Xây dựng quy trình sản xuất và tiêu chuẩn hóa bộ kit thử định lượng bilirubin trực tiếp trong huyết thanh bằng phương pháp diazo hóa

I - TÊN ĐỀ TÀI: XÂY DỰNG QUY TRÌNH SẢN XUẤT VÀ TIÊU CHUẨN HOÁ BỘ KIT THỬ ĐỊNH LƯỢNG BILIRUBIN TRỰC TIẾP TRONG HUYẾT THANH BẰNG PHƯƠNG PHÁP DIAZO HÓA II - NHIỆM VỤ LUẬN VĂN: − Xây dựng

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP.HCM BỆNH VIỆN QUẬN 4 TP.HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS-TS TRẦN THANH NHÃN

Cán bộ chấm nhận xét 1:

Cán bộ chấm nhận xét 2:

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại:

HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA, ngày 22 tháng 07 năm 2010

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHIÃ VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc

TP HCM, ngày 22 tháng 07 năm 2010

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ và tên học viên: NGUYỄN THỊ PHƯƠNG TRANG Giới tính : Nữ

I - TÊN ĐỀ TÀI:

XÂY DỰNG QUY TRÌNH SẢN XUẤT VÀ TIÊU CHUẨN HOÁ

BỘ KIT THỬ ĐỊNH LƯỢNG BILIRUBIN TRỰC TIẾP TRONG HUYẾT THANH BẰNG PHƯƠNG PHÁP DIAZO HÓA

II - NHIỆM VỤ LUẬN VĂN:

− Xây dựng quy trình sản xuất bộ kit thử định lượng Bilirubin trực tiếp trong

huyết thanh bằng phương pháp Diazo hóa

− Khảo sát độ đúng, độ chính xác, độ tuyến tính của bộ kit với các huyết thanh

kiểm tra

− Kiểm tra độ ổn định của bộ kit bằng phương pháp dài hạn và phương pháp già

− Sử dụng bộ kit thử trên trong xét nghiệm có so sánh thống kê với bộ kit ngoại

nhập đang sử dụng

III - NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : tháng 12 năm 2009

IV - NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ : tháng 07 năm 2010

V - HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN : PGS-TS TRẦN THANH NHÃN

Nội dung và đề cương luận văn thạc sĩ đã được Hội đồng chuyên ngành thông qua

TRƯỞNG PHÒNG ĐÀO TẠO SĐH TRƯỞNG KHOA QL NGÀNH

(Họ tên và chữ ký)

LỜI CẢM ƠN

Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:

- Thầy hướng dẫn tôi: PGS-TS Trần Thanh Nhãn

- Cô chủ nhiệm của tôi: TS Nguyễn Thúy Hương

- Quý Thầy Cô trong bộ môn Công nghệ sinh học – trường Đại học Bách khoa TP.HCM

- Gia đình tôi,

- Quý đồng nghiệp,

- Bạn bè cùng học lớp cao học 2008

Xin được cảm ơn tất cả đã giúp tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp này !

TÓM TẮT

Đề tài luận văn “Xây dựng quy trình sản xuất và tiêu chuẩn hóa bộ kit thử định lượng Bilirubin trực tiếp trong huyết thanh bằng phương Diazo hóa” được thực hiện với mục tiêu ứng dụng phần mềm vi tính (Design-Expert, FormRules, INForm, Microsoft Office Excel) kết hợp với thực nghiệm để thiết kế và tối ưu hóa công thức pha chế bộ kit định lượng Bilirubin trực tiếp Thành phần công thức tối ưu của bộ

kit: nồng độ acid sulfanilic = 49,3252 mmol/L, Natri nitrit = 73,3275 mmol/L

độ ổn định của bộ kit theo thời gian và bằng phương pháp già hóa cấp tốc, từ đó dự

đoán hạn sử dụng của bộ kit.Thời hạn sử dụng bộ kit được dự đoán là 62 tháng kể

trực tiếp trong huyết thanh của 217 lượt bệnh nhân và 30 mẫu huyết thanh nội kiểm tra tại khoa xét nghiệm bệnh viện Quận 4-TP.HCM và có so sánh thống kê kết quả với bộ kit ngoại nhập (ISE - Ý) đang sử dụng tại đây

Kết quả của đề tài sẽ góp phần tạo ra các dòng sản phẩm nội địa trong lĩnh vực xét nghiệm, nhằm hạ giá thành sản phẩm và giảm chi phí cho bệnh nhân

Abstract

The project, make a manufacturing process and standardization bilirubin direct quantitative of a kit in serum by diazo method, is performed towards applying the software such as Design-Expert, FormRules, INForm, Microsoft Office Excel to design and be optimum mixing formular for bilirubin direct quantitative kit by diazo

method Ingredients of optimum formular of a kit include: concentration of acid sulfanilic = 49,3252 mmol/L, concentration of Natri nitrit = 73,3275 mmol/L

Based on the optimum formular, we prepare medicines to test the stable kit by

kit The predicted expiry date of the kit is 62 months from the manufacture date at

On the other hands, we use this kit to determine the bilirubin direct quantitative

in serum of 217 patients and serum of 30 IQC (Internal Quality Control) at biochemistry department of district 4 hospital at Ho Chi Minh City And then we compare to imported kit (ISE - Italy) are using at our hospital

The result of this project is a foundation for manufacturing research to other biochemical kits in Vietnam, and this result also contributes to create the series of domestic products in test field Therefore we can reduce the product price and lighten the expense of patient

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN

LỜI CẢM ƠN

TÓM TẮT

MỤC LỤC

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Tổng quan về bilirubin 5

2.1.1 Cấu trúc hóa học của bilirubin 5

2.1.2 Chuyển hóa bilirubin 7

2.1.2.1 Tạo biliverdin 7

2.1.2.2 Tạo bilirubin 8

2.2 Bệnh lý liên quan 11

2.2.1 Chỉ số bilirubin ở người bình thường 11

2.2.2 Thay đổi sinh lý 11

2.2.2.1 Bilirubin gián tiếp tăng 11

2.2.2.2 Bilirubin trực tiếp tăng 11

2.2.2.3 Một số hội chứng rối loạn chuyển hóa bilirubin di truyền 12

2.2.2.4 Các thể vàng da 14

2.3 Các phương pháp định lượng bilirubin trong huyết thanh 15

2.3.1 Phương pháp diazo hóa 15

2.3.1.1 Lịch sử phát triển 15

2.3.1.2 Nguyên tắc 15

2.3.2 Các phương pháp định lượng khác 17

2.3.2.1 Phương pháp enzym 17

2.3.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng cao áp 17

2.3.2.3 Phương pháp đo bilirubin xuyên da 18

2.3.3 Ưu và nhược điểm của các phương pháp định lượng bilirubin 19

2.3.4 Các quy trình tham khảo 19

2.4 Thiết kế và tối ưu hóa công thức 21

2.4.1 Thiết kế mô hình thực nghiệm 21

2.4.1.1 Mô hình công thức (formulation designs) 22

2.4.1.2 Mô hình quy trình (process designs) 22

2.4.1.3 Mô hình kết hợp (combined designs) 22

2.4.2 Nghiên cứu liên quan nhân quả 23

2.4.3 Tối ưu hóa công thức 23

2.4.4 Ứng dụng phần mềm vi tính 24

2.4.4.1 Các phần mềm thông minh 24

2.4.4.2 Cấu tạo của các phần mềm thông minh 27

2.4.4.3 Ứng dụng phần mềm thông minh 29

2.5 Thẩm định quy trình định lượng 30

2.5.1 Miền giá trị - khoảng tuyến tính 30

2.5.1.1 Khảo sát khoảng tuân theo định luật Lambert – Beer 30

2.5.1.2 Sự lệch khỏi định luật Beer 30

2.5.1.3 Miền giá trị (khoảng tuyến tính) 31

2.5.2 Xây dựng phương trình hội quy tuyến tính 31

2.5.2.1 Công thức tính hệ số hồi quy 32

2.5.2.2 Phương sai tái hiện 32

2.5.2.3 Kiểm định sự có nghĩa của các hệ số hồi quy theo Student 32

2.5.2.4 Kiểm định sự tương thích của mô hình với thực nghiệm theo tiêu chuẩn Fisher 33

2.5.3 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 33

2.5.4 Độ đặc hiệu (specific) 34

2.5.5 Độ chính xác (precision) 34

2.5.5.1 Độ lặp lại (repeatibility) 34

2.5.5.2 Độ chính xác trung gian (intermediate precision) 34

2.5.5.3 Độ sao chép lại (reproducibility) 35

2.5.6 Độ đúng (accuracy) 35

2.6 Độ ổn định 36

2.6.1 Độ ổn định của thuốc 36

2.6.2 Hạn dùng của thuốc 36

2.6.3 Nghiên cứu độ ổn định của thuốc 36

2.6.3.1 Phương pháp thử độ ổn định thực hay phương pháp theo dõi tự nhiên (real time method) 36

2.6.3.2 Phương pháp thử độ ổn định cấp tốc hay phương pháp già hóa cấp tốc (aging method) 36

Chương 3 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 39

3.1 Nguyên liệu, hóa chất và trang thiết bị 40

3.1.1 Hóa chất và dung môi 40

3.1.2 Chất chuẩn và chất thử 40

3.1.3 Thiết bị nghiên cứu 41

3.1.4 Phần mềm chuyên dụng 42

3.2 Phương pháp nghiên cứu 43

3.2.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu 43

3.2.2 Xây dựng công thức tối ưu và quy trình điều chế bộ kit theo phương pháp thực nghiệm 43

3.2.2.1 Quy trình định lượng creatinin trong huyết thanh 43

3.2.2.2 Thăm dò sơ bộ các yếu tố ảnh hưởng 46

3.2.2.3 Thăm dò mối liên quan nhân quả 46

3.2.2.4 Tối ưu hóa quy trình 47

3.2.3 Thẩm định quy trình định lượng 50

3.2.3.1 Thẩm định quy trình tối ưu 50

3.2.3.2 So sánh quy trình tối ưu và quy trình tham khảo 52

3.2.4 Thử nghiệm độ ổn định của bộ kit 52

3.2.4.1 Theo dõi độ ổn định của bộ kit theo phương pháp dài hạn 53

3.2.4.2 Theo dõi độ ổn định của bộ kit theo phương pháp già hoá cấp tốc 54 3.2.4.3 Xác định tuổi thọ của bộ thuốc thử 57

3.2.5 Ứng dụng bộ kit nghiên cứu trên mẫu thử thật và so sánh với bộ kit ngoại nhập 57

3.2.6 Tính toán hiệu quả kinh tế của bộ kit 58

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 59

4.1 Xây dựng quy trình bào chế bộ kit 60

4.1.1 Thăm dò sơ bộ các yếu tố ảnh hưởng 60

4.1.1.1 Ảnh hưởng của nồng độ acid sulfanilic đến độ hấp thu 60

4.1.1.2 Ảnh hưởng của nồng độ natri nitrit đến độ hấp thu 61

4.1.1.3 Ảnh hưởng của thời gian ủ đến độ hấp thu 62

4.1.1.4 Ảnh hưởng của acid clohydric đến độ hấp thu 63

4.1.2 Thăm dò nhân quả 64

4.1.2.1 Mô hình thí nghiệm 64

4.1.2.2 Kết quả thực nghiệm 67

4.1.2.3 Liên quan nhân quả 68

4.1.3 Tối ưu hóa công thức 70

4.1.3.1 Dữ liệu đầu vào cho phần mềm INForm 71

4.1.3.2 Luyện mạng thần kinh 72

4.1.3.3 Điều kiện tối ưu hóa 72

4.1.3.4 Kết quả tối ưu hoá 73

4.2 Thẩm định quy trình định lượng 74

4.2.1 Thẩm định quy trình tối ưu 74

4.2.1.1 Khoảng tuyến tính 74

4.2.1.2 Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính 81

4.2.1.3 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 82

4.2.1.4 Độ đặc hiệu 83

4.2.1.5 Độ chính xác 84

4.1.2.6 Độ đúng 86

4.2.2 So sánh quy trình tối ưu và quy trình tham khảo 87

4.2.2.1 Đánh giá quy trình tham khảo 87

4.2.2.2 So sánh thành phần thuốc thử và điều kiện tiến hành 89

4.2.2.3 So sánh các chỉ số thống kê 89

4.3 Thử nghiệm độ ổn định của bộ kit 90

4.3.1 Theo dõi độ ổn định của bộ kit theo thời gian 90

4.3.2 Theo dõi độ ổn định của bộ kit theo phương pháp già hoá cấp tốc 93 4.3.2.1 Điều kiện theo dõi ở nhiệt độ 25 o C ± 3 o C 93

4.3.2.2 Điều kiện theo dõi ở nhiệt độ 40 o C ± 3 o C 97

4.3.2.3 Áp dụng phương trình Arrhenius tính tuổi thọ bộ kit 99

4.3.3 Xác định tuổi thọ của bộ thuốc thử 102

4.4 Ứng dụng bộ kit nghiên cứu trên mẫu thử thật và so sánh kết quả với bộ kit ngoại nhập 102

4.5 Tính toán hiệu quả kinh tế của bộ kit 103

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 104

5.1 Kết luận 105

5.1.1 Xây dựng công thức và quy trình bào chế 105

5.1.2 Xây dựng và thẩm định quy trình 105

5.1.3 Thử nghiệm độ ổn định của bộ kit 105

5.1.4 Ứng dụng bộ kit trên mẫu thật và so sánh kết quả với bộ ngoại nhập 105

5.1.5 Tính toán hiệu quả kinh tế của bộ kit 105

5.2 Đề nghị 105

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Bảng 2.1 - Ưu, nhược điểm của các phương pháp định lượng bilirubin 19

Bảng 2.2 - Các quy trình tham khảo 20

Bảng 2.3 -Thời gian cần thiết để kiểm tra lại kết quả phụ thuộc vào tbảo quản [5] 37

Bảng 3.1 - Hóa chất và dung môi: 40

Bảng 3.2 - Chất chuẩn và chất thử: 40

Bảng 3.3 - Trang thiết bị được sử dụng: 41

Bảng 3.4 - Phần mềm được sử dụng 42

Bảng 3.5 - Thành phần của quy trình định lượng bilirubin trực tiếp 45

Bảng 3.6 - Mẫu cho tiến hành thử nghiệm độ đặc hiệu 51

Bảng 3.7 - Thể tích thuốc thử cần dùng thử nghiệm độ ổn định (dự kiến) 53

Bảng 3.8 - Thời khóa biểu tiến hành thử độ ổn định theo phương pháp dài hạn (dự kiến) 54

Bảng 3.9 - Thời khóa biểu tiến hành thử độ ổn định theo phương pháp già hoá ở 250C ± 30C, độ ẩm tương đối 75% ± 5% (dự kiến) 55

Bảng 3.10 - Thời khóa biểu tiến hành thử độ ổn định theo phương pháp già hoá ở 400C ± 30C, độ ẩm tương đối 75% ± 5% (dự kiến) 56

Bảng 4.1 - Sự phụ thuộc độ hấp thu (Y) theo nồng độ acid sulfanilic 60

Bảng 4.2 - Sự phụ thuộc độ hấp thu (Y) theo nồng độ natri nitrit 61

Bảng 4.3 - Sự phụ thuộc độ hấp thu (Y) theo thời gian ủ 62

Bảng 4.4 - Sự phụ thuộc độ hấp thu (Y) theo nồng độ acid chlohydric 63

Bảng 4.5 - Các yếu tố và mức được khảo sát trong mô hình D-Optimal 64

Bảng 4.6 - Mô hình D-Optimal 65

Bảng 4.7 - Dữ liệu của mô hình D-Optimal 66

Bảng 4.8 - Kết quả thực nghiệm theo mô hình D-Optimal (thăm dò nhân quả) 67

Bảng 4.9 - Dữ liệu đầu vào cho phần mềm FormRules 68

Bảng 4.10 - Các yếu tố ảnh hưởng đến độ hấp thu 69

Bảng 4.11 - Đầu vào cho phần mềm INForm 71

Bảng 4.12 - Thành phần công thức tối ưu của bộ kit 73

Bảng 4.13 - Độ hấp thu đo được ở các nồng độ khảo sát khoảng tuyến tính (từ 0 đến 22 mg/dL với khoảng biến thiên 1mg/dL) 75

Bảng 4.14 - Độ hấp thu đo được ở các nồng độ khảo sát khoảng tuyến tính (giữa nồng độ từ 20 – 21 mg/dL với khoảng biến thiên 0,05mg/dL) 77

Bảng 4.15 - Độ hấp thu đo được ở các nồng độ khảo sát khoảng tuyến tính (giữa nồng độ từ 0 – 1 mg/dL với khoảng biến thiên 79

Bảng 4.16 - Sự phụ thuộc độ hấp thu (Y) theo nồng độ bilirubin trực tiếp (công thức tối ưu) 81

Bảng 4.17 - Kết quả độ hấp thu trong thử nghiệm độ đặc hiệu 83

Bảng 4.18 - Kết quả thực nghiệm về độ chính xác (lặp lại) 84

Bảng 4.19 - Kết quả thẩm định độ chính xác trung gian 85

Bảng 4.20 - Kết quả thực nghiệm độ đúng 86

Bảng 4.21 - Sự phụ thuộc độ hấp thu theo nồng độ của quy trình I.S.E 87

Bảng 4.22 - Kết quả thực nghiệm với độ chính xác (quy trình I.S.E) 88

Bảng 4.23 - Kết quả thực nghiệm của quy trình I.S.E 88

Bảng 4.24 - So sánh thành phần thuốc thử và điều kiện tiến hành các quy trình 89

Bảng 4.25 - So sánh các chỉ số thống kê giữa quy trình tối ưu và quy trình tham khảo 89

Bảng 4.26 - Kết quả nồng độ thay đổi theo theo thời gian (phương pháp dài hạn)90 Bảng 4.27 -Tuổi thọ của bộ kit ở 3 lô thử nghiệm theo phương pháp dài hạn 92

Bảng 4.28 - Nồng độ bilirubin trực tiếp trong các chu kỳ theo dõi bằng phương pháp già hóa cấp tốc ở 25oC, độ ẩm tương đối 75 ± 5% 93

Bảng 4.29 - Kết quả xác định độ ổn định theo quy tắc Van’t Hoff (trong điều kiện 25± 30C,độ ẩm tương đối là 75 ± 5%) của lô BD120901 94

Bảng 4.30 - Kết quả xác định độ ổn định theo quy tắc Van’t Hoff (trong điều kiện 25± 30C,độ ẩm tương đối là 75 ± 5%) của lô BD120902 95

Bảng 4.31 - Kết quả xác định độ ổn định theo quy tắc Van’t Hoff (trong điều kiện 25± 30C,độ ẩm tương đối là 75 ± 5%) của lô BD120902 96

Bảng 4.32 -Tuổi thọ 3 lô bộ kit trong điều kiện 25±30C, độ ẩm tương đối

75±5%) 96

Bảng 4.33 - Nồng độ creatinin trong các chu kỳ theo dõi bằng phương pháp già hóa cấp tốc ở 40oC, độ ẩm tương đối 75 ± 5% 97

Bảng 4.34 - Kết quả xác định độ ổn định theo quy tắc Van’t Hoff (400C) 98

Bảng 4.35 - Bảng tương ứng giữa lnK và 1000/T 99

Bảng 4.36 -Tuổi thọ của bộ kit tính theo phương pháp Arrhenius1 101

Bảng 4.37 - Tuổi thọ được xác định của bộ kit 102

Bảng 4.38 - So sánh kết quả định lượng bilirubin trực tiếp của 2 bộ kit 102

Bảng 4.39 - Giá tham khảo một số bộ kit bilirubin trực tiếp trên thị trường 103

Bảng 4.40 - Giá tham khảo các loại hoá chất chế tạo bộ kit BD1209 103

Hình 2.1 Cấu trúc thẳng của bilirubin 5

Hình 2.2 Mối liên quan cấu trúc giữa porphyrin và sắc tố mật 6

Hình 2.3 Sơ đồ phản ứng liên hợp của bilirubin 8

Hình 2.4 Sơ đồ chuyển hóa bilirubin 10

Hình 2.5 Sơ đồ phản ứng của phương pháp diazo hóa 16

Hình 2.6 Sơ đồ tóm tắt quy trình thiết kế và tối ưu hóa công thức 21

Hình 2.7 Mối liên quan nhân quả 23

Hình 2.8 Minh họa các mối liên quan của xi với y 24

Hình 2.9 Nguyên lý vận hành của phần mềm thông minh INForm 26

Hình 2.10 Cấu trúc mạng đa lớp 27

Hình 2.11 Giới hạn của định luật Beer về sự hấp thụ quang 30

Hình 3.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu 43

Hình 3.2 Sơ đồ quy trình điều chế bộ kit 44

Hình 3.3 Minh họa các hàm mục tiêu áp dụng trong tối ưu hóa 49

Hình 4.1 Ảnh hưởng của nồng độ acid sulfanilic đến độ hấp thu 60

Hình 4.2 Ảnh hưởng của nồng độ natri nitrit đến độ hấp thu 61

Hình 4.3 Ảnh hưởng của thời gian ủ đến độ hấp thu 62

Hình 4.4 Ảnh hưởng của acid clohydric đến độ hấp thu 63

Hình 4.5 Mối liên quan giữa độ hấp thu (Y) với nồng độ acid sulfanilic (X1) và nồng độ natri nitrit (X2) 70

Hình 4.6 Sơ đồ quy trình định lượng bilirubin trực tiếp của bộ kit 74

Hình 4.7 Đường biểu diễn độ hấp thu theo nồng độ bilirubin trực tiếp (với khoảng khảo sát từ 0 - 22 mg/dL) 76

Hình 4.8 Đường biểu diễn độ hấp thu theo nồng độ bilirubin trực tiếp (với khoảng khảo sát từ 20 - 21 mg/dL) 78

Hình 4.9 Đường biểu diễn độ hấp thu theo nồng độ bilirubin trực tiếp (với khoảng khảo sát từ 1 - 0 mg/dL) 80

Hình 4.10 Đường chuẩn giữa độ hấp thu và nồng độ 82

Hình 4.11 Đường chuẩn giữa độ hấp thu và nồng độ của quy trình I.S.E 87

Hình 4.12 Đường tuyến tính giữa thời gian và ln[C] của lô BD120901 90

Hình 4.13 Đường tuyến tính giữa thời gian và ln[C] của lô BD120902 91

Hình 4.14 Đường tuyến tính giữa thời gian và ln[C] lô Cr-T110803 91

Hình 4.15 Đường tuyến tính liên quan giữa ln K và 1000/T ở lô BD120901 99

Hình 4.16 Đường tuyến tính liên quan giữa ln K và 1000/T ở BD120902 100

Hình 4.17 Đường tuyến tính liên quan giữa ln K và 1000/T ở lô BD120903 100

Vàng da là bệnh lý rất thường gặp hiện nay Đây là những một trong những

bệnh liên quan đến sự tăng nồng độ bilirubin trong các dịch cơ thể Xác định được nồng độ bilirubin trong huyết thanh (HT) có thể giúp chẩn đoán sớm bệnh lý liên quan cũng như dự đoán nguyên nhân của bệnh Do đó việc định lượng bilirubin trong huyết thanh là một trong những xét nghiệm sinh hóa quan trọng cần được thực hiện để giúp cho việc chẩn đoán sớm và điều trị bệnh có hiệu quả

Có nhiều phương pháp được sử dụng để định lượng bilirubin trực tiếp trong

huyết thanh như: phương pháp diazo hóa, phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC), phương pháp sử dụng enzym, phương pháp đo bilirubin xuyên qua da,… trong đó

phương pháp diazo hóa được sử dụng rộng rãi trong các phòng xét nghiệm sinh hóa dưới dạng kit thử vì có ưu điểm là đơn giản, tiện dụng, nhanh chóng và có độ chính xác cao

Trong lĩnh vực xét nghiệm sinh hóa lâm sàng hiện nay hầu hết các phòng xét nghiệm đều sử dụng các kit thử nhập từ nước ngoài Đó là một trong những nguyên nhân làm tăng giá thành các xét nghiệm và đồng thời làm tăng thêm gánh nặng điều trị cho bệnh nhân Việc sản xuất trong nước những kit thử cho các xét nghiệm hóa sinh với chất lượng ổn định, giá thành rẻ là một đòi hỏi cấp thiết Thực hiện được điều này, chúng ta sẽ từng bước chủ động trong việc cung cấp các thuốc thử cho các phòng xét nghiệm hóa sinh, giảm bớt lệ thuộc vào các sản phẩm nhập ngoại, tiết kiệm được ngoại tệ, cũng như góp phần giảm chi phí điều trị cho bệnh nhân

Chúng tôi chọn đề tài “Xây dựng quy trình sản xuất và tiêu chuẩn hóa bộ kit định lượng Bilirubin trực tiếp trong huyết thanh bằng phương pháp Diazo hóa” nhằm mục đích nghiên cứu và hướng đến sản xuất bộ kit thử này để thay thế các sản phẩm ngoại nhập

Mục tiêu nghiên cứu:

– Áp dụng các phần mềm vi tính trong nghiên cứu kỹ thuật bào chế như: khảo sát mối liên hệ nhân quả, thiết kế mô hình thực nghiệm và tối ưu hóa công thức Từ đó xác định công thức và quy trình bào chế tối ưu cho bộ kit

– Thẩm định quy trình định lượng nồng độ Bilirubin trực tiếp trong huyết thanh từ bộ kit

– Ứng dụng sản xuất thử 3 lô bộ kit ở quy mô phòng thí nghiệm

– Xác định độ ổn định bộ kit theo thời gian và phương pháp lão hóa cấp tốc – Sử dụng bộ kit thử trên mẫu huyết thanh bệnh nhân có so sánh thống kê với

bộ kit ngoại nhập

– Đánh giá sơ lược hiệu quả kinh tế của việc sản xuất bộ kit trên

2.1 TỔNG QUAN VỀ BILIRUBIN

2.1.1 CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA BILIRUBIN [2], [16],[22], [25] ,[30]

Bilirubin được tìm ra đầu tiên bởi Virchow năm 1849, ông gọi sắc tố vàng xanh này là “hematoidin” Thuật ngữ “bilirubin” được Stadeler đặt ra năm 1864, và đến 1874 thì Tarchanoff chứng minh được mối liên quan trực tiếp giữa sắc tố mật

và hemoglobin Fisher và Plieninger đã tổng hợp và đưa ra cấu trúc của bilirubin IXα (hình 2.1) Cấu trúc bốn vòng pyrol liên kết thẳng hàng này của phân tử bilirubin đã được thừa nhận suốt hơn 30 năm Cấu trúc này gồm 4 vòng pyrol nối

những chuỗi bên Carbon α của vòng pyrol ở phía ngoài sẽ gắn với nhóm carbonyl (C=O)

N N

H

C H2M e

N N

O H

Hình 2.1 Cấu trúc thẳng của bilirubin

Tuy nhiên, cấu trúc bốn vòng pyrol thẳng hàng lại không giải thích được đặc tính quan trọng của bilirubin là tính ít tan trong nước và tan nhiều trong các dung môi không phân cực vì trong cấu trúc có hai phân tử acid propionic được cho rằng làm tăng tính phân cực và như thế sẽ làm phân tử bilirubin trở nên thân nước hơn Do đó cấu hình dạng chữ “U” đã được đưa ra và nó đã giải thích được đầy đủ trạng thái vật lý của phân tử bilirubin trong các dung môi hữu cơ không phân cực

So sánh công thức của bilirubin và protoporphyrin cho thấy mối liên hệ cấu trúc gần gũi giữa các sắc tố mật với porphyrin (hình 2.2)

N CH N

C H

N C

H

N

C H

Protoporphyrin IX

N

C H N

C H

N C H

C H

CH2

CH2

C O O H C O O H OO

Biliverdin IX

H H H

N

C H N

C

H2

N C

Hình 2.2 Mối liên quan cấu trúc giữa porphyrin và sắc tố mật

Nhìn chung, sắc tố mật khác porphyrin ở số lượng, vị trí của cầu nối =CH−

và −CH2− nối các vòng pyrol với nhau, ở mức độ oxy hóa hoặc khử của vòng pyrol

và khác ở các nhóm thế gắn trên carbon β của vòng pyrol Sắc tố mật chủ yếu trong

tự nhiên được đặt tên là “IXα” vì nó được tạo thành do sự khử carbon cầu nối α của protoporphyrin IX Màu sắc của sắc tố mật được tạo thành do các liên kết đôi liên hợp trong phân tử (−C=C−C=C−C=) (nhóm mang màu) Khi tăng số lượng liên kết đôi liên hợp trong nhóm mang màu sẽ gây ra một sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại ở ánh sáng khả kiến của sắc tố mật Ví dụ, sự khử một liên kết đôi ở cầu nối

=CH− trung tâm sẽ chuyển biliverdin thành bilirubin, đồng thời làm giảm bước sóng hấp thu cực đại từ 640 nm (màu xanh) xuống 450 nm (màu vàng)

Bilirubin có nguồn gốc tự nhiên chứa một lượng lớn (99%) dạng IXα Bilirubin IXβ và IXδ tạo thành từ sự phân cắt của cầu β và δ chỉ chiếm tỉ lệ nhỏ hơn 0,5% khi phân lập từ mật

2.1.2 CHUYỂN HÓA BILIRUBIN [2], [3], [15], [16], [22], [25], [30], [37]

Đời sống trung bình của hồng cầu người khoảng 120 ngày, trong thời gian này hemoglobin không biến đổi Khi hồng cầu “chết” thì hemoglobin được giải phóng và thoái hóa Globin và Fe có thể được cơ thể sử dụng lại, đó là điều khác với nhiều chất chuyển hóa khác của cơ thể Sự thoái hóa của hem dẫn đến sự tạo sắc tố mật: biliverdin và bilirubin

Bilirubin IXα được tạo thành từ sự dị hóa protoporphyrin IX của hem dưới xúc tác của enzym hem oxygenase Vòng porphyrin sẽ bị mở ở vị trí cầu nối α tạo sắc tố xanh biliverdin, biliverdin sau đó sẽ được chuyển hóa thành bilirubin dưới tác dụng của enzym biliverdin reductase, coenzym là NADPH Mỗi mol hem chuyển hóa theo đường này sẽ tạo ra một mol carbon monoxide, một mol bilirubin, một mol ion sắt

Mỗi ngày trung bình một người tạo ra từ 250-300 mg bilirubin Khoảng 85% số đó xuất phát từ nguồn hem trong hồng cầu già bị phân hủy ở tế bào gan, lách và tủy xương Khoảng 15% còn lại được tạo thành từ sự phân hủy tiền tế bào hồng cầu trong tủy xương và từ sự chuyển hóa của các protein chứa hem khác như

myoglobin, cytochrome và peroxidase

2.1.2.1 Tạo biliverdin

Bước đầu tiên của sự thoái hóa hemoglobin là mở vòng porphyrin của hem Vòng này bị cắt ở vị trí α giữa gốc pyrol I và II, bằng cách oxy hóa và loại carbon ở đầu nối =CH− ở vị trí α dưới dạng carbon monoxide (CO), giải phóng nguyên tử sắt

Fe được cơ thể sử dụng trở lại, còn globin có thể bị thủy phân thành các acid amin bởi hệ cathepsin Các acid amin này hoặc cơ thể sử dụng để tổng hợp

protein (kể cả globin) và một số chất có tác dụng sinh học khác, hoặc được thoái

2.1.2.2 Tạo bilirubin

Biliverdin bị khử ở cầu nối –CH= tại vị trí γ tạo bilirubin (màu vàng xanh, xanh ve) Enzym xúc tác là biliverdin reductase với NADPH để cung cấp hydro Một phần bilirubin sau khi được tạo thành ở hệ thống võng mô được truyền vào

máu Bilirubin này gọi là bilirubin tự do, không tan trong nước, cho phản ứng diazo chậm nên còn gọi là bilirubin gián tiếp Một phần bilirubin cũng được hình thành

ngay ở gan Trong máu, bilirubin tự do kết hợp với albumin của huyết thanh rồi được vận chuyển về gan

Tại màng tế bào gan, bilirubin tách khỏi albumin với một cơ chế chưa rõ và được chuyển vào gan Khi vào trong tế bào gan, bilirubin liên kết thuận nghịch với protein tan trong nước là ligandin hay protein Y Ligandin là một loại protein thuộc gia đình gene glutathion-S-transferase, chiếm tỷ lệ khoảng 5% trên tổng số protein gan Ligandin cũng gắn kết với nhiều hợp chất khác như steroid, bromsulfthalein (BSP), xanh indocyanin và vài loại carcinogen

œ Sự biến đổi bilirubin ở gan

Tại gan bilirubin tự do liên hợp với hai phân tử acid glucurunic để tạo bilirubin diglucuronat Phản ứng xảy ra giữa hai nhóm carboxyl (−COOH) thuộc gốc propionat (Pr) ở mạch nhánh của bilirubin với hai nhóm OH bán acetal của hai phân tử acid glucurunic (dưới dạng hoạt hóa uridindiphosphat glucurunat), với sự xúc tác của enzym glucuronyl transferase Có một ít bilirubin liên hợp dưới dạng monoglucuronat Sơ đồ phản ứng liên hợp của bilirubin được mô tả ở hình 2.3

Glucose-1-P + UTP UDP-glucose pyrophosphorylase UDP-glucose Pyrophosphate +

UDP-glucuronic acid Bilirubin + Bilirubin Glucuronyl Transferase Bilirubin-glucuronic + UDP

Hình 2.3 Sơ đồ phản ứng liên hợp của bilirubin

Bilirubin liên hợp tan trong nước, cho phản ứng diazo nhanh nên còn gọi là bilirubin trực tiếp Bilirubin được gan bài tiết vào mật dựa trên sự vận chuyển tích cực ngược bậc thang nồng độ hay còn gọi là vận chuyển chủ động

Bilirubin là sắc tố chủ yếu của dịch mật Bình thường biliverdin có trong mật người với một lượng rất ít (ở dạng vết), nhưng màu của nó đậm hơn nhiều so với màu của bilirubin (cùng một lượng tương đương) Ở người các sắc tố mật chiếm khoảng 15-20% trọng lượng khô của mật

œ Sự biến đổi bilirubin ở ruột

Bilirubin liên hợp theo ống dẫn mật đổ vào ruột Ở ruột bilirubin liên hợp bị thủy phân dưới tác dụng của enzym β-glucuronidase do gan, tế bào biểu mô ruột và

vi khuẩn đường ruột tiết ra, giải phóng bilirubin

Tới đại tràng dưới tác dụng của các enzym của vi khuẩn yếm khí, bilirubin lần lượt bị khử oxy, bão hòa các liên kết đôi để tạo urobilinogen và stercobilinogen,

là những hợp chất không màu Stercobilinogen là sản phẩm cuối cùng của sự thoái hóa bilirubin ở đại tràng

Một phần các sản phẩm khử màu của bilirubin (urobilinogen và stercobilinogen) được tái hấp thu vào máu theo tĩnh mạch cửa gan Ở gan chúng có thể một phần được oxy hóa trở lại, tái tạo bilirubin rồi lại đổ vào ruột (chu trình ruột gan), một phần nhỏ theo máu về thận và thải ra ngoài theo nước tiểu Phần còn lại của urobilinogen và stercobilinogen ở ruột không được tái hấp thu, được đào thải ra ngoài theo phân

Ở phân và nước tiểu urobilinogen và sterconilinogen bị oxy hóa bởi oxy của không khí thành urobilin và stercobilin Các sản phẩm này có màu vàng da cam làm cho bình thường phân có màu vàng da cam Bình thường nước tiểu chứa rất ít urobilinogen và urobilin (1-4 mg/ngày) còn stercobilinogen trong phân có khoảng 40-280 mg/ngày

Trong trường hợp vi khuẩn bị giảm sút (chẳng hạn do uống kháng sinh), bilirubin không bị khử ở ruột, được đào thải nguyên vẹn ra theo phân, khi tiếp xúc với không khí, bilirubin bị oxy hóa để thành biliverdin, vì vậy trong các trường hợp

này phân có màu xanh Cũng có kết quả tương tự ở trẻ sơ sinh trong những tuần đầu sau khi đẻ do thiếu enzym vi khuẩn, bilirubin không bị khử ở ruột mà bị oxy hóa thành biliverdin làm cho phân có màu xanh

Hình 2.4 Sơ đồ chuyển hóa bilirubin.

8HBiliverdin

2.2 BỆNH LÝ LIÊN QUAN [2],[13],[14],[16], [17], [21], [23],[36]

2.2.1 CHỈ SỐ BILIRUBIN Ở NGỪƠI BÌNH THƯỜNG

2.2.2 THAY ĐỔI SINH LÝ

Khi bilirubin tăng cao ở máu sẽ xâm nhập vào tổ chức và gây vàng da Nguyên nhân có thể do: tán huyết, lượng bilirubin sản xuất vượt khả năng thải trừ của gan, các tổn thương gan (giảm liên hợp và thải trừ ngược vào máu), tắc đường dẫn mật cản trở sự bài xuất, Từ đó mà phân ra 3 loại vàng da: hủy huyết, viêm gan

và tắc mật Thực tế thường có sự phối hợp của các nguyên nhân

2.2.2.1 Bilirubin gián tiếp tăng:

Mức tăng bilirubin gián tiếp, phản ánh sự tán huyết tăng, thường từ 6-10 mg/dL, có khi tới 20 mg/dL Gặp trong các trường hợp:

- Vàng da tán huyết (vàng da sinh lý của trẻ sơ sinh), thiếu máu tán huyết chứng nguyên hồng cầu huyết ở trẻ sơ sinh, thiếu máu ác tính, sau truyền máu khác loại hoặc khi hấp thụ một ổ máu tụ lớn, các bệnh về Hb khi có cơn tán huyết…

- Rối loạn liên hợp bilirubin: bệnh vàng da mang tính di truyền do khuyết tật của enzym glucuronyl transferase, tổn thương nhu mô gan do các nguyên nhân, dùng các chất gây độc cho tế bào gan (chloroform, phosphor, arsphenamin, CCl4…), độc tố, gan bị xung huyết do bệnh tim hoặc xơ gan

2.2.2.2 Bilirubin trực tiếp tăng:

Mức tăng bilirubin trực tiếp, phản ánh việc mật từ gan vào máu Thường gặp trong các trường hợp sau:

- Ứ mật trong gan: viêm gan do virus hay do nhiễm độc, loạn dưỡng gan

cấp hoặc bán cấp, các diễn biến xấu cấp của viêm gan mãn và xơ gan, trong hội

chứng Rotor và Dubin-Johnson

- Tắc đường dẫn mật ngoài gan do sỏi mật, ung thư đầu tụy hay phình

Water, hạch to chèn ép đường dẫn mật, cơ thắt Oddi…

2.2.2.3 Một số hội chứng rối loạn chuyển hóa bilirubin di truyền

™ Hội chứng Gilbert

Hội chứng Gilbert gặp ở 3-5% dân số, rất quan trọng về mặt lâm sàng vì

thường bị chẩn đoán lầm với bệnh viêm gan mãn tính Sự đột biến của gen bilirubin-UDP-glucuronosyl-transferase (UGT1A1) dẫn đến hoạt động của enzym

glucuronyltransferase gan bị giảm sút Nồng độ bilirubin tự do (bilirubin gián tiếp)

huyết thanh dao động từ 1,5-3 mg/dL và có xu hướng tăng nhanh Trong phần lớn

bệnh nhân, gen bị đột biến lặp, có 7 cặp A=T thay vì 6 như ở gen không bị đột biến

Hiện tượng đột biến gen với 5 hoặc 8 cặp A=T hiếm gặp hơn

Có thể dễ dàng phân biệt hội chứng Gilbert với bệnh viêm gan mãn tính ở

biểu hiện lâm sàng: hội chứng Gilbert không có dấu hiệu thiếu máu và bilirubin

trong nước tiểu, hoặc bằng các thử nghiệm chức năng gan thông thường Ngoài ra,

sự tăng tỉ lệ bilirubin monoglucuronic so với bilirubin diglucuronic trong hội chứng

Gilbert cho thấy có sự rối loạn trong quá trình chuyển hóa bilirubin monoglucuronic

thành bilirubin diglucuronic Bệnh nhân bị hội chứng Gilbert có thể bị ngộ độc

acetaminophen vì phản ứng chuyển hóa chủ yếu của acetaminophen là phản ứng

liên hợp glucuronic

™ Hội chứng Crigler-Najjar (type I)

Hội chứng Crigler-Najjar type I hiếm khi xảy ra, nguyên nhân là do sự thiếu

hụt hoàn toàn enzym UDP-glucuronyltransferase, biểu hiện bằng sự tăng rất cao của

bilirubin tự do (bilirubin gián tiếp) (25-50 mg/dL) Hội chứng di truyền theo nhiễm

sắc thể lặn Đa số trẻ sẽ bị tổn thương não nghiêm trọng hoặc chết trong năm đầu

đời

Biện pháp trích máu tĩnh mạch hoặc tách hồng cầu khỏi huyết tương có thể làm giảm bilirubin huyết thanh nhưng bệnh não vẫn phát triển Cấy ghép gan sớm là liệu pháp duy nhất có hiệu quả

™ Hội chứng Crigler-Najjar (type II)

Hội chứng Crigler-Najjar type II di truyền theo nhiễm sắc thể trội với đặc điểm thiếu hụt một phần UDP-glucuronyltransferase Trong hội chứng này, bilirubin tự do (bilirubin gián tiếp) thường tăng từ 5-20 mg/dL (85-340 µmol/L) Khác với hội chứng Crigler-Najjar type I, type II đáp ứng tốt với phenobarbital và người bệnh có khả năng duy trì cuộc sống bình thường

™ Hội chứng Lucey-Driscoll

Một số trẻ mới sinh có biểu hiện thoáng qua của hội chứng tăng bilirubin không phải do bất thường chức năng gan hoặc do tăng tiết sắc tố mật Nồng độ bilirubin tự do (bilirubin gián tiếp) huyết thanh nằm trong khoảng từ 9-65 mg/dL

Qua các thử nghiệm in vitro, một chất ức chế glucuronyltransferase đã được tìm

thấy trong máu của trẻ lẫn máu của những bà mẹ Chất ức chế này chưa được phân lập nhưng dựa vào sự có mặt của chất này trong máu phụ nữ mang thai, người ta cho rằng chất ức chế này có thể là một hormon steroid progesterol

lẽ là melanin Alanin aminotransferase và alkaline phosphatase huyết thanh bình thường

™ Hội chứng Rotor

Tương tự như hội chứng Dubin-Johnson, hội chứng Rotor cũng làm tăng chủ yếu bilirubin liên hợp, nhưng không có sắc tố trong gan Tổng coproporphyrin trong nước tiểu tăng, với khoảng 2/3 là coproporphyrin I Tiên lượng bệnh tốt

2.2.2.4 Các thể vàng da

Bilirubin được vận chuyển trong máu dưới dạng kết hợp với protein (chủ yếu là albumin) Trong một số trường hợp bệnh lý, bilirubin trong máu tăng cao (có trường hợp lên đến 20 mg/dL) vượt quá khả năng kết hợp của albumin huyết thanh Phần bilirubin còn lại sẽ tách khỏi dung dịch, khuếch tán vào các mô, làm cho các

mô có màu vàng, gây vàng da Vàng da được xếp theo ba nhóm chính:

- Vàng da do tan huyết (vàng da trước gan): mọi trường hợp tăng vỡ hồng cầu dẫn đến tăng sắc tố mật (bilirubin) Trong trường hợp hồng cầu bị phá hủy nhiều, bilirubin tự do (không được gan liên hợp hết) tăng trong máu, thường chiếm

tỷ lệ 80% bilirubin toàn phần Trong trường hợp này không có bilirubin trong nước tiểu vì bilirubin tự do không tan trong nước nên không qua được thận Sự tạo thành một lượng lớn sắc tố mật cũng dẫn đến sự bài xuất nhiều urobilinogen và stercobilinogen trong nước tiểu và phân làm cho phân và nước tiểu có màu vàng sẫm

- Vàng da do viêm gan (vàng da tại gan): trong viêm gan, do có tổn thương

tế bào như nhu mô gan, làm giảm khả năng liên hợp bilirubin, bilirubin tự do trong máu tăng Ngoài ra, khi viêm gan, các nhu mô gan bị phù nề, chèn ép các vi quản mật gây tắc mật làm cho bilirubin liên hợp không xuống ruột được, tăng cao trong máu và xuất hiện trong nước tiểu Urobilinogen cũng có thể tăng trong nước tiểu vì tổn thương gan làm giảm khả năng tái tạo bilirubin từ urobilinogen, chất này bị ứ đọng ở lại gan nên urobilinogen tràn vào máu và đào thải ra ngoài theo nước tiểu

- Vàng da do tắc mật (vàng da sau gan): trong trường hợp đường dẫn mật bị tắc do sỏi mật, u đầu tụy thì bilirubin liên hợp bị ứ lại ở gan, tràn vào máu và tăng lên rất cao, chiếm tỷ lệ trên 80% bilirubin toàn phần Bilirubin liên hợp do tan trong nước cao nên qua được cầu thận và ra theo nước tiểu (có sắc tố mật trong nước tiểu) Vì bilirubin không xuống ruột được nên không có urobilinogen và stercobilinogen trong nước tiểu và phân Nếu thấy nước tiểu có bilirubin liên hợp, nhưng không có urobilinogen và phân không có stercobilin (phân trắng), nghĩ đến vàng da do tắc mật

2.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BILIRUBIN TRONG HUYẾT THANH [2], [13], [30], [34], [36]

2.3.1 PHƯƠNG PHÁP DIAZO HÓA:

2.3.1.1 Lịch sử phát triển:

Phương pháp diazo hóa, dựa trên phản ứng giữa bilirubin với hợp chất diazo hóa của acid sulfanilic được Ehrlich tìm ra vào năm 1883, sau đó được Van Den Bergh và Muller áp dụng để định lượng bilirubin trong huyết tương và mật năm

1916 Phương pháp này là nền tảng của hầu hết các phương pháp định lượng bilirubin khác và là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất hiện nay

2.3.1.2 Nguyên tắc:

Acid sulfanilic phản ứng với natri nitrit trong môi trường HCl tạo hợp chất diazo Hợp chất diazo của acid sulfanilic (p–diazobenzenesulfonic acid) phản ứng với bilirubin tạo hợp chất azobilirubin có màu tím ở môi trường acid và màu xanh ở môi trường kiềm Cường độ màu phụ thuộc nồng độ bilirubin trong huyết thanh, được đo bằng phương pháp đo quang

Phương pháp diazo có thể phát hiện và định lượng hai dạng bilirubin trong huyết thanh: bilirubin trực tiếp (bilirubin liên hợp) thân nước, có khả năng phản ứng

mà không cần sự có mặt của chất xúc tác hoặc chất làm tăng độ hòa tan và bilirubin gián tiếp (bilirubin tự do) khó tan trong nước, phản ứng khi có mặt chất xúc tác Bilirubin toàn phần là tổng của bilirubin trực tiếp và bilirubin gián tiếp

Một số chất xúc tác cho phản ứng diazo: metanol (phương pháp của Malloy

và Evelyn), caffein/natri benzoat (phương pháp của Jendrassic và Grof), dimethyl sulfoxide (phương pháp của Walters và Gerarde)…

H O3S N H2 + NaNO 2 H Cl H O3S N N + C l

HO3S N N Cl N

N H

CH2Me

N N

HOH2C

HO3S N N Cl

N N

N N

SO3H

+

Glucuronic acid Glucuronic acid

Azobilirubin (isomer II)

Hình 2.5 Sơ đồ phản ứng của phương pháp diazo hóa

Bilirubin trực tiếp được đo ở khoảng pH 3,7 đến 4,5, trong khoảng pH này enzym bilirubin oxidase oxy hóa bilirubin liên hợp và δ-bilirubin nhưng không tác động lên bilirubin tự do Ở pH 10, enzym oxy hóa tác động chọn lọc lên bilirubin diglucuronic

2.3.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC: high performance liquid

chromatography)

Vào những năm giữa thập niên 50, Billing, Cole và Lathe đã sử dụng cột sắc ký pha đảo với bột kieselguhr được silicon hóa để tách 3 loại bilirubin khác nhau: bilirubin tự do, bilirubin monoglucuronic và diglucuronic

Sau đó, Kuenzle và cộng sự là những người đầu tiên thành công trong việc

sử dụng kĩ thuật sắc ký cột mà không qua bước tách protein, và đã xác định được bốn loại bilirubin: bilirubin tự do (α-bilirubin), bilirubin liên hợp một lần (β-bilirubin), bilirubin liên hợp hai lần (γ-bilirubin) và bilirubin liên kết vô cùng chặt chẽ với protein (δ-bilirubin) tạo thành phức hợp albumin-bilirubin trong huyết thanh

Một nghiên cứu khác chỉ ra rằng δ-bilirubin bao gồm một hay nhiều loại bilirubin liên kết cộng hóa trị với albumin Liên kết cộng hóa trị này rất chặt chẽ Bilirubin liên kết với albumin không bị phóng thích khi tác dụng với acid, base mạnh hay các tác nhân gây biến tính mạnh khác cũng như bởi sự thủy phân, enzym phân giải protein, hay khi đun với metanol δ-bilirubin tác dụng trực tiếp với tác

nhân diazo acid sulfanilic Sự khám phá ra δ-bilirubin đã giải thích cho sự hiện diện một lượng lớn bilirubin trong cơ thể của bệnh nhân có bệnh lý về gan hay triệu chứng vàng da lâu ngày do viêm gan đã được kiểm soát tốt Đó là loại bilirubin chậm đào thải ra khỏi huyết tương nhất vì nó tuân theo sự chuyển hóa của albumin với chu kì dị hóa albumin kéo dài đến 19 ngày

HPLC rất thuận tiện và hữu ích để lý giải các loại bilirubin trong huyết thanh tồn tại một cách tự nhiên hay ở các dạng khi dùng các phương pháp quang trị liệu

Về mặt lâm sàng, nó cũng giúp đỡ cho các bác sĩ có thêm công cụ chẩn đoán các chứng vàng da, tuy không nhiều bởi vì biết rõ tỉ lệ các loại bilirubin trong máu thì không có giá trị chẩn đoán nhiều Tuy nhiên, phương pháp HPLC có nhược điểm là

vô hiệu khi nồng độ bilirubin thấp dưới 1 mg/dL (17 µmol/L) và khá phức tạp với các phân tích lâm sàng thường quy Vài dạng của δ-bilirubin có thể bị sót trong quá

trình tái xử lý mẫu

2.3.2.3 Phương pháp đo bilirubin xuyên da

Đây là phương pháp không xâm lấn để định lượng bilirubin, được giới thiệu bởi Yamanouchi và cộng sự Thiết bị đo bilirubin đầu tiên là một quang kế phản xạ dùng hai màng lọc để hiệu chỉnh màu của Hemoglobin và đòi hỏi phải đo đạc trên 8 vùng khác nhau của cơ thể

Đã có nhiều nỗ lực để chế tạo dụng cụ đo bilirubin để gia tăng độ chính xác của phép đo Những báo cáo gần đây cho thấy ít nhất một trong số các thiết bị đó (bilicheck) cho kết quả sai lệch khoảng ± 2 mg/dL so với kết quả thu được từ phép

đo diazo hóa Một nghiên cứu khác cho thấy dụng cụ bilicheck cho kết quả thấp khi nồng độ bilirubin trong máu cao hơn 10 mg/dL (170 µmol/L)

Mặc dù phương pháp đo bilirubin qua da không thể thay thế cho các phương pháp định lượng trong phòng thí nghiệm nhưng nó có thể cung cấp thông tin ngay tức thì và như thế sẽ kinh tế hơn

2.3.3 ƯU VÀ NHƯỢC ĐIỂM CỦA CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BILIRUBIN:

Ưu nhược điểm của các phương pháp định lượng bilirubin trong huyết thanh được trình bày trong bảng 2.1

Bảng 2.1 - Ưu, nhược điểm của các phương pháp định lượng bilirubin

Ưu điểm Nhược điểm

nhanh chóng, độ chính xác cao

- Kit thử đắt tiền

trong máu

- Trang thiết bị phức tạp, đắt tiền

- Vô hiệu đối với nồng độ bilirubin thấp hơn 1 mg/dL

Phương pháp đo xuyên

da

thấp hơn phương pháp diazo hóa

2.3.4 CÁC QUY TRÌNH THAM KHẢO

Một số quy trình định lượng bilirubin trực tiếp trong huyết thanh bằng

phương pháp diazo, được tóm tắt theo bảng sau: