trà: catechins, theaflavins, thearubigins, flavonols, phenolic acids

o Các hợp chất hữu cơ khác: alkaloids, lignans, saponins, pigments

H

OH

OH OH H OH

C (+)-catechin

O O

H

OH

OH OH H OH

EC (-)-epicatechin

O O

H

OH

OH OH OH OH

O O

H

OH

OH OH OH OH

GC (-)-gallocatechin EGC (-)-epigallocatechin

O O

H

OH

OH OH H O

O

OH OH OH

CG (-)-catechingallate

O O

H

OH

OH OH H O

O

OH OH OH

ECG (-)-epicatechingallate

O O

H

OH

OH OH OH

O H OH OH

GCG (-)-gallocatechingallate

O O

H

OH

OH OH OH

OH OH

O H

OH O

Theaflavin (TF-1)

Theaflavin-3-gallate (TF-2A)

O

OH OH

O H

O

OH

O H

OH OH

OH O

O

O H OH OH

OH O O

OH O

O

OH

O H

OH OH

OH O O

OH O

- Thearubigins có cấu trúc phức tạp, có khối lượng từ 1000 – 4000 Da

- Flavonols: ở dạng mono- hay triglycoside với các genin là kaempferol,

O H

OH

OH OH

quercetin

O

O OH

O H

OH

OH OH

OH

myricetin

- Các phenolic acid khác như:

O H O H OH

O OH

Gallic acid

O

OH OH

OH

Caffeic acid

I.3.2 Các hợp chất hữu cơ khác trong trà

H N

H3C

CH3O

O

Theobromine

N

N N N

CH3O

O O

O

H

O

O H

OH OH OH

OH OH OH

Secoisolariciresinol

O O

OH O

O O H

Matairesinol

- Saponins: dạng triterpenoid saponin

- Pigments: chlorophylls, carotenoids

I.3.3 Thành phần các chất trong lá trà tươi

- Thành phần các hợp chất có trong lá trà tươi có giá trị khác nhau, tùy thuộc vào giống trà, thổ nhưỡng, độ sinh trưởng… Thành phần có hàm lượng lớn nhất là các hợp chất polyphenols, mà trong đó phần lớn là các flavonoids

- Thành phần hóa học trong lá trà có thể xem trong phụ lục 5

I.4 Nhựa trao đổi ion [1, 37, 47]

I.4.1 Phân loại, một số tính chất

- Người ta thường phân loại nhựa trao đổi ion theo tính chất trao đổi Có 4 loại chính là :

o Nhựa trao đổi cation (cationit), có tính acid mạnh Có nhóm đặc

trưng là –SO3H, -PO3H Có khả năng phân ly thành ion linh động, khả năng trao đổi ít chịu ảnh hưởng pH

o Nhựa trao đổi cation (cationit), có tính acid yếu Có nhóm đặc trưng

là –COOH, -OH (của phenol) Khả năng phân ly yếu trong môi trường acid nên khả năng trao đổi trong môi trường acid thấp hơn trong môi trường base

o Nhựa trao đổi anion (anionit), có tính base mạnh Có nhóm đặc

trưng là amine bậc 4, liên kết với nhóm –OH bằng liên kết tĩnh điện Khả năng trao đổi ít phụ thuộc pH

o Nhựa trao đổi anion (anionit), có tính base yếu Có nhóm đặc trưng

là các amine bậc 1, 2, 3 Trao đổi trong môi trường acid tốt hơn trong môi trường kiềm

Ngoài ra, còn có các loại hỗn hợp các tính chất trên, hay có khả năng tạo chelate… để tăng độ chọn lọc cho một số ion đặc biệt nào đó

- Một cách tổng quát, có thể xem cấu tạo của nhựa trao đổi ion bao gồm một mạng lưới polymer hay copolymer (thường là polystyrene, divinylbenzene

(DVB), polyacrylic, methacrylic…), trên đó có gắn thêm các nhóm đặc trưng khác nhau để thay đổi tính chất trao đổi ion của nhựa

- Một số dạng nhựa trao đổi ion thường gặp là

o Sulfonated polystyrene divinylbenzene crosslinked: cationit có tính acid mạnh

Hay người ta có thể thực hiện biến đổi các nhóm đặc trưng để tạo thành anionit có tính base mạnh

Hay tính base yếu

o Copolymer giữa phenol và formaldehyde: cationit acid mạnh

o Polyacrylic hoặc polymethacrylic crosslinked với divinylbenzene

- Tính chất vật lý của nhựa cũng là một đặc điểm quan trọng, trong một số trường hợp có ảnh hưởng lớn đến hiệu quả hoạt động của chúng Ví dụ cấu trúc vật lý của nhựa gồm có các dạng (a): gel, (b): isoporous, (c): macroporous (macroreticular).

Ngoài ra, các đặc điểm như cỡ hạt, kích thước lổ xốp, hình dạng hạt, diện tích bề mặt, độ xốp, độ trương, lượng nối ngang, cũng là các đặc điểm quan trọng ảnh hưởng đến tính chất của nhựa

I.4.2 Cơ chế trao đổi ion

- Sơ đồ biểu diễn cơ chế chung của quá trình trao đổi ion như sau:

Hình 0-2 : Cơ chế quá trình trao đổi ion

(1) quá trình phân tách thành ion cần trao đổi trong dung dịch

(2) ion cần trao đổi sẽ khuyếch tán trong dung dịch đến lớp dung dịch trên bề mặt chất trao đổi (nhựa) Tăng quá trình này bằng cách khuấy, nếu trong cột thì sự chuyển động hỗn loạn của dòng pha động làm quá trình này diễn ra nhanh

(3) ion cần trao đổi khuyếch tán qua lớp màng đến bề mặt chất trao đổi Quá trình này tuân theo định luật Nernst-Planck Yếu tố quyết định là đặc tính di chuyển của ion trao đổi

(4) ion cần trao đổi khuyếch tán bên trong vật liệu Quá trình này phụ thuộc vào tính chất của vật liệu Động lực của quá trình là gradient nồng độ

(5) Kết hợp giữa ion cần trao đổi và nhóm chức của vật liệu

(6) Phân tách của ion trao đổi ra khỏi chất trao đổi

(7) Ion trao đổi tách ra sẽ khuyếch tán đến bề mặt của vật liệu trao đổi Quá trình này diễn ra để đảm bảo nguyên tắc cân bằng điện tích trong vật liệu (8) (9) ion trao đổi sẽ khuyếch tán qua lớp màng trên bề mặt và khuyếch tán vào dung dịch

- Cơ chế trên chỉ là trường hợp tổng quát đối với ion vô cơ và khi các quá trình diễn ra mà không có sự cản trở nào Trong từng trường hợp cụ thể, quá trình sẽ có sự khác nhau, và giai đoạn nào chậm nhất sẽ quyết định tốc độ chung

- Khi quá trình xảy ra với các ion hữu cơ, cơ chế phức tạp hơn và thường khó

xác định rõ Có thể nêu một số nguyên nhân như:

o Các ion hữu cơ có kích thước lớn, có thể chịu tác động của yếu tố kích thước mao quản của vật liệu

o Các hợp chất hữu cơ thường có nhiều nhóm có thể tạo thành ion, mà mỗi ion lại có độ tích điện khác nhau Hơn nữa, có thể tạo thành ion dương và âm trong cùng một phân tử

o Hiệu ứng không gian có thể quyết định vị trí nhóm mang điện tích

o Có những nhóm chức có thể tạo liên kết phối trí, hydro, Van der Waals

o Các hợp chất hữu cơ có thể tạo thành dimer, trimer…

I.5 Sắc ký lỏng [19]

I.5.1 Phân loại

o CEC – capillary electrochromatography

o NP – normal phase

o RP – reversed phase

o IEX – ion-exchange

o SEC – size-exclusion chromatography

- Sắc ký lỏng có 4 loại chính là NP, RP, IEX và SEC Lực tương tác phân tử trong trường hợp là NP là sự phân cực, RP – sự phân bố, IEX – lực ion; còn trong SEC là kích thước vật lý

- Đặc điểm chung của các phương pháp NP, RP, IEX: dựa vào lực tương tác

bề mặt Do đó, pha tĩnh có diện tích bề mặt càng lớn thì thời gian lưu càng lớn và khả năng phân tách càng lớn

I.5.1.1 NPLC (Normal phase liquid chromatography)

- Dựa vào sự khác nhau của lực tương tác phân cực giữa chất phân tích và

pha tĩnh Tương tác này càng mạnh chất phân tích càng bị giữ lại lâu trong cột Nếu pha động tương tác mạnh với pha tĩnh, nó sẽ cạnh tranh với chất phân tích làm tương tác giữa chất phân tích và pha động yếu đi, thời gian lưu sẽ giảm

- Pha động là chất không phân cực (hexane, heptan…) và thêm một ít các chất phân cực (methanol, ethanol…) Các chất phân cực thêm vào pha động

để hiệu chỉnh thời gian lưu của chất phân tích

- Thành phần của pha động có ảnh hưởng lớn đến thời gian lưu của tác chất – thời gian lưu rất nhạy với thành phần pha động

I.5.1.2 RPLC (Reversed phase liquid chromatography)

- Ngược với NPLC, RPLC phân tách các chất dựa vào lực phân bố (tính ưa

nước hay tương tác Van der Waals)

- Bề mặt pha tĩnh kỵ nước, pha động là chất thân nước

- Ưu điểm: phân tách được các chất gần giống nhau Giải thích: lực phân bố

là lực tương tác phân tử yếu nhất, do đó năng lượng nền trong quá trình sắc

ký thấp  có thể phân biệt được những khác biệt nhỏ trong tương tác phân

tử của các chất gần giống nhau

I.5.1.3 IEX (Ion-exchange chromatography)

- Dựa vào lực tương tác giữa ion chất phân tích với các tâm ion trái dấu trên

pha tĩnh (nhựa trao đổi ion hay chất kỵ nước được hấp phụ ion)

- Ví dụ quá trình trao đổi 2 ion A+, B+ giữa dung dịch và nhựa trao đổi ion E

-[ ][ ][ ][ ]

Hệ số K càng lớn, khả năng B+ thay thế cho A trên bề mặt càng lớn

I.5.1.4 SEC (Size-exclusion chromatography)

- Quá trình phân tách dựa vào bán kính thủy động của chất phân tích Bán

kính thủy động càng lớn, thời gian lưu càng thấp

- Các tên gọi khác

o GFC : gel-filtration chromatography

o GPC : gel-permeation chromatography

- Trong SEC, tương tác giữa chất phân tích và pha động cần phải tránh Chất

có khối lượng phân tử càng lớn, bán kính thủy động càng lớn, càng bị rửa giải nhanh

- Dung môi được lựa chọn là chất liên kết mạnh với pha động hơn chất phân tích, từ đó ngăn cản sự tương tác chất phân tích với bề mặt pha tĩnh

- Trong điều kiện đó, các chất có phân tử nhỏ sẽ dễ dàng đi vào bên trong các khoảng trống mao quản; do đó, quá trình di chuyển của chúng qua cột sẽ lâu hơn (đường đi dài hơn) Ngược lại, các chất có phân tử lớn sẽ không đi được vào trong các mao quản và do đó sẽ đi theo con đường bên ngoài các hạt pha tĩnh, và bị rửa giải sớm hơn Tóm lại, các chất có phân tử càng lớn

sẽ ra khỏi cột càng sớm

Hình 0-3 : Sơ đồ quá trình sắc ký rây phân tử (SEC)

I.5.2 Các thông số đặc trƣng của sắc ký lỏng

- Retention volume VR, retention time tR: VR = F tR (F: tốc độ dòng pha

động)

- Void volume / time: V0 , t 0 : V0 = F t0

- Retention factor k

o Tỉ lệ với hệ số phân bố chất phân tích giữa pha động và pha tĩnh k~K

o Theo nhiệt động học, hằng số cân bằng K được biểu diễn qua hàm số

mũ của năng lượng tự do Gibbs, có sự cạnh tranh giữa chất phân tích

và dung môi lên trên pha tĩnh

o Thành phần ∆Geluent phụ thuộc vào thành phần dung môi, nếu dung môi tương tác mạnh với pha tĩnh, ∆Geluent lớn, K sẽ nhỏ, tức là thời gian lưu của chất phân tích sẽ nhỏ

- Selectivity α:

o Khi α = 1, hai peak trùng lắp nên không tách ra được

o Selectivity α phụ thuộc vào sự khác biệt của tương tác giữa 2 chất

cần tách với pha tĩnh Ảnh hưởng của pha động là thứ yếu (qua các

hiệu ứng như solvate, ion hóa…) Do đó, muốn nâng selectivity α,

nói chung, phải quan tâm đến việc lựa chọn pha tĩnh phù hợp

- Efficiency , đĩa lý thuyết (theoretical plate) N

o Khi nạp mẫu vào cột, tất cả các chất đều nằm trong một vùng rất nhỏ Sau khi đi qua cột, các chất sẽ tách nhau ra, hình thành một

vùng rộng hơn Efficiency đặc trưng cho mức độ kéo dãn này

o Martin và Synge là người đưa ra lý thuyết đĩa: các chất phân tích sẽ ngay lập tức lập cân bằng với pha tĩnh và chia cột thành một số đĩa giả định Mỗi đĩa có chiều cao nhất định gọi là chiều cao đĩa lý

thuyết HETP (height of effective theoretical plate) Mỗi chất phân

tích được xem như nằm trên mỗi đĩa trong một khoảng thời gian nhất định, là thời gian để thiết lập trạng thái cân bằng Chiều cao đĩa càng nhỏ, số đĩa càng lớn, quá trình phân tách các chất càng dễ

o Số đĩa lý thuyết tính theo công thức

o Các nhân tố ảnh hưởng đến efficiency là các yếu tố động học của hệ

thống, như khuyếch tán phân tử, động lực của dòng, đặc điểm của cột, tốc độ dòng Tốc độ dòng lớn sẽ giảm thời gian khuyếch tán phân tử, nhưng chất phân tích phải đi một đoạn xa hơn để thiết lập cân bằng nhiệt động – hai tác dụng ngược nhau, do đó phải chọn chế

độ sao cho đạt efficiency cao nhất

- Efficiency N phụ thuộc vào tính chất vật lý của cột, selectivity α phụ thuộc

vào tương tác giữa chất phân tích và bề mặt chất nhồi trong cột Hai yếu tố này được xem xét đồng thời để thiết lập chế độ phân tách tốt nhất

- Resolution R: Tỉ lệ khoảng cách 2 peak và chiều rộng trung bình của chúng

- Trong phần lớn các trường hợp thực tế (k > 5), ta có

- Giá trị R tổng hợp các ảnh hưởng của 3 thông số: selectivity α, efficiency N

và retention factor k Giá trị R thích hợp vào khoảng 1.5

- Muốn điều chỉnh R, ta cần quan tâm trước tiên đến selectivity α, retension

factor k (phụ thuộc vào sự khác biệt lực tương tác với bề mặt pha tĩnh giữa

chất phân tích và dung môi, hay giữa các chất phân tích) Sau đó mới đến

efficiency N (phụ thuộc vào tính chất động học của cột) - ảnh hưởng bậc ½

I.6 Lƣợc khảo các công trình nghiên cứu

I.6.1 Xử lý nguyên liệu

- Muốn thu được nhiều các hợp chất catechins mong muốn cần phải xử lý làm bất hoạt các enzyme xúc tác cho quá trình oxi hoá các catechins, như phenoloxidase, peroxidase… Cách phổ biến nhất là dùng hơi nước (100oC) trong 2-3 phút Ngoài ra, cũng có các cách diệt men khác được nghiên cứu:

o Hà (2006) [2, 30] đã dùng phương pháp xử lý bằng vi sóng trong thời gian 90s Mẫu lá trà sau khi xử lý không có hiện tượng biến màu do quá trình lên men và lượng catechins chiết được giảm không đáng

kể Tuy nhiên việc ứng dụng công nghệ xử lý bằng vi sóng vào sản xuất số lượng lớn còn nhiều khó khăn về thiết bị

o Liang (2007) [22]: đã dùng phương pháp đun lá trà tươi trong nước sôi (100oC) trong 3 phút, tỉ lệ nước:nguyên liệu (20:1) Phương pháp này vừa diệt men vừa loại được 83% caffeine, mặc dù lượng catechins sẽ

bị giảm đi 5% so với phương pháp dùng hơi nước Đây là kết quả rất thiết thực, có thể áp dụng vào thực tiễn Hạn chế của phương pháp là phải thực hiện xử lý sớm sau khi thu hoạch để hạn chế sự thất thoát catechins

o Omiadze (2007)[26] đã dùng khí sulfur dioxide trong buồng kín, nồng

độ 100 – 150 mg/L, trong 30 – 60s Kết quả diệt men tương đương với phương pháp dùng hơi nước

I.6.2 Chiết xuất catechins từ trà xanh

- Phương pháp hiện nay đang được ứng dụng thực tế nhiều nhất trong việc

chiết xuất các hợp chất thiên nhiên là phương pháp gia nhiệt hoàn lưu với

dung môi Có nhiều công trình nghiên cứu với các phương pháp khác nhau

để nâng cao hiệu quả quá trình chiết xuất Ví dụ:

- Chiết xuất có sự hỗ trợ của vi sóng (microwave-assisted extraction (MAE))

o Pan (2003) [27]: công suất 700W, dung môi cồn Xác định được điều kiện chiết xuất tốt nhất là cồn 50%, thời gian 4 phút, tỉ lệ dung môi:nguyên liệu (20:1) Trong điều kiện đó, nồng độ

polyphenol trong dịch chiết (30%)cao hơn các phương pháp ngâm chiết ở nhiệt độ phòng trong 20h, chiết có hỗ trợ bằng siêu âm siêu

âm trong 90 phút, hay đun hoàn lưu trong 45 phút (28%)

o Quan (2006) [30]: 800W, dung môi cồn Xác định được điều kiện chiết xuất tốt nhất là cồn 60%, 6 phút, tỉ lệ dung môi : dược liệu (6:1) Hiệu suất chiết polyphenol đạt 82.46%, cao hơn phương pháp ngâm chiết trong 24h, siêu âm 60 phút, hay đun hoàn lưu trong 60 phút

o Spigno (2009) [38]: ở điều kiện chiết xuất 600W, 100-150s, dùng dung môi nước cất, lượng polyphenol chiết được cao hơn phương pháp đun hoàn lưu thông thường Tác giả cũng đã xây dựng được mô hình chỉ sự phụ thuộc của nồng độ polyphenols trong dịch chiết theo

tỉ lệ dung môi : nguyên liệu

 Phương pháp chiết xuất polyphenol từ trà xanh có sự hỗ trợ của vi sóng có hiệu suất cao hơn một số phương pháp khác Tuy nhiên, việc ứng dụng vào thực tế sản xuất còn nhiều khó khăn do hạn chế của việc mở rộng qui mô và khó kiểm soát nhiệt độ

- Dùng carbon dioxide siêu tới hạn (supercritical carbon dioxide extraction

(SC-CO 2 ))

o Içen (2009) [15]

: dùng CO2 ở 250 bar, tốc độ 11 g/phút, thời gian 7h

để chiết xuất caffeine từ phụ phẩm chế biến trà (thân, cuốn,…), đạt được hiệu suất cao hơn phương pháp chiết bằng chloroform

o Meterc (2008) [25]

: dùng CO2 siêu tới hạn để sấy phun dịch chiết trà xanh Chiết bằng cách đun với nước, tỉ lệ dung môi : nguyên liệu (10:1) thu được kết quả: nhiệt độ tốt nhất là 80oC

SC-CO2 với ethanol để tách caffeine và EGCG vì độ chọn lọc chỉ đạt mức 0.24 Nếu chỉ dùng nước, độ lựa chọn caffeine/EGCG đạt 0.88

o Park (2007) [28]

: dùng SC-CO2 với ethanol 95% làm dung môi hỗ trợ

để chiết caffeine và catechins từ trà xanh Xác định được điều kiện tốt nhất là 80oC, 300 bar Quá trình chiết tuân theo qui luật chuyển khối giữa nguyên liệu và dung môi, tức lượng chất chiết được tăng khi tăng lưu lượng dòng CO2, kích thước bột trà giảm

o Chang (2000) [8-9]

: tỉ lệ catechin tổng / caffeine tăng dần theo tỉ lệ ethanol sử dụng cùng với 400 L SC-CO2, 31 Mpa Tuy nhiên tỉ lệ này thấp hơn phương pháp chiết bằng Sohlex với dung môi ethanol 95%

 CO2 siêu tới hạn là dung môi có nhiều ưu điểm: không độc, không cháy, thân thiện với môi trường, tương đối rẻ, sản phẩm thu được không lẫn dung môi… rất hữu hiệu để chiết xuất các hợp chất thiên nhiên Hạn chế là phải thực hiện ở áp suất cao Ứng dụng SC-CO2vào việc chiết xuất trà xanh phần lớn là để chiết xuất caffeine, hay loại caffeine khỏi các sản phẩm catechins

- Chiết xuất ở áp suất cao (pressurized liquids)

o Jun (2009) [16-18]: chiết xuất lá trà xanh với dung môi EtOH 50%, tỉ lệ dung môi : nguyên liệu (20:1), ở áp suất 400MPa trong 15 phút; hiệu suất tương đương với quá trình đun hoàn lưu trong 2h ở 85oC Tỉ lệ tổng catechin : caffeine là 5.6 Nếu chiết caffeine từ toàn cây trà xanh, hiệu suất cao nhất (4± 0.22%) đạt được ở điều kiện nồng độ cồn 50%, tỉ lệ dung môi : nguyên liệu (20:1), áp suất 500 MPa, trong

1 phút Nếu chỉ tính polyphenol thì điều kiện tối ưu là EtOH 50%, tỉ

lệ 20:1, áp suất 500MPa, trong 1 phút; thu polyphenols hiệu suất 30

± 1.3% tương đương với chiết hoàn lưu trong 45 phút, siêu âm trong

methanol ở trạng thái lỏng), trong 10 phút; thu được catechin, epicatechin lần lượt là 0.62, 0.31 (mg/g), so với phương pháp khuấy trộn gia nhiệt (60o

C, 10 phút) là 0.23, 3.45 (mg/g)

 Chiết xuất ở áp suất cao sẽ giúp quá trình chuyển khối xảy ra nhanh hơn, do đó thời gian chiết giảm, giúp bảo vệ các hoạt chất Phương pháp này thực hiện trong môi trường suất cao nhưng với dung môi thông thường, do đó dễ dàng chọn dung môi thích hợp cho chất cần chiết Tóm lại, đây là phương pháp có nhiều ưu điểm nhưng chưa được nghiên cứu ứng dụng nhiều trong chiết xuất trà xanh

- Chiết xuất có sự hỗ trợ của siêu âm (ultrasonic-assisted extraction) ứng

dụng trong chiết xuất trà xanh chủ yếu khi cần giữ hương vị (các hợp chất

dễ bay hơi) trong các qui trình sản xuất thực phẩm, nước uống… [41]

I.6.3 Phân tách catechins từ dịch chiết trà xanh

- Muốn thu được sản phẩm có hàm lượng catechin cao, trước tiên phải lựa chọn phương pháp chiết xuất có độ chọn lựa catechin cao Dịch chiết trà xanh tiếp tục được xử lý để nâng cao hàm lượng catechin, giảm hàm lượng các thành phần không mong muốn Có nhiều phương pháp phân tách catechin từ dịch chiết trà xanh được nghiên cứu, trong đó một phần quan trọng là các phương pháp loại bỏ caffeine, một alkaloid có hoạt tính, chiếm khoảng 2-4% hàm lượng chất khô trong dịch chiết Một số kết quả nghiên cứu đã được công bố như sau:

- Dùng phương pháp sắc ký cột:

o Ye (2009) [45]: dùng cột lignocellulose từ cây trà, dung môi rửa giải

là EtOH nồng độ từ 0 – 80%, thu được kết quả: phân đoạn nồng độ EtOH từ 0 – 10%: caffeine và non-gallate catechins; phân đoạn > 20%: các gallated-catechins, trong đó EGCG thu được chủ yếu ở cuối phân đoạn 40% và đầu phân đoạn 60% Khi rửa giải với nồng

độ dung môi 10% và 80%, ở phân đoạn 80% thu được EGCG có