Sử dụng chỉ thị phân tử Microsatellite đánh giá đa dạng di truyền các dòng keo lá tràm (Acacia auriculiformis)

Sử dụng chỉ thị phân tử Microsatellite đánh giá đa dạng di truyền các dòng keo lá tràm (Acacia auriculiformis)

***000***

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN BIỆT CÁC LOẠI THỊT HEO, BÕ, CỪU BẰNG

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

***000***

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN BIỆT CÁC LOẠI THỊT HEO, BÕ, CỪU BẰNG

PHƯƠNG PHÁP MULTIPLEX PCR

Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện :

PGS TS NGUYỄN NGỌC TUÂN TRỊNH THỊ THANH HUYỀN

KS LƯƠNG QUÝ PHƯƠNG

Thành phố Hồ Chí Minh

09/2007

LỜI CẢM ƠN

Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến:

Thầy PGS.TS Nguyễn Ngọc Tuân, Giảng viên khoa Chăn nuôi thú y, trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

Cô PGS.TS Trần Thị Dân, Giảng viên khoa Chăn nuôi thú y, trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh

KS Lương Quý Phương, Trung tâm Phân tích thí nghiệm hóa sinh trường Đại Học Nông Lâm

Đã tận tình hướng dẫn, ủng hộ và giúp đỡ tôi thực hiện và hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp

Xin chân thành cảm ơn:

- Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tại trường

- Ban giám đốc, thầy cô và các cán bộ công chức Trung tâm phân tích thí nghiệm hóa sinh trường Đại Học Nông Lâm, đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực tập và hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp

- Thầy Đinh Xuân Phát đã nhiệt tình giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình học tập cũng như thực hiện khóa luận

Tập thể các bạn sinh viên lớp Công nghệ sinh học 29 - Trường Đại học Nông Lâm TP HCM đã luôn bên tôi những lúc khó khăn, cùng tôi chia sẻ vui buồn trong quá trình học và quá trình thực hiện khóa luận

Và đặc biệt con xin thành kính ghi ơn Cha Mẹ đã sinh thành, dưỡng dục con nên người, để con được như ngày hôm nay

TÓM TẮT KHÓA LUẬN

TRỊNH THỊ THANH HUYỀN, thực hiện khóa luận “Phân biệt ba loại thịt heo, bò cừu bằng phương pháp multiplex PCR”

KS Lương Quý Phương

Thời gian thực hiện từ tháng 2/2007 đến tháng 8/2007, tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa – Sinh, trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh

Để tạo tiền đề trong việc giải quyết vấn đề gian lận thương mại đối với sản phẩm thịt tươi và thịt chế biến, bước đầu chúng tôi tiến hành thiết lập quy trình phân biệt ba loại thịt heo, bò, cừu bằng phương pháp multiplex PCR

Kết quả đạt được như sau:

1) Tách chiết DNA từ thịt tươi và thịt đã xử lý nhiệt ở nhiệt độ: 800C/15’,

1200C/15’, 1200C/30’, 1300C/15’ với tỷ số OD trung bình là 2,0 (thịt tươi), 1,9 (thịt

xử lý nhiệt)- tinh sạch, đạt tiêu chuẩn

2) Sau khi tiến hành tối ưu hóa phản ứng multiplex PCR bằng việc thử nghiệm nhiều quy trình (gồm quy trình của Matsunaga và ctv (1998) và các thử nghiệm điều chỉnh về thành phần hóa chất, nhiệt độ và thời gian của chu trình nhiệt, nồng độ mồi trong phản ứng), chúng tôi đã xác định được quy trình thích hợp, trong đó nồng độ MgCl2 2mM, lượng FSIM: RP: RB: RS lần lượt là 0,4: 0,83: 0,24: 0,17 M, nhiệt

độ và thời gian của chu kỳ nhiệt ở giai đoạn lặp lại là: biến tính (940C/1phút), bắt cặp (540C/45giây), kéo dài (720C/1phút)

3) Sử dụng quy trình nultiplex PCR vừa tìm được đối với các hỗn hợp DNA của

cả ba loài trong đó nồng độ DNA bò, cừu giảm dần và đã xác định được nồng độ của thịt cừu, bò mà quy trình này còn phát hiện được là 1ng/ l

4) Chúng tôi tiếp tục thực hiện quy trình trên đối với các hỗn hợp thịt đã xử lý nhiệt ở các nhiệt độ khác nhau và rút ra kết luận là ở các nhiêt độ biến tính

800C/15’, 1200C/15’, 1200C/30’, 1300C/15’ vẫn còn phân biệt được ba loài trên

SUMMARY

TRINH THI THANH HUYEN in subject “Identifying meat of three meat species: pig, bovine, sheep by multiplex PCR”

Suspervisors : PhD Nguyen Ngọc Tuan

BCs Luong Quy Phuong

To primarily resolve economic faudulent at meat products, we establish protocol to identify meat of three species (pig, bovine, sheep) by multiplex PCR The results:

1) Extraction DNA from raw meats and heated meats (at temperatures:

800C/15 min, 1200C/15 min, 1200C/30 min, 1300C/15 min), average ratio of OD were 2,0 (raw meat) and 1,9 ( heated meat) were pure, standard quality

2) After optimizing procedures including protocol of Matsunaga et al.(1998) and changing volume of reaction, element of chemical, temperature and time of thermal cycle, concentration of primer), we established the suitable multiplex PCR protocol This protocol was MgCl2 2 mM; concentration of primers FSIM: RP: RB:

RS were 0,4: 0,83: 0,24: 0,17 M, temperature and thermal cycle (denature 940C/1 min, anealing 540C/45 sec, elongation 720C/1 min)

3) Aplying the multiplex PCR protocol to analyse mix DNA from three meat with descending concentration on bovine DNA and sheep DNA, the limits of DNA sample detected were 1ng/ l for bovine and sheep

4) Using the protocol for mix heated meats to reach the conlusion that at processing temperatures: 800C/15 min, 1200C/15min, 1200C/30 min, 1300C/15min the meats of pig, bovine, sheep were still identified

Meat and bone meal from three companies (CE, A, VY) were examined by the established protocol, the products of those company were meat from pig, bovine and bovine, respectively

MỤC LỤC

Bìa i

Trang tựa ii

Lời cảm tạ iii

Tóm tắt khóa luận iv

Summary v

Mục lục vi

Danh sách các chữ viết tắt x

Danh sách các bảng xi

Danh sách các hình và biểu đồ xii

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích 2

1.3 Yêu cầu 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Sơ lược về thịt chế biến 3

2.1.1 Giới thiệu về thịt 3

2.1.2 Giới thiệu về thịt chế biến 4

2.1.3 Tình hình sản xuất và tiêu thụ thịt chế biến 4

2.1.3.1 Tình hình gian lận trên thị trường thịt tươi và thịt chế biến của thế giới 4

2.2 Một vài đặc điểm về tế bào động vật 6

2.3 Cơ sở để phân biệt các loại thịt chế biến bằng phương pháp multiplex PCR 7

2.4 Các phương pháp phân biệt các loại thịt 8

2.4.1 Phương pháp quan sát dưới kính hiển vi quang học 8

2.4.2 Miễn dịch liên kết enzym (ELISA) 8

2.4.3 Protein array 9

2.4.4 Điện di 2 chiều 9

2.4.5 Giới thiệu chung về phương pháp PCR (polymerase chain reaction) 10

2.4.6 Nguyên tắc multiplex PCR 16

2.5 Các công trình nghiên cứu về phát hiện loài trong thịt chế biến bằng phương pháp multiplex PCR 16

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

3.1 Nội dung thực hiện 18

3.2 Thời gian và địa điểm tiến hành 18

3.3 Vật liệu 19

3.3.1 Nguồn mẫu tách chiết DNA 19

3.3.2 Đoạn mồi 19

3.3.3 Hóa chất 19

3.3.3.1 Hóa chất dùng trong tách chiết DNA 19

3.3.3.2 Hóa chất dùng trong điện di 19

3.3.3.3 Hóa chất dùng trong phản ứng PCR 20

3.3.3.4 Thiết bị và dụng cụ 20

3.4 Phương pháp tiến hành 20

3.4.1 Lấy và bảo quản mẫu 20

3.4.2 Phối hợp các loại thịt để tạo hỗn hợp thịt và xử lý nhiệt 20

3.4.3 Tách chiết DNA 21

3.4.5.1 Thực hiện phản ứng m-PCR theo quy trình của Matsugana

và ctv (1998) 24

3.4.5.2 Thí nghiệm điều chỉnh thành phần phản ứng 24

3.4.5.3 Thí nghiệm điều chỉnh chu trình nhiệt 24

3.4.5.4 Thí nghiệm điều chỉnh nồng độ mồi trong 1 phản ứng 25

3.4.6 Thực hiện phản ứng m-PCR hai loài (heo, bò và heo, cừu) ở các nồng độ DNA khác nhau 26

3.4.7 Thực hiện phản ứng m-PCR cho hỗn hợp DNA heo, bò, cừu 27

3.4.8 S-PCR đối với DNA của thịt xử lý nhiệt ở các nhiệt độ khác nhau: 800C/15 phút, 1200C/15 phút, 1200C/30 phút, 1300C/15 phút 27

3.4.9 M-PCR để phát hiện thịt heo, bò, cừu trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở các nhiệt độ khác nhau 28

3.4.10 M-PCR đối cới bột thịt 28

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

4.1 Kết quả tách chiết 29

4.2 Kết quả s-PCR đối với thịt tươi thuần loài theo quy trình của Matsugana và ctv (1998) 31

4.3 Kết quả phản ứng m-PCR 3 loài theo quy trình của Matsugana và ctv (1998) 32

4.4 Kết quả quá trình thiết lập và tối ưu hóa phản ứng m- PCR 33

4.4.1 Điều chỉnh thể tích phản ứng 33

4.4.2 Kết quả thí nghiệm điều chỉnh nồng độ Mg2+ 33

4.4.3 Kết quả thí nghiệm điều chỉnh chu trình nhiệt 34

4.4.4 Kết quả thí nghiệm điều chỉnh nồng độ mồi 36

4.4.5 Kết quả kiểm tra tính ổn định của quy trình 38

4.5 Kết quả m-PCR đối với 2 loài 39

4.7 Kết quả s-PCR của thịt xử lý nhiệt 40

4.8 Kết quả m-PCR đối với các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt 43

4.9 Kết quả m-PCR đối với bột thịt 45

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 47

5.1 Kết luận 47

5.2 Đề nghị 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

PHỤ LỤC 51

Bảng 3 1 Tỷ lệ các loại thịt trong các hỗn hợp thịt 21

Bảng 3 2 Thành phần hóa chất PCR 23

Bảng 3 3 Nồng độ mồi ngược đối với mỗi loại thịt trong s-PCR 23

Bảng 3 4 Chu trình nhiệt của phản ứng 23

Bảng 3 5 Thành phần hóa chất PCR 24

Bảng 3 6 Chu trình nhiệt của phản ứng trước và sau khi điều chỉnh 25

Bảng 3 7 Điều chỉnh nồng độ mồi RS (giảm) 25

Bảng 3 8 Điều chỉnh nồng độ mồi RP (tăng) 26

Bảng 3 9 Phối hợp DNA của heo và bò ở các nồng độ khác nhau 26

Bảng 3 10 Phối hợp DNA của heo và cừu ở các nồng độ khác nhau 27

Bảng 3 11 Thành phần các hỗn hợp DNA heo, bò, cừu 27

Bảng 3 12 Hỗn hợp thịt ở các nhiệt độ xử lý khác nhau 28

Bảng 4 1 Tỷ số OD và hàm lượng DNA của thịt bò, heo, cừu 29

Bảng 4 2 Tỷ số OD và hàm lượng DNA tách chiết từ thịt tươi và thịt xử lý nhiệt 30

HÌNH TRANG

Hình 4.1 Sản phẩm s-PCR theo quy trình của Matsugana và ctv (1999) 32

Hình 4.2 Sản phẩm m-PCR theo quy trình của Matsugana và ctv (1998) 33

Hình 4.3 Sản phẩm m-PCR khi điều chỉnh thể tích phản ứng 34

Hình 4.4 Sản phẩm m-PCR sau khi tăng nồng độ Mg2+ 35

Hình 4.5 Sản phẩm m-PCR khi điều chỉnh nhiệt độ bắt cặp: 560C và 540C 35

Hình 4.6 Sản phẩm m-PCR sau khi điều chỉnh chu trình nhiệt 36

Hình 4.7 Kết quả m-PCR khi giảm RS 38

Hình 4.8 Kết quả m-PCR khi tăng RP 38

Hình 4.9 Kết quả kiểm tra tính ổn định của quy trình 39

Hình 4.10 Sản phẩm m-PCR đối với heo, bò 40

Hình 4.11 Sản phẩm m-PCR đối với DNA heo, cừu 40

Hình 4.12 Kết quả m-PCR của các hỗn hợp DNA 41

Hình 4.13 Kết quả s – PCR đối với thịt xử lý nhiệt ở 800C/15 phút 42

Hình 4.14 Kết quả phản ứng s-PCR đối với thịt xử lý nhiệt ở 1200C/15 phút 42

Hình 4.15 Kết quả s-PCR của thịt xử lý nhiệt ở 1200 C/30 phút 43

Hình 4.16 Sản phẩm s-PCR của thịt xử lý nhiệt ở 1300C/15 phút 43

Hình 4.17 Kết quả m-PCR đối với hỗn hợp thịt xử lý ở nhiệt độ 800C/15 phút 44

Hình 4.18 Kết quả m – PCR đối với hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở1200C/15 phút 45

Hình 4.19 Kết quả m-PCR đối với hỗn hỗn hợp xử lý nhiệt 1200C/30 phút 46

Hình 4.20 Kết quả m-PCR của các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở 1300C/15 phút 46

Hình 4.21 Kết quả m-PCR của bột thịt 47

BIỂU ĐỒ Biểu đồ 4 1 So sánh tỷ số OD và nồng độ DNA của thịt heo, bò, cừu 290

Biểu đồ 4 2 So sánh tỷ số OD và nồng độ DNA của thịt tươi và thịt xử lý nhiệt 301

BSE :Bovine spongiform encephalopathy

ctv: cộng tác viên

DNA: deoxyribonucleic acid

dNTP : Deoxyribonucleotide triphosphate

EDTA: ethylene diamine tetra acetate

ELISA: enzyme link imuno assay

Lad: Ladder

MBM: Meat and bone meal

mtDNA : mitochondrial cytochrome b DNA

m – PCR : multiplex PCR

NST: nhiễm sắc thể

OD: optical density

PCR: polymerase chain reaction

SDS: sodium dodecyl sulfate

RNA: ribonucleic acid

Taq: Taq polymerase

TBE: Tris borate EDTA

TE: Tris EDTA

Thịt chế biến thường được xử lý ở nhiệt độ cao trên 1000C (khoảng 1200C đối với thịt hộp, xúc xích tiệt trùng…) Đặc biệt bột xương thịt làm thức ăn gia súc (Meat and bone meal - MBM) tuy được xử lý ở nhiệt độ khoảng 1300C nhưng lại được sản xuất từ những phụ phế phẩm trong công nghiệp giết mổ nên một số mầm bệnh nguy hiểm vẫn còn tồn tại và có khả năng gây bệnh Ví dụ BSE (Bovine spongiform encephalopathy: bệnh bò điên) có khả năng lây sang người, protein prion gây bệnh này chỉ mất khả năng gây bệnh ở nhiệt độ 1800C Hiện nay, các phương pháp xử lý nhiệt thông thường không thể loại bỏ được nguy cơ mầm bệnh BSE Vì lý do này, các nước trên thế giới trong đó có Việt Nam không cho phép nhập bột xương thịt có nguồn gốc từ thịt bò, cừu, dê của các nước Châu Âu, Châu

Mỹ, Nhật Bản vì sợ bệnh BSE

Việc gian lận thương mại sẽ gây ra vấn đề không thể kiểm soát nguồn gốc các thực phẩm nhập khẩu Ngày nay, khi tình hình gian lận trong sản xuất và tiêu thụ sản phẩm thịt tươi, thịt chế biến vẫn diễn ra cùng với các dịch bệnh nguy hiểm liên tiếp hoành hành thì việc đảm bảo tính trung thực và an toàn của các sản phẩm này là rất cấp thiết

Điều này đặt ra cho các nhà quản lý và các nhà nghiên cứu phải tìm ra phương pháp phát hiện, phân biệt nhanh chóng, chính xác các loại thịt trong sản

phẩm thịt tươi cũng như thịt chế biến để ngăn chặn kịp thời những gian lận nhằm mục đích bảo vệ lợi ích chính đáng và sức khỏe cho người tiêu dùng

Có nhiều cách để xác định nguồn gốc thịt: dùng kính hiển vi quang học, ELISA, điện di 2 chiều, protein array, multiplex PCR Bốn phương pháp đầu hoặc chậm hoặc không thể ứng dụng cho các sản phẩm thịt đã xử lý ở nhiệt độ cao Còn phương pháp multiplex PCR là một phương pháp nhanh, đặc hiệu, đơn giản, thích hợp để phân biệt các loại thịt đã xử lý nhiệt

Vì vậy để tạo tiền đề cho việc giải quyết vấn đề trên, bước đầu chúng tôi tiến hành xây dựng quy trình phân biệt ba loại thịt heo, bò, cừu trong hỗn hợp thịt chế biến bằng phương pháp multiplex PCR

Nắm vững qui trình tách chiết DNA

Tối ưu hóa quy trình multiplex PCR và ứng dụng quy trình này vào việc phát hiện các loại bột thịt làm thức ăn gia súc

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Bảng 2 1 Tỉ lệ của các mô trong các loại thịt (%tính theo khối lượng thịt xẻ)

Tính chất của các mô và thành phần cấu tạo của các mô đều khác nhau Do

đó tùy theo đặc tính và tỉ lệ của các thành phần cấu tạo trong mỗi loại mô sẽ quyết định tính chất của thịt Người ta thừa nhận mô mỡ và mô cơ có giá trị sử dụng cao nhất Vì con người sử dụng thịt làm thực phẩm là để thỏa mãn nhu cầu về protein và

2.1.2 Giới thiệu về thịt chế biến

Thịt có giá trị sử dụng cao thì phải được chế biến thành nhiều dạng sản phẩm khác nhau tùy theo mục đích sử dụng khác nhau của giới tiêu dùng Việc chế biến làm tăng sự ngon miệng, tăng khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng, hạn chế sự hư hỏng do vi sinh vật, tăng thời gian bảo quản do đó tăng giá trị sử dụng của thịt (Romans và ctv, 1999)

Thịt chế biến có hai nhóm chính: thịt chế biến làm thức ăn cho con người, thịt chế biến làm thức ăn cho gia súc Thịt chế biến làm thức ăn cho con người được chế biến từ mô cơ, mô mỡ, mô liên kết Riêng thịt chế biến dùng làm thức ăn gia súc (thường là bột thịt) còn được chế biến từ các nguồn vật liệu giàu protein khác như: da, lông, móng, máu, hệ xương và các nội quan (các phụ phế phẩm lò mổ)

Có nhiều phương pháp chế biến: phơi khô, muối, ướp đường, lên men, xử lý nhiệt (nấu, hấp, sấy) Trong đó phương pháp chế biến ở nhiệt độ cao là phổ biến nhất Tùy theo loại sản phẩm và mục đích sử dụng mà người ta xử lý ở các nhiệt độ khác nhau Hiện nay, hầu hết các sản phẩm chế biến như xúc xích, lạp xưởng được xử lý

ở 800C; xúc xích tiệt trùng, thịt hộp các loại thường xử lý 1200C trở lên; đối với bột thịt sử dụng cho gia súc được xử lý ở 1300C (Hồ Thị Nguyệt Thu, 2003)

2.1.3 Tình hình sản xuất và tiêu thụ thịt chế biến

2.1.3.1 Tình hình gian lận trên thị trường thịt tươi và thịt chế biến của thế giới

Cơ quan tiêu chuẩn về thực phẩm (FSA – Food standard Agency) đã tổ chức nhiều cuộc điều tra trên đối tượng thịt và các sản phẩm thịt chế biến, kết quả cho thấy

có rất nhiều sai lệch giữa thành phần thực tế với nhãn hiệu hàng hóa của sản phẩm Nhất là sản phẩm thịt chế biến gồm nhiều loại thịt khác nhau, các nhà sản xuất thường ghi trên nhãn sản phẩm những loại thịt có giá trị cao và tránh ghi những loại thịt có giá trị thấp được trộn vào trong sản phẩm Một số trường hợp lại ghi sai tỷ lệ

giữa các loại thịt Trong khi đó, khả năng kiểm soát thành phần, độ an toàn và chất lượng sản phẩm thịt chế biến trên thị trường của các tổ chức ban ngành có liên quan vẫn còn ít

(Nguồn:http://archive.food.gov.uk/maff/archive/food/insheet/1999/N0167/176meat.htm.)

Một cuộc điều tra khác của bộ môn Kỹ thuật thực phẩm và vệ sinh thực phẩm, trường Thú y, ĐH Ankara (Mỹ) (2006) về các loại thịt được trộn vào trong thịt và thịt chế biến Trên 100 mẫu điều tra, kết quả là: 39,2% xúc xích lên men, 35,7 % xúc xích Ý, 27.2% xúc xích Đức, 22,2% thịt tươi, 6,2% thịt viên có chứa thịt của những loài động vật không công bố trên nhãn sản phẩm Cụ thể là xúc xích lên men, xúc xích Ý, xúc xích Đức được công bố là chỉ chứa thịt bò nhưng kết quả kiểm tra lại phát hiện có lẫn thịt gia cầm; các mẫu thịt bò tươi kết quả kiểm nghiệm lại cho dương tính với thịt hươu và thịt ngựa; thịt bò viên lại có chứa thịt gia cầm (Nguồn: www.blackwell-synergy.com/doi/abs/10.1111/j.1745-4573.2006.00046.x)

2.1.3.2 Tình hình xuất nhập khẩu động vật và sản phẩm chế biến từ động vật ở Việt Nam

Ở Việt Nam, tình hình gian lận thương mại trong sản xuất, tiêu thụ thịt và sản phẩm chế biến từ thịt là vấn đề nhức nhối đối với các nhà quản lý Ngay cả thịt tươi bán ở chợ hay ở các cửa hàng cũng bị gian lận như: thịt trâu giả bò, thịt ngựa giả bò, heo giả thịt dê Đối với thịt chế biến như xúc xích tôm, xúc xích bò, chả giò, thịt hộp… trên thị trường có nhiều sản phẩm nghi ngờ không đúng thành phần như nhãn hiệu hàng hóa đã đăng kí, đặc biệt các thức ăn chế biến nhập khẩu Chúng

ta chưa có các kỹ thuật để xác minh thành phần thịt trong sản phẩm

Những năm gần đây, Việt Nam nổi lên vấn đề về vệ sinh an toàn thực phẩm Các bệnh dịch lớn đã và đang diễn ra Tình trạng vận chuyển lậu động vật và các sản phẩm động vật vẫn thường xảy ra Cục Thú y đã phối hợp với Vụ Pháp chế –

Bộ Nông nghiệp và PTNT, Cục An toàn vệ sinh thực phẩm – Bộ Y tế, Cục Quản lý Thị trường – Bộ Thương mại thường xuyên tổ chức thanh tra, kiểm tra công tác

kiểm dịch nhập khẩu động vật, sản phẩm động vật, đặc biệt là hoạt động chống nhập lậu động vật, sản phẩm động vật qua biên giới Kết quả thanh tra, kiểm tra cho thấy tình hình nhập lậu động vật, sản phẩm động vật qua biên giới diễn biến hết sức phức tạp, chính quyền địa phương chưa thực sự quan tâm chỉ đạo công tác ngăn chặn và xử lý nhập lậu động vật, sản phẩm động vật qua biên giới, sự phối hợp giữa các cơ quan, ban ngành tại địa phương chưa thống nhất và thiếu chặt chẽ

Trong khi đó, các nước nhập khẩu yêu cầu về đăng ký công bố chất lượng, kiểm dịch, kiểm soát giết mổ của các nước nhập khẩu thường rất chặt chẽ Các yêu cầu, tiêu chuẩn về vệ sinh và an toàn thực phẩm của các nước này cũng rất cao

Các nhà nhập khẩu nước ngoài còn yêu cầu thịt và sản phẩm của thịt phải được lấy từ vùng an toàn đối với bệnh lở mồm long móng, dịch tả lợn, newcastle, BSE và những vùng này phải được tổ chức dịch tễ quốc tế (OIE) công nhận

Yêu cầu, tiêu chuẩn của Việt Nam thường không chặt chẽ bằng các yêu cầu tiêu chuẩn của các nước nhập khẩu (Bùi Thị Cúc, 2006)

(Nguồn: http:// www.cucthuy.gov.vn)

2.2 Một vài đặc điểm về tế bào động vật

Tế bào động vật thuộc dạng tế bào eukaryote, được bao quanh bởi màng tế bào, bên trong chứa nhân và các bào quan khác Khác với các tế bào eukaryote khác như thực vật và nấm, tế bào động vật không có vách tế bào (cell wall) (nguồn: www.Micro.Magnet.fsu.edu/cells/animalcell.html - 40k)

Chính vì tế bào động vật không có vách vững chắc nên khi tách chiết DNA

từ tế bào động vật không cần giai đoạn phá vỡ vách tế bào Cũng do không có vách

tế bào, tế bào động vật phát triển rất đa dạng về hình dạng Đặc biệt là tế bào thần kinh và tế bào cơ (Davidson, 2005)

Các tế bào động vật được nối với nhau bằng một loại protein cấu trúc xoắn bậc ba gọi là collagen Còn ở thực vật và nấm các tế bào được nối với nhau bằng loại protein khác chẳng hạn như pectin

(Nguồn: www.Micro.Magnet.fsu.edu/cells/animals/animalmodel.html - 8k) Nguyên sinh chất của tế bào động vật chứa khoảng 85 % nước và 15 % protein và các RNA, DNA, enzym, axit amin, các sản phẩm trung gian của sự trao đổi chất, muối khoáng…Mỗi tế bào thường có một nhân, thường có hình tròn hay hình bầu dục Nhân thường nằm ở giữa tế bào, nhưng cũng có thể nằm lệch sát màng tế bào như ở tế bào cơ vân (Nguyễn Đình Trung, Nguyễn Minh Tâm, 2005)

2.3 Cơ sở để phân biệt các loại thịt chế biến bằng phương pháp multiplex PCR

Phương pháp PCR thực chất là một phương pháp tạo dòng trong ống nghiệm, nhằm mục đích thu nhận một lượng lớn bản sao của một trình tự xác định Chính vì vậy, đoạn DNA mục tiêu được nhân lên rất nhiều lần và có thể được quan sát thông qua những kỹ thuật phân tách và điện di DNA (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 2002)

Năm 1997, Sawyer đã khẳng định trên gen cytochrom b ở ty thể (mtDNA)

có vùng bảo tồn cho các loài gia súc, gia cầm Dựa vào đó tác giả thiết kế mồi xuôi cho việc khuếch đại một đoạn DNA của các loài gia súc, gia cầm này Và dựa vào

trình tự chuyên biệt cho từng loài trên mtDNA mà thiết kế mồi xuôi cho từng loài

Theo Matsugana và ctv (1998), việc sử dụng 7 đoạn mồi (1 mồi xuôi, 6 mồi ngược) với tỉ lệ thích hợp để phát hiện một đoạn DNA chuyên biệt cho các loài bò, heo, gà, cừu, dê, ngựa Các đoạn DNA chuyên biệt này của dê, gà, bò, cừu, heo, ngựa lần lượt có khích thước: 157, 227, 274, 331, 398, 439 bp Kết quả PCR được quan sát bằng điện di Sự hiện diện hoặc vắng mặt sản phẩm PCR cho phép xác định có hay không thịt loài gia súc đó trong sản phẩm

Nhằm xác định nồng độ nhỏ nhất để có thể phát hiện được loài từ thịt chế biến, năm 2004, Myers và ctv cũng đã sử dụng phương pháp multiplex PCR để

khuếch đại vùng gen trên mtDNA Tác giả thực hiện phản ứng PCR với nhiều nồng

độ DNA khác nhau Sau đó dựa sự có hay không các sản phẩm PCR qua điện di để xác định nồng độ tối thiểu của DNA để phản ứng PCR còn phát hiện được

2.4 Các phương pháp phân biệt các loại thịt

2.4.1 Phương pháp quan sát dưới kính hiển vi quang học

Để phân biệt các loài trong bột xương thịt người ta lập ra một thư viện hình ảnh về các mẫu xương Theo đó các mẫu bột xương thịt được quan sát dưới kính hiển vi và đối chiếu với thư viện này để xác định các loài có trong mẫu xét nghiệm

Phương pháp này đòi hỏi người xét nghiệm phải có kinh nghiệm và tay nghề cao Ngoài ra, phương pháp này có độ chính xác không cao vì còn phụ thuộc vào kinh nghiệm của nhân viên xét nghiệm

(Nguồn: http://www.europa.eu.int/comm/food/fs/bse/index-in.html)

2.4.2 Miễn dịch liên kết enzym (ELISA)

Năm 1972 – 1973, ELISA được sử dụng đầu tiên trong y học để chẩn đoán virut Đến năm 1977, Clark và Adam lần đầu tiên ứng dụng ELISA để xác định virut hại thực vật tại Scottlen Nguyên tắc chung của kỹ thuật ELISA là nguyên tắc bánh kẹp (sandwich), tạo liên kết đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể

Sự liên kết đó cho phép định lượng sự hiện diện của kháng thể hoặc kháng nguyên Kháng thể hoặc kháng nguyên có thể được xác định khi được nhận biết đặc hiệu bằng một kháng thể thứ hai cộng hợp với hệ biotin – streptavidin – enzym sẽ tạo ra sản phẩm có màu khi tác dụng với cơ chất phù hợp

Đây là kỹ thuật khá nhạy và tương đối đơn giản, cho phép xác định kháng nguyên (KN) và kháng thể (KT) ở nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml), rẻ tiền, an toàn và độ chính xác cao (Phạm Văn Ty, 2001)

Tuy nhiên bản thân kỹ thuật ELISA nói chung cũng còn có một số nhược điểm Đối chứng âm vẫn có thể cho kết quả dương tính do bị nhiễm chéo từ chất tạo

màu hoặc từ kháng thể được đánh dấu hoặc do bản thân đối chứng bị nhiễm Đối chứng dương không xuất hiện màu mà mẫu kiểm tra có màu do đối chứng quá hạn hay điều kiện bảo quản không tốt Đặc biệt đối với việc xác định loài trong thịt chế biến bằng phương pháp ELISA không tỏ ra là phương pháp thích hợp (Ali và ctv, 2005), vì protein trong thịt xử lý nhiệt phần lớn đã bị biến tính Hơn nữa kỹ thuật ELISA cần phải có lượng mẫu đủ lớn để có thể nhận diện màu

2.4.3 Protein array

Protein array là phương pháp sử dụng một loại hạt hình cầu (hay slide) để xác định đồng thời nhiều phản ứng trong cùng một ống nghiệm hay giếng nhỏ có chứa mẫu Phát hiện mẫu nhờ các chất nhuộm huỳnh quang có trong hạt cầu được kích thích Độ nhạy của tín hiệu biểu thị cho lượng mẫu đích

Phương pháp này có nhiều ưu điểm:

Cho phép phát hiện cùng lúc hàng trăm chỉ tiêu trong cùng một giếng mẫu

Độ lặp lại cao

Không cần lượng mẫu lớn

Độ chuyên biệt cao

Tuy nhiên, phương pháp hiện đại với các thiết bị tiên tiến, đắt tiền đo đó ở Việt Nam chưa có điều kiện ứng dụng rộng rãi kỹ thuật này vào trong các nghiên cứu (Trần Nhật Phương, 2004) Hơn nữa cũng như ELISA, phương pháp này khó có thể

áp dụng đối với thịt đã xử lý nhiệt

2.4.4 Điện di 2 chiều

Phương pháp điện di 2 chiều được xây dựng từ hai kỹ thuật phân tách sản phẩm theo 2 thành phần cấu thành của bản thân sản phẩm (điểm đẳng điện, khối lượng phân tử) Phương pháp này có hai giai đoạn phân tách: giai đoạn đầu phân tách sản phẩm dựa vào điểm đẳng điện của phân tử protein mẫu; giai đoạn hai, sản phẩm được phân tách theo khối lượng phân tử (Rybicki và Purves, 2003)

Phương pháp này có tính ứng dụng cao, cho phép phát hiện cùng lúc hàng ngàn polypeptide khác nhau với độ nhạy cao Kết quả tốt nhất trên mẫu huyết thanh

và dịch chiết tế bào (Garfin, 2000)

Tuy nhiên, để kỹ thuật điện di 2 chiều đạt kết quả tốt cần phải có tay nghề kỹ thuật cao Và cũng như hai kỹ thuật ELISA và protein array, kỹ thuật này không phù hợp để xác định protein của thịt đã xử lý nhiệt

2.4.5 Giới thiệu chung về phương pháp PCR (polymerase chain reaction)

Phương pháp PCR là một công cụ đã trở nên phổ biến trong sinh học phân

tử, đem lại một cuộc cách mạng trong công nghệ di truyền học phân tử, đánh dấu một bước tiến cực kỳ quan trọng cũng như các khám phá trước đây về enzym cắt giới hạn và phương pháp Southern blot Phương pháp này do K Mulis cùng cộng sự phát minh năm 1985 Đây là một phương pháp hoàn toàn mới trong việc nghiên cứu

và phân tích gen và hệ gen Đối với các phương pháp trước đây khó khăn lớn nhất trong phân tích gen ở chỗ chúng là những mục tiêu đơn lẻ và rất nhỏ trong một hệ gen phức tạp, khổng lồ Trong khi đó kỹ thuật PCR lại giúp chúng ta có thể tạo ra một số lượng lớn các bản sao của một đoạn DNA mong muốn

Nhờ các ưu điểm nổi trội trong nghiên cứu sinh học phân tử mà kỹ thuật PCR nhanh chóng được áp dụng rộng rãi để chẩn đoán các bệnh về virus, vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng và cho kết quả chính xác Mặt khác, sự phân tích thành phần và trật tự nucleotid trên phân tử DNA bằng phương pháp PCR còn có ý nghĩa to lớn trong công tác phân loại các loài sinh vật

Thực chất đây là một phương pháp tạo dòng in vitro, không cần sự hiện diện

của tế bào và nguyên tắc sẽ được trình bày sau đây

Nguyên tắc

Nguyên tắc của phương pháp là tạo lượng lớn các đoạn DNA đặc thù từ phân

tử DNA khuôn dựa trên sự hoạt động của DNA – polymerase để tổng hợp sợi mới

bổ sung

Các yếu tố cơ bản để thực hiện phản ứng PCR

Sợi khuôn DNA chỉ cần biết trình tự nucleotid của đoạn nhỏ nằm cạnh đoạn cần nhân lên để thiết kế hai đoạn mồi oligonucleotid

Hai đoạn mồi ngắn xác định điểm bắt đầu tổng hợp DNA, là tín hiệu chỉ hướng đi (5’ – 3’) của enzym DNA polymerase Mồi dài khoảng 20 nucleotid và ở hai đầu của mồi không kết hợp với nhau theo nguyên tắc bổ sung

Có đầy đủ 4 loại nuclotid tự do (dNTP): dATP, dTTP, dGTP, dCTP

Enzym chịu nhiệt Taq polymerase

Dung dịch đệm

Ion Mg2+

Nước tinh khiết không có enzym nuclease

Các bước cơ bản của một chu kỳ phản ứng PCR:

Bước 1: Biến tính (denaturation)

Sợi DNA khuôn mạch đôi tách thành hai sợi DNA mạch đơn dưới tác dụng của nhiệt độ cao khoảng 94 – 950C trong vòng 30 giây – 1 phút

Bước 2: Bắt cặp (hybridization)

Nhiệt độ trong giai đoạn này được hạ thấp xuống khoảng 37 – 680C tùy thuộc vào nhiệt độ nóng chảy (Tm) của cặp mồi sử dụng để đoạn mồi bắt cặp với sợi DNA khuôn Thời gian cho giai đoạn này kéo dài từ 30 giây – 1 phút

Bước 3: Kéo dài (elongation)

Nhiệt độ được tăng đến 720C giúp cho enzym polymerase hoạt động tổng hợp sợi DNA mới bổ sung với mạch khuôn từ vị trí bắt cặp của đoạn mồi Thời gian của giai đoạn kéo dài từ 30 giây đến vài phút

Một chu kỳ gồm ba bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, và mỗi lần lại làm tăng gấp đôi lượng mẫu của lần trước Đây là sự khuếch đại theo cấp số nhân, theo tính toán sau 30 chu kỳ sự khuếch đại sẽ là 106

so với số lượng mẫu ban đầu

Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR

DNA mẫu

thường khuếch đại tốt nhất đối với đoạn DNA dài khoảng 1 – 1,5 kb

Phương pháp này cũng cho phép xác định DNA với một lượng thấp, khoảng nhỏ hơn 100 ng (Trần Thị Xô và Nguyễn Thị Lan, 1999) Tính trung thực của DNA polymerase không những phụ thuộc vào mức độ sai sót của bản thân enzym này mà còn phụ thuộc vào số bản sao ban đầu của DNA mẫu (Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 1999) Lượng bản sao của DNA mẫu ban đầu quá lớn sẽ gây ra sai số cao trong quá trình sao chép Sai số ngẫu nhiên trong vài chu kỳ đầu sẽ lan rộng đến những chu kỳ sau Do đó, việc giảm lượng DNA mẫu ban đầu còn hạn chế được các khuếch đại “kí sinh” tạo những sản phẩm phụ không mong muốn

Mẫu DNA tinh sạch sẽ cho kết quả tốt nhất, tuy nhiên nhiều kỹ thuật PCR vẫn đạt kết quả tốt đối với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào Thậm chí phương pháp PCR còn cho phép khuếch đại cả những mẫu DNA không được bảo quản tốt, đã bị phân hủy như vết máu lâu ngày, tinh dịch đã khô, hóa thạch, tóc, móng tay người chết, (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002)

Enzym DNA polymerase

Hiệu quả của phương pháp phụ thuộc vào khả năng chịu nhiệt của enzym polymerase (vì phản ứng PCR luôn phải thực hiện ở những nhiệt độ khác nhau)

Phương pháp PCR chuyển sang bước ngoặc mới với việc phát hiện enzym taq polymerase có nguồn gốc từ vi khuẩn (Thermus aquaticus) phân lập từ suối nước

nóng nên chịu được nhiệt độ cao Enzym này không bị biến tính ở nhiệt độ biến tính

và xúc tác tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng tạo ra các sản phẩm DNA tinh sạch Điều này cho phép tự động hóa tất cả các bước của chu trình nhân bản DNA Từ đó máy luân nhiệt PCR ra đời và có khả năng điều khiển cả về nhiệt độ lẫn thời gian (Trần Thị Xô và Nguyễn Thị Lan, 1999)

Ngày nay nhiều polymerase chịu nhiệt khác cũng đã được đưa ra thị trường

với nhiều chức năng hoàn thiện hơn Tth polymerase hoạt động như một enzym

phiên mã ngược khi có mặt RNA khuôn và ion Mn++ Tth pol lại xúc tác phản ứng

tổng hợp cDNA trên bản mẫu RNA (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 2002)

Tuy vậy trong phản ứng PCR, nếu DNA Taq polymerase quá dư thừa, chúng

ta sẽ thấy hiện tượng tổng hợp DNA do phản ứng giả của mồi trên dây đơn Hầu hết

ở các quy trình, người ta khuyến cáo nồng độ Taq nên sử dụng là 0,5 UI/25 l để

kiểm soát tính chuyên tính của phản ứng và không nên sử dụng nồng độ cao hơn 2,5 UI/25 l (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999)

Mồi

Mồi là một chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được sự khuếch đại đặc trưng và

có hiệu quả cao nhất Chọn mồi là một công việc rất quan trọng quyết định thành công của phương pháp và công việc đó phải dựa theo một số nguyên tắc sau đây:

Chọn trình tự mồi xuôi và mồi ngược sao cho chúng không bắt cặp bổ sung giữa mồi xuôi và mồi ngược và cũng không có những cấu trúc kẹp tóc do

sự bắt cặp bổ sung giữa các phần khác nhau của một mồi

Mồi phải đặc hiệu đối với DNA cần khuếch đại và không trùng với các trình tự khác trên gen

Trình tự nằm giữa mồi xuôi và ngược không được quá lớn, khoảng dưới 1kb là tốt nhất và phản ứng PCR sẽ không cho kết quả tốt nếu đoạn khuếch đại lớn hơn 3 kb

Độ dài mồi cần chọn khoảng 18 – 30 nucleotid Nếu mồi dài hơn 30 nucleotid sẽ ảnh hưởng đến sự tổng hợp ở bước 3 Trong trường hợp tiến hành trên những DNA được dòng hóa như cosmid thì mồi cần dùng sẽ có chuỗi mã ngắn khoảng 10 nucleotid

Nhiệt độ bắt cặp của mồi xuôi và ngược không được quá cách biệt, thông thường trong khoảng 4 – 50

C Thành phần nucleotid của các mồi phải cân bằng tránh các cặp GC lặp đi lặp lại nhiều lần Công thức tính nhiệt độ bắt cặp của mồi trong trường hợp có khoảng 20 nucleotid là:

Tm = 4(G+C) + 2(A+T)

Trong đó: A, T, C, G là thành phần các nucleotid của đoạn mồi

Tuy nhiên, việc tính toán này chỉ có tính chất tạm thời, chúng ta phải điều

nhất Bằng kinh nghiệm và thực hiện thí nghiệm nhiều lần chúng ta mới có thể có số liệu đúng về nhiệt độ bắt cặp của mồi

Dung dịch đệm

Môi trường đệm KCl đã và đang được áp dụng là một dung dịch đệm rất hữu hiệu cho kỹ thuật PCR Ngoài ra còn có dung dịch điệm NaCl dùng cho việc khuếch đại những đoạn DNA giàu GC và amonium sulphate cho những sản phẩm PCR có trọng lượng phân tử thấp (Holm và ctv, 1991)

pH của dung dịch đệm cũng được xem xét kỹ trong kỹ thuật PCR Hầu hết các dung môi phản ứng được đệm trong môi trường Tris – HCl ở pH = 8,3

Những hoạt chất ổn định enzym (enzym stabilizers) cũng được chú ý như: gelatin (0,01%), Triton X – 100 (0,1% (v/v)) trong những dung dịch đệm để tồn trữ enzym Có trường hợp người ta sử dụng cả hai làm dung dịch điệm

Ion Mg 2+

Một trong những ảnh hưởng có tính chất quyết định đến sự chuyên biệt và hiệu quả của phản ứng PCR là nồng độ Mg2+ Môi trường có tính chất ion cao sẽ làm cho dung dịch đệm trở nên năng động rất nhiều Do đó nồng độ Mg2+

cao hay thấp đều tạo ra những ảnh hưởng rất lớn Nồng độ Mg2+ cao sẽ làm cho phân tử DNA mạch đôi ổn định hơn nhưng đồng thời ngăn cản sự biến tính hoàn toàn của sản phẩm trong mỗi chu kì và do đó làm giảm sản phẩm PCR tạo ra Ngoài ra lượng

Mg2+ dư còn làm tăng hiện tượng bắt cặp giả tạo ra những sản phẩm không mong muốn với số lượng khá lớn

Ngược lại nếu nồng độ Mg2+ quá thấp (< 0,5 M), sẽ ảnh hưởng xấu đến quá trình kéo dài vì Mg2+ đóng vai trò là co-factor của Taq polymerase Một vài ion

Mg2+ sẽ được kẹp giữ bởi dNTP trong phản ứng Vì vậy cần phải tỷ lệ thích hợp giữa dNTP và Mg2+

Nucleotid

Cần phải có cả bốn loại nucleotid dạng triphophat: dATP, dTTP, dCTP, dGTP Người ta khuyến cáo rằng mỗi loại deoxynucleotid được sử dụng là 200 M

Phải giữ cho nồng độ của tất cả các deoxynucleotid luôn bằng nhau, để tránh sự gắn kết nhầm lẫn

Thời gian và số chu kỳ

Phản ứng PCR diễn ra qua hai giai đoạn, giai đoạn đầu số lương bản sao tăng theo cấp số nhân nhưng sau đó hiệu quả khuếch đại giảm dần vì một số nguyên nhân sau:

Cạn kiệt các thành phần phản ứng, nhất là sự giảm nồng độ các nucleotid

Hơn nữa ống nghiệm dùng cho các phản ứng của cùng một thí nghiệm phải thuộc cùng một kiểu vì đặc tính truyền nhiệt của của các ống này cũng như độ tiếp xúc giữa ống và bộ phận tạo nhiệt của thiết bị có ảnh hưởng lớn đến quá trình khuếch đại (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 2002)

Ưu và nhược điểm của phản ứng PCR

Ưu điểm của phản ứng PCR

Thời gian thực hiện nhanh, đơn giản, ít tốn kém

Không đòi hỏi mẫu phải tinh sạch cao (vết máu khô, mẫu vật khảo cổ)

Nhược điểm của phản ứng PCR

Đòi hỏi phải biết trình tự nucleotid của đoạn DNA cần khuếch đại, hay ít nhất cũng phải biết trình tự hai đầu của phân tử DNA

Chỉ khuếch đại những phân tử DNA có kích thước nhỏ hơn 3 kb, tốt nhất là 1 kb

Rất dễ bị nhiễm, dẫn đến tạo sản phẩm phụ (dương tính giả)

Ứng dụng của kỹ thuật PCR

Do có khả năng khuếch đại một lượng DNA cực nhanh và chuyên biệt nên kỹ thuật PCR được áp dụng rộng rãi trên nhiều lĩnh vực (Nguyễn Văn Uyển, 1995):

- Sản xuất các mẫu dò

- Ứng dụng trong khuếch đại DNA, RNA

- Ứng dụng để phân tích đa dạng di truyền

- Ứng dụng trong chẩn đoán bệnh

2.4.6 Nguyên tắc multiplex PCR

Multiplex PCR là phản ứng PCR cho phép phát hiện cùng lúc nhiều gen của một sinh vật hay nhiều sinh vật khác nhau bằng cách sử dụng nhiều cặp mồi khác nhau trong một phản ứng

2.5 Các công trình nghiên cứu về phát hiện loài trong thịt chế biến bằng

phương pháp multiplex PCR

Hơn một thập kỉ qua, sau khi ra đời phương pháp PCR nói chung và multiplex PCR nói riêng đã được sử dụng rộng rãi để phát hiện hay phân biệt DNA các sinh vật khác nhau từ nhiều nguồn mẫu Vì vậy phương pháp multiplex PCR cũng đã được nhiều nhà nghiên cứu sử dụng trong việc phân biệt loài động vật trong thịt chế biến

Năm 1997, Wayne và ctv đã có công trình nghiên cứu về trình tự mtDNA dài2001 bp của 23 dòng chó Kết quả nghiên cứu cho thấy trên mtDNA có trình tự

bảo toàn cho cả 23 dòng chó

Tại Hoa Kỳ, Sawyer (1997) đã tìm ra một phương pháp nhanh và nhạy để xác định và ngăn chặn tình trạng nhập khẩu bò nhiễm BSE Tác giả đã xây dựng quy trình PCR phát hiện thịt bò trong thịt và bột thịt xương dựa trên đoạn gen bảo tồn của mtDNA bò (B – mtDNA)

Năm 1998, Matsugana đã công bố công trình nghiên cứu phát hiện 6 loại thịt (bò, heo, gà, cừu, dê, ngựa) từ thịt chế biến Tác giả sử dụng 7 đoạn mồi với tỉ lệ thích hợp để phát hiện DNA chuyên biệt cho từng loài Mồi xuôi được thiết kế dựa

trên trình tự DNA bảo toàn của gen mtDNA, còn mồi ngược được thết kế dựa vào

trình tự chuyên biệt ở mỗi loài Các cặp mồi này cho các sản phẩm PCR có kích thước khác nhau tương ứng với 6 loại thịt Các đoạn DNA của dê, gà, bò, cừu, heo, ngựa lần lượt có khích thước: 157, 227, 274, 331, 398, 439 bp Kết quả PCR được quan sát bằng điện di DNA của dê, gà, bò, cừu, heo được phát hiện cả đối với DNA tách chiết từ thịt xử lý nhiệt ở 1000

C hay 1200C, riêng đối với thịt ngựa thì không phát hiện được ở 1200C Giới hạn nhỏ nhất của nồng độ DNA mà phản ứng PCR còn phát hiện được là 0,25 ng

Năm 2000, Montiel-Sosa và ctv đã thiết kế cặp mồi có tính chuyên biệt cao

trên đoạn bảo tồn của gen mtDNA Cặp mồi này được dùng để khuếch đại đoạn

DNA dài 531bp của gia cầm bằng phương pháp PCR Phương pháp này tỏ ra hữu dụng đối với cả thịt tươi và hỗn hợp thịt chế biến bao gồm thịt phơi khô và thịt nấu chín từ bò, cừu, gà

Năm 2004, Myers và ctv cũng đã dựa vào đoạn mtDNA để thiết lập phản ứng

multiplex PCR nhằm phát hiện thịt các loài bò, heo, cừu, dê, ngựa trong thức ăn chó Giới hạn DNA để phát hiện là 1 g/kg Kết quả cho thấy chỉ có 27 mẫu trong tổng số 31 mẫu là chứa thịt bò và heo (các mẫu thức ăn chó được ghi trên nhãn là chỉ gồm thịt bò và heo)

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Nội dung thực hiện

(1) Tách chiết DNA từ thịt tươi và thịt xử lý nhiệt ở: 800C/15’, 1200C/15’,

(5) Thực hiện phản ứng m-PCR để xác định ba loại thịt heo, bò, cừu

Thực hiện phản ứng m-PCR đối với hỗn hợp DNA heo, bò, cừu có nồng

độ của DNA bò, cừu giảm dần để xác định ở nồng độ nào phản ứng m-PCR vẫn còn phát hiện được hai loài này

Thực hiện phản ứng m-PCR với hỗn hợp thịt đã xử lý ở các nhiệt độ

800C/15’, 1200C/15’, 1200C/30’, 1300C/15’

(6) Thực hiện phản ứng m-PCR phát hiện thịt heo, bò, cừu trong bột thịt

3.2 Thời gian và địa điểm tiến hành

Đề tài được tiến hành từ ngày 01-02-2007 đến ngày 30-07-2007 tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm trường Đại Học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh

3.3 Vật liệu

3.3.1 Nguồn mẫu tách chiết DNA

Mẫu cơ vân được lấy từ thịt heo, bò, cừu mua ở siêu thị Metro TP Hồ Chí Minh

Mẫu bột xương thịt sử dụng trong thức chế biến thức ăn gia súc của các hãng

CE, A, VY

3.3.2 Đoạn mồi

Matsugana và ctv (1998) đã xác định được trình tự bảo toàn trên gen mtDNA, dựa vào trình tự này tác giả đã thiết kế đoạn mồi xuôi chung cho DNA thịt heo, bò, cừu Đoạn mồi này được kí hiệu là FSIM:

5’– GACCTCCCAGCTCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA – 3’

Tuy nhiên ở mỗi loài thú khác nhau sẽ có những trình tự trên gen mtDNA khác nhau, từ đó tác giả cũng đã thiết kế mồi xuôi cho từng loại gia súc heo, bò, cừu, được kí hiệu lần lượt là: RP, RB, RS:

RP: 5’ – GCTGATAGTAGATTTGTGATGACCGTA – 3’

RB: 5’ – CTAGAAAAGTGTAAGACCCGTAATATAAG – 3’

RS: 5’ – CTATGAATGCTGTGGCTATTGTCGCA – 3’

3.3.3 Hóa chất

3.3.3.1 Hóa chất dùng trong tách chiết DNA

Tris-HCl, NaCl, SDS, EDTA, proteinase K, sodium acetate, isoamyl alcohol, phenol, chloroform, ethanol, TE 1 X

3.3.3.2 Hóa chất dùng trong điện di

Agarose, TBE 0,5 X (Tris borate EDTA, pH = 8,3), loading dye 6 X, ladder

100bp, 200bp, ethidium bromide

3.3.3.3 Hóa chất dùng trong phản ứng PCR

Taq DNA polymerase: 5UI/µl (Promega), dung dịch đệm 10X

(Promega), dNTP 25 mM (Promega), MgCl2 25 mM (Promega), 4 đoạn mồi (khuếch đại gen mtDNA ở heo, bò, cừu), nước cất 2 lần (khử ion, hấp vô trùng, chiếu UV, pH 6,8 –7)

3.3.3.4 Thiết bị và dụng cụ

Tủ sấy (Jencons - PLS), water bath (Memmert), autoclave (Tommy), máy cất nước (khử ion) (Branstead), máy ly tâm (Mikro Z2K/Sigma 3K30C), tủ trữ mẫu và hóa chất (Reetech, Brandt, Sanyo), máy chụp gel (Biorad), máy luân nhiệt (Eppendorf, version 2.11.32), bộ điện di (Biorad), máy đo OD (Hewlett Packard), micropipet, đầu tip, eppendorf, kéo, chày, kẹp…

3.4 Phương pháp tiến hành

3.4.1 Lấy và bảo quản mẫu

Mua 500 g mỗi loại thịt bỏ vào túi nilon sạch kích thước 5 x 10 cm, dán nhãn cho mỗi loại thịt, trữ trong thùng đá, đem về phòng thí nghiệm, trữ ở –700C

3.4.2 Phối hợp các loại thịt để tạo hỗn hợp thịt và xử lý nhiệt

Mỗi loại thịt, lấy khoảng 150 g đem nghiền nhuyễn bằng máy nghiền mẫu Sau đó đem cân và trộn các loại thịt với tỉ lệ thịt heo, bò, cừu giảm dần (bảng 3.1) Mỗi túi mẫu có khối lượng 20 g

2 Cho vào 60 µl dung dịch đệm tách chiết (50 mM Tris-HCl, 20 mM NaCl,

1 mM EDTA và 1% SDS, pH= 8) và 3 µl dung dịch protease K (20 mg/ml) Ủ hỗn hợp ở 55o

C trong 1h

3 Cho vào 375 µl nước cất khử ion vô trùng; vortex 14000 vòng/phút trong

30 giây Cho thêm 200 µl dung dịch hỗn hợp phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1); vortex 14000 vòng/phút trong 1 phút; ly tâm 12000 vòng/phút trong 2 phút ở 10o

C

4 Lấy phần nước nổi bên trên chuyển vào eppendorf 1,5 ml mới đã có sẵn

1 ml dung dịch cồn tuyệt đối; trộn đều; ủ – 20oC trong 1 giờ

5 Ly tâm 12000 vòng/phút trong 2 phút ở 10oC; lấy cặn làm ráo

6 Rửa cặn bằng 1ml ethanol 70 %, ly tâm 12000 vòng/phút trong 2 phút ở

10oC, lấy cặn

7 Làm khô cặn trong tủ ấm ở 55o

C

8 Hòa tan cặn bằng 200 µl dung dịch TE; ủ 55oC trong 2 giờ

Sản phẩm DNA sau khi tách chiết được trữ ở – 20oC hoặc sử dụng ngay Kiểm tra độ tinh sạch DNA bằng cách đo mật độ quang (OD: optical density) ở bước sóng

260 nm và 280 nm bằng quang phổ kế (model HP 8453) Hàm lượng DNA được ước lượng theo công thức DNA (ng/μl) = 62,9*OD260nm – 36*OD280nm Các mẫu DNA tách chiết có tỷ số OD260 nm/OD280 nm (tỷ số OD) trên 1,6 được sử dụng cho PCR Sau khi đo OD, chúng tôi pha loãng mẫu đến nồng độ 100 ng/ l

Kết quả OD được xử ký bằng phần mền Statgraphics Version 7.0

3.4.4 Thực hiện phản ứng s-PCR

Để tìm quy trình PCR phù hợp cho việc xác định 3 loại thịt heo, bò, cừu trong hỗn hợp thịt, đầu tiên chúng tôi thử nghiệm phản ứng s-PCR theo quy trình của Matsugana và ctv (1998)

Thành phần phản ứng được trình bày trong bảng 3.2 và bảng 3.3

Bảng 3 3 Nồng độ mồi ngƣợc đối với mỗi loại thịt trong s-PCR

2

Lặp lại 35 chu kỳ

Biến tính Bắt cặp Kéo dài