Luận văn thạc sĩ Sinh học, Sinh học thực nghiệm, Lumbrokinase, Pichia pastoris

Tuy nhiên, các nghiên cứu này mới chỉ dừng lại ở mức độ tinh sạch, đánh giá tính chất l hóa của LK từ giun đất và tách dòng gen mã hóa LK, hiện chƣa có công bố nào về nghiên cứu sản xuất

VŨ THỊ BÍCH NGỌC

BIỂU HIỆN, TINH SẠCH VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT CỦA

LUMBROKINASE Ở PICHIA PASTORIS

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

VŨ THỊ BÍCH NGỌC

BIỂU HIỆN, TINH SẠCH VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT CỦA

LUMBROKINASE Ở PICHIA PASTORIS

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số : 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS QUYỀN ĐÌNH THI PGS TS TRỊNH HỒNG THÁI

Hà Nội - 2014

Vũ Thị Bích Ngọc i Cao học K20

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới PGS TS Quyền Đình

Thi- Trưởng phòng Công nghệ sinh học Enzyme- Viện Công nghệ sinh học- Viện Hàn lâm

khoa học và công nghệ Việt Nam, người thầy đã rất quan tâm, tận tình chỉ bảo, định

hướng nghiên cứu và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình công tác, học tập, tạo mọi điều

kiện để tôi có thể hoàn thành tốt luận văn này

Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS TS Trịnh Hồng Thái- Trưởng

phòng Proteomic và Sinh học cấu trúc- Đại học Khoa học tự nhiên- Đại học quốc gia Hà

Nội, người thầy đã tạo nền tảng cho tôi từ những ngày đầu tiên làm quen với sinh học thực

nghiệm Thầy đã rất nhiệt tình hướng dẫn, chỉ bảo tôi trong quá trình học tập tại trường,

sửa chữa luận văn và động viên tôi trong thời gian nghiên cứu

Để thực hiện tốt luận văn này, tôi cũng xin trân trọng cảm ơn các thầy giáo, cô

giáo trong khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học tự nhiên, đặc biệt là các thầy cô giáo

trong bộ môn Sinh lý Thực vật và Hóa sinh học đã tận tình giảng dạy và dìu dắt tôi trong

suốt thời gian học tập tại trường

Trong quá trình học tập, làm việc và thực hiện luận văn, tôi đã nhận được sự chỉ

bảo nhiệt tình, sự giúp đỡ, chia sẻ những kinh nghiệm trong công việc và cuộc sống của

TS Đỗ Thị Tuyên, TS Lý Thị Bích Thủy cùng các anh chị và các bạn học viên, sinh viên

làm việc tại Phòng Công nghệ sinh học Enzyme- Viện Công nghệ sinh học- Viện Hàn lâm

khoa học và công nghệ Việt Nam Tôi xin chân thành cảm ơn

Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình và bạn bè đã khích lệ, động viên và luôn

bên tôi trong suốt thời gian qua

Hà Nội, tháng 10 năm 2014

Học viên

Vũ Thị Bích Ngọc

Vũ Thị Bích Ngọc ii Cao học K20

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC CÁC HÌNH vi

BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ BỆNH TẮC NGHẼN MẠCH MÁU 3

1.1.1 Sơ lược về bệnh tắc nghẽn mạch máu 3

1.1.2 Quá trình đông máu và cơ chế tan huyết khối 3

1.1.3 Một số thuốc điều trị tắc nghẽn mạch máu 6

1.2 KHÁI QUÁT VỀ ENZYME THỦY PHÂN FIBRIN 9

1.2.1 Một số nguồn sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin 9

1.2.2 Phân loại enzyme thủy phân fibrin 11

1.3 KHÁI QUÁT VỀ ENZYME LUMBROKINASE 12

1.3.1 Cấu trúc và đặc tính của lumbrokinase 12

1.3.2 Tình hình nghiên cứu lumbrokinase ở Việt Nam 15

1.3.3 Tình hình nghiên cứu lumbrokinase trên thế giới 16

1.4 HỆ BIỂU HIỆN PICHIA PASTORIS 19

1.4.1 Khái quát về hệ biểu hiện Pichia pastoris 19

1.4.2 Chuyển gen ngoại lai vào genome nấm men 22

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 24

2.1 VẬT LIỆU VÀ HÓA CHẤT 24

2.1.1 Vật liệu 24

Vũ Thị Bích Ngọc iii Cao học K20

2.1.2 Hóa chất 24

2.1.3 Các dung dịch và đệm 25

2.1.4 Môi trường 26

2.1.5 Máy móc và thiết bị 27

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.2.1 Phương pháp nuôi cấy 28

2.2.2 Khảo sát điều kiện nuôi cấy biểu hiện LK tái tổ hợp 29

2.2.3 Tinh sạch protein tái tổ hợp 29

2.2.4 Tách fibrinogen 30

2.2.5 Xác định hoạt tính thủy phân fibrin 31

2.2.6 Xác định hàm lượng protein 32

2.2.7 Xác định các yếu tố ảnh hưởng lên hoạt tính và độ bền của enzyme 33

2.2.8 Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) 34

2.2.9 Phản ứng nối ghép gen ngoại lai 35

2.2.10 Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E coli 35

2.2.11 Tách chiết DNA plasmid từ tế bào E coli 36

2.2.12 Điện di DNA trên gel agarose 36

2.2.13 Xử lí DNA plasmid bằng enzyme cắt giới hạn 37

2.2.14 Tinh sạch DNA gel agarose 37

2.2.15 Biến nạp DNA plasmid vào tế bào nấm men bằng phương pháp xung điện 38

2.2.16 Tách chiết DNA tổng số nấm men 39

2.2.17 Điện di protein trên gel polyacrylamide ( SDS- PAGE) 40

2.2.18 Nhận dạng protein ngoại lai bằng kĩ thuật MALDI- TOF (MS/ MS) (Matrix-assisted laser desorption ionization- Time of flight) 41

Vũ Thị Bích Ngọc iv Cao học K20

2.2.19 Giải trình tự nucleotide 41

2.2.20 Xử lý số liệu 42

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43

3.1 NHÂN DÒNG GEN MÃ HÓA LUMBROKINASE 43

3.1.1 Thiết kế vector tách dòng pJET1.2 blunt/lk (pJLK) 43

3.1.2 Thiết kế vector biểu hiện pPICZαA/LK (pPLK) 46

3.2 BIỂU HIỆN LUMBROKINASE TRONG P PASTORIS X33 49

3.2.1 Tạo chủng P pastoris X33 mang gen lk 49

3.2.2 Sàng lọc các dòng P pastoris X33/pPLK tái tổ hợp 51

3.2.3 Biểu hiện P pastoris X33/pPLK tái tổ hợp 52

3.2.4 Tối ưu môi trường biểu hiện 53

3.2.5 Tối ưu nồng độ methanol 55

3.2.6 Tối ưu thời gian biểu hiện 56

3.3 TINH SẠCH rLK 56

3.4 ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT CỦA rLK 58

3.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính và độ bền enzyme rLK 58

3.4.2 Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính và độ bền enzyme rLK 61

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64

PHỤ LỤC i

Vũ Thị Bích Ngọc v Cao học K20

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Hoạt tính thủy phân fibrin và casein của một số protease 12

Bảng 2.1 Danh mục hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 24

Bảng 2.2 Dung dịch sử dụng trong nghiên cứu 25

Bảng 2.3 Môi trường sử dụng trong nghiên cứu 27

Bảng 2.4 Các máy móc thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 28

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng PCR với thể tích 25 µl 34

Bảng 2.6 Thành phần gel polyacrylamide 12,5% 40

Bảng 3.1 Hoạt tính rLK ở các môi trường biểu hiện khác nhau 53

Bảng 3.2 Hiệu suất tinh sạch rLK 58

Vũ Thị Bích Ngọc vi Cao học K20

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Quá trình hình thành cục máu đông trong mạch máu 4

Hình 1.2 Vai trò của antiplasmin (chất ức chế plasmin) 5

Hình 1.3 Sơ đồ chuyển hóa plasminogen 6

Hình 1.4 Cấu trúc bậc 3 của lumbrokinase tách chiết từ các loài giun đất 14

Hình 1.5 Cơ chế hoạt động của lumbrokinase 15

Hình 1.6 Con đường chuyển hóa methanol trong P pastoris 21

Hình 1.8 Hiện tượng tích hợp gen ngoại lai vào vị trí 5’AOX1 hoặc aox1::ARG4 của genome nấm men P pastoris 23

Hình 2.1 Đường chuẩn plasmin (Sigma) 32

Hình 2.2 Đường chuẩn BSA (Sigma) 32

Hình 3.1 Điện di đồ sản phẩm PCR 43

Hình 3.2 Điện di đồ sản phẩm tách plasmid pJLK, sản phẩm cắt kiểm tra plasmid pJLK với XbaI và XhoI 44

Hình 3.3 Trình tự vector tách dòng pJLK 45

Hình 3.4 Điện di đồ sản phẩm tinh sạch vector pPICZαA và gen lk , sản phẩm tách plasmid pPLK , sản phẩm cắt plasmid pPLK với enzyme EcoRI và XbaI 47

Hình 3.5 Trình tự vector biểu hiện pPLKvà trình tự amino acid tương ứng 48

Hình 3.6 Điện di đồ tinh sạch sản phẩm cắt plasmid pPLK với enzyme SacI 49

Hình 3.7 Điện di đồ sản phẩm tách DNA nấm men, sản phẩm PCR bộ gen nấm men P pastoris X33 50

Hình 3.8 Đĩa thử hoạt tính thủy phân fibrin của dịch nổi thu từ các dòng P pastoris X33/ pPLK tái tổ hợp 52

Hình 3.9 Điện di đồ protein ngoại bào thu được từ dịch nuôi cấy chủng nấm men tái tổ hợp 53

Hình 3.10 Điện di đồ protein ngoại bào thu được từ dịch tối ưu môi trường biểu hiện X33/pPLK 54

Vũ Thị Bích Ngọc vii Cao học K20

Hình 3.11 Ảnh hưởng của nồng độ MeOH cảm ứng lên mức độ biểu hiện rLK 55

Hình 3.12 Tối ưu thời gian biểu hiện rLK 56

Hình 3.13 Điện di đồ sản phẩm tinh sạch rLK 57

Hình 3.14 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme rLK 60

Hình 3.15 Ảnh hưởng nhiệt độ đến độ bền enzyme rLK 61

Hình 3.16 Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme rLK 62

Hình 3.17 Ảnh hưởng của pH lên độ bền enzyme rLK 63

Vũ Thị Bích Ngọc viii Cao học K20

BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Viết tắt Viết đầy đủ

2D- PAGE Two dimention - polyacrylamide gel electrophoresis

(Điện di hai chiều trên gel polyacrylamide)

ARN Acid ribonucleic

BLAST Basic local alignment search tool (Công cụ tìm kiếm liên kết

định vị cơ bản)

MALDI- TOF Matrix- assisted laser desorption/ionization- time of flight (ion

hóa mẫu hấp thụ dựa trên chất nền và năng lƣợng laser- thời

Vũ Thị Bích Ngọc ix Cao học K20

SDS- PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

Vũ Thị Bích Ngọc 1 Cao học K20

MỞ ĐẦU

Bệnh tim mạch là một trong nh ng nguyên nh n g y tử vong cao nhất trên toàn thế giới Theo tổ chức Y tế thế giới (WHO), hàng năm có khoảng trên 17 triệu người chết vì bệnh tim mạch, dự tính lên tới 23,3 triệu người vào năm 2030 Trên 80% các ca tử vong xảy ra ở các nước có thu nhập thấp và trung bình, điển hình là các nước đang phát triển tại vùng Nam Á và Đông Nam Á, nơi bệnh tim mạch đang gia tăng cùng với tốc độ công nghiệp hóa, đô thị hóa và nh ng thay đổi trong lối sống [64] Tại Việt Nam, theo thống kê của Viện tim mạch, tỷ lệ người d n mắc các bệnh tim mạch và đột quỵ khoảng 16% d n số

Có nhiều nguyên nh n dẫn tới rối loạn tim mạch và mạch máu não như: chứng tràn máu não, tăng huyết áp, xơ cứng động mạch,….[34] Trong tổng số các bệnh nh n bị tai biến mạch máu não thì có đến 24% tử vong, 50% sống nhưng bị các di chứng nặng hoặc nhẹ, chỉ có 26% số bệnh nh n sống và làm việc bình thường Nguyên nh n chủ yếu là do xuất hiện cục máu đông g y tắc mạch và cản trở lưu thông máu Do đó, việc làm tan cục máu đông đóng vai trò quan trọng trong việc điều trị bệnh này

Vào khoảng nh ng năm 90, các nhà nghiên cứu tại Nhật Bản đã phát hiện

được 1 enzyme có hoạt tính thủy ph n fibrin cao từ giun đất Lumbricus rubellus,

bao gồm 6 izozyme được đặt tên chung là lumbrokinase (LK) [47,50] Về phương diện l m sàng, LK được xem là thuốc tan huyết khối đặc hiệu, sử dụng làm thuốc uống vì có thể được hấp thu từ ruột vào máu và hoạt hóa hệ thống fibrin nội sinh [66] Một ưu điểm lớn của lumbrokinase so với các thuốc điều trị bệnh tắc nghẽn mạch thông dụng khác - thường được sử dụng làm thuốc tiêm (như tPA (tissue type plasminogen activator), urokinase và streptokinase) [40,42] là không có tác dụng phụ, không g y chảy máu hệ thống, giá thành rẻ

Hiện nay, hầu hết các thuốc đặc trị tắc nghẽn mạch máu có mặt tại Việt nam phải nhập khẩu từ nước ngoài và có giá thành cao

Vì vậy, nh ng năm gần đ y, nghiên cứu sản xuất các yếu tố chống tắc nghẽn mạch máu dạng tự nhiên và tái tổ hợp bắt đầu được quan t m ở trong nước Trong

Vũ Thị Bích Ngọc 2 Cao học K20

số đó, LK nhận đƣợc rất nhiều quan t m của các nhà khoa học do nh ng ƣu điểm nổi bật của nó Tuy nhiên, các nghiên cứu này mới chỉ dừng lại ở mức độ tinh sạch, đánh giá tính chất l hóa của LK từ giun đất và tách dòng gen mã hóa LK, hiện chƣa có công bố nào về nghiên cứu sản xuất lumbrokinase tái tổ hợp để làm thuốc

Nhằm góp phần vào việc hạ giá thành sản phẩm và chủ động nguồn nguyên liệu để sản xuất lumbrokinase, đề tài KC04.01/11-15 (2012-2014) “Nghiên cứu quy trình công nghệ sản xuất lumbrokinase tái tổ hợp làm thuốc phòng chống tắc nghẽn mạch máu’’ do PGS.TS Quyền Đình Thi làm chủ nhiệm đã đề xuất x y dựng quy trình công nghệ tạo các dòng tế bào sản xuất LK tái tổ hợp Trong khuôn khổ đề tài

này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu “Biểu hiện, tinh sạch và đánh giá tính chất

của lumbrokinase ở Pichia pastoris”, nhằm tiến tới x y dựng đƣợc quy trình công

nghệ tạo các dòng tế bào sản xuất LK tái tổ hợp dùng làm nguyên liệu thuốc cũng nhƣ x y dựng quy trình công nghệ ổn định sản xuất LK tái tổ hợp

Với đề tài trên, luận văn tập trung giải quyết các vấn đề sau:

1 Sử dụng công nghệ gen và công nghệ protein để biểu hiện và tinh sạch đƣợc enzyme lumbrokinase có hoạt tính thủy phân fibrin

2 Nghiên cứu một số tính chất của enzyme LK tái tổ hợp tinh sạch đƣợc

vì bệnh tim mạch Ở Mỹ, cứ 29 gi y có thêm một người bị bệnh mạch vành, và cứ 1 phút thì có một người tử vong Tử vong do bệnh tim mạch chiếm 42% toàn bộ các ca

tử vong, phí tổn do bệnh chiếm 128 tỉ USD/ năm Hiện nay trên thế giới số người chết hoặc chịu di chứng nặng nề từ các bệnh tim mạch và tai biến mạch máu não ngày càng gia tăng nhất là ở các nước đang phát triển Ngoài ra còn có rất nhiều bệnh liên quan đến tắc nghẽn mạch máu như: tràn máu não, nhồi máu cơ tim, tắc động mạch phổi Nguyên nh n chủ yếu của các bệnh trên là do các cục máu đông làm tắc nghẽn mạch máu Do đó để hạn chế thấp nhất tỷ lệ tử vong và các biến chứng do bệnh tim mạch g y ra, các nhà khoa học

đã đi theo hướng xử l các huyết khối hình thành trong thành mạch Và việc làm tan cục máu đông đóng vai trò quan trọng trong việc điều trị bệnh tim mạch [7]

1.1.2 Quá trình đông máu và cơ chế tan huyết khối

Đông máu là hiện tượng sinh lý xảy ra khi mạch máu bị tổn thương, máu được chuyển từ thể lỏng sang thể đặc Quá trình bao gồm một chuỗi các phản ứng xảy ra theo kiểu bậc thang được chia thành 3 giai đoạn: giai đoạn hình thành phức hợp prothrombinase qua 2 con đường nội sinh và ngoại sinh, giai đoạn hình thành thrombin từ prothrombin và giai đoạn tạo mạng lưới fibrin từ fibrinogen hình thành cục máu đông [1]

Cơ chế đông máu được bảo tồn khá chắc trong tiến hóa, riêng với lớp thú, hệ thống đông máu tồn tại 2 thành phần là tế bào (tiểu cầu) và protein (các yếu tố đông máu) Rối loạn của 1 trong 2 thành phần gây rối loạn trong quá trình đông máu, tác động tới việc máu đông nhiều hoặc đông quá ít

Vũ Thị Bích Ngọc 4 Cao học K20

Khi chấn thương làm tổn hại đến nội mạc mạch máu, tiểu cầu lập tức tạo nút chặn cầm máu tại vết thương, đ y được coi là quá trình cầm máu ban đầu Quá trình cầm máu thứ phát diễn ra đồng thời, các yếu tố đông máu trong huyết tương đáp ứng một loạt các chuỗi phản ứng để tạo các sợi huyết có vai trò củng cố nút chặn tiểu cầu

Đ y thực chất là chuyển fibrinogen dạng hòa tan thành fibrin dạng không hòa tan, sau đó, các mạch máu sẽ tạo mạng lưới chứa tiểu cầu sợi huyết hình thành cục máu, gắn vào thành mạch để ngăn chặn sự mất máu và tạo điều kiện để liền vết thương (Hình 1.1)

Hình 1.1 Quá trình hình thành cục máu đông trong mạch máu

Bình thường trong cơ thể, quá trình đông máu được kiểm soát chặt chẽ bởi quá trình chống đông máu để khu trú việc đông máu chỉ ở chỗ bị thương mà không lan rộng ra cả dòng máu Tham gia quá trình chống đông máu là hàng loạt các chất chống đông khác nhau và hiện tượng tiêu fibrin dưới tác dụng của plasmin- enzyme thủy phân fibrin của cơ thể [2] Quá trình đông máu liên quan tới 1 hệ thống phản ứng protease bao gồm khoảng 30 loại protein khác nhau, trong khi đó chỉ có 1 enzyme plasmin có thể phá vỡ cục máu đông

Giai đoạn 3:

Mạng lưới fibrin bắt gi hồng cầu, bịt kín hoàn toàn thành mạch máu

Khối fibrin Tiểu cầu

Màng trong thành mạch máu

Mô liên kết

Tế bào hồng cầu

Vũ Thị Bích Ngọc 5 Cao học K20

Cục máu đông có thể tan trở lại nhờ quá trình tan huyết khối nhằm tái lưu thông tuần hoàn máu, đ y là quá trình ngược với quá trình đông máu Có hai cơ chế làm tan huyết khối là: cơ chế ph n hủy fibrin thông qua hoạt hóa plasminogen thành plasmin và cơ chế ph n hủy trực tiếp fibrin (Hình 1.3)

Đối với cơ chế tan huyết khối thông qua hoạt hóa plasminogen có sự tham gia của các yếu tố gồm: plasminogen, plasmin và các chất hoạt hóa Plasmin gồm 2 chuỗi polypeptide nối với nhau bằng một cầu nối disulfide, chuỗi nhẹ gắn serine- protease, chuỗi nặng có vị trí gắn fibrin Yếu tố này được tạo ra dưới dạng không hoạt động là plasminogen ở gan Đ y là một chuỗi polypeptide chứa 791 amino acid Chất hoạt hóa plasminogen của mô (tPA) chuyển plasminogen thành plasmin, plasmin xúc tác phản ứng cắt fibrin thành các sản phẩm tan được, được gọi là sản phẩm thoái giáng của fibrin (FDPs) Các sản phẩm này có tác dụng cạnh tranh với thrombin làm chậm sự chuyển hóa fibrinogen thành fibrin (làm chậm sự tạo thành cục máu) Trong máu người bình thường, plasmin tồn tại song song với yếu tố ức chế là antiplasmin (Hình 1.2) Nó có nồng độ cao hơn 30 lần so với plasmin trong huyết tương, chống lại tác động của plasmin tới việc ph n hủy protein trong huyết tương [7] Trong máu có 2 yếu tố hoạt hóa plasminogen tự nhiên là yếu tố hoạt hóa

mô (tPA) và urokinase (uPA), các hoạt động tiêu sợi huyết tự nhiên được kiểm soát bởi các chất ức chế hoạt hóa plasminogen (ví dụ PAI-1: plasminogen activator inhibitor – 1, một chất ức chế tác dụng nhanh của t-PA và u-PA) và các chất ức chế plasmin (ví dụ a1- antiplasmin, a2-macroglobulin) [22]

Hình 1.2 Vai trò của antiplasmin (chất ức chế plasmin)

Vũ Thị Bích Ngọc 6 Cao học K20

Nhờ cơ chế trên mà cơ thể gi được sự ổn định và c n bằng gi a quá trình đông máu và tan huyết khối

Hình 1.3 Sơ đồ chuyển hóa plasminogen

Cơ chế tan huyết khối thông qua ph n hủy trực tiếp fibrin được xem là cơ chế an toàn hơn cơ chế hoạt hóa plasminogen vì plasmin có liên quan đến hệ thống cầm máu của cơ thể, nếu lượng plasminogen được hoạt hóa thành plasmin mất c n bằng so với antiplasmin thì sẽ nguy hiểm với nh ng vết thương chảy máu Ngoài các yếu tố lumbrokinase, t-PA và u-PA không có yếu tố nào có thể ph n hủy trực tiếp fibrin mà đều phải thông qua hoạt hóa plasminogen [46]

Ý nghĩa của quá trình thủy phân fibrin là rất lớn vì fibrin có thể được thải loại từ dòng máu, tạo các kháng đông và kháng kết dính có hoạt tính cao

1.1.3 Một số thuốc điều trị tắc nghẽn mạch máu

Hiện nay trên thế giới, do nh ng thay đổi trong môi trường và lối sống, số bệnh nhân tử vong do bệnh tim mạch ngày càng tăng cao, đặc biệt là ở nh ng nước đang phát triển Do vậy, nhu cầu về thuốc ch a bệnh tim mạch là rất lớn

Yếu tố hoạt hóa plasminogen nội

mô (tPA)

Yếu tố XIa, XIIa

kallikrein

Sản phẩm thoái giáng của fibrin

Thrombin- yếu tố ức chế quá trình thuỷ ph n fibrin

Yếu tố ức chế hoạt hóa

plasminogen 1&2

Vũ Thị Bích Ngọc 7 Cao học K20

Trong hầu hết các thể khác nhau của bệnh như: bệnh tràn máu não, nhồi máu

cơ tim hay tắc nghẽn động mạch phổi đều có nguyên nhân tắc nghẽn mạch do việc hình thành cục máu đông trong mạch máu [51] Việc điều trị thường tập trung vào kìm hãm sự tạo thành fibrin hoặc g y tác động để chuyển hóa plasminogen thành plasmin

Trước đ y, các thuốc kháng đông có bản chất hóa học như heparin và coumarin thường được sử dụng trong việc xử l bệnh nghẽn mạch với tác dụng kìm hãm sự tạo thành cục fibrin [64] Khi tiêm heparin với liều 0,5-1 mg/kg trọng lượng

cơ thể có thể kéo dài thời gian đông máu tới trên 30 phút Heparin có tác dụng ngay tức thời nên nhanh chóng ngăn cản sự phát triển của huyết khối Tác dụng của heparin kéo dài trong vòng 3- 4 giờ rồi bị phá hủy bởi heparinase có trong máu Tiêm coumarin vào cơ thể, coumarin sẽ tác dụng cạnh tranh với vitamin K nh ng vị trí hoạt động trong các phản ứng enzyme để dẫn đến sự tạo thành bốn yếu tố II, VII,

IX, X 12 giờ sau khi tiêm coumarin, hoạt tính đông máu giảm xuống còn 50% và sau 24 giờ chỉ còn bằng 20% so với bình thường Như vậy, coumarin không có tác dụng chống đông ngay lập tức vì còn phải đợi cho các yếu tố đông máu có sẵn trong huyết tương tiêu thụ hết Ba ngày sau khi chấm dứt điều trị bằng coumarin thời gian đông máu mới trở lại bình thường [1]

Ngoài ra, các nhà điều trị còn sử dụng aspirin trong việc ngăn ngừa nhồi máu

cơ tim Các thuốc atropine, papaverine và nitroglyceryl giúp ngăn ngừa hoặc giảm

co thắt mạch vành Cho đến nh ng năm 1950 các phương pháp chỉ là để làm giảm nhẹ chứ chưa phải điều trị [15,55]

Sau khi nhận thấy có thể kìm hãm sự tạo thành fibrin trong cơ thể sống bằng cách chuyển hóa plasminogen dạng không hoạt động thành plasmin hoạt động, các nghiên cứu l m sàng đã chỉ ra cách tiếp cận tốt nhất để điều trị nghẽn mạch là tiêm trực tiếp vào tĩnh mạch 1 enzyme có khả năng chuyển hóa plasminogen thành plasmin Các enzyme đang được sử dụng rộng rãi trong việc điều trị là streptokinase

(từ vi khuẩn α- haemolytic Streptococcus), urokinase (từ nước tiểu của người) và

tPA (chất hoạt hóa plasminogen của mô) tái tổ hợp [40]

Vũ Thị Bích Ngọc 8 Cao học K20

Nattokinase: là một loại enzyme tự nhiên được chiết xuất từ môi trường lên

men của vi khuẩn Bacillus natto Nattokinase làm tan fibrin gấp 4 lần plasmin nội

sinh trong cơ thể Nattokinase giúp duy trì và tăng cường khả năng ph n hủy fibrin bình thường của cơ thể nhằm hỗ trợ điều trị và phòng ngừa các bệnh liên quan đến huyết khối như nhồi máu cơ tim, thiếu máu lên não, đột quỵ [56,59]

Streptokinase: là một protein có khối lượng 47 kDa, sinh ra từ vi khuẩn

α-haemolytic Streptococcus Streptokinase xúc tác chuyển hóa plasminogen người

thành plasmin qua sự thủy ph n liên kết L-arginyl-L-valyl [42,50]

t-PA: là yếu tố hoạt hóa mô, có thể sản xuất bằng con đường tái tổ hợp

nhưng giá thành cao Đầu tiên t-PA gắn với fibrin, phức này sau đó gắn vào plasminogen tạo thành phức hợp hoạt hóa plasminogen để thủy ph n fibrin [27,31]

Urokinase: được tổng hợp bởi tế bào biểu mô hình ống trong thận người và

thu được trong nước tiểu, do đó việc sản xuất và khai thác l m sàng bị hạn chế (2300 lít nước tiểu mới thu được 29 mg urokinase tinh khiết) [63] Urokinase cũng hoạt động như một chất hoạt hóa plasminogen, thủy ph n liên kết ester ở L-lysine

và L-arginine [50], thường được dùng để tiêu hủy huyết khối tại chỗ, ngoài ra còn dùng để điều trị tắc nghẽn phổi, huyết khối tĩnh mạch s u.Việc sử dụng các enzyme này đã tỏ ra rất hiệu quả tuy nhiên nó vẫn chưa thể giải quyết được hết các vấn đề nảy sinh trong điều trị nghẽn mạch máu như sốt, tăng chảy máu cao, tạo kháng nguyên, khó xác định liều lượng thích hợp (streptokinase), giá thành cao (t-PA tái tổ hợp và urokinase) và không hiệu quả khi uống qua đường miệng [37]

Bên cạnh việc hoạt hóa plasminogen thành plasmin, các nhà khoa học còn nghiên cứu và tìm kiếm nh ng tác nh n có khả năng thủy ph n trực tiếp fibrin và giải quyết được nhược điểm của các loại thuốc đã sử dụng trước đó Các enzyme này phổ biến trong tự nhiên từ con người, động vật, thực vật, vi khuẩn và đã được

sử dụng thành công trong việc xử l tắc mạch, cứu sống nhiều trường hợp tắc mạch phổi và nhồi máu cơ tim

Vũ Thị Bích Ngọc 9 Cao học K20

1.2 KHÁI QUÁT VỀ ENZYME THỦY PHÂN FIBRIN

1.2.1 Một số nguồn sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin

Xu hướng nghiên cứu tìm ra các enzyme thủy ph n fibrin có nguồn gốc từ nhiều đối tượng khác nhau ngày càng phổ biến

Năm 1987, Sumi và cs, sau nhiều năm nghiên cứu về enzyme ph n giải cục nghẽn và tìm kiếm một tác nh n tự nhiên có thể hòa tan cục nghẽn liên quan tới nhồi máu cơ tim và tai biến mạch máu não, đã phát hiện ra nattokinase- một enzyme

có khả năng thủy ph n fibrin mạnh Nattokinase được chiết và tinh sạch từ một loại thực phẩm lên men truyền thống là Natto, đã được sử dụng ở Nhật Bản trên 2000 năm như một vị thuốc d n gian cho các bệnh về tim mạch và tê phù Natto được sản

xuất thông qua một quá trình lên men bằng cách bổ sung B natto, một vi khuẩn có lợi vào dịch đậu tương đã được nấu sôi Khi đó B natto sẽ sản xuất ra enzyme

nattokinase Sau khi thử nghiệm trên 173 loại thức ăn tự nhiên được xem là có tác dụng đối với các bệnh liên quan tới hiện tượng nghẽn mạch máu, Sumi đã tìm được điều mà ông mong muốn khi natto được nhỏ lên cục nghẽn nh n tạo làm từ fibrin trên một đĩa petri và để yên ở 37C Cục nghẽn xung quanh natto đã tan dần và tan hoàn toàn trong 18 giờ Ông đã đặt tên cho enzyme mới phát hiện này là

“nattokinase”, có nghĩa là “enzyme ở natto” [56]

Đến năm 1991, Mihara và cs đã tách chiết được enzyme có hoạt tính thủy

ph n fibrin cao từ giun đất Lumbricus rubellus, một thành phần chính để ch a

nh ng cơn sốt và nhận ra rằng enzyme này gồm có 6 isozyme, ông đã đặt tên chung cho 6 enzyme này là lumbrokinase [47]

Có thể nói, việc nghiên cứu phát hiện các enzyme có hoạt tính thủy ph n fibrin cao là một trong nh ng vấn đề hiện nay rất được quan t m Sau nh ng phát hiện đầu tiên về enzyme thủy ph n fibrin và triển vọng ứng dụng của nó trong việc điều trị bệnh tim mạch, hàng loạt nghiên cứu trên các đối tượng khác nhau đã được công bố Các enzyme thủy ph n fibrin không chỉ được tách chiết từ các loại thuốc, thức ăn truyền thống mà còn từ nhiều loài động vật, thực vật khác

Vũ Thị Bích Ngọc 10 Cao học K20

Năm 1996, Kim và cs đã tinh sạch được một enzyme có hoạt tính thủy ph n

fibrin mạnh từ Bacillus sp CK 11-4, ph n lập từ nước sốt đậu tương

Chungkook-Jang - một loại thực phẩm lên men truyền thống của Hàn Quốc [38]

Coll-Sangrona và Arocha-Pinango (1998) đã tách chiết enzyme thủy ph n

fibrin từ một loại s u bướm Lonomia achelous thu thập trên cánh đồng Các tác giả

đã kết luận rằng có sự tồn tại một enzyme có khả năng ph n giải cục nghẽn có ích ở

L achelous và họ đang tiến hành nghiên cứu sử dụng enzyme này làm thuốc ch a

đó giảm dần tới 15 giờ [18]

Năm 2001, Choi và Sa đã tách chiết và xác định đặc tính của enzyme thủy

ph n fibrin từ loài bèo tấm Spirodela polyrhiza-một thành phần trong bài thuốc d n

tộc ở phương Đông Bài thuốc này được sử dụng để làm giảm áp lực máu và giải độc cho các trường hợp bị rắn cắn [13]

Năm 2004, Wang và cs đã tách chiết enzyme thủy ph n fibrin từ nọc rắn

Agkistrodon acutus Các enzyme thủy ph n fibrin từ nọc rắn có thể ph n hủy trực

tiếp fibrin và fibrinogen Enzyme thủy ph n fibrin đầu tiên được tách chiết từ nọc

rắn A acutus có hoạt tính g y xuất huyết [63]

Vào năm 2007, các nhà khoa học Nhật Bản đã chỉ ra tác động chống huyết

khối của bột tỏi không mùi ở cả 2 điều kiện in vitro và in vivo Bột tỏi không ảnh

hưởng đến yếu tố tPA và các chất ức chế tiết từ tế bào nội mô tĩnh mạch cuống rốn của người, tăng cường hoạt động của plasmin nhờ tPA trong thủy ph n fibrin và trong các xét nghiệm sinh màu khoảng 1,8- 8,7 lần Ngoài ra, bột tỏi được xem là

Vũ Thị Bích Ngọc 11 Cao học K20

thực phẩm chức năng trong việc kháng tiểu cầu [48], giảm fibrinogen trong máu [8], làm dày, mịn và thay đổi cấu trúc thành động mạch liên quan đến lão hóa và xơ v a động mạch, giảm huyết áp [23] Đ y được xem là sản phẩm y học tiềm năng chiết xuất từ thực vật không g y ra các tác dụng phụ [52]

1.2.2 Phân loại enzyme thủy phân fibrin

Fibrin có bản chất là protein nên enzyme thủy ph n nó thuộc lớp 3 (hydrolase), nhóm protease theo cách ph n loại của Hội Hóa sinh quốc tế (năm 1960), xúc tác phản ứng thủy ph n liên kết peptide, tạo thành các peptide ph n tử thấp và các amino acid Các enzyme có phản ứng thủy ph n fibrin cao đã nghiên cứu chủ yếu thuộc nhóm serine protease (trung t m hoạt động bao gồm một bộ ba

xúc tác Asp…His…Ser, duy chỉ có enzyme tách chiết từ nọc rắn A acutus thuộc

nhóm metalloprotease [63]

Nói chung, chưa có sự ph n biệt rõ ràng gi a enzyme thủy ph n fibrin và các enzyme khác thuộc nhóm protease Người ta thường nhận ra chúng nhờ vào hoạt tính thủy ph n fibrin mạnh (được so sánh với hoạt tính của plasmin) Do thuộc nhóm protease nên hầu hết các enzyme thủy ph n fibrin đã được nghiên cứu đều có hoạt tính thủy ph n casein Tuy nhiên không phải enzyme có hoạt tính thủy ph n casein cao thì hoạt tính thủy ph n fibrin cũng cao và ngược lại (Bảng 1.1) [38] Đ y chính là tính đặc hiệu cơ chất của enzyme

Mặc dù không có một ranh giới rõ ràng gi a enzyme thủy ph n fibrin với các protease khác, nhưng nghĩa của các nghiên cứu về nó đều có một điểm chung là: tìm một enzyme có hoạt tính thủy ph n fibrin mạnh có thể làm thuốc ch a tắc nghẽn mạch máu Rõ ràng, không phải enzyme có hoạt tính thủy ph n fibrin nào cũng có thể đáp ứng được yêu cầu ấy Bởi vì khi vào mạch máu, enzyme chịu ảnh hưởng của rất nhiều yếu tố có trong máu (ví dụ như 2--macro globulin là chất kìm hãm protease) cũng như có nh ng tác động ngược lại đối với máu dẫn đến nh ng ảnh hưởng không mong muốn [30]

Vũ Thị Bích Ngọc 12 Cao học K20

Bảng 1.1 Hoạt tính thủy phân fibrin và casein của một số protease

phân casein (U)

Hoạt tính thủy phân fibrin (U)

Protease từ B licheliformis (type VIII) 423 41

1.3 KHÁI QUÁT VỀ ENZYME LUMBROKINASE

1.3.1 Cấu trúc và đặc tính của lumbrokinase

Lumbrokinase là tên gọi chung chỉ một nhóm gồm 6 isozyme có tác dụng thủy ph n fibrin, làm tan cục máu đông Khối lượng ph n tử trung bình của lumbrokinase từ 25 đến 32 kDa [46] Lumbrokinase là nh ng chuỗi polypeptide đơn giàu asparagine hoặc aspartic acid, rất ít proline và lysin, không chứa thành phần đường Chúng được xếp vào serine protease kiềm giống trypsin Tuy nhiên chúng giàu asparagine và aspartic acid hơn so với các serine protease khác đã biết

Lumbrokinase được tìm thấy trong ruột, dịch mô và dịch ruột của rất nhiều loài giun đất Chúng có tác dụng tiêu sợi huyết mạnh, người ta giải thích sự có mặt của nó trong các loại giun là do chúng cần để tiêu hóa thức ăn là nh ng mảnh vụn thực vật và các chất h u cơ trong đất nên chúng sản xuất LK như một serine protease [46]

Một số nghiên cứu gần đ y cho rằng các enzyme thủy ph n fibrin có thể hòa tan cục máu đông và hạn chế được khả năng vón cục [19,35] Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu đều đi vào tách chiết, tinh sạch, đánh giá tính chất l hóa và ứng

dụng l m sàng của enzyme thủy ph n fibrin từ giun đất L rubellus, L bimastus, E

Vũ Thị Bích Ngọc 13 Cao học K20

fetida hoặc E Andrei [28,66,67] Một số tác giả thử nghiệm tác dụng chống tắc

nghẽn mạch ở mức độ s u trên động vật thực nghiệm, nghiên cứu biến đổi hóa học nhằm mục đích làm enzyme bền hơn, nghiên cứu các đặc tính và biến đổi hóa học của enzyme khi đưa vào cơ thể [50]

Từ năm 2002 đến 2003, các nhà khoa học Trung Quốc cũng tách chiết được

enzyme có hoạt tính thủy ph n fibrin cao từ loài giun E fetida [45,60] Họ đã chứng

minh rằng các enzyme này có thể sử dụng làm thuốc uống thay thế một số thuốc

ch a bệnh tim mạch rất đắt trên thị trường hiện nay như urokinase và tPA

Cho và cs (2004) đã tinh sạch được 6 ph n đoạn lumbrokinase (F1 đến F6) từ

giun đất L rubellus có hoạt tính thủy ph n fibrin bằng phương pháp tủa muối

ammonium sulfate và sắc k cột Hoạt tính thủy ph n protein trên cơ chất casein của

6 isoenzyme này đạt được từ 11,3-167,5 U/mg xếp theo thứ tự hoạt tính F2>F1>F5>F6>F3>F4 Hoạt tính thủy ph n fibrin của 6 ph n đoạn này trên đĩa fibrin đạt được từ 20,8-207,2 U/mg xếp theo thứ tự tương ứng F6>F2>F5>F3>F1>F4 Khối lượng ph n tử của các isozyme được xác định bằng điện di SDS-PAGE tương ứng là 24,6 (F1); 26,8 (F2); 28,2 (F3); 25,4 (F4); 33,1 (F5) và 33,0 kDa (F6) Nhiệt độ tối ưu của 6 isozyme là 50C, và pH tối ưu trong vùng pH 4-12 Bốn isozyme (F1-F4) hoàn toàn bị ức chế bởi PMSF Hai enzyme F5-F6 hoàn toàn bị ức chế bởi aprotinin, N-p-torsyl-L-lysine chloromethyl ketone (TLCK), N-torsyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK), soybean trypsin inhibitor (SBTI), lima bean trypsin inhibitor (LBTI) và leupeptin [12]

Sun và cs (2006) đã nghiên cứu tác dụng bảo vệ của lumbrokinase chống lại

chứng thiếu máu cục bộ cơ tim ở chuột và tiến tới nghiên cứu cơ chế của nó LK đã làm giảm chứng nhồi máu cơ tim phụ thuộc vào các liều khác nhau Tốc độ hạn chế của LK ở các liều 20, 40 và 80 mg/kg thể trọng tương ứng là 7,7%; 34,6% và 46,2% Các nghiên cứu về điện t m đồ cho rằng, khi dùng LK ở nồng độ 10 và 50

l ở 10 mV, dòng canxi dạng L (ICaL) của cơ tim đã giảm rõ ràng tương ứng từ 14,42±1,5 pA/pF tới -11,33±1,4 pA/pF (giảm tới 21,4%, có nghĩa thống kê với p<0,01) và -9,92 ± 1,31 pA/pF (giảm 36,5%, có nghĩa thống kê với p<0,01) Cơ

Hình 1.4 Cấu trúc bậc 3 của lumbrokinase tách chiết từ các loài giun đất

Từ việc ph n tích protein của các loài giun đất cho thấy, cấu trúc bậc 3 của

các isoenzyme lumbrokinase từ loài L rubellus có rất nhiều điểm giống nhau so với các protein từ loài E fetida ở các xoắn α, nếp gấp β và các đoạn cuộn xoắn (Hình

1.4) [46] Một phần trình tự acid amin của LK giống với trình tự amino acid cùng vị trí của các serine protease tương tự trypsin bao gồm: elastase, yếu tố đông máu IX, trypsin, kallikrien và chymo trypsin [49]

Cơ chế hoạt động của lumbrokinase bao gồm việc kích hoạt plasminogen giống như các yếu tố hoạt hóa mô t-PA khác và ph n hủy trực tiếp fibrin (Hình 1.5), nhưng không ph n hủy các protein huyết tương bao gồm plasminogen và albumin

Vũ Thị Bích Ngọc 15 Cao học K20

Hình 1.5 Cơ chế hoạt động của lumbrokinase

Khả năng hấp thu lumbrokinase qua thành ruột non trên thỏ cũng đã được chứng minh Lumbrokinase tinh khiết pha trong dung dịch đệm Krebs-Henseleit ở các nồng độ khác nhau lần lượt là 0,5; 1,0; và 2,0 mg/ml đã được đưa vào bên trong niêm mạc ruột của thỏ trong các khoảng thời gian khác nhau (30, 60, 120 phút) Xác định khả năng tiêu sợi huyết bằng cách lấy dịch bên ngoài niêm mạc ruột thỏ sau các khoảng thời gian và nhỏ lên đĩa fibrin theo dõi vòng hoạt tính Kết quả cho thấy, sau hai giờ theo dõi, vòng hoạt tính trên đĩa fibrin đạt 21,798 ± 11,0; 22,118 ± 0,4; 11,8 ± 31,977 mm2 Khi nhỏ trực tiếp lumbrokinase ở các nồng độ khác nhau lên đĩa fibrin, diện tích vòng hoạt tính lần lượt là 148,3; 253,5; 276,2 mm2

tương ứng với 14,7; 8,7 và 11,5% lumbrokinase được chuyển từ bên trong ra bên ngoài niêm mạc ruột non Điều đó chứng tỏ rằng, lumbrokinase được hấp thu hiệu quả qua thành ruột non vào máu và thích hợp làm nguyên liệu sản xuất thuốc trị tắc nghẽn mạch máu qua đường uống [66]

1.3.2 Tình hình nghiên cứu lumbrokinase ở Việt Nam

Việt Nam là nước có khí hậu nóng ẩm, thích hợp cho nhiều loài giun đất phát triển nên có số lượng rất lớn các loài giun đất [5] Nhờ sự phát triển của công nghệ sinh học, hiện nay đã có nhiều công trình nghiên cứu về các sản phẩm chống đông máu, đặc biệt là các sản phẩm tách chiết từ các loài giun có sẵn trong nước Nhóm nghiên cứu của PGS TS Nguyễn Thị Ngọc Dao và cs (2006) đã thực hiện đề

tài cấp cơ sở Viện CNSH “Tách dòng và tìm điều kiện biểu hiện gen mã hóa cho enzyme lumbrokinase từ giun quế” Trong nghiên cứu này, nhóm tác giả đã sàng lọc

Vũ Thị Bích Ngọc 16 Cao học K20

được các loài giun đất có hoạt tính thủy ph n fibrin cao và bước đầu tìm cách nh n

dòng trình tự gen mã hóa LK từ loài giun quế Perionyx excavatus

L Thị Bích Thủy và cs (2004, 2006) đã tinh sạch enzyme có hoạt tính thủy

ph n fibrin từ P excavatus và đánh giá được một số tính chất của nó [4] Phan Thị Bích Tr m (2008) cũng đã tách chiết và tinh sạch enzyme thủy ph n fibrin từ P excavatus và tách chiết được 8 ph n đoạn có hoạt tính thủy ph n fibrin cao [6]

Hầu hết các nghiên cứu ở trong nước mới chỉ dừng lại ở mức độ tinh sạch, đánh giá tính chất l hóa của LK từ giun đất, rất ít các nghiên cứu đề cập đến LK tái

tổ hợp Năm 2013, Bùi Phương Linh và cs đã nh n dòng và biểu hiện thành công

gen mã hóa LK từ giun đất L rubellus ở E coli Trong nghiên cứu này, gene mã hóa LK từ loài giun L rubellus (AB045720) trên GenBank được tối ưu hóa codon Gen lk có chứa 747 bp, mã hóa cho 238 aa Gen được tạo dòng trong vector pET22b(+) và biểu hiện trong E coli BL21(DE3)pLysE, bước đầu có hoạt tính thủy

ph n fibrin cao so với chuẩn plasmin (Sigma) Sau cảm ứng IPTG 1 mM, xuất hiện băng protein chiếm đến 92% protein tổng số và tăng dần ở các thời gian cảm ứng khác nhau, đạt cực đại ở 6 giờ sau cảm ứng Nhận dạng Maldi-Tof đã khẳng định protein biểu hiện chính là LK [3]

1.3.3 Tình hình nghiên cứu lumbrokinase trên thế giới

Nhằm phục vụ thị trường một lượng lớn chế phẩm LK với hoạt tính thủy phân fibrin cao và giá thành thấp, các nhà khoa học trên thế giới đã quan t m nhiều hơn tới việc nhân dòng gen, biểu hiện và sản xuất enzyme LK dạng tái tổ hợp

Dong và cs (2004) đã nh n dòng và đánh giá tính chất của DNA tái tổ hợp

mã hóa cho enzyme-3 (EFE-3) thủy ph n fibrin từ giun đất E fetida (GenBank: AY438622) Trong nghiên cứu này, cDNA tái tổ hợp mã hóa cho EFE-3 được nh n

dòng bằng RT-PCR DNA tái tổ hợp có khung đọc mở (741 nucleotide) mã hóa một protein (247 amino acid) EFE-3 đã chỉ ra mức độ cao của các protease F-III-1, F-

III-2 và bovine trypsin EFE-3 tái tổ hợp đã được biểu hiện trong E coli dưới dạng

thể vùi và gen mã hóa dạng tự nhiên của EFE-3 được tiết ra trong môi trường tế bào

Vũ Thị Bích Ngọc 17 Cao học K20

COS-7 Hai sản phẩm tái tổ hợp này đều ở dưới dạng thể vùi và protease được tiết

ra có hoạt tính thủy ph n fibrin Bên cạnh đó, nhóm tác giả của Cho đã nh n dòng,

đọc trình tự và biểu hiện protein thủy ph n fibrin serine- protease từ giun đất L rubellus Lumbrokinase tái tổ hợp có hoạt tính cao khi biểu hiện ở E coli [19]

Cũng trong năm 2004, Hu và cs đã tối ưu hóa dòng tế bào, biểu hiện và đánh giá tính chất l hóa của LK tái tổ hợp trong s a dê Hai gen LK đã được nh n dòng

và tối ưu hóa đưa vào vector biểu hiện tế bào tuyến vú pIbCP Vector pIbCP-LK đã được trực tiếp đưa vào tế bào tuyến vú ở dê Kết quả đã chỉ ra rằng cả hai gen LK-w

và LK-m đã được thể hiện trong s a dê Hoạt tính thủy ph n fibrin của LK-w trong

s a là 225 ±13,2 tPA U/L, trong khi đó LK-m là 550 ±21,6 tPA U/L Điều này đã chỉ ra việc tối ưu hóa các dòng tế bào có vai trò quan trọng nhằm n ng cao biểu hiện

LK Khối lượng ph n tử của LK tái tổ hợp là 31,8 kDa [28]

Đến năm 2005, Ge và cs đã nh n dòng thành công gen mã hóa lumbrokinase

từ giun đất L bimastus (GenBank: AF433650) Gen này (852 bp) gồm một khung

đọc mở mã hóa cho hai phần của protein: một peptide tín hiệu (44 aa) và một

peptide thành thục (239 aa) Gen lk đã được nh n dòng và đưa vào vector

pPICZA, một vector dùng biểu hiện trong nấm men Bằng phương pháp PAGE và Western blot, kết quả đã chỉ ra rằng PI239 tái tổ hợp đã tiết vào dịch nuôi cấy và có hoạt tính thủy ph n fibrin [25]

SDS-Zhao và cs (2006) đã nh n dòng và biểu hiện thành công lumbrokinase tái tổ

hợp ở P pastoris Gen lk F238 đã được khuếch đại bằng RT-PCR từ RNA tổng số của giun đất E fetida Gen này bao gồm trình tự peptide tín hiệu được chèn vào vector pUCm-T tạo plasmid có gắn đoạn chèn pUCm-T-F238 Trình tự lk F238

(738 bp) gồm một khung đọc mở mã hóa một polypeptide (245 aa), gồm đoạn peptide tín hiệu (7 aa) và đoạn peptide thuần thục (238 aa) (GenBank: DQ202401)

Trình tự aa tương đồng với trình tự của L rubellus F-III-2 là 99% Đồng thời, trong

nghiên cứu này, gen LK F238-m không có trình tự peptide tín hiệu được khuếch đại bằng PCR dùng khuôn pUCm-T-F238 Plasmid biểu hiện pPIC9-F238-m được thiết

kế bằng cách chèn đoạn gen F238-m vào vector biểu hiện pPIC9 Plasmid

pPIC9-Vũ Thị Bích Ngọc 18 Cao học K20

F238-m được mở vòng bằng BglII và sau đó được biến nạp vào chủng P pastoris

GS115 bằng phương pháp xung điện Các dòng biến nạp được sàng lọc trên đĩa môi trường MM và MD để chắc chắn có sự hội nhập của gen F238-m vào genome của nấm men Cứ sau 24 giờ methanol nồng độ 0,5% được cảm ứng để biểu hiện protein tái tổ hợp Kết quả trên SDS-PAGE đã chỉ ra khối lượng ph n tử của LK tái tổ hợp

là 28 kDa phù hợp với kích thước tính toán theo l thuyết Sau khi cảm ứng, hoạt tính thủy ph n fibrin của dịch nổi đã được xác định bằng đĩa fibrin Nh ng dòng có hoạt tính thủy ph n fibrin cao (100 U/ml) đã được thu nhận [68]

Cũng lựa chọn hệ biểu hiện P pastoris, Yuan và cs (2006) đã biểu hiện và đánh giá tính chất l hóa của lumbrokinase-3 từ giun E fetida Trong nghiên cứu

này cDNA mã hóa gen LK-3 đã được nh n dòng, đưa vào vector pPIC9K và biểu

hiện ở P pastoris GS115 bằng phương pháp xung điện Mức độ biểu hiện cao của

LK-3 trong nấm men đã được thể hiện ở các giai đoạn cảm ứng khác nhau và thể hiện hoạt tính thủy ph n fibrin của LK-3 tái tổ hợp [67]

Năm 2007, Ge và cs đã biểu hiện thành công lumbrokinase (rPI239) trong P pastoris Hàm lượng protein tổng số đạt 0,174 g/l trong dịch lên men Lumbrokinase tái tổ hợp rPI239 đã thể hiện hoạt tính ở mô hình in vitro Hoạt tính

in vivo rPI239 đã được xác định bằng phản ứng thủy ph n fibrin Kết quả nghiên

cứu của nhóm tác giả này đã khẳng định lumbrokinase tái tổ hợp đã được biểu hiện

thành công trong P pastoris và protein tái tổ hợp này có hoạt tính thủy ph n fibrin

ở cả hai mô hình in vivo và in vitro [24]

Cho tới năm 2010, Xu và cs đã thiết kế và biểu hiện thành công đoạn peptide

thuần thục của gen LK PI239 trong E coli Tác giả đã nh n dòng và đưa vào vector

biểu hiện pET22b(-), rLK đã được biểu hiện ở dạng thể vùi và có thể sử dụng dạng thể vùi này để tinh sạch Người ta đã sử dụng urea để hoạt hóa LK tái tổ hợp về dạng tự nhiên Lumbrokinase tái tổ hợp tinh sạch được thử nghiệm trên mô hình chuột g y huyết khối, và nhóm tác giả đã đưa đến kết luận có thể sử dụng rLK để điều trị các bệnh liên quan huyết khối [65]

Vũ Thị Bích Ngọc 19 Cao học K20

1.4 HỆ BIỂU HIỆN PICHIA PASTORIS

1.4.1 Khái quát về hệ biểu hiện Pichia pastoris

Trong các hệ biểu hiện được sử dụng hiện nay, bao gồm: vi khuẩn E coli, vi khuẩn Bacillus, tế bào động vật có vú, tế bào côn trùng và nấm men P pastoris, thì

vi khuẩn E coli được sử dụng nhiều nhất để sản xuất DNA và protein tái tổ hợp

Tuy nhiên, nhược điểm của hệ biểu hiện này là không có quá trình sửa đổi sau dịch

mã như quá trình glycosyl hóa, protein thường cuộn xoắn lỗi, protein không bị glycosyl hóa nên không đảm bảo hoạt tính sinh học [17,44] Protein tái tổ hợp được

biểu hiện trong E coli thường tồn tại ở dạng thể vùi, g y trở ngại cho việc tinh sạch,

hoạt hóa khôi phục lại dạng có hoạt tính Thời gian gần đ y, các nhà nghiên cứu sử

dụng nấm men P pastoris làm hệ vật chủ để biểu hiện protein ngoại bào, thuận tiện

hơn trong quá trình tinh sạch dạng có hoạt tính

P pastoris là một vi sinh vật nh n chuẩn nên các protein được biểu hiện ở tế bào này thường được glycosyl hóa và cuộn xoắn chính xác Hơn n a, P pastoris dễ

nuôi cấy, có thể sinh trưởng đến mật độ tế bào cao và các thao tác di truyền đơn giản hơn nhiều so với nuôi cấy các tế bào động vật [17,32] Thêm vào đó, vector biểu hiện mang gen ngoại lai có thể được chèn hiệu quả vào genome nấm men thông qua quá trình tái tổ hợp gi a các đoạn tương đồng tạo dòng tế bào ổn định dể

sẵn sàng cho biểu hiện protein ngoại lai Ưu điểm n a là P pastoris có 2 gen aox1

và aox2 (mã hóa cho enzyme alcohol oxidase- AOX) có promoter mạnh cho phép

P pastoris sử dụng methanol như một nguồn cacbon và nguồn năng lượng, tạo điều

kiện sản xuất một lượng lớn protein đích với kỹ thuật đơn giản, chi phí thấp hơn hẳn

so với các hệ thống biểu hiện nh n chuẩn khác Cũng nhờ đó, P pastoris dễ dàng

tăng trưởng trong điều kiện môi trường methanol khá cao, trong khi hầu hết các vi sinh vật khác sẽ chết trong điều kiện này Các promoter AOX được cảm ứng bởi methanol và bị ức chế bởi glucose Sự biểu hiện của protein ngoại lai được kiểm soát bởi promoter AOX1, đồng nghĩa với việc sự biểu hiện protein ngoại lai được cảm ứng bởi việc bổ sung methanol

Vũ Thị Bích Ngọc 20 Cao học K20

P pastoris có 2 gen mã hóa AOX Gen aox1 chịu trách nhiệm chính cho hoạt tính AOX của tế bào [20,41,62] Biểu hiện của gen aox1 được kiểm soát chặt chẽ và tăng nếu nồng độ methanol cao Gen aox2 tương đồng tới 97% với gen aox1, tuy nhiên lại có hoạt tính AOX thấp Nếu P pastoris bị đột biến gen aox1 (ví dụ, chủng

P pastoris KM71), chỉ còn lại aox2, nên sẽ sinh trưởng chậm trên môi trường có

methanol (Muts- Methanol utilization slow) [16,41] Chủng này được sử dụng để biểu hiện các protein đòi hỏi sự cải biến s u sắc sau dịch mã Chủng Mut+

(Methanol utilization plus) (ví dụ, chủng P pastoris X33) là chủng dại có cả 2 gen aox1 và aox2 nên sẽ sinh trưởng tốt trên môi trường có methanol Do đó, chủng P pastoris X33 hay được sử dụng để biểu hiện protein ngoại lai, thu sản lượng protein

lớn [32]

P pastoris (thuộc chi Komagataella) là 1 trong 10 loài nấm men khác nhau

đại diện cho 4 chi có khả năng chuyển hóa methanol Các chi khác bao gồm

Candida, Hansenula và Torulopsis Con đường chuyển hóa methanol ở tất cả các

loài nấm men là giống nhau Trong quá trình chuyển hóa methanol, bước đầu tiên

là quá trình oxi hóa methanol thành formaldehyde, sử dụng oxy ph n tử nhờ enzyme alcohol oxidase Phản ứng này tạo formaldehyde và hydrogen peroxide

H2O2 Để tránh ngộ độc H2O2, quá trình chuyển hóa methanol diễn ra trong peroxisome, đ y là nơi cô lập nh ng sản phẩm độc hại của tế bào Sau đó, formaldehyde tạo ra được chuyển tới tế bào chất để tham gia các con đường trao đổi chất khác Quá trình chuyển hóa methanol được miêu tả cụ thể hơn trong hình 1.6 AOX là một homo-octamer với mỗi tiểu đơn vị chứa 1 co-factor FAD liên kết không cộng hóa trị Alcohol oxidase có ái lực thấp với O2 và P pastoris bù lại bằng

cách tạo ra một lượng lớn enzyme này

Vũ Thị Bích Ngọc 21 Cao học K20

Hình 1.6 Con đường chuyển hóa methanol trong P pastoris [32]

Ở chủng P pastoris, các protein tiết thường được điều khiển bởi tế bào vật

chủ nhờ chuỗi trình tự tín hiệu, được xem như trình tự tiết nằm trên protein ngoại

lai Trong một số các trình tự tiết khác nhau thì trình tự α- factor nguồn gốc từ S cerevisiae được sử dụng khá rộng rãi và thành công hiện nay [54] Do đó, các vector biểu hiện sử dụng cho P pastoris thường mang trình tự tín hiệu này để giúp

cho protein tái tổ hợp được tiết ra ngoài môi trường nuôi cấy

Ở sinh vật nh n chuẩn, các protein thường được biến đổi sau quá trình dịch

mã, điều này có liên quan mật thiết đến hoạt tính của các protein Sự glycosyl hóa là

sự biến đổi thông dụng nhất trong các hệ thống sinh vật nh n chuẩn và nó cần thiết cho các chức năng của protein như sự nhận diện, sự truyền tín hiệu, sự tương tác

gi a các protein và tế bào Đ y là quá trình gắn thêm gốc đường vào ph n tử protein không cần khuôn mẫu theo 2 dạng là glycosyl hóa protein ở vị trí N (N- linked) và glycosyl hóa ở vị trí O (O- linked) [26] Hai dạng glycosyl hóa này khác nhau không chỉ ở vị trí gắn vào của đường mà còn ở loại đường và số lượng đường được

Sự glycosyl hóa protein ở vị trí N là quá trình biến đổi sau dịch mã được bảo tồn ở nấm men và các eukaryote khác Glycosyl hoá ở vị trí N bắt đầu từ mạng lưới nội chất (ER) với sự chuyển chuỗi oligosaccharide vào vị trí asparagine của một

Vũ Thị Bích Ngọc 22 Cao học K20

protein Vị trí gắn bao gồm trình tự ba axit amin là Asn-Xaa-Ser/Thr (trong đó, Xaa

là aa bất kỳ ngoại trừ proline) Chuỗi oligosaccharide này chứa 3 ph n tử đường glucose ở đuôi không khử của cấu trúc lõi Man9GlcNAc2 gắn vào protein và nó bị cắt bởi các enzyme glucosidase của lưới nội chất và enzyme α-1,2 mannosidase và

đi vào bộ máy golgi Sự glycosyl hóa ở vị trí O là quá trình tạo liên kết cộng hóa trị

gi a một monosaccharide với axit amin Ser hay Thr Tính đặc hiệu của trình tự cho thấy glycosyl hoá ở vị trí O không quyết định sự gấp cuộn và tính tan của protein

P pastoris đang ngày càng được sử dụng rộng rãi trong việc sản xuất các

glycoprotein dược phẩm bởi dễ thao tác, dễ sản xuất với quy mô lớn, chi phí sản

xuất thấp và chu kỳ sản xuất ngắn Một ưu điểm khác là ở Pichia, các protein tiết

không có liên kết α1- 3 với mannose, có quá trình glycosyl hóa vào đầu N (8- 14

mannose vào mỗi chuỗi bên) nhưng không bị glycosyl hóa quá mức như ở S cerevisiae (50- 150 mannose ở mỗi chuỗi bên), do đó, protein được sản xuất từ Pichia có cấu trúc bậc 4 ít bị sai lệch

1.4.2 Chuyển gen ngoại lai vào genome nấm men

Quá trình chèn vector biểu hiện vào genome nấm men dựa trên nguyên tắc trao đổi đơn (single crossover) ở các trình tự tương đồng Vector pPICZα không

chứa gen his4 nên việc chèn vector tái tổ hợp chỉ có thể xảy ra ở locus AOX1 Các vector biểu hiện trong P pastoris thường chứa một đoạn DNA của promoter có

chứa điểm cắt giới hạn đặc biệt, có tác dụng hướng vector đã mở vòng tích hợp vào genome (Hình 1.8)

Vũ Thị Bích Ngọc 23 Cao học K20

Hình 1.7 Hiện tƣợng tích hợp gen ngoại lai vào vị trí 5’AOX1

hoặc aox1::ARG4 của genome nấm men P pastoris [32]

Đầu tiên, vector cần đƣợc mở vòng tại locus 5’ AOX1 bằng 1 trong 3 loại

enzyme: SacI, PmeI hoặc BstXI [33] Tiếp đó, vector đƣợc mở vòng này sẽ chèn

vào vùng 5’ AOX1 hoặc 5’ aox1 ở genome nấm men Do đó, chủng biểu hiện đƣợc

sử dụng sẽ quyết định chủng tái tổ hợp cho phép chuyển hóa methanol mạnh (Mut+) hay yếu (MutS) Nếu sử dụng chủng biểu hiện P pastoris Mut+ mà xảy ra

trao đổi kép sẽ thay thể hẳn vùng AOX1 trong genome nấm men thì chủng tái tổ

hợp nhận đƣợc sẽ có kiểu hình MutS[32]

Vũ Thị Bích Ngọc 24 Cao học K20

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 VẬT LIỆU VÀ HÓA CHẤT

2.1.1 Vật liệu

Tế bào E coli DH10B (Invitrogen, Mỹ) được sử dụng để nhân dòng gen, tế

bào P pastoris X33 (Invitrogen, Mỹ) được sử dụng để biểu hiện

Vector pJET1.2/blunt (Fermentas) để nhân dòng, vector pPICZαA

(Invitrogen) được dùng để biểu hiện gen lk

Gen lk từ loài giun đất Eisenia fetida (AF304199) được tối ưu hóa codon phù

hợp với hệ biểu hiện P pastoris (Genscript, Mỹ)

2.1.2 Hóa chất

Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm đều ở dạng tinh khiết, các enzyme cắt giới hạn đều của các hãng uy tín trên thế giới Một số hóa chất chính và enzyme được liệt kê ở bảng 2.1

Bảng 2.1 Danh mục hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

Acrylamide, chloroform, isoamyl alcohol, EDTA, imidazol,

sodium acetate, temed, triton X100

Merck ( Đức)

Agarose, cao nấm men, peptone, potassium phosphate, tris

base

Bio Basic Inc (Mỹ)

Ethidium bromide, probond resin, zeocin Invitrogen (Mỹ)

Thang DNA chuẩn, thang protein chuẩn

Enzyme: EcoRI, RNase, SacI, T4 ligase, Taq polymerase,

XbaI, XhoI

Fermentas (Latvia)

Dung dịch APS 10% ammonium persulfate

Dung dich Bradford gốc 100 ml 95% ethanol, 350 mg coomassie brilliant blue

G250, 200 ml 88% phosphoric acid Dung dịch Bradford

working

425 ml H2O, 15 ml 95% ethanol, 30 ml 88% phosphoric acid, 30 ml dung dịch bradford gốc

Dung dịch II 0,2 N NaOH, 1% SDS

Dung dịch III 3 M potassium acetate, pH 5,5

Dung dịch IV 2% triton X100; 1% SDS; 100 mM NaCl; 10 mM tris

HCl; 1 mM EDTA Dung dịch 24:1 24 chloroform : 1 isopropanol (v/v)

Dung dịch nhuộm DNA 0,1 ug/ml ethidium bromide

Dung dịch nhuộm PAGE 0,1% (w/v) coomassie brilliant blue; 30% (v/v) methanol;

10% (v/v) acid acetic Dung dịch tẩy PAGE 30% (v/v) methanol, 10% (v/v) acid acetic

Dung dịch A1 50% methanol; 5% acid acetic; 0,037% formaldehyde

Dung dịch A3 0,02 % (w/v) Na2S2O3 5H2O

Vũ Thị Bích Ngọc 26 Cao học K20

Dung dịch A5 5% Na2CO3+ 0,037 % Formaldehyde

Dung dịch A6 5% acid acetic

Đệm điện di Protein 20 mM tris HCl; 192 mM Glycine; 0,1% SDS, pH 8,8 Đệm 5x tra mẫu protein 0,05% brommophenol blue; 50% glycerol; 0,313 M tris

HCl, pH 6,8; 10% SDS; 10% β-mercaptoethanol

Đệm 10x TBE 20 mM EDTA, 900 mM tris borate, pH 8,0

Đệm 6x tra mẫu DNA 0,09% brommophenol blue; 0,09% xylene xyanol (FF),

60% glycerol

Đệm gắn Native Binding

Buffer (NBB)

50 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, 10 mM imidazole, pH 8,0

Đệm rửa Native Wash

Buffer (NWB)

50 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, 20 mM imidazole, pH 8,0

Đệm thôi Native Elution

methanol

MM 1,34% YNB; 4.10-5 biotin; 0,5% methanol

MMY YP; 1,34% YNB; 4.10-5 biotin; 0,5% methanol

LB 1% peptone; 0,5% cao nấm men; 1% sodium chloride

LB đặc LB, 2% agar

LB lowsalt 1% peptone; 0,5% cao nấm men; 0,5% sodium chloride

YP 2% peptone; 1% cao nấm men

YPD YP, 2% glucose

YPD đặc YPD, 2% agar

YPDS YPD đặc; 0,1 M sorbitol

YPM YP; 0,5% methanol

YPG YP, 1% glycerol

YPTM YPM; 0,01% triton X 100

YPCTM YPTM, 1% casaminoacids

2.1.5 Máy móc và thiết bị

Các máy móc và thiết bị đƣợc sử dụng làm thí nghiệm hiện đại và có độ chính xác cao thuộc phòng Công nghệ sinh học Enzyme và Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn l m khoa học và công

nghệ Việt Nam (bảng 2.4)

Vũ Thị Bích Ngọc 28 Cao học K20

Bảng 2.4 Các máy móc thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

Máy Votex OSI

Máy lắc rung Provocell

Máy li t m lạnh Hettich Mikro 22R

Eppendorf ( Đức) Sartorius (Đức) Wealtec ( Đài Loan) Biorad ( Mỹ)

Biometra (Đức) (Hàn quốc) Rotolab ( Đức) Esco (Mỹ) Hettich (Đức) Hitachi (Nhật Bản) Vision (Hàn quốc) Sartorius (Đức) Labomed (Mỹ) Quantus (Anh) Tomy ( Nhật) Sanyo (Nhật) Toshiba (Nhật) Deawoo (Hàn quốc) Sanyo (Nhật Bản)

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp nuôi cấy

Nuôi cấy hoạt hóa nấm men: Các chủng P pastoris X33 từ các ống giống

được hoạt hóa lại trên môi trường YPD agar ở 28oC, từ 3-5 ngày, sau đó được nuôi trong môi trường YPD lỏng ở 28oC, lắc 200 rpm trong 16- 18 giờ

Vũ Thị Bích Ngọc 29 Cao học K20

Nuôi cấy E coli: E coli bảo quản ở -84oC được hoạt hóa trên đĩa thạch, ủ

37oC qua đêm Đĩa sau ủ được bảo quản ở 4oC Một khuẩn lạc riêng rẽ trên đĩa thạch được nhặt nuôi vào 2 ml LB lỏng, lắc 200 rpm ở 37oC qua đêm Các chủng tái

tổ hợp được nuôi trong các môi trường tương ứng bổ sung zeocin (nồng độ cuối cùng 100 μg/ml)

Nuôi biểu hiện: Chủng P pastoris được nuôi lắc trong môi trường YP bổ

sung 1% (w/v) glycerol, lắc 200 rpm ở 28oC qua đêm, sau đó chuyển sang môi trường YP, tiếp 1% (v/v) methanol sau mỗi 24 giờ để cảm ứng biểu hiện LK

2.2.2 Khảo sát điều kiện nuôi cấy biểu hiện LK tái tổ hợp

Thời gian thu mẫu: Để xác định thời gian thu mẫu tối ưu cho biểu hiện rLK, chủng P pastoris tái tổ hợp được nuôi lắc trong môi trường YP lỏng; pH 7,0; lắc

200 rpm ở 28oC, thu mẫu và cảm ứng 1% (v/v) methanol sau mỗi 24 giờ Mật độ tế bào và hoạt tính enzyme được xác định tại các thời điểm khảo sát khác nhau

Môi trường biểu hiện: Để lựa chọn môi trường thích hợp cho biểu hiện rLK, chủng P pastoris tái tổ hợp được nuôi biểu hiện trong 6 môi trường khác nhau

(BMMY, MMY, MM, YPM, YPTM, YPTCM) Các mẫu nuôi biểu hiện được thu

để xác định mật độ tế bào và hoạt tính rLK

Nồng độ chất cảm ứng: Để xác định nồng độ methanol có ảnh hưởng như

thế nào đến cảm ứng biểu hiện rLK, chủng tái tổ hợp được nuôi cấy trong môi trường YP lỏng; pH 7,0; nhiệt độ và thời gian nuôi cấy tối ưu, bổ sung methanol với các nồng độ 0; 0,5; 1; 1,5; 2% Dịch nuôi biểu hiện được thu để xác định mật độ tế bào và hoạt tính

2.2.3 Tinh sạch protein tái tổ hợp

Nguyên lý: Protein tái tổ hợp được tinh sạch bằng cột resin gắn nickel chuyên

dùng cho các protein tái tổ hợp có đuôi polyhistidine Trong đó, resin là chất mang dạng agarose liên kết chéo, chứa thụ thể iminodiacetic acid và chất này làm cầu nối với Ni2+ Cột resin- nickel có ái lực cao với đuôi polyhistidine Việc gắn kết hình thành thông qua liên kết gi a ion Ni2+ và đuôi 6xHis trong ph n tử protein Tinh