Luận văn thạc sĩ Sinh học, Sinh học thực nghiệm, Hệ protein màng, Bệnh mạch vành cấp

Cùng với sự ra đời, phát triển của tin sinh học và các kĩ thuật phân tích dựa trên phổ khối lượng, cách tiếp cận proteomics đang cho thấy đây là một phương pháp hữu hiệu và khó có thể th

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Hà Nội – 2013

K20 – Sinh học thực nghiệm – i – Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Thị Bích Thảo và PGS TS Trịnh Hồng Thái, những người thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu khoa học và thực hiện luận văn này

Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy giáo, cô giáo trong Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tận tình giảng dạy, dìu dắt tôi trong thời gian học tập tại Trường

Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới GS TS Phan Văn Chi, cùng toàn thể các anh chị làm việc tại Phòng Hóa sinh Protein, Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hết lòng định hướng và giúp đỡ tôi thực hiện thành công luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn Viện Tim mạch, Bệnh viện Bạch Mai,

Hà Nội đã cung cấp mẫu tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình và bạn bè đã khích lệ, động viên, giúp đỡ và là chỗ dựa vững chắc cho tôi trong quãng thời gian qua

Luận văn được thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí từ Đề tài Độc lập cấp Nhà nước số 03/2011 PTNTĐ/HĐ-ĐTĐL

Hà Nội, tháng 12 năm 2013

Học viên Trần Thái Thượng

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG iv

DANH MỤC CÁC HÌNH v

BẢNG KÍ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT i

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 - TỔNG QUAN 3

1.1 HUYẾT THANH 3

K20 – Sinh học thực nghiệm – ii – Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN

1.1.1 Khái niệm về huyết thanh 3

1.1.2 Đặc điểm, thành phần của hệ protein huyết thanh 3

1.1.3 Chức năng của các protein trong huyết thanh 6

1.1.4 Phương pháp proteomics và ứng dụng trong nghiên cứu hệ protein huyết thanh 7

1.2 PROTEIN MÀNG VÀ CÁCH TIẾP CẬN PROTEOMICS TRONG NGHIÊN CỨU 12

1.2.1 Vai trò của protein màng 12

1.2.2 Ứng dụng của proteomics trong nghiên cứu protein màng 15

1.3 HỘI CHỨNG MẠCH VÀNH CẤP 17

1.3.1 Bệnh động mạch vành và hội chứng mạch vành cấp 17

1.3.2 Các phương pháp chẩn đoán hội chứng mạch vành cấp 18

1.4 CÁC NGHIÊN CỨU GẦN ĐÂY VỀ PROTEIN MÀNG VÀ TIM MẠCH 19

1.4.1 Những nghiên cứu trên thế giới 19

1.4.2 Những nghiên cứu tại Việt Nam 20

Chương 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 21

2.1 NGUYÊN LIỆU 21

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 21

2.2.2 Hóa chất 21

2.1.3 Thiết bị 22

2.2 PHƯƠNG PHÁP 22

2.2.1 Loại albumin và IgG huyết thanh bằng “Aurum™Serum Protein Mini Kit” 23

2.2.2 Xác định hàm lượng protein và tủa để tinh sạch mẫu 24

2.2.3 Điện di gel polyacrylamide có SDS (SDS-PAGE) 25

2.2.4 Thủy phân protein bằng trypsin trong gel 26

2.2.5 Sắc kí đa chiều và phân tích khối phổ 26

2.2.6 Nhận diện protein qua phổ khối lượng thu được 27

2.2.7 Nhận diện và phân loại protein màng huyết thanh bệnh nhân mạch vành cấp 29

Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

3.1 KẾT QUẢ 31

3.1.1 Loại albumin và IgG trong huyết thanh 31

3.1.2 Tủa protein trong huyết thanh 32

3.1.3 Phân tách các protein trong huyết thanh bằng SDS-PAGE 34

3.1.4 Nhận diện protein màng trong huyết thanh 35

3.1.5 Phân tích dữ liệu vị trí dưới tế bào của các protein màng 40

3.1.6 Phân tích dữ liệu chức năng của các protein màng 42

K20 – Sinh học thực nghiệm – iii – Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN

3.1.7 Phân tích dữ liệu các quá trình sinh học mà protein màng tham gia 44

3.1.8 Phân tích dữ liệu khối lượng và cải biến sau dịch mã của các protein màng 47

3.1.9 Dự đoán vùng xuyên màng qua các chương trình tin sinh học 49

3.2 THẢO LUẬN 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 PHỤ LỤC I Phụ lục 1 Danh sách bệnh nhân I Phụ lục 2 Danh sách các protein màng nhận diện được trong huyết thanh bệnh nhân ACS và kết quả dự đoán số vùng xuyên màng III

K20 – Sinh học thực nghiệm – iv – Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 Các hóa chất chính được sử dụng trong nghiên cứu 21

Bảng 2 Các thành phần tạo gel 25

Bảng 3 Phân loại protein theo vị trí dưới tế bào 40

Bảng 4 Phân loại protein theo chức năng 42

Bảng 5 Phân loại protein theo quá trình sinh học 45

Bảng 6 Phân loại protein theo khối lượng 47

Bảng 7 Phân loại protein theo cải biến sau dịch mã 48

Bảng 8 Kết quả dự đoán vùng xuyên màng (TMD) 53

Bảng 9 Kết quả dự đoán số lượng protein theo số vùng xuyên màng (TMD) 54

K20 – Sinh học thực nghiệm – v – Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 Một số kiểu định vị của các protein màng 14

Hình 2 Quy trình phân tích mẫu huyết thanh 23

Hình 3 Quy trình nhận diện protein màng từ dữ liệu phổ khối lượng thu được 28

Hình 4 Thông số tra cứu dữ liệu protein bằng phần mềm Mascot 29

Hình 5 Kết quả loại albumin và IgG bằng Aurum™ Serum Protein Mini Kit 32

Hình 6 Hình ảnh điện di SDS-PAGE kết quả tủa protein bằng acetone 33

Hình 7 Hình ảnh điện di các mẫu huyết thanh bệnh nhân ACS sau tủa protein bằng acetone 34

Hình 8 Hình ảnh minh họa các phân đoạn huyết thanh bệnh nhân ACS được cắt trên bản gel SDS – PAGE 35

Hình 9 Hình ảnh minh họa kết quả nhận diện protein bằng phần mềm Mascot 37

Hình 10 Hình ảnh minh họa các thông số của một protein được nhận diện bằng phương pháp khối phổ 37

Hình 11 Hình ảnh minh họa thông tin của một protein trên cơ sở dữ liệu UniProt 38 Hình 12 Hình ảnh minh họa kết quả tìm kiếm thông tin của các protein từ cơ sở dữ liệu UniProt 38

Hình 13 Hình ảnh minh họa thông tin chi tiết của các protein màng 39

Hình 14 Tỉ lệ phân bố dưới tế bào của các protein màng trong huyết thanh bệnh nhân mạch vành cấp 41

Hình 15 Tỉ lệ theo chức năng của các protein màng trong huyết thanh bệnh nhân mạch vành cấp 43

Hình 16 Tỉ lệ tham gia vào các quá trình sinh học của các protein màng trong huyết thanh bệnh nhân mạch vành cấp 46

Hình 17 Tỉ lệ theo khối lượng của các protein màng trong huyết thanh bệnh nhân mạch vành cấp 47

Hình 18 Tỉ lệ các loại cải biến sau dịch mã của các protein màng trong huyết thanh bệnh nhân mạch vành cấp 49

K20 – Sinh học thực nghiệm – vi – Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN

Hình 19 Hình ảnh minh họa kết quả dự đoán vùng xuyên màng của chương trình

TMHMM 50Hình 20 Hình ảnh minh họa kết quả dự đoán vùng xuyên màng của chương trình

SOSUI 51Hình 21 Hình ảnh minh họa kết quả dự đoán vùng xuyên màng của chương trình

Phobius 52Hình 22 Hình ảnh so sánh kết quả dự đoán TMD giữa các chương trình tin sinh học

53Hình 23 Hình ảnh so sánh kết quả dự đoán số lượng TMD của các chương trình tin

sinh học 55

K20 – Sinh học thực nghiệm – i – Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN

BẢNG KÍ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ACN Acetonitrile

ACS Acute Coronary Syndrome Hội chứng mạch vành cấp

APS Ammonium persulfate

BSA Bovine serum albumin Albumin huyết thanh bò

Protein gắn acid béo của tim

HLPP Human Liver Proteome Project Dự án Hệ protein Gan Người

HPPP Human Plasma Proteome Project Dự án Hệ protein Huyết

tương Người HPLC High Performance Liquid

Chromatography

Sắc kí lỏng hiệu năng cao

K20 – Sinh học thực nghiệm – ii – Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN

HUPO Human Proteome Organization Tổ chức nghiên cứu Hệ

protein Người IAA Indole-3-Acetic Acid

NCBI National Center for Biotechnology

Information

Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh học Quốc gia NGEP_L New Gene Expressed in Prostate

SCX Strong Cation Exchange Trao đổi cation mạnh

SDS Sodium Dodecyl Sulfate

SDS-PAGE SDS-Polyacrylamide Gel

Electrophoresis

Điện di trên gel polyacrylamide có SDS SIB Swiss Institute of Bioinformatics Viện Tin sinh học Thụy Sĩ TEMED Tetramethylethylenediamine

TFA Trifluroacetic acid

K20 – Sinh học thực nghiệm – iii – Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN

TMHMM Transmembrane Hidden Markov

Model

Chương trình dự đoán TMD dựa trên thuật toán Markov

TrEMBL Tranffered European Molecular

Biology Laboratory

Đã chuyển giao đến Phòng Thí nghiệm Sinh học Phân tử châu Âu

K20 – Sinh học thực nghiệm – 1 – Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN

MỞ ĐẦU

Hội chứng mạch vành cấp (Acute Coronary Syndrome, ACS) thường xảy ra bất ngờ, đột ngột, có tỉ lệ tử vong cao và để lại nhiều di chứng nặng nề nếu không được cấp cứu kịp thời Ở Việt Nam, do áp lực công việc ngày càng tăng cao cùng với thói quen ăn uống không cân đối, tình trạng thừa cân, béo phì hay hút thuốc lá đã dẫn đến tỉ lệ các bệnh lí tim mạch nói chung và ACS nói riêng tăng lên rõ rệt trong những năm gần đây Hội chứng mạch vành cấp thường liên quan đến những biến đổi bất thường xảy ra bên trong dòng máu Hơn nữa, dòng máu tuần hoàn gần như khắp cơ thể, tiếp xúc với hầu hết các tế bào nên rất nhiều biến đổi trong cơ thể được phản ánh vào trong máu Huyết thanh là thành phần chính của máu, là môi trường cho các tế bào máu hoạt động nên những biến đổi này cũng được phản ánh trong huyết thanh Do đó, huyết thanh đã được lựa chọn như một trong những đối tượng nghiên cứu chính trong nhiều bệnh lí, đặc biệt là tim mạch Đã có rất nhiều nghiên cứu được thực hiện trên huyết thanh nhưng gần đây hướng tiếp cận về protein màng đang thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học

Protein màng có vai trò then chốt trong các hoạt động sống của tế bào vì chúng thực hiện rất nhiều chức năng quan trọng Những thay đổi bất thường trong hoạt động của các protein này chính là dấu hiệu nhận biết sự phát sinh và phát triển bệnh

lí Những năm gần đây các nghiên cứu về protein đặc biệt là protein màng đang rất được quan tâm và đầu tư Cùng với sự ra đời, phát triển của tin sinh học và các kĩ thuật phân tích dựa trên phổ khối lượng, cách tiếp cận proteomics đang cho thấy đây là một phương pháp hữu hiệu và khó có thể thay thế trong việc phân tích các hệ protein trong cơ thể Tại Việt Nam, những nghiên cứu proteomics đã được tiến hành trong một số năm qua và đạt được những kết quả nhất định

Trên cơ sở đó chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu xác định hệ protein màng trong huyết thanh của bệnh nhân mắc hội chứng mạch vành cấp” với

mục đích:

K20 – Sinh học thực nghiệm – 2 – Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN

1 Nhận diện các protein màng có trong huyết thanh bệnh nhân mắc hội chứng mạch vành cấp

2 Xây dựng và phân tích dữ liệu cơ bản về các protein này

3 Dự đoán số vùng xuyên màng trong cấu trúc các protein màng

Đề tài đƣợc thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

K20 – Sinh học thực nghiệm – 3 – Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN

Chương 1 - TỔNG QUAN

1.1 HUYẾT THANH

1.1.1 Khái niệm về huyết thanh

Máu là dung dịch sinh lí quan trọng nhất trong cơ thể con người Nhiệm vụ của máu là tuần hoàn khắp cơ thể, cung cấp oxi cũng như các chất dinh dưỡng cần thiết cho các tế bào, đồng thời chuyển các chất thải từ chính những tế bào này đến các cơ quan bài tiết Để có thể thực hiện những chức năng trên, máu được tạo nên nhờ hai thành phần cơ bản là các tế bào máu và một môi trường bao quanh các tế bào này Môi trường này chính là huyết tương

Huyết tương là thành phần phi tế bào, là môi trường sống của các tế bào máu, chiếm tới 55 – 60% thể tích máu [48] Trong huyết tương có nhiều nhân tố quan trọng tham gia vào quá trình đông máu Khi các nhân tố này được tách khỏi huyết tương, phần dịch còn lại chính là huyết thanh Huyết thanh bao gồm nước, muối, lipid, đường, các enzyme, kháng thể và các protein hòa tan khác Như vậy, thành phần của huyết thanh rất giống huyết tương và các protein của huyết thanh thực hiện các vai trò rất đa dạng như đáp ứng miễn dịch, cung cấp chất dinh dưỡng và nhiều hoạt động sinh lý quan trọng khác trong cơ thể [11]

1.1.2 Đặc điểm, thành phần của hệ protein huyết thanh

Một người trưởng thành chứa khoảng 3,5 - 5 lít huyết thanh với khoảng 200 -

250 gam protein Đây là mẫu rất giàu protein với hàm lượng thay đổi từ 60 - 80 mg/ml Trong đó, khoảng từ 10.000 đến 20.000 protein khác nhau xuất hiện trong huyết thanh tại một thời điểm nhất định, phần lớn trong số chúng có mặt ở nồng độ rất thấp, cỡ ng/ml [12]

Các protein hiện diện trong huyết thanh với nhiều lí do khác nhau và được chia thành các nhóm như sau:

K20 – Sinh học thực nghiệm – 4 – Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN

 Protein do mô đặc tiết ra và có hoạt động trong huyết thanh: Các protein này

được tiết với số lượng lớn từ gan và các nội tạng, có khối lượng phân tử lớn hơn kích thước lỗ lọc của thận (~ 45 kDa) nên không chui qua được màng lọc của thận,

do đó thời gian cư trú trong huyết thanh thường dài (thời gian tồn tại của albumin trong huyết thanh lên tới 21 ngày)

 Các globulin miễn dịch (Immunoglobulin): Các phân tử giữ chức năng kháng

thể điển hình trong huyết thanh

 Chất gắn thụ thể trung gian: Các hormone có bản chất là protein và peptide

đều nằm trong nhóm này Những protein này có kích thước khác nhau, phù hợp với các cấp độ hoạt động điều hòa (với những hormone nhỏ như insulin việc điều chỉnh rất nhanh chóng, với những hormone lớn như erythropoietin thì việc điều chỉnh diễn

ra chậm hơn)

 Chất gắn thụ thể nội bộ: Bao gồm các cytokine và các chất dẫn truyền ở cự li

gần khác trong con đường truyền thông tin liên tế bào Thông thường, những protein này có kích thước phân tử nhỏ hơn màng lọc của thận (do đó, thời gian cư trú trong huyết thanh khá ngắn), những chất này tạo ra các tương tác cục bộ giữa các tế bào và được pha loãng trong huyết thanh khi không còn tác dụng

 Những chất lưu hành tạm thời: Bao gồm các protein không phải là hormone,

hoạt động trong huyết thanh với thời gian ngắn và cũng theo máu đến vị trí cụ thể

để biểu hiện chức năng Ví dụ, các protein được tiết và hấp thụ bởi lysosome qua các thụ thể

 Sản phẩm giải phóng từ các mô: Là các protein thực hiện chức năng thông

thường trong tế bào nhưng được giải phóng vào trong huyết thanh khi tế bào bị tổn thương hoặc bị chết Phần lớn những protein này là các chỉ thị chẩn đoán bệnh quan trọng.Ví dụ, troponin, creatinin kinase hoặc myoglobin sử dụng trong chẩn đoán bệnh nhồi máu cơ tim

K20 – Sinh học thực nghiệm – 5 – Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN

 Các chất tiết khác thường: Những protein này được giải phóng từ các khối u

và những mô bệnh khác, không bắt nguồn từ những hoạt động chức năng của các cơ quan trong cơ thể

 Protein ngoại lai: Là những protein của các sinh vật lây nhiễm hay động vật

kí sinh được tiết vào trong hệ tuần hoàn

Thành phần protein trong huyết thanh đa dạng, phức tạp và rất biến động Các nhà khoa học đã đưa ra ba lí do giải thích về số lượng của protein trong huyết thanh Đầu tiên, do hầu hết các protein huyết thanh đều bị glycosyl hóa rất mạnh nên giả

sử rằng trong huyết thanh thật sự chỉ có khoảng 500 protein, và mỗi protein lại có khoảng 20 dạng glycosyl hóa gồm 5 kiểu biến đổi (bao gồm tiền chất, dạng có hoạt tính, sản phẩm suy thoái và các biến đổi cắt nối), tổng cộng sẽ tạo ra khoảng 50.000 dạng khác nhau Thứ hai, huyết thanh còn được bổ sung bởi thành phần giải phóng

từ các mô, đây là tác động của hệ protein người (sản phẩm của bộ gen người), mỗi sản phẩm này có 10 biến thể cắt nối, cải biến sau dịch mã hay đứt gẫy, tổng cộng lên tới hơn 500.000 dạng Cuối cùng với lớp immunoglobulin, theo tính toán cũng phải chứa khoảng 10.000.000 trình tự khác nhau [13] Do đó, huyết thanh là một hệ protein khá toàn diện, là phiên bản lớn và cũng là một mẫu nghiên cứu hấp dẫn [12] Huyết thanh được sử dụng nhiều trong chẩn đoán bệnh nhờ hai đặc trưng: mẫu

có thể lấy dễ dàng và an toàn; mẫu không chỉ phản ánh toàn diện kiểu hình người

mà còn cho biết trạng thái của cơ thể trên từng thời điểm Trong khi đó, những mẫu khác như nước bọt, nước mắt, nước tiểu chỉ được coi là một tập con nhỏ của huyết thanh và phản ánh hoạt động của các tế bào địa phương [1]

Bên cạnh đó, huyết thanh còn là một thành phần quan trọng trong máu, chứa nhiều protein có nguồn gốc và chức năng khác nhau, tác động lên nhiều cơ quan, nhiều quá trình sinh học khác nhau trong cơ thể Chính vì thành phần protein của huyết thanh bắt nguồn từ nhiều nguồn gốc mà việc nghiên cứu hệ protein huyết thanh hứa hẹn sẽ mang lại nhiều thông tin bổ ích để phát triển các công trình nghiên cứu, chẩn đoán và chữa trị nhiều bệnh khác nhau, đặc biệt là các bệnh nguy hiểm

K20 – Sinh học thực nghiệm – 6 – Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN

như đái tháo đường, ung thư và tim mạch Trên thực tế, nhiều loại protein trong huyết thanh đã được nghiên cứu trước khi chúng ta biết đến sự tồn tại của gen [12] Những thay đổi bất thường về thành phần protein huyết thanh chắc chắn có liên quan đến các quá trình bệnh lí Nói cách khác, huyết thanh là dạng mẫu đặc biệt, chứa đựng nhiều thông tin cần thiết cho việc nghiên cứu và chẩn đoán bệnh, vì thế việc sử dụng huyết thanh cho mục đích nghiên cứu là cách tiếp cận hợp lí, đã và đang được minh chứng qua những thành tựu thu được trong nhiều thập kỉ qua

Các protein có hàm lượng cao trong huyết thanh gồm 22 loại, chiếm đến 99% lượng protein tổng số, trong đó có albumin, immunoglobin, transferrin, haptoglobin, lipoprotein… [31] Ví dụ, albumin thông thường thay đổi từ 35 – 50 mg/ml (chiếm

50 – 70%) do sự tổng hợp liên tục hàng ngày ở gan (khoảng 12 g/ngày) và có thời gian bán hủy là 21 ngày nên protein này được coi là chỉ thị của bệnh xơ gan hay bệnh suy dinh dưỡng [14] IgG có nồng độ khoảng 5 – 7 mg/ml chiếm 10% Các protein còn lại tuy hàm lượng thấp, khoảng 1% hàm lượng protein tổng số như interleukin 6, hormone, carbonhydrate antigen 125 (CA-125), β2-microglobulin nhưng có thể lại là những protein có chức năng quan trọng và được coi là những chất chỉ thị có độ nhạy cao trong chẩn đoán nhiều quá trình bệnh lí [47] Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng các protein huyết thanh có thể là các chỉ thị sinh học đủ tin cậy trong chẩn đoán một số bệnh như: ung thư buồng trứng (CA 15-3), ung thư tuyến tiền liệt (PSA), ung thư gan (α-fetoprotein) và các bệnh về tim mạch (C-reactive protein) [4] Như vậy, các protein hiện diện trong huyết thanh với nhiều

lí do khác nhau và điều này cũng gợi ý cho việc có thể phát hiện và nghiên cứu chúng bằng nhiều phương pháp khác nhau

1.1.3 Chức năng của các protein trong huyết thanh

Huyết thanh đóng vai trò rất quan trọng trong các hoạt động sống của cơ thể, là môi trường trao đổi chất của các mô và cơ quan, đồng thời cũng là môi trường phức tạp, chứa hàng nghìn loại protein với hàm lượng rất khác nhau Theo chức năng, có thể phân chia protein huyết thanh thành các nhóm sau:

K20 – Sinh học thực nghiệm – 7 – Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN

 Chức năng miễn dịch: Bao gồm các Ig (IgA, IgG, IgM, IgD, IgE) và các bổ

thể tham gia vào quá trình bảo vệ cơ thể như tăng thực bào, phản ứng đặc hiệu với kháng nguyên (peptide, vi khuẩn, virus…)

 Duy trì áp suất keo, độ nhớt của máu: Trong huyết thanh, protein tạo thành

dung dịch keo để duy trì áp suất thẩm thấu, sức căng bề mặt và tính đệm

 Chức năng xúc tác: Enzyme có chức năng xúc tác cho các phản ứng của các

quá trình sinh học từ đơn giản đến phức tạp

 Vận chuyển các chất: Vận chuyển chất dinh dưỡng, nước, muối đến các tổ

chức và vận chuyển các chất thải, chất bã qua thận, phổi, mồ hôi, hệ tiêu hoá như: transferrin vận chuyển sắt; haptoglobin vận chuyển HST tự do…

 Chức năng điều hoà: Những protein này tuy có hàm lượng rất nhỏ (ng/ml)

nhưng có vai trò rất quan trọng trong mọi hoạt động của cơ thể Chúng bao gồm các hormone, cytokine, các protein ức chế đặc hiệu enzyme [5]

1.1.4 Phương pháp proteomics và ứng dụng trong nghiên cứu hệ protein huyết thanh

Một trong những tổ chức có đóng góp vô cùng lớn cho việc nghiên cứu hệ protein trong huyết thanh người là HUPO (Human Proteome Organization) Một số dự án

về hệ protein người đã được HUPO khởi động rất thành công như: Dự án những Sáng kiến Proteomics Tiêu chuẩn (PSI); Dự án Hệ protein Gan Người (HLPP); Dự

án hệ protein não người (HBPP), và đặc biệt là Dự án Hệ protein Huyết tương Người (HPPP) Hệ protein huyết tương là một trong những dự án lớn nhất của HUPO với 47 phòng thí nghiệm của 14 nước tham gia Dự án này có ba mục tiêu khoa học chính: phân tích toàn diện thành phần protein của huyết tương và huyết thanh người; xác định nguồn gốc sinh học của các biến thể trong mỗi cá thể qua thời gian như trạng thái sinh lí, bệnh lí và dược lí để xác định được những chỉ thị sinh học có giá trị; xác định mức độ mở rộng của các biến thể qua những quần thể và qua những cá thể trong các quần thể Từ khi ra đời đến nay tổ chức HUPO đã có rất

K20 – Sinh học thực nghiệm – 8 – Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN

nhiều đóng góp lớn trong việc ứng dụng proteomics trong việc nghiên cứu nhiều hệ protein [1]

Proteomics là một lĩnh vực khoa học nghiên cứu về hệ protein – sản phẩm của hệ gene được biểu hiện trong tế bào, mô hoặc cơ thể trong những điều kiện và thời gian xác định [1].Thuật ngữ proteomics lần đầu tiên được đưa ra bởi Marc Wilkins

và cộng sự vào những năm đầu của thập niên 90 Proteomics bao gồm những nghiên cứu có tính hệ thống nhằm cung cấp kiến thức tổng quan về cấu trúc, chức năng của protein và vai trò của chúng trong điều hòa hoạt động của các hệ sinh học Những cải tiến về trang thiết bị và phương pháp hiện nay đã cho phép mở rộng phạm vi nghiên cứu từ phân tích sinh hóa các protein đơn lẻ đến nhận dạng và xác định những phức hợp protein [50] Mục đích của nghiên cứu proteomics là nhận diện tất

cả các protein đựợc mã hóa trong hệ gene của sinh vật và xác định: phạm vi và phương thức biểu hiện, hoạt động của hệ protein ở các kiểu tế bào và loại mô khác nhau; sự phân bố trong tế bào; những cải biến sau dịch mã; mối tương tác với những protein và thành phần khác; mối quan hệ cấu trúc – chức năng Ngoài ra, nghiên cứu proteomics cũng cung cấp những hiểu biết tổng thể về sự biểu hiện của các protein ở những trạng thái phát triển sinh lí và bệnh lí khác nhau [2]

Proteomics có bốn công cụ chính:

 Các kĩ thuật phân tách protein

Các tổ chức sống thường có cấu tạo rất phức tạp với thành phần chủ yếu là protein, hơn nữa, đa số các protein không thể thực hiện chức năng nếu chúng chỉ tồn tại đơn lẻ Điều này làm cho cấu trúc của mẫu nghiên cứu rất phức tạp Do đó, phải phân tách protein nhằm mục đích làm đơn giản những phức hệ protein bằng cách phân tách chúng thành các phân tử hoặc các nhóm protein nhỏ hơn Vì vậy, phân tách protein cho phép khảo sát, đơn giản hóa các mẫu nghiên cứu phân tích tiếp theo

Điện di là một trong những kĩ thuật thường được sử dụng để phân tách các protein trong mẫu nghiên cứu Hai loại điện di được dùng phổ biến là điện di một

K20 – Sinh học thực nghiệm – 9 – Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN

chiều và hai chiều Tuy là một kĩ thuật mạnh nhưng điện di hai chiều vẫn có nhược điểm là cần số lượng lớn nguyên liệu đầu vào và có độ nhạy thấp để phát hiện các protein có nồng độ không cao như các cytokine và những phân tử tín hiệu Nhược điểm thứ hai là mỗi mẫu khác nhau cần phân tách trên các gel khác nhau, vì vậy sẽ tốn rất nhiều gel để có đủ số lượng phục vụ cho các phương pháp thống kê Hơn nữa, trong các nghiên cứu tổng thể như xác định thành phần protein trong một mẫu không thể sử dụng điện di hai chiều được vì điện di hai chiều làm các protein trong mẫu tách nhau quá xa trên một bản gel điện di Khi đó điện di một chiều sẽ phù hợp hơn

 Khối phổ

Khối phổ (Mass Spectrometry, MS) là phương pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo và phân tích chính xác khối lượng phân tử của chất đó dựa trên sự chuyển động trong từ trường và điện trường Phương pháp này ngày càng được lựa chọn nhiều hơn để phân tích các phức hợp protein Các thiết bị khối phổ trong thập kỉ vừa qua đã có những cải tiến mạnh mẽ với việc tăng độ nhạy lên rất cao để có thể phân tích được các phân tử sinh học với độ chính xác gần như tuyệt đối Phân tích proteomics dựa trên các nguyên lí phổ học đã trở thành một môn khoa học thật sự nhờ có các dữ liệu về trình tự gene (đặc biệt là việc giải mã thành công bộ gene người) cùng với những thành tựu kĩ thuật vượt bậc trong nhiều lĩnh vực, trong đó đặc biệt là sự phát triển của những phương pháp ion hóa năng lượng thấp, phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân Cho đến nay những phân tích về protein (cấu trúc bậc một, những biến đổi sau dịch mã hay tương tác protein – protein…) bằng hệ thống khối phổ đã không chỉ thành công với những nhóm protein riêng biệt mà còn

cả với các phức hệ protein được biểu hiện trong tế bào [49]

 Hệ thống phần mềm phân tích và xử lí

Công cụ thiết yếu thứ ba của proteomics là một hệ thống phần mềm thực sự mạnh mẽ để có thể xử lí được một lượng lớn các dữ liệu thu trong các phân tích hệ protein Đó là những phần mềm dùng để vận hành máy móc trong quá trình nghiên

K20 – Sinh học thực nghiệm – 10 – Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN

cứu hay để so sánh mức độ biểu hiện của protein, xác định trình tự của một peptide

từ các số liệu phổ khối lượng, dự đoán cấu cấu trúc hay các tương tác của các protein Những phần mềm này có thể giúp các nhà khoa học kiểm tra kết quả và đánh giá chất lượng của dữ liệu trong thời gian ngắn mà chỉ tốn ít sức lực

 Tập hợp cơ sở dữ liệu nhận dạng protein

Công cụ cuối cùng là cơ sở dữ liệu: các dữ liệu về protein, các trình tự biểu hiện được đánh dấu và trình tự genome hoàn chỉnh là một dữ liệu đầy đủ và chọn lọc cho tất cả các protein đã biểu hiện trong các cơ thể Sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học trong đó có tin sinh học những thập niên gần đây đã đưa đến một lượng dữ liệu khổng lồ trong lĩnh vực khoa học sự sống Kết quả chính là sự ra đời của các cơ sở dữ liệu trực tuyến như SwissProt, TrEMBL, PIR… Khi chúng ta so sánh một thông tin trình tự không đầy đủ, hay thậm chí là các số liệu khối phổ chưa

xử lí, chúng ta vẫn có thể nhận biết một thành phần protein bằng việc đối chiếu với một cơ sở dữ liệu đầy đủ có sẵn Những năm gần đây việc kết hợp các cơ sở dữ liệu lớn trên thế giới với nhau đã tạo bước ngoặt lớn trong các nghiên cứu về proteomics

Tất nhiên là không thể chỉ sử dụng một phương pháp riêng biệt là có thể xác định

và định lượng đầy đủ các thành phần của một phức hệ protein Công việc này đòi hỏi phải tích hợp các công cụ phân tích dữ liệu với nhau một cách hiệu quả nhất Có hai cách chính được lựa chọn để tối ưu hóa kĩ thuật này Cách thứ nhất là kết hợp giữa điện di hai chiều và khối phổ Cách thứ hai là kết hợp làm sạch một phần protein với những kĩ thuật mới được phát triển và tự động hóa, phân tích bằng khối phổ liên tiếp (MS/MS) Sau đó xử lí bằng phần mềm chuyên dụng và so sánh với cơ

sở dữ liệu trực tuyến Trong cách thứ nhất, những protein trong một mẫu sinh học được phân tách bằng điện di hai chiều, sau khi nhuộm với chất màu chuyên dụng, mỗi vệt protein được định lượng theo cường độ bắt màu Sau đó, những vệt protein được lựa chọn sẽ được thủy phân, phân tích bằng khối phổ và nhận dạng bằng cách tra cứu trên các cơ sở dữ liệu Tuy nhiên, nếu theo cách này có rất nhiều yếu tố có

K20 – Sinh học thực nghiệm – 11 – Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN

thể ảnh hưởng đến kết quả của quá trình phân tích vì có rất nhiều thao tác phải thực hiện trong một thời gian tương đối dài Cách thứ hai thường áp dụng là kết hợp sắc

kí lỏng đặc biệt là sắc kí lỏng đa chiều (MDLC) với thiết bị khối phổ ion hóa bằng phun điện ESI-MS/MS Cách tiếp cận này là hữu hiệu nhất trong phân tích các hệ protein Hunt và cộng sự đã đi tiên phong trong việc sử dụng LC-MS/MS trong phân tích những phức hợp peptide và phương pháp này ngày nay đã trở thành cốt lõi trong nghiên cứu proteomics [26]

Sử dụng các công cụ trên trong nghiên cứu bệnh học, proteomics lâm sàng đã thu được nhiều kết quả theo ba hướng nghiên cứu chính sau [7]:

 Nghiên cứu cơ chế phát sinh bệnh ở mức độ phân tử

 Tìm ra các chỉ thị sinh học mới, góp phần sàng lọc, chẩn đoán sớm và theo dõi tiến triển của bệnh

 Nghiên cứu các đích tác dụng của thuốc điều trị, qua đó tìm ra các thuốc có tác dụng tối ưu, phát triển hướng nghiên cứu y học cá nhân, tức là sử dụng biện pháp điều trị thích hợp cho từng người

Vì vậy, proteomics đang trở thành một trong những hướng nghiên cứu quan trọng nhất của sinh học và công nghệ sinh học ứng dụng trong nghiên cứu sinh y dược Cùng với những tiến bộ của tin sinh học, những nghiên cứu về proteomics đối với các hệ sinh học đang có những đóng góp cơ bản đối với sự hiểu biết của chúng

ta về kiểu hình của các tế bào ở trạng thái bình thường và bệnh lí Hiện nay, có nhiều hệ thống thiết bị và hóa chất được sản xuất chuyên dụng cho các nghiên cứu

về biểu hiện gene và xác định hệ protein Nghiên cứu proteomics giúp thu được thông tin mới nhằm bổ sung, hỗ trợ cho những nghiên cứu chẩn đoán lâm sàng, phát hiện bệnh ở giai đoạn sớm và để có phác đồ điều trị kịp thời Năm 2002, Adkins và cộng sự bằng phương pháp sắc ký lỏng và khối phổ đã phát hiện được 490 loại protein khác nhau trong huyết thanh [8] Năm 2004, Chan và cộng sử dụng phương pháp sắc ký lỏng đa chiều – xác định phổ khối lượng đã phát hiện được 1444

K20 – Sinh học thực nghiệm – 12 – Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN

protein [16] Đến năm 2005, theo kết quả xác định và so sánh của 35 phòng thí nghiệm trong dự án hệ protein huyết tương người của HUPO, con số này đã là 3020 [2] Lượng thông tin phong phú do các nghiên cứu về hệ protein huyết thanh thu được hoàn toàn bổ trợ cho những thông tin di truyền từ các nghiên cứu genome

1.2 PROTEIN MÀNG VÀ CÁCH TIẾP CẬN PROTEOMICS TRONG

NGHIÊN CỨU

1.2.1 Vai trò của protein màng

Các protein màng giữ vai trò then chốt trong sự trao đổi vật chất cũng như tín hiệu giữa bên trong và bên ngoài màng do đó liên quan tới rất nhiều quá trình và những tín hiệu môi trường Protein màng có thể thực hiện các chức năng như thụ thể gắn nội sinh, hình thành nên các kênh hay các lỗ vận chuyển các hợp chất khối lượng phân tử thấp hay hoạt động như một phân tử nhận biết hay bám dính tế bào Protein màng rất quan trọng trong giao tiếp tế bào và con đường tín hiệu tế bào [28] Các con đường tín hiệu tế bào là sự đáp ứng của cơ thể với các kích thích bên ngoài cũng như duy trì sự kiểm soát với những quá trình xảy ra bên trong tế bào hay giữa các tế bào với nhau Các con đường tín hiệu là một hệ thống các quá trình, trong đó

có phiên mã, dịch mã, tăng sinh, apoptosis, biệt hóa, trao đổi chất và sự sống sót của

tế bào

Sự thay đổi hay sai sót trong các con đường này sẽ dẫn đến các hiện tượng bất thường như phản ứng tự miễn, tăng sinh không kiểm soát hay mất các đáp ứng apoptosis trong quá trình phát sinh một số bệnh Ví dụ, tiểu đường loại I là một bệnh tự miễn gây ra do sự thiếu hụt insulin – một sản phẩm sinh ra từ các tế bào β trong đảo tụy Langerhan (do các tế bào này bị hệ miễn dịch của chính cơ thể nhận lầm và tiêu diệt) [37] Các bằng chứng quan trọng thu được cho thấy rằng sự chết của các tế bào tụy này có nguyên nhân từ các cytokine tiền viêm Một vài cytokine loại này gây độc đối với tế bào β bằng cách kích hoạt con đường tiền apoptosis thông qua một con đường tín hiệu trên màng tế bào [17]

K20 – Sinh học thực nghiệm – 13 – Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN

Các con đường tín hiệu bị biến đổi thường liên quan đến các protein màng và hiển nhiên có mặt trong nhiều bệnh ung thư Ví dụ, sự biểu hiện quá mức của thụ thể nhân tố sinh trưởng biểu sinh gây ra tới hơn 50% các loại ung thư biểu mô [20] Ezrin là một protein liên kết F-actin tới màng tế bào bằng quá trình phosphoryl hóa

và protein này có liên hệ với sự tiến triển, di căn của khối u trong một vài bệnh ung thư bao gồm ung thư xương ở trẻ em và ung thư hạch xuất hiện trên mô cơ [45] Một nghiên cứu gần đây cho thấy sự hoạt động quá mức của kênh ion kali kích hoạt qua trung gian canxi đã thúc đẩy nhanh các chất gây ung thư biểu mô tuyến tiền liệt của người [30] Hơn nữa, NGEP-L, gene mã hóa cho một protein màng, vừa được gắn với giả thuyết về sự thúc đẩy tương tác phụ thuộc liên kết tế bào của tế bào ung thư tiền liệt tuyến LNCaP [19] Theo đó, nhu cầu hiểu được vai trò của các protein màng trong con đường tín hiệu tế bào cũng như động lực của các tế bào sống là rất bức thiết

Hầu hết các protein màng có chứa các phần xuyên màng với vùng kị nước nằm trong lớp lipid của màng sinh học và các vùng ưa nước định vị ở mặt trong và mặt ngoài của màng Bản chất của màng là một lớp kép lipid với các acid béo xếp đối diện nhau với các cực ưa nước hướng ra bên ngoài Bên trong cấu trúc này là một lượng lớn protein màng cùng các tính chất và chức năng khác nhau Nhóm protein này bao gồm các protein xuyên màng bắc qua toàn bộ lớp kép lipid với một hoặc nhiều vùng xuyên màng; các protein định vị thành một phức hệ hình thành nên các kênh hay lỗ để vận chuyển các chất dinh dưỡng hay loại bỏ các hợp chất độc hại; những protein gắn hoặc bên trong hoặc bên ngoài màng nhưng không xuyên qua màng; những protein gắn gián tiếp với màng thông qua ba loại protein ở trên Điều đáng chú ý là rất nhiều các protein loại này được cải biến sau dịch mã bằng cách gắn thêm các nhóm glycan – một đặc tính thường hay được khai thác cho việc phân tích các protein màng trong các dự án proteomics (Hình 1)

K20 – Sinh học thực nghiệm – 14 – Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN

Hình 1 Một số kiểu định vị của các protein màng [56]

1: Protein xuyên hoàn toàn qua màng nhờ một α-helix

2: Protein xuyên hoàn toàn qua màng nhờ nhiều α-helix

3: Protein xuyên hoàn toàn qua màng nhờ cấu trúc beta barrel

4: Protein xuyên một phần vào màng

5: Protein neo với màng qua một cầu lipid

6: Protein neo với màng qua một nhóm oligosaccharide gắn với một cầu lipid

7, 8: Protein gắn gián tiếp với màng thông qua một protein xuyên màng khác

Các vùng lộ ra môi trường ngoại bào của các protein màng thường liên quan tới các tương tác tế bào – tế bào và gắn với những phân tử tín hiệu, trong khi đó những vùng định vị bên trong tế bào chất có vai trò quan trọng trong việc liên kết với bộ khung xương tế bào và kích hoạt các con đường tín hiệu nội bào Việc điều hòa các protein màng thường đạt được bằng cách phosphoryl hóa các vùng riêng biệt của protein đó [35] Ví dụ, sự kích thích mitogen thường khởi động một đáp ứng tế bào bằng cách kích hoạt toàn bộ các quá trình phosphoryl hóa Kích thích này được khởi động từ một thụ thể màng và lan nhanh vào tế bào qua quá trình phosphoryl hóa các chất trung gian hay các cơ quan đáp ứng [25] Như vậy, với vai trò trung tâm trong con đường truyền tin và vận chuyển các chất của tế bào, protein màng là đích nghiên cứu của rất nhiều nhà khoa học

Cấu trúc của hệ protein màng và độ phong phú của một số protein màng có thể biến đổi một cách có ý nghĩa trong sự biệt hóa tế bào cũng như trong các quá trình

K20 – Sinh học thực nghiệm – 15 – Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN

diễn tiến bệnh lí Bởi vậy, các protein màng có thể là những chỉ thị sinh học tiềm năng cho sự phát triển và dự đoán về bệnh, hay cũng có thể là các đích thuốc hữu ích trong lâm sàng để ngăn chặn các dòng thác tín hiệu có liên quan đến sự phát sinh bệnh tật Do đó, việc nhận biết và mô tả các protein màng cũng như chức năng của chúng là rất thiết thực để tạo nên một bộ khung phân tử giúp hiểu rõ về sự truyền tín hiệu và tác động của các kích thích lên những con đường tín hiệu này Tiếp theo đó là nhiệm vụ cốt yếu trong việc khám khá ra các loại thuốc mới tốt hơn cùng với các chiến lược tích cực trong việc điều trị nhiều căn bệnh phổ biến như là tim mạch

1.2.2 Ứng dụng của proteomics trong nghiên cứu protein màng

Trong sinh bệnh học, protein màng thường được phân tích toàn diện theo tình trạng sức khỏe hay dưới các điều kiện nhân tạo Những nghiên cứu về protein màng chủ yếu tập trung theo hướng tiếp cận proteomics Một vài nghiên cứu chính vừa được công bố gần đây đã thử nghiệm trên các mô hình mô nuôi cấy hoặc các dòng

tế bào như tế bào gốc phôi người, tế bào ung thư buồng trứng, tế bào gan chuột, tế bào lympho B trong bệnh ung thư hệ bạch huyết, ung thư biểu mô thận

Nghiên cứu về các protein màng sử dụng proteomics định lượng độ phân giải cao vẫn còn đang là một thách thức Cản trở chính trong các phân tích này chính là các protein màng thường thường có nồng độ thấp do độ hòa tan kém Hơn nữa, với các protein gắn màng, loại protein có chứa cả vùng ưa nước và kị nước, thường rất khó tinh sạch và xác định tính chất Phần lớn các thử nghiệm làm giàu protein màng đều cho thấy sự thiếu hụt các thông tin thu được về protein màng Phân tích này có thể được chia thành ba bước thí nghiệm chính: làm giàu và tinh sạch protein màng, hòa tan hoàn toàn các protein này, cuối cùng là phân tích, nhận diện và xác định tính chất Hầu hết các phương pháp tiếp cận thực nghiệm là làm giàu và tinh sạch màng cũng như các protein màng, với thách thức chính là sự hiện diện của các protein tạp nhiễm với hàm lượng cao hơn nhiều lần Việc tách thành các phân đoạn nhỏ sẽ giúp làm giảm độ phức tạp của mẫu và cải thiện khả năng phân tích một mẫu phức hợp

K20 – Sinh học thực nghiệm – 16 – Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN

ban đầu Điều này sẽ giúp tăng khả năng nhận diện các protein có độ phong phú thấp hay các protein nhất định đang được quan tâm nghiên cứu Cách tiếp cận truyền thống trong tinh sạch màng là sử dụng phương pháp tủa hóa học kết hợp với siêu li tâm theo gradient Gần đây tinh sạch hai pha lỏng đã được ứng dụng để tách

sơ bộ các protein màng từ não và gan chuột trước khi sử dụng phân tích phổ khối lượng Protein màng có thể được làm giàu từng phần bằng cách sử dụng nhiều bước

và kiểu li tâm khác nhau với dịch li giải tế bào, mô hay vi thể Từ đó các protein màng được tách riêng từ các bào quan khác nhau dựa trên sự khác biệt về tỉ trọng của chúng Năm 2005, Zhang và cộng sự đã sử dụng li tâm gradient tỉ trọng sucrose

để phân tách các protein màng khỏi mô gan chuột, nhận diện được 88 protein gắn màng trong số 175 protein thu được [52] Hơn nữa, các bước rửa sử dụng pH hay muối có nồng độ cao cũng giúp loại bỏ các protein không mong muốn có nguồn gốc

từ tế bào chất Cũng trong năm đó, Foster và cộng sự kết hợp li tâm gradient bằng sucrose với tách chiết bằng natri carbonat để làm giàu protein màng trong các tế bào gốc trung mô người Họ đã tìm được tổng số 463 protein trong đó có 122 là các protein gắn màng [22] Tuy nhiên, ngay cả các nghiên cứu thành công nhất cũng chỉ

ra rằng các phân đoạn protein màng được làm giàu bằng phương pháp tinh sạch qua hai pha này đều bị ảnh hưởng bởi sự có mặt đáng kể của các thành phần không mong muốn Kết quả là rất khó để có thể tạo ra các dữ liệu so sánh biểu hiện giữa các mẫu nghiên cứu khác nhau Các nghiên cứu gần đây đã chuyển hướng sang nghiên cứu các mẫu có sẵn ở dạng hòa tan Do đó, sẽ tránh được các khó khăn liên quan đến việc hòa tan các protein màng Huyết thanh chính là một mẫu tiềm năng theo hướng nghiên cứu này Bên cạnh đó, áp dụng kĩ thuật phổ khối lượng, một kĩ thuật có độ nhạy cao và khả năng nhận diện protein trong một mẫu tổng thể mà không cần tách chiết ra từng loại protein riêng biệt sẽ đem lại những kết quả rất khả quan

K20 – Sinh học thực nghiệm – 17 – Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN

1.3 HỘI CHỨNG MẠCH VÀNH CẤP

1.3.1 Bệnh động mạch vành và hội chứng mạch vành cấp

Tim là một nội quan có vai trò then chốt trong hệ thống tuần hoàn của cơ thể, hoạt động liên tục từ khi sinh ra cho đến khi chết Để quá trình này diễn ra bình thường, tim phải sử dụng một lượng máu giàu oxi rất lớn cung cấp bởi hai động mạch vành Nếu có bất kì rối loạn nào xảy ra với động mạch vành đều gây ra những tác động nghiêm trọng do việc giảm lưu lượng oxi và dinh dưỡng đi nuôi cơ tim Đây là nguyên nhân chủ yếu gây ra các cơn đau tim và có thể dẫn đến tử vong [54] Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới thì các bệnh lí liên quan đến tim mạch là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới với 17,3 triệu người chết vì căn bệnh này vào năm 2008 và dự đoán sẽ tăng lên 23,3 triệu người vào năm 2030 [57] Bệnh động mạch vành (coronary artery disease) hay còn gọi là bệnh tim do động mạch vành (coronary heart disease) hoặc bệnh thiếu máu cục bộ cơ tim (ischemic myocardial disease) thường gặp trong các bệnh lí liên quan đến tim mạch Mỗi năm

Tổ chức Y tế Thế giới ước tính có 3,8 triệu đàn ông và 3,4 triệu phụ nữ chết vì bệnh động mạch vành Tỉ lệ chết vì bệnh này đã giảm ở Bắc Mĩ và Tây Âu, nhưng đang tăng nhanh ở các nước đang phát triển Người ta tính toán rằng khoảng 82% tỉ lệ chết vì bệnh động mạch vành trong tương lai sẽ xảy ra ở các nước đang phát triển [36] Ở Việt Nam tình hình bệnh động mạch vành cũng ngày đang tăng cao Theo thống kê của Viện Tim mạch, Bệnh viện Bạch Mai vào năm 1991 tỉ lệ mắc bệnh mạch vành chỉ chiếm 3% thì đến năm 1996 tỉ lệ này là 6,1% và đến năm 1999 đã lên đến 9,5% [3] Trong số các hội chứng của bệnh mạch vành thì hội chứng mạch vành cấp (ACS) gần đây đang thu hút được sự quan tâm của các nhà nghiên cứu ACS bao gồm đau thắt ngực không ổn định và dạng nguy hiểm hơn là nhồi máu cơ tim

Có rất nhiều nguyên nhân dẫn đến sự phát sinh và phát triển bệnh tim mạch nói chung và ACS nói riêng Các nghiên cứu về ACS do tác động của các yếu tố nguy

cơ như đái tháo đường, rối loạn lipid máu, hút thuốc lá, béo phì đã được nghiên cứu

K20 – Sinh học thực nghiệm – 18 – Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN

nhiều trên thế giới cũng như ở nước ta Thêm vào đó một vấn đề được quan tâm trong vài năm gần đây là hội chứng chuyển hoá Tùy theo các định nghĩa khác nhau nhưng đều bao gồm các tiêu chí sau: béo phì dạng nam, rối loạn lipid máu, rối loạn dung nạp đường máu và tăng huyết áp Các nghiên cứu dịch tễ cho thấy ở người hội chứng chuyển hoá có nguy cơ mắc bệnh tim mạch do xơ vữa tăng gấp 2-3 lần Thống kê cũng cho thấy ở Mĩ hội chứng chuyển hoá chiếm 25% ở độ tuổi trên 20

và gia tăng lên 45% ở độ tuổi trên 50 [27]

1.3.2 Các phương pháp chẩn đoán hội chứng mạch vành cấp

Có rất nhiều phương pháp để chẩn đoán ACS: siêu âm nội mạch, chụp cắt lớp vi tính quang học, nội soi mạch hoặc đo lưu lượng, áp lực nội mạch vành Trong đó, chụp động mạch vành được xem là tiêu chuẩn vàng cho chẩn đoán bệnh động mạch vành trên thế giới cũng như tại Việt Nam, ước tính có khoảng 2.000.000 ca (trung bình khoảng 800 ca trên 100.000 dân) được thực hiện mỗi năm tại Hoa Kì [15] Hiện tại chưa có kĩ thuật hình ảnh nào khác hiển thị chi tiết việc lưu thông mạch vành như kĩ thật này, tuy rằng những kĩ thuật không xâm lấn như chụp mạch cộng hưởng từ, chụp cắt lớp vi tính đa diện và chụp cắt lớp tia điện tử đã được cải thiện khá nhiều về độ phân giải Mặc dù vậy, chụp động mạch vành bị giới hạn khi chỉ xem lòng mạch vành mà không xem được bề mặt nội mô, bản chất mảng bám, thành mạch hay dòng chảy sinh lí động mạch vành Hơn nữa, các bức xạ phát ra từ các thiết bị chụp trong một thời gian dài cũng gây nguy hại cho sức khỏe của các bệnh nhân Để khắc phục mặt hạn chế này, các xét nghiệm sinh hóa đã ra đời với việc sử dụng các phương pháp đo các dấu ấn tim trong máu Trong những năm qua, hướng dẫn chẩn đoán và điều trị nhồi máu cơ tim cấp của Tổ chức Y tế Thế giới, của Hội tim mạch Hoa Kì, của Hội tim mạch châu Âu được cập nhật không ngừng

mà các dấu ấn tim là nền tảng của những thay đổi đó Từ những năm 50 cho đến nay, đã có rất nhiều dấu ấn tim khác nhau được sử dụng trong hội chứng mạch vành cấp như Aspartate Aminotransferase của thập niên 50, các đồng phân và đồng đẳng Creatine kinase (CK) của thập niên 60, Myoglobin của thập niên 70 và gần đây nhất

K20 – Sinh học thực nghiệm – 19 – Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN

là các troponin tim [10], [53] Hiện tại, dấu ấn sinh hóa tim lí tưởng cho hội chứng mạch vành cấp vẫn còn tiếp tục được nghiên cứu

1.4 CÁC NGHIÊN CỨU GẦN ĐÂY VỀ PROTEIN MÀNG VÀ TIM MẠCH

1.4.1 Những nghiên cứu trên thế giới

Gần đây, những nghiên cứu proteomics về các bệnh lí tim mạch đang tập trung nhiều vào việc phân tích về các protein màng với những cải tiến về kĩ thuật trong việc làm giàu các protein này Bên cạnh đó, các nhà khoa học cũng quan tâm đến việc tìm hiểu hệ protein của các cấu trúc dưới tế bào và các hệ thống sinh học để tìm kiếm các chỉ thị bệnh có giá trị Đa phần các nghiên cứu được thực hiện trên mô hình chuột Kislinger và cộng sự vào năm 2006 đã thực hiện phân đoạn các thành phần cấu tạo nên tế bào của rất nhiều loại mô bao gồm cả mô tim chuột và kết hợp với các phân tích khối phổ Tác giả đã thu được 1652 protein tim, tuy nhiên số lượng protein màng tế bào thu được lại ít hơn mong đợi [29] Một nghiên cứu khác tiến hành vào năm 2011 của Parker cũng đã nhận diện được 1556 vị trí glycosyl hóa liên kết đầu N (N-linked) đại diện cho 972 nhóm protein từ các protein tim chuột Trong số đó, 650 protein được dự đoán là có vùng xuyên màng Các phân tích cũng

hé lộ rằng có tới 76,9% các protein đã được nhận diện cho thấy chúng định vị trên màng [43]

Điện di hai chiều giữ vai trò quan trọng trong các nghiên cứu proteomics Với khả năng phân tách protein theo cả điểm đẳng điện và khối lượng nên kĩ thuật này rất hữu hiệu trong việc phát hiện ra các cải biến sau dịch mã – nhân tố làm biến đổi giá trị đẳng điện cũng như khối lượng protein Tuy vậy, hạn chế chủ yếu của kĩ thuật này chính nằm ở phạm vi phân tích Điện di hai chiều chỉ giới hạn trong tầm hoạt động khoảng 104

so với độ đa dạng rất lớn của các protein trong tế bào hay mô (106), và đặc biệt là trong huyết thanh (1012) Để vượt qua vấn đề này cần phải làm đơn giản hóa các mẫu và điển hình nhất là nghiên cứu trên từng phần dưới tế bào thay vì nghiên cứu toàn bộ tế bào Tuy vậy, điện di hai chiều vẫn có một nhược

K20 – Sinh học thực nghiệm – 20 – Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN

điểm nữa trong nghiên cứu các protein màng Đó là các protein màng rất khó hòa tan trong đệm điện di đẳng điện Vấn đề này có thể khắc phục bằng điện di một chiều kết hợp LC-MS/MS trong phân tích tổng thể [44] Trên cơ sở đó, Franklin đã tách chiết phần nhân tế bào tim của chuột,sau đó phân đoạn thành những phần nhỏ hơn như phần protein tan trong acid, protein liên kết chất nhiễm sắc, protein chất nền của nhân Sử dụng phân tích proteomics tác giả đã nhận diện được 1048 protein trong đó có 142 protein có vùng xuyên màng Xa hơn, sử dụng kĩ thuật phổ khối lượng độ chính xác cao để tìm các peptide tương ứng với toàn bộ 54 biến thể của histone kết quả cũng cho thấy có 17 trong số đó được nhận diện bằng một peptide đặc trưng duy nhất [23]

1.4.2 Những nghiên cứu tại Việt Nam

Năm 2010, Trần Thế Thành cùng cộng sự đã tiến hành tách chiết protein màng từ

mô gan chuột, sử dụng sắc kí lỏng kết nối khối phổ đã nhận diện được 318 protein màng Trong đó có 212 protein (66,67%) có ít nhất một vùng xuyên màng được dự đoán bằng chương trình SOSUI [46] Năm 2013, Nguyễn Tiến Dũng đã sử dụng phương pháp tương tự khi phân tích mô não chuột và truy vấn trên cơ sở dữ liệu UniProt cũng tìm thấy 298 protein màng Sau khi kết hợp hai công cụ tin sinh là SOSUI và TMHMM tác giả cũng dự đoán được 129 protein trong số đó (43,3%) có vùng xuyên màng [21] Gần đây nhất Nguyễn Thị Minh Phương dựa trên cách tiếp cận proteomics trong nghiên cứu so sánh mức độ biểu hiện của các protein bền nhiệt trong huyết thanh bệnh nhân ACS Kết quả đã phát hiện được 19 protein có mức độ biểu hiện thay đổi, trong đó có 7 protein chỉ biểu hiện tăng, 3 protein chỉ biểu hiện giảm và 9 protein biểu hiện thay đổi lúc tăng lúc giảm [6] Tuy vậy, các nghiên cứu protein màng tổng thể trên đối tượng con người mà cụ thể là huyết thanh vẫn chưa có nhiều Do đó, chúng tôi đã thực hiện nghiên cứu này nhằm xây dựng

dữ liệu protein màng để làm tiền đề cơ bản cho những nghiên cứu ứng dụng về ACS trong tương lai

K20 – Sinh học thực nghiệm – 21 – Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN

Chương 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 NGUYÊN LIỆU

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu nghiên cứu là huyết thanh của 30 bệnh nhân mắc hội chứng mạch vành cấp được cung cấp từ Viện Tim mạch thuộc Bệnh viện Bạch Mai, Hà Nội Các mẫu được lựa chọn theo các tiêu chuẩn chặt chẽ về lâm sàng Mẫu được bảo quản ở -

800C

2.2.2 Hóa chất

Bảng 1 Các hóa chất chính được sử dụng trong nghiên cứu

Bio-Rad Hercule,California, Hoa Kì

Cột sắc kí loại albumin, IgG

Ngoài ra một số hóa chất khác sử dụng trong nghiên cứu đều đạt độ tinh sạch cao phù hợp với các thí nghiệm sinh học phân tử

K20 – Sinh học thực nghiệm – 22 – Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN

2.1.3 Thiết bị

 Hệ thống tủ lạnh (-250C) và lạnh sâu (-800C) để bảo quản mẫu (Sanyo, Nhật

Bản)

 Máy li tâm và li tâm lạnh (Biofuge Fresco, Đức)

 Hệ thống nguồn và buồng điện di (Bio-Rad, Hoa Kì)

 Máy scan và cắt gel cùng với phần mềm phân tích hình ảnh (Bio-Rad, Hoa Kì)

 Hệ thống sắc kí lỏng nano hiệu năng cao (nano-LC) đa chiều (LC Packing, Amsterdam, Hà Lan) Hệ sắc kí gồm một microautosampler FAMOS, bơm Ultimate

micro HPLC, và thiết bị chuyển cột Swischos

 Hệ máy khối phổ QSTAR®XL, sử dụng nguồn ESI (Applied Biosystems, MDS SCIEX, Canada), cột sắc kí ngược pha C18 (Vydac, Hoa Kì), đầu đưa mẫu Sillica PicoTip (New Objective, Hoa Kì)

 Máy tính kết nối đến các cơ sở dữ liệu trực tuyến

Cùng các trang thiết bị hiện đại khác của Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt

Nam

2.2 PHƯƠNG PHÁP

Sơ đồ các bước thí nghiệm trong luận văn được tiến hành như trong Hình 2:

K20 – Sinh học thực nghiệm – 23 – Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN

Hình 2 Quy trình phân tích mẫu huyết thanh

2.2.1 Loại albumin và IgG huyết thanh bằng “Aurum™Serum Protein Mini Kit”

Chuẩn bị mẫu

Các mẫu huyết thanh của 30 bệnh nhân mắc hội chứng mạch vành cấp lần lƣợt đƣợc pha loãng trong các ống Eppendorf với đệm Binding theo tỉ lệ 1 : 3 (60 µl huyết thanh : 180 µl đệm)

 Loại bỏ dung dịch đệm Binding đã qua cột

 Đặt cột vào một ống Eppendorf khác để chạy mẫu

Huyết thanh Loại albumin & IgG Tủa lạnh bằng

acetone

SDS-PAGE và cắt băng

Thủy phân trong gel bằng trypsin Phân tích LC-

ESI-MS/MS

K20 – Sinh học thực nghiệm – 24 – Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN

Loại bỏ Albumin & IgG

 Đưa 200 µl mẫu đã pha loãng vào cột đã được chuẩn bị và cho chảy qua chất giá theo lực trọng trường

 Mix nhẹ cột, để yên trong khoảng 5 phút đến 10 phút, sau đó lặp lại bước này hai lần

 Để yên cột trong 10 phút rồi đem li tâm 10.000g, 20 giây

 Tiếp theo, rửa cột với 200 µl đệm Binding trong và thu lấy phần dịch rửa, phần dịch này trộn với phần mẫu thu được ở trên

 Dung dịch đã loại albumin và IgG sau khi qua cột được bảo quản ở tủ -25ºC đến khi sử dụng cho các bước thí nghiêm tiếp theo

Một phần dịch không bám cột được sử dụng để điện di SDS-PAGE kiểm tra kết quả loại albumin và IgG

2.2.2 Xác định hàm lượng protein và tủa để tinh sạch mẫu

Hàm lượng protein của mẫu được xác định theo phương pháp Bradford với thuốc nhuộm Quick Start Bradford Dye Regent 1x (Bio-Rad, Hercules, Hoa Kì) Mẫu được pha loãng với tỉ lệ thể tích 1: 50 và trộn đều với thuốc thử của phản ứng theo hướng dẫn của nhà sản xuất: 20 µl mẫu trộn với 980 µl thuốc nhuộm, ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút Mẫu được đo ở bước sóng 595 nm, thí nghiệm được lặp lại 3 lần, sử dụng BSA chuẩn với các nồng độ khác nhau (từ 0,125mg/ml đến 2mg/ml)

để xây dựng đường chuẩn Sau khi xác định phương trình đường chuẩn, tính toán nồng độ thực của mẫu theo tỉ lệ pha loãng

Sau đó, tinh sạch mẫu bằng cách tủa mẫu trong acetone 100% ở -25oC qua đêm theo tỉ lệ 1 thể tích mẫu : 4 thể tích aceton Sau khi tủa xong, tiến hành li tâm 13000 vòng/phút trong 30 phút Loại bỏ dịch nổi, thu tủa protein dùng cho các thí nghiệm tiếp theo

K20 – Sinh học thực nghiệm – 25 – Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN

2.2.3 Điện di gel polyacrylamide có SDS (SDS-PAGE)

Quy trình SDS-PAGE được thực hiện để phân tách mẫu nghiên cứu thành các nhóm có khối lượng phân tử khác nhau Điều này sẽ giúp làm giảm độ phức tạp của mẫu trong các phân tích tiếp theo Hơn nữa, qua kết quả điện di ta còn có thể xác định được độ tinh sạch của mẫu qua các bước xử lí trước đó để có biện pháp khắc phục các hiện tượng không mong muốn Protein sau tủa được hòa tan và biến tính trong 15 µl đệm Sample (25% (v/v) glycerol; 14,4 mM 2-mercapto ethanol; 2% (w/v) SDS; 0,1% (w/v) bromophenol blue; 60 mM 1M Tris-Cl pH 6,8) ở 980C, 10 phút Cuối cùng, mẫu được phân tách trên gel polyacrylamide với thành phần theo như Bảng 2 (thể tích được tính cho một bản gel)

120 phút Bản gel được tẩy nền bằng dung dịch tẩy (30% (v/v) methanol; 10% (v/v) acid acetic) cho đến khi có thể quan sát thấy các băng protein hiện rõ nét trên nền gel Tiến hành chụp các bản gel bằng máy laser Bio-Rad FX dưới sự hỗ trợ của

K20 – Sinh học thực nghiệm – 26 – Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN

phần mềm phân tích hình ảnh Phần mềm sẽ ước lượng hàm lượng protein trong từng giếng điện di bằng cách đo độ tương phản trên hình ảnh điện di Sau đó, các giếng điện di sẽ được phân chia thành các phân đoạn có hàm lượng protein xấp xỉ nhau Cuối cùng, các phân đoạn sẽ được cắt rời khỏi bản gel dùng cho bước thủy phân tiếp theo

2.2.4 Thủy phân protein bằng trypsin trong gel

Các phân đoạn protein biểu hiện trên bản điện di SDS-PAGE được cắt ra từ bản gel polyacrylamide và chuyển vào ống Eppendorf 1,5 ml Gel được rửa, loại thuốc nhuộm bằng dung dịch rửa (50 mM NH4HCO3 pH 8 ; 50% ACN) Sau đó, các mảnh gel được làm khô bằng 100% ACN và khử bằng DTT với dung dịch khử chứa

5 mM DTT ở 56 0C trong 1h Sau khi khử, gel được alkyl hóa bằng IAA với dịch chứa 5 mM IAA trong tối, 1 giờ ở nhiệt độ phòng Enzyme trypsin (loại sử dụng cho đọc trình tự, Sigma-Aldrich, Hoa Kì) được thêm vào với tỉ lệ enzyme : cơ chất

là 1 : 50, ở 370C trong 16 giờ Sau khi thủy phân, các peptide được chiết ra khỏi gel bằng dung dịch chiết chứa 50% ACN; 0,1% FA và siêu âm 20 phút Quá trình chiết peptide khỏi gel được lặp lại ba lần

2.2.5 Sắc kí đa chiều và phân tích khối phổ

Hỗn hợp peptide sau khi thủy phân trong trong gel được hòa vào FA 1% và phân tích trên hệ sắc kí lỏng Nano Đối với hỗn hợp peptide phức tạp tạo ra do thủy phân protein trong các phân đoạn gel, tiến hành chạy 2 chiều (qua cột trao đổi ion SCX

và cột RP C18) với 16 phân đoạn, 60 phút/mỗi phân đoạn

Hệ sắc kí lỏng nano

Các loại cột với đường kính mức m được sử dụng cho hệ NanoLC theo nguyên

lý ngược pha C18 (75 m x 15 cm), hoặc trao đổi ion SCX (500 m x 1,5 cm), đường kính dây nối là 20 m

Quy trình hoạt động của hệ sắc ký

K20 – Sinh học thực nghiệm – 27 – Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN

Các peptide được phân tách theo chiều thứ nhất trên cột sắc kí trao đổi ion SCX (LC Parking, Dionex, Hoa Kì) bằng các chất trao đổi cation mạnh Peptide được đưa vào với thể tích 20 l thông qua hệ đưa mẫu tự động và được đưa lên cột SCX (500 m x 15 mm) với tốc độ dòng 30 l/phút bằng 0,1% FA Các peptide bám trên cột SCX được thôi ra bằng 16 phân đoạn muối CH3COONH4 có nồng độ từ 0 đến 1M Peptide thôi ra từ cột SCX được cô đặc và loại muối trên cột ngược pha (300

m x 1,5 cm) trước khi phân tách trên cột RP-C18 với chiều dài 15 cm Sắc ký chiều thứ hai được thực hiện trên cột ngược pha C18 15 cm với pha linh động A (0,1% FA) và B (0,1% FA trong 85% ACN) Các peptide được thôi ra với tốc độ dòng là 0,2 l/phút theo gradient tuyến tính từ 5-100% dung dịch B trong 60 phút Các phân tích khối phổ được thực hiện sử dụng hệ thống QSTARXL MS/MS (Applied Biosystems/MDS Sciex, Ontario, Canada) được trang bị với nguồn ion hóa bằng phun điện (ESI)

Ghi phổ NanoLC-ESI- MS/MS

Máy khối phổ QSTARXL được vận hành ở chế độ Information Dependent Acquisition để thực hiện việc chuyển từ quét phổ TOF MS đơn đối với các ion nằm trong dải khối từ 400 amu đến 1200 amu sang khối phổ liên tiếp (MS/MS) trên 3 ion phân tử có mật độ cao nhất và lớn hơn 20 được xác định tự động nhờ phần mềm BioAnalyst QS phiên bản 1.1 (Applied Biosystems, Hoa Kì) Sai số về khối được đặt ở mức ± 0,25 Da, thời gian không thực hiện lại MS/MS đối với một mảnh là 90 giây Hiệu điện thế được đặt ở nguồn để ion hóa mẫu là 2200V

2.2.6 Nhận diện protein qua phổ khối lượng thu được

K20 – Sinh học thực nghiệm – 28 – Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN

Hình 3 Quy trình nhận diện protein màng từ dữ liệu phổ khối lƣợng thu đƣợc

Phổ khối MS/MS đƣợc phân tích bằng phần mềm Mascot kết hợp với Ngân hàng

Dữ liệu Protein NCBInr (Hoa Kì) thông qua website do MatrixScience (London, Anh) phát triển với hơn 8 triệu trình tự protein của các loài khác nhau (Hình 3) Phần mềm Mascot có khả năng phân tích dữ liệu phổ MS/MS dựa trên thuật toán

Hệ thống ESI-MS/MS

Cơ sở dữ liệu UniProt

Dữ liệu đặc điểm

Phổ khối lƣợng

NCBInr

Phần mềm Mascot

Dữ liệu đặc điểm protein

Dữ liệu nhận diện protein

K20 – Sinh học thực nghiệm – 29 – Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN

Mowse Các thông số để tìm kiếm dữ liệu được cài đặt trên trang truy xuất dữ liệu như trong Hình 4

Hình 4 Thông số tra cứu dữ liệu protein bằng phần mềm Mascot

2.2.7 Nhận diện và phân loại protein màng huyết thanh bệnh nhân mạch vành cấp

Tập hợp protein

Sau khi phần mềm Mascot trả các kết quả đã truy vấn, những kết quả này được chuyển sang cơ sở dữ liệu Uniprot để tìm kiếm các protein có dữ liệu cụ thể đi kèm như là vị trí, chức năng hay các quá trình mà protein đó tham gia Các dữ liệu này được xuất lên chương trình Excel thuận tiện cho việc truy xuất Tiếp theo, các protein màng sẽ được nhận diện thông qua các giữ liệu GO (Gene Ontology) và được sẽ được phân tích sâu hơn về vị trí dưới tế bào, các cải biến sau dịch mã, sự biến động về khối lượng, các chức năng sinh học cụ thể Đặc biệt hơn là vai trò của một số protein trong các diễn biến bệnh lí có liên quan đến hội chứng mạch vành cấp (Hình 3)

Xác định vùng xuyên màng