Luận văn thạc sĩ Sinh học, Sinh học thực nghiệm, Enzym, Vi sinh vật, enzym dehalogenase

MỞ ĐẦU Nhóm hợp chất halogen là nhóm hợp chất được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp, nông nghiệp, y học… Bên cạnh những lợi ích to lớn thì việc sử dụng một cách tràn lan v

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Đàm Lý

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU TINH SẠCH ENZYM

DEHALOGENASE TỪ CHỦNG VI SINH VẬT PHÂN LẬP

TẠI VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2014

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Đàm Lý

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU TINH SẠCH ENZYM

DEHALOGENASE TỪ CHỦNG VI SINH VẬT PHÂN LẬP

TẠI VIỆT NAM

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và lòng biết ơn sâu sắc nhất

đến PGS TS Nguyễn Quang Huy, người Thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo cho

em những kĩ năng nghiên cứu cũng như những kiến thức cần thiết trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài Bên cạnh đó Thầy đã tạo điều kiện học tập và nghiên cứu tốt nhất cho em để em có thể hoàn thành tốt luận văn này

Tiếp đến em xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo trong Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã nhiệt tình giảng dạy, hướng dẫn và cung cấp cho em những kiến thức bổ ích trong suốt khóa học

Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô, các anh chị, các bạn, các em sinh viên trong Bộ môn Sinh lý thực vật và Hóa Sinh, phòng Enzyme học và Phân tích hoạt tính sinh học, Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Protein và Enzym, Trung tâm Nghiên cứu Khoa học sự sống, khoa Sinh học đã hướng dẫn và giúp đỡ em trong thời gian em nghiên cứu tại các phòng thí nghiệm

Đề tài được thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí của đề tài cấp Đại học Quốc Gia Hà Nội mã số KLEPT 12-01 Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệEnzym và Protein, nhân dịp này em xin trân trọng cảm ơn sự giúp

đỡ quý báu đó

Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn bên cạnh, động viên, ủng hộ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em trong suốt thời gian học tập cũng như quá trình hoàn thành khóa luận này

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 10 tháng 08 năm 2014

Học viên

Nguyễn Đàm Lý

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 Hợp chất halogen 2

1.1.1 Hợp chất halogen hữu cơ 2

1.1.2 Ứng dụng của hợp chất clo hữu cơ 2

1.1.3 Tác hại của hợp chất clo hữu cơ 5

1.2 Tình hình sử dụng hợp chất có chứa clo ở Việt Nam 7

1.3 Một số phương pháp xử lý hợp chất clo hữu cơ 8

1.3.1 Phân hủy bằng tia cực tím (UV) hoặc bằng ánh sáng mặt trời 8

1.3.2 Phân hủy bằng vi sóng Plasma 9

1.3.3 Biện pháp ozon hóa/UV 9

1.3.4 Biện pháp oxy hóa bằng không khí ướt 9

1.3.5 Biện pháp oxy hóa ở nhiệt độ cao 9

1.3.6 Phân hủy bằng công nghệ sinh học 10

1.4 Giới thiệu về hợp chất 2,2-Dichloropropionate Sodium (2,2 DCPS) 12

1.4.1 Ứng dụng của 2,2 DCPS 12

1.4.2 Ảnh hưởng của 2,2 DCPS đến sức khỏe con người 13

1.4.3 Quá trình phân hủy trong môi trường tự nhiên của 2,2 DCPS 13

1.5 Enzym dehalogenase 15

Chương 2 – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Nguyên liệu 17

2.2 Hóa chất và thiết bị 17

2.2.1 Hóa chất và môi trường nuôi cấy 17

2.2.2 Máy móc, thiết bị 18

2.3 Phương pháp nghiên cứu 18

2.3.1 Phương pháp thu mẫu 18

2.3.2 Phương pháp phân lập 18

2.3.3 Phương pháp tuyển chọn các chủng vi sinh vật 19

2.3.4 Phương pháp phân loại chủng vi sinh vật 19

2.3.5 Nghiên cứu các đặc điểm hóa sinh của các chủng vi sinh vật 21

2.3.6 Nghiên cứu các điều kiện sinh trưởng và khả năng sử dụng một số cơ chất khác nhau 22

2.3.7 Đánh giá khả năng phân hủy hợp chất 2,2 DCPS 22

2.3.8 Phương pháp nghiên cứu tinh sạch dehalogenase 24

2.3.9 Phương pháp thống kê sinh học 29

Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

3.1 Phân lập các chủng vi sinh vật có khả năng sử dụng 2,2 DCPS 30

3.3 Xác định các đặc điểm sinh lý, hóa sinh của chủng H11 33

3.3.1 Nhuộm Gram 33

3.3.2 Kết quả chụp ảnh kính hiển vi điện tử quét 33

3.3.3 Giải trình tự gen 16S rRNA 34

3.3 Khả năng sử dụng các hợp chất hữu cơ khác nhau của chủng H11 36

3.4 Nghiên cứu khả năng sinh trưởng phát triển chủng H11 37

3.4.1.Xây dựng đường cong sinh trưởng của chủng H11 37

3.4.2.Tối ưu các điều kiện cho sự sinh trưởng của các chủng H11 37

3.5.Khả năng phân hủy 2,2 DCPS 39

3.5.2.Khả năng phân hủy 2,2 DCPS theo thời gian 39

3.6 Bước đầu nghiên cứu tinh sạch dehalogenase từ chủng H11 39

3.6.2 Xác định hoạt tính enzym dehalogen 39

3.6.3 Sắc ký trao đổi anion 40

3.6.4 Điện di không biến tính protein 41

KẾT LUẬN 44

KIẾN NGHỊ 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO 46

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 Công thức hóa học một số loại thuốc bảo vệ thực vật phổ biến 4

Hình 2 Sự luân chuyển thuốc BVTV trong môi trường không khí và nước 6

Hình 3 Công thức cấu tạo của 2,2 DCPS 12

Hình 4 Đường chuẩn nồng độ NaCl với ion Cl- có trong mẫu 24

Hình 5 Đường chuẩn nồng đô protein 25

Hình 6 Hình thái một số chủng vi sinh vật trên môi trường thạch MGB 31

Hình 7 Chủng vi khuẩn H11 trên môi trường MGB và MGB bổ sung Bromothymol blue 32

Hình 8 Hình thái chủng H11 dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 100 33

Hình 9 Ảnh hiện vi điện tử quét chủng H11 ở độ phóng đại 5000 33

Hình 10 Vị trí phân loại của chủng H11 với các loài có quan hệ họ hàng gần. 35

Hình 11 Khả năng sinh trưởng của chủng H11 trên môi trường MGB và MGB 0.1% cao nấm 37

Hình 12 Khả năng sinh trưởng của chủng H11 tại các nhiệt độ khác nhau trên môi trường MGB 38

Hình 13 Khả năng sinh trưởng của H11 với các nồng độ cơ chất khác nhau trên môi trường MGB 38

Hình 14 Khả năng phân hủy theo thời gian của H11 trên môi trường MGB 39 Hình 15 Kết quả điện di SDS-PAGEsau khi qua cột Q sepharose 40

Hình 16 Điện di không biến tính protein 41

Hình 17 Kết quả điện di SDS-PAGE sau khi qua cột Sephadex G-75 42

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 Sử dụng của hợp chất clo ở châu Âu năm 2012 5 Bảng 2 Mức dư lượng tối đa cho phép của mộ số thuốc trừ sâu, diệt cỏ gốc clo trong đất ở Việt Nam 7 Bảng 3 Thành phần của bản gel điện di không biến tính protein 26 Bảng 4 Thành phần bản gel SDS-PAGE 28 Bảng 5 Đặc điểm các khuẩn lạc trên môi trường MGB có bổ sung cơ chất 2,2 DCPS 30 Bảng 6 Kết quả thử kit API 20NE của chủng H11 36

MỞ ĐẦU

Nhóm hợp chất halogen là nhóm hợp chất được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp, nông nghiệp, y học… Bên cạnh những lợi ích to lớn thì việc sử dụng một cách tràn lan và không có biện pháp xử lý triệt để đã và đang gây

ra những hậu quả nghiêm trọng đến môi trường, hệ sinh thái và sức khỏe con người Việc sử dụng các phương pháp vật lý, hóa học để giải quyết tình trạng ô nhiễm gây

ra bởi các hợp chất halogen cho hiệu quả cao tuy nhiên đòi hỏi công nghệ hiện đại, chi phí cao và vấn đề hậu xử lý các sản phẩm tạo thành Phương pháp sinh học sử dụng các chủng vi sinh vật có khả năng phân giải các hợp chất halogen được đánh giá là hướng nghiên cứu mới có tiềm năng cao không chỉ cho hiệu quả cao mà còn thân thiện với môi trường, ít tốn kém và mang tính bền vững Trong tự nhiên tồn tại một số nhóm vi sinh vật có khả năng sử dụng các hợp chất halogen làm nguồn cung cấp cacbon duy trì hoạt động sống, chúng chuyên hóa các hợp chất halogen từ dạng độc hại trở thành dạng ít hoặc không độc với môi trường sinh thái và con người

Việt Nam là nước sản xuất nông nghiệp, cùng với điều kiện khí hậu phù hợp cho sự phát triển của cây trồng nhưng cũng là cơ hội cho sự lây lan của nhiều loại sâu bệnh, cỏ dại Để hạn chế sự phát triển lây lan của sâu bệnh, cỏ dại hàng năm chúng ta sử dụng một lượng lớn thuốc bảo vệ thực vật trong đó có nhóm các hợp chất halogen Việc sử dụng hợp chất này nhưng lại không có biện pháp kiểm soát đã gây ra tình trạng ô nhiễm môi trường nghiêm trọng, ảnh hưởng đến sinh thái môi trường và sức khỏe con người Ở Việt Nam hiện chưa có nhiều nghiên cứu cơ bản

về việc ứng dụng vi sinh vật có khả năng phân giải hợp chất halogen để giải quyết ô nhiễm môi trường, việc ứng dụng vi sinh vật trong tự nhiên để giải quyết ô nhiễm môi truờng còn mới mẻ, tiềm năng của phương pháp sinh học còn nhiều đồng thời

để tiếp tục phát triển các đề tài đã được thực hiện trước đó chúng tôi đã tiến hành

thực hiện đề tài:

“BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU TINH SẠCH ENZYM DEHALOGENASE

TỪ CHỦNG VI SINH VẬT PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM” với mục tiêu phân lập

các vi sinh vật có hoạt tính phân giải hợp chất clo trên cơ sở các chủng tuyển chọn được bước đầu nghiên cứu tinh sạch enzym có khả năng phân hủy hợp chất có chứa

Chương 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Hợp chất halogen

1.1.1 Hợp chất halogen hữu cơ

Các hợp chất halogen hữu cơ là một lớp gồm các chất hóa học tự nhiên và tổng hợp, có chứa một hoặc nhiều gốc halogen gồm Flo, Clo, Brom, Iot kết hợp với cacbon và các yếu tố khác Chúng được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp, nông nghiệp, y học như sản xuất nhựa, thiết bị y tế, tổng hợp cao su, đặc biệt là sản xuất thuốc trừ sâu bệnh trong nông nghiệp [19]

Các hợp chất hữu cơ dẫn xuất halogen đều có tính độc cao, chúng là một trong những nhóm các chất gây ô nhiễm môi trường lớn nhất do việc sử dụng tràn lan các loại thuốc diệt cỏ, thuốc trừ sâu trong nông nghiệp cũng như việc sản xuất các loại dung môi, chất dẻo và nhiều chất trung gian cho các sản phẩm hóa tổng hợp Việc sử dụng tràn lan thiếu kiểm soát các hợp chất hữu cơ dẫn xuất halogen đã dẫn đến tình trạng tồn dư với khối lượng lớn trong môi trường vượt qua sự chịu tải

và tái sinh của hệ sinh thái dẫn đến ô nhiễm môi trường hệ sinh thái, ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng [52]

1.1.2 Ứng dụng của hợp chất clo hữu cơ

Hợp chất clo hữu cơ được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau của đời sống như các sản phẩm nhựa, các dung môi tẩy rửa Các loại hợp chất này thường bền vững và khó bị phân hủy nên tồn tại lâu dài trong tự nhiên Dư lượng lớn các loại hợp chất này được tìm thấy trong đất, nước và không khí qua nước mưa vào các hệ thống nước uống và nước sinh hoạt ảnh hưởng đến sức khỏe con người

và các loại sinh vật [18]

Một số ứng dụng quan trọng:

- Chất dẻo:

Hiện nay, trong cuộc sống hàng ngày con người sử dụng nhiều các sản phẩm

từ nhựa tổng hợp như PVC (polyvinyl chlorua), PE (polyethylene), PP (polypropylene), PS (polystyrene) trong đó polyvinylclorua (PVC) là loại nhựa nhiệt dẻo được sản xuất và tiêu thụ nhiều thứ ba trên thế giới Clo trong PVC có khả

năng kìm hãm sự cháy chính vì đặc điểm này mà PVC gần nhƣ chiếm vị trí độc tôn trong lĩnh vực xây dựng dân dụng [33]

- Dung môi:

Dung môi clo là dung môi phổ biến nhất trong số các dẫn xuất halogen Trichloroethylene (CHCl=CCl2) và Tetrachloroethylene (CCl2=CCl2), Chlorofluorocarbons (CFC),Methylene chloride (CH2Cl2), carbon tetrachloride (CCl4), Chloroform (CHCl3), 1,1,1-trichloroethane (CH3-CCl) Dung môi clo đƣợc ứng dụng trong công nghệ làm lạnh, giặt khô, dập lửa, làm sạch kim loại, tẩy dầu

mỡ, bình xịt ô tô, in ấn, giấy và các ngành công nghiệp dệt may, loại bỏ sơn, ngành công nghiệp đồ nội thất, sản xuất nhựa nhiệt dẻo [15,22]

- Thuốc nhuộm:

Một số loại thuốc nhuộm đƣợc sử dụng để nhuộm len, cellulose, bông và sợi tổng hợp có bản chất là dẫn xuất hữu cơ của halogen Các loại thuốc nhuộm nhƣ picric acid, indigotin và một số thuốc nhuộm azo sản xuất từ nguyên liệu ban đầu nhƣ chloroanilines, chlorobenzenes, chloronitrobenzenes, chloroacetic acid Các hợp chất hữu cơ dẫn xuất halogen có màu sắc đặc trƣng đƣợc sửdụng đểnhuộm xơ sợi xenluloz Clo prinazines và các chất dẫn xuất của chúngđƣợc sửdụng để nhuộm sợi bông, trong khi thuốc nhuộm có thành phần chloro nhƣ remalan, procilan, procion đƣợc sử dụng cho nhuộm len và sợi polyamide [57]

- Dƣợc phẩm

Trong sản xuất dƣợc phẩm, 80% các dƣợc phẩm và vitamin là liên quan đến clo, nhiều loại thuốc cần có clo để gây tác dụng Ceclor và Lorabid đƣợc sử dụng để điều trị nhiễm trùng tai, Toremifene là một loại thuốc chống ung thƣ vú, và vancomycin kháng sinh tự nhiên đƣợc sử dụng để chống lại nhiễm trùng kháng penicillin Clorua benzyl đƣợc sử dụng để tổng hợp các loại thuốc phenobarbital, benzedrine, và demerol Thuốc mê hô hấp bao gồm các organofluorines desflurane, sevoflurane và enflurane (CHClFCF2OCHF2 ) Các hợp chất perfluorocacbon, chẳng hạn nhƣ perfluorotributylamine ([CF3 CF2 CF2CF2]3N), đƣợc sử dụng để thay thế máu hoặc chế tạo "máu nhân tạo" và đƣợc sử dụng cho tạo hình động mạch

cỏ như axit chlorophenoxyacetic, dalapon, thuốc diệt nấm- polychlorophenol và

thuốc trừ sâu DDT [35]

Hình 1 Công thức hóa học một số loại thuốc bảo vệ thực vật phổ biến

Vì có ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau do đó con người tạo

ra các hợp chất clo ngày càng nhiều Ở các nước càng phát triển thì lượng các hợp chất clo được sản xuất và sử dụng càng nhiều Chỉ riêng ở châu Âu năm 2012 đã sử dụng đến gần 10 triệu tấn hợp chất có chứa clo (bảng 1)

Bảng 1.Sử dụng của hợp chất clo ở châu Âu năm 2012 (9.747 triệu tấn) [54]

Ứng dụng của clo ở châu Âu 2012 Triệu tấn %

1.1.3 Tác hại của hợp chất clo hữu cơ

Việc sử dụng thuốc BVTV trong nông nghiệp đã làm tác động tới môi trường sinh thái Định hướng của thuốc là diệt sâu hại, cỏ dại , nhưng diễn biến thực tế do thiếu sự kiểm soát thuốc BVTV lại ảnh hưởng độc tới đất, nước, không khí và các sản phẩm nông nghiệp, động vật, sức khoẻ con người đặc biệt những dư lượng của những chất do tính độc cao như chlordane, DDT, picloram,

Không khí là một phần quan trọng trong quá trình luân chuyển và phân tán thuốc BVTV Khi con người sử dụng, thuốc BVTV sẽ phân tán vào không khí, đất nước bề mặt Lượng mưa hàng năm sẽ giúp làm sạch bầu không khí đồng thời rửa trôi thuốc BVTV trên bề mặt để tích tụ trong sông, suối, ao, hồ và thuốc BVTV sẽ thâm nhập vào nguồn nước ngầm bằng cách ngấm qua đất (hình 2)

Một đặc tính quan trọng của thuốc BVTV trong hệ sinh thái là tính khuếch đại sinh học Từ nồng độ sử dụng nhỏ, sau khi vào hệ sinh thái thông qua chuỗi lưới thức ăn chất độc được tích luỹ với nồng độ cao dần qua các bậc dinh dưỡng Hầu hết các loại thuốc BVTV đều độc đối với người và động vật máu nóng, tuy nhiên mức độ gây độc của mỗi loại thuốc có khác nhau, có loại thuốc gây độc cấp tính, có loại thuốc có tính tích luỹ lâu trong cơ thể sống, bền vững trong môi trường Thuốc BVTV xâm nhập vào cơ thể con người bằng các con đường như qua da, qua miệng,

dư trong thực phẩm vào cơ thể qua con đường ăn uống, chúng có thể bị loại bỏ theo khí thở, theo phân hoặc nước tiểu, tuy nhiên không thể tránh khỏi sự chuyển hóa các chất độc hại này ở trong gan Một số thuốc bảo vệ thực vật chuyển hóa thành những sản phẩm ít độc hơn, dễ hòa tan trong nước hơn thì sẽ dễ dàng bị loại bỏ, nhưng cũng có những loại hóa chất lại tạo thành những chất trao đổi trung gian độc hơn (như paration chuyển thành paraoxon), tích lũy trong một số cơ quan hoặc mô mỡ gây tổn thương và kèm theo các triệu chứng ngộ độc nguy hiểm Thuốc bảo vệ thực vật có trong thức ăn, đồ uống với lượng lớn có thể gây ngộ độc cấp tính gây rối loạn tiêu hóa (nôn mửa, tiêu chảy), rối loạn thần kinh (nhức đầu, hôn mê, co giật hoặc co cứng cơ ), trụy tim mạch, suy hô hấp rất dễ dẫn dến tử vong Các kết quả nghiên cứu cho thấy có đến 90% thuốc BVTV không đạt mục đích mà còn gây nhiễm độc đất, nước, nông sản [13, 14]

Hình 2 Sự luân chuyển thuốc BVTV trong môi trường không khí và nước[13]

Trên thế giới ước tính có khoảng 39 triệu người có thể bị ngộ độc cấp tính hàng năm do ảnh hưởng của hóa chất BVTV Trong đó có khoảng 3 triệu người bị ngộ độc cấp tính nghiêm trọng và 220 nghìn người tử vong mỗi năm Đi đôi với số lượng hóa chất bảo vệ thực vật sử dụng tăng là số người ngộ độc hóa chất BVTV cũng tăng, đặc biệt là tại các nước đang phát triển, 99% trường hợp ngộ độc xảy ra ởcác nước này, cho dù lượng tiêu thụ hoá chất bảo vệ thực vật chỉ chiếm 20% Tuy nhiên, phần lớn người nông dân tại các nước này chưa nhận biết đầy đủ về tác hại cũng như nguy cơ do hoá chất bảo vệ thực vật gây ra [58]

1.2 Tình hình sử dụng hợp chất có chứa clo ở Việt Nam

Thực trạng nhiễm độc hoá chất bảo vệ thực vật tại Việt Nam vẫn còn nghiêm trọng Thống kê sơ bộ tại 38 tỉnh, thành phố, trong năm 2007 đã xảy ra gần 4.700

vụ, với 5.207 trường hợp bị nhiễm độc hoá chất bảo vệ thực vật và 106 người đã tử vong Năm 2009 có 4.372 vụ nhiễm độc với 4.515 trường hợp, tử vong 138 trường hợp chiếm tỷ lệ 3,05% Theo Hà Minh Trung và cộng sự, cả nước hiện có 11,5 triệu hộ nông nghiệp, số người tiếp xúc nghề nghiệp với hóa chất bảo vệ thực vật ít nhất cũng tới 11,5 triệu người [11] Với tỷ lệ nhiễm độc hóa chất bảo vệ thực vật mãn tính là 18,26% thì số người bị nhiễm độc mãn tính trong cả nước lên tới 2,1 triệu người Nguyên nhân chủ yếu do tình trạng lạm dụng và sử dụng bừa bãi hoá chất BVTV trong đó 98% trường hợp lạm dụng hoặc pha đặc hơn so với hướng dẫn trên bao bì 2-3 lần; có từ 84,17% đến 93,23% không sử dụng đầy đủ phương 2 tiện bảo vệ cá nhân khi phun hoá chất bảo vệ thực vật [7] Trước thực tiễn sử dụng một cách tràn lan thuốc BVTV ở Việt Nam, năm 2008 Bộ Tài nguyên và Môi trường đã đưa ra quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về dư lượng hóa chất BVTV trong đất, trong đó

có một số thuốc BVTV có nguồn gốc clo (bảng 2)

Bảng 2 Mức dư lượng tối đa cho phép của mộ số thuốc trừ sâu, diệt cỏ gốc clo

trong đất ở Việt Nam [59]

Theo báo cáo của Vụ Khoa học công nghệ và Môi trường (Bộ Nông nghiệp

và Phát triển nông thôn), lượng thuốc BVTV nhập vào Việt Nam là 77.000 tấn, tổng lượng thuốc BVTV trôi nổi không được phép sử dụng đang lưu trữ cần tiêu hủy trên

cả nước là 150 tấn thuốc nước và thuốc bột Chúng đặc biệt nguy hiểm vì thuộc vào nhóm POP (nhóm chất ô nhiễm hữu cơ khó phân hủy) - do đó gây ra những nguy cơ đối với môi trường và sức khỏe con người Các chất này bao gồm: aldrin, chlordane, DDT,…[1, 50]

Những năm gần đây, do diện tích đất canh tác ở nước ta bị thu hẹp người sản xuất bắt buộc phải thâm canh tăng vụ, thay đổi cơ cấu giống cây trồng…, kéo theo

đó là việc tăng sử dụng phân bón, thuốc bảo vệ thực vật Bên cạnh đó, do khí hậu biến đổi bất thường nên tình hình sâu bệnh diễn biến phức tạp hơn, vì vậy số lượng

và chủng loại thuốc BVTV sử dụng cũng tăng lên Nếu như trước năm 1985, khối lượng thuốc BVTV dùng hàng năm khoảng 6.500 - 9.000 tấn thì từ năm 1991 đến nay lượng thuốc sử dụng biến động từ 25-38 ngàn tấn [64] Việc sử dụng thuốc BVTV không rõ nguồn gốc xuất xứ và cùng với đó các loại bao bì, chai lọ đựng thuốc BVTV không được xử lý đúng cách cũng đang là mối nguy cơ đe dọa nghiêm trọng tới sức khỏe cộng đồng và gây ô nhiễm môi trường

1.3 Một số phương pháp xử lý hợp chất clo hữu cơ

1.3.1 Phân hủy bằng tia cực tím (UV) hoặc bằng ánh sáng mặt trời

Các phản ứng phân huỷ bằng tia cực tím (UV), bằng ánh sáng mặt trời thường làm gãy mạch vòng hoặc gẫy các mối liên kết giữa Clo và Cacbon hoặc nguyên tố khác trong cấu trúc phân tử của chất hữu cơ và sau đó thay thế nhóm Cl bằng nhóm Phenyl hoặc nhóm Hydroxyl và giảm độ độc của hoạt chất Ưu điểm của biện pháp này là hiệu suất xử lý cao, chi phí cho xử lý thấp, rác thải an toàn ngoài môi trường Tuy nhiên, nhược điểm của biện pháp là không thể áp dụng để xử

lý chất ô nhiễm chảy tràn và chất thải rửa có nồng độ đậm đặc Nếu áp dụng để xử

lý ô nhiễm đất thì lớp đất trực tiếp được tia UV chiếu không dày hơn 5mm Do đó, khi cần xử lý nhanh lớp đất bị ô nhiễm tới các tầng sâu hơn 5mm thì biện pháp này

ít được sử dụng và đặc biệt trong công nghệ xử lý hiện trường [60]

1.3.2 Phân hủy bằng vi sóng Plasma

Biện pháp này được tiến hành trong thiết bị cấu tạo đặc biệt Chất hữu cơ được dẫn qua ống phản ứng (Detector Plasma) sinh ra sóng phát xạ electron cực ngắn (vi sóng) Sóng phát xạ electron tác dụng vào các phân tử hữu cơ tạo ra nhóm gốc tự do và sau đó dẫn tới các phản ứng tạo SO2, CO2, [HPO3]2-, Cl2, Br2, … ( sản phẩm tạo ra phụ thuộc vào bản chất thuốc BVTV)

Kết quả thực nghiệm theo biện pháp trên ở một số loại thuốc BVTV đã phá huỷ đến 99% (với tốc độ từ 1,8 đến 3 kg/h)

Ưu điểm của biện pháp này là hiệu suất xử lý cao, thiết bị gọn nhẹ Khí thải khi xử lý an toàn cho môi trường Tuy nhiên, nhược điểm của biện pháp này là chỉ sử dụng hiệu quả trong pha lỏng và pha khí, chi phí cho xử lý cao, phải đầu tư lớn [60]

1.3.3 Biện pháp ozon hóa/UV

Ozon hoá kết hợp với chiếu tia cực tím là biện pháp phân huỷ các chất thải hữu cơ trong dung dịch hoặc trong dung môi Kỹ thuật này thường được áp dụng để

xử lý ô nhiễm thuốc trừ sâu ở Mỹ Phản ứng hoá học để phân huỷ hợp chất là:

Thuốc trừ sâu, diệt cỏ + O3 CO2 + H2O + các nguyên tố khác

Ưu điểm của biện pháp này là sử dụng thiết bị gọn nhẹ, chi phí vận hành thấp, chất thải ra môi trường sau khi xử lý là loại ít độc, thời gian phân huỷ rất ngắn Nhược điểm của biện pháp là chỉ sử dụng có hiệu quả cao trong các pha lỏng, pha khí Chi phí ban đầu cho xử lý là rất lớn [60]

1.3.4 Biện pháp oxy hóa bằng không khí ướt

Biện pháp này dựa trên cơ chế oxy hoá bằng hỗn hợp không khí và hơi nước

ở nhiệt độ cao > 350oC và áp suất 150 atm Kết quả xử lý đạt hiệu quả 95% Chi phí cho xử lý theo biện pháp này chưa được công bố [60]

1.3.5 Biện pháp oxy hóa ở nhiệt độ cao (thiêu đốt, nung chảy, lò nung chảy)

Biện pháp oxy hoá ở nhiệt độ cao có 2 bước chính:

- Bước 1: Tách chất ô nhiễm ra hỗn hợp đất bằng phương pháp hoá hơi chất ô nhiễm

- Bước 2: Là bước phá huỷ chất ô nhiễm bằng nhiệt độ cao Dùng nhiệt độ cao có lượng oxy dư để oxy hoá các chất ô nhiễm thành CO2, H2O, NOx, P2O5

Ưu điểm của biện pháp xử lý nhiệt độ cao là biện pháp tổng hợp vừa tách chất ô nhiễm ra khỏi đất, vừa làm sạch triệt để chất ô nhiễm; khí thải rất an toàn cho môi trường (khi có hệ thống lọc khí thải) Hiệu suất xử lý tiêu độc cao > 95%; cặn

bã tro sau khi xử lý chiếm tỷ lệ nhỏ (0,01%)

Hạn chế của biện pháp này là chi phí cho xử lý cao, không áp dụng cho xử lý đất bị ô nhiễm kim loại nặng, cấu trúc đất sau khi xử lý bị phá huỷ, khí thải cần phải lọc trước khi thải ra môi trường [60]

1.3.6 Phân hủy bằng công nghệ sinh học

Việc loại bỏ có hiệu quả tồn dư thuốc BVTV là một trong các khó khăn chính mà nền nông nghiệp phải đối mặt Vi sinh vật đất được biết đến như những cơ thể có khả năng phân huỷ rất nhiều thuốc BVTV dùng trong nông nghiệp Trong những năm gần đây xu hướng sử dụng vi sinh vật để phân huỷ lượng tồn dư thuốc BVTV một cách an toàn được chú trọng nghiên cứu [60]

Biện pháp phân huỷ thuốc BVTV bằng tác nhân sinh học dựa trên cơ sở sử dụng nhóm vi sinh vật có sẵn môi trường đất, các sinh vật có khả năng phá huỷ sự phức tạp trong cấu trúc hoá học và hoạt tính sinh học của thuốc BVTV Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng trong môi trường đất quần thể vi sinh vật trong môi trường đất luôn luôn có khả năng thích nghi đối với sự thay đổi điều kiện sống Ở trong đất, thuốc BVTV bị phân huỷ thành các hợp chất vô cơ nhờ các phản ứng ôxy hoá, thuỷ phân, khử oxy xảy ra ở mọi tầng đất và tác động quang hoá xảy ra ở tầng đất mặt Tập đoàn vi sinh vật đất rất phong phú và phức tạp Chúng có thể phân huỷ thuốc BVTV và dùng thuốc như là nguồn cung cấp chất dinh dưỡng, cung cấp cacbon, nitơ và năng lượng để chúng xây dựng cơ thể Quá trình phân huỷ của vi sinh vật có thể gồm một hay nhiều giai đoạn, hình thành các sản phẩm trung gian và cuối cùng dẫn tới sự khoáng hóa hoàn toàn sản phẩm thành CO2, H2O và một số chất khác không độc hại Một số nhóm thuốc BVTV thường chỉ bị một số loài vi sinh vật phân huỷ Tuy nhiên một số loài vi sinh vật có thể phân huỷ được nhiều thuốc BVTV trong cùng một nhóm hoặc ở các nhóm thuốc khá xa nhau [32] Các

nghiên cứu cho thấy nhiều vi sinh vật có khả năng phân huỷ 2,4-D, trong đó có

Achrombacter, Alcaligenes, Corynebacterrium, Flavobaterium, Pseudomonas,…

Yadav và cộng sự đã phát hiện nấm Phanerochaete Chrysosporium có khả năng

phân huỷ 2,4-D và rất nhiều hợp chất hữu cơ quan trọng có cấu trúc khác như Clorinated phenol, PCBs, Dioxin, Monoaromatic và Polyaromatic hydrocacbon,

Nitromatic [51] Chủng Aerobacter aerogenes chuyển hoá thuốc trừ sâu DDT và chủng Alcaligenes denitrificans NTB-1 phát triển trên môi trường 2,4-

dichlorobenzoate trong điều kiện hiếu khí [5] Ngoài các vi khuẩn hiếu khí nhóm vi

khuẩn kỵ khí thuộc chi Dehalococcoides có khả năng khử clo của nhiều hợp chất

chứa clo như Trichloethylene, Vinylchloride….[5] Ở Việt Nam, Nguyễn Thị Kim Cúc và Phạm Việt Cường đã tiến hành phân lập và tuyển chọn một số chủng thuộc

chi Pseudomonas có khả năng phân huỷ được metyl parathion và đạt được kết quả

khả quan [6]

Quá trình phân hủy thuốc BVTV của sinh vật đất đã xẩy ra trong môi trường

có hiệu suất chuyển hoá thấp Để tăng tốc độ phân huỷ thuốc BVTV và phù hợp với yêu cầu xử lý, người ta đã tối ưu hoá các điều kiện sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật như: pH , môi trường, độ ẩm, nhiệt độ, dinh dưỡng, độ thoáng khí, bổ sung vào môi trường đất chế phẩm sinh vật có khả năng phân huỷ thuốc BVTV

Một số trở ngại có thể sử dụng vi sinh vật trong xử lý sinh học là những điều kiện môi trường tại nơi cần xử lý, như sự có mặt của các kim loại nặng độc, nồng

độ các chất ô nhiễm hữu cơ cao có thể làm cho vi sinh vật tự nhiên không phát triển được và làm chết vi sinh vật đưa vào, giảm đáng kể ý nghĩa đáng ý nghĩa thực tế của xử lý sinh học [60]

Hiện nay với những kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại có thể tạo ra những chủng vi khuẩn có khả năng phân huỷ đồng thời nhiều hoá chất độc hại mà không yêu cầu điều kiện nuôi cấy phức tạp và không gây hại cho động thực vật cũng như con người Phương pháp này sẽ được ứng dụng rộng rãi trong tương lai sau các nghiên cứu ký lưỡng [29]

1.4 Giới thiệu về hợp chất 2,2-Dichloropropionate Sodium (2,2 DCPS)

2,2–dichloropropionate sodium (2,2 DCPS), tên thông dụng là Dalapon Là dạng muối Na của axit 2,2-dichloropropionic

Hình 3 Công thức cấu tạo của 2,2 DCPS

2,2 DCPS có tính độc thấp, thuốc gây ngứa và đôi khi ảnh hưởng tới da Đây

là loại thuốc trừ cỏ được sử dụng sau khi hạt nảy mầm, nhóm dẫn xuất alifatic, do công ty Pepro (Pháp) tạo ra từ năm 1944 Thuốc có dạng bột khi hòa vào nước, có màu trắng đến trắng ngà Thuốc dễ hòa tan trong nước và dung môi hữu cơ Trong dung dịch nước ở nhiệt độ 25oC thuốc ít phân hủy, khi nhiệt độ trên 50o C bị phân hủy nhanh tạo thành rượu ethylic và axít clohydric dẫn đến mất tác dụng và ăn mòn kim loại Vì vậy khi đã pha thuốc cần dùng ngay, không để qua ngày Ngoài ra thuốc cũng dễ hút ẩm làm chảy nước và chuyển qua màu nâu, cho nên cần bảo quản thuốc nơi khô ráo và bao bì kín [61]

1.4.1 Ứng dụng của 2,2 DCPS

Hợp chất 2,2–dichloropropionate sodium được dùng trừ cỏ và ít có hiệu quả với cỏ lá rộng Trong thời gian sử dụng cần ẩm độ không khí cao giúp thuốc được hấp thu tốt hơn Dalapon nên phun ở nồng độ 0,75-1,0% và phun 2-3 lần với chu kỳ 2-3 tuần/lần Nếu chỉ phun một lần ở liều lượng cao, thuốc phá hủy mạch dẫn của lá làm ngăn cản quá trình lưu dẫn thuốc xuống rễ, thân ngầm Ngoài ra do thuốc dễ bị mưa rửa trôi, nên tránh mưa ít nhất 6 giờ sau khi sử dụng Sau khi sử dụng, thuốc mau phân hủy bởi nhiều loại vi sinh vật, riêng với cây cao su thuốc không gây hại cho những bộ phận đã hóa nâu, nhưng gây cháy lá và chết chồi non Ở Việt Nam, 2,2 DCPS thường được dùng để trừ cỏ một lá mầm và hai lá mầm kể cả lau, sậy, cỏ tranh hay các loại cỏ có bộ rễ ăn sâu dưới đất Nếu dùng cho khai hoang, phục hóa thì dùng với liều 20kg/ha trở lên Để trừ cỏ cho ngô, mía, cây ăn quả, cây công

nghiệp thì dùng 2-5 kg/ha Thuốc có tác dụng nội hấp nên thâm nhập vào lá cỏ rất nhanh (cũng có thể thâm nhập qua rễ cỏ) làm rối loạn sinh lí nên lá biến dạng, than cong queo, giòn, dễ gãy và cuối cùng bị chết Thuốc có hiệu lực trong 2-3 tuần Thông thường phun thuốc trừ cỏ lúc trước gieo cấy cây trồng khoảng 3 tuần [40]

1.4.2 Ảnh hưởng của 2,2 DCPS đến sức khỏe con người

Ảnh hưởng với môi trường: Với hàm lượng vượt quá 2660ppm (part per million) trong môi trường đất sẽ gây ức chế, kìm hãm các vi sinh vật đồng hóa nitơ trong đất Với nồng độ lớn gây ảnh hưởng đến năng suất, chất lượng hoa màu, lương thực [23] Ảnh hưởng tới sức khỏe con người: Khi tiếp xúc với nồng độ cao

và trong thời gian dài có các triệu chứng như dị ứng da, bỏng da, có hại cho mắt, hệ

hô hấp, mệt mỏi, chán ăn, tiêu chảy, nôn mửa, làm chậm xung thần kinh trung ương, có thể gây trầm cảm Một số nghiên cứu trước đây được thực hiện ở chó và chuột cho thấy có sự tăng trọng lượng thận ở động vật ăn liều rất cao trong ngày Trong một thí nghiệm, cho chuột và chó cho ăn với liều lượng tương ứng 50mg/kg/ngày và 1100mg/kg/ngày thì sau hai năm với chuột và một năm với chó cho thấy mức tăng trung bình nhẹ trọng lượng thận [12]

1.4.3 Quá trình phân hủy trong môi trường tự nhiên của 2,2 DCPS

Muối 2,2 DCPS thủy phân chậm trong nước tạo ra axít pyruvic và Cl-, khả năng phân hủy càng tăng khi tăng nhiệt độ Sau 175 giờ, mức độ thủy phân của 2,2 DCPS ở 25oC ở các nồng độ dung dịch 1%, 5% và 18% lần lượt là 0,41%, 0,61% và 0,8%; pH môi trường củng ảnh hưởng tới quá trình thủy phân, ở giá trị pH = 2,3,

60oC trong 30 giờ lượng 2,2 DCPS bị phân hủy là 20% Cùng điều kiện như vậy nhưng với giá trị pH = 12 thì lượng 2,2 DCPS bị phân hủy là 50%

2,2 DCPS chịu ảnh hưởng của quá trình quang phân Khi một dung dịch 2,2 DCPS (0,25M) được chiếu với ánh sáng UV ở 253,7 nm ở 49oC thì 70% bị phân hủy trong vòng 7 giờ Axít pyruvic được hình thành sau đó được decarboxyl hóa thành acetaldehyde, cacbon dioxide và một lượng nhỏ chất 1,1-dichloroethan (2-4%) và một loại polymer không tan trong nước Theo các báo cáo trước đây thì thời

gian bán rã bằng thủy phân của 2,2 DCPS ở nồng độ <1%, nhiệt độ dưới 25oC là khoảng vài tháng

Quá trình phân hủy hóa học và vật lý đối với 2,2 DCPS diễn ra chậm ở nhiệt

độ phòng tạo thành axít pyruvic, axít hydrochloric và natri clorua Đốt cháy 2,2 DCPS ở nhiệt độ 900oC thì sản phẩm tạo thành bao gồm carbon monoxide, carbon dioxide, clo và axít chlohydric [16, 29]

Hiện nay, sự phân hủy 2,2 DCPS trong môi trường đất chủ yếu là nhờ vi sinh vật Một số chủng vi sinh vật có khả năng sử dụng 2,2 DCPS làm nguồn cung cấp carbon cho quá trình trao đổi chất của chúng 2,2 DCPS dễ dàng bị loại bỏ bởi các

loài như: Pseudomonas, Agrobacterium, Nocardia, Alcaligenes, Arthrobacter và

Bacillus [24] Hirsch và Alexander nghiên cứu cho thấy 89% tới 100% hàm lượng

2,2 DCPS bị phân giải sau 3 tuần trong môi trường đất chứa các chủng thuộc chi

Nocardia và Pseudomonas [44] Schwarze và cộng sự đã phân lập được 5 chủng vi

khuẩn có khả năng phân hủy 2,2 DCPS đó là Agrobacterium tumefaciens RS4, A

Tumedaciens RS5, Xanthomonas maltophilia RS6, Comamonas acidovorans RS7

và Alcaligenes xylosoxidans ssp denitrifcans RS9 [27]

Bản chất của quá trình phân hủy 2,2 DCPS của vi sinh vật là nhờ vào sự hoạt động của enzym được gọi là chung là enzym dehalogenase, được xác định và định danh bởi Jensen (1957) [50] Các nghiên cứu phân lập vi khuẩn có khả năng hình thành dehalogenase đã được thực hiện Jing và Huyop, 2008, 2012 [28, 17]; Schwarze và cộng sự, 1997 [44]; Hamid và cộng sự, 1982 [21]; Motosugi và cộng

sự, 1982 [36]; Allison và các cộng sự, 1982 [16]; Hardman và Slater, 1981 [12] Các nghiên cứu đều cho thấy trong điều kiện nuôi cấy và làm giàu trên môi trường dinh dưỡng có bổ sung cơ chất 2,2 DCPS các chủng vi sinh vật có thể sinh trưởng

và sản sinh ra dehalogenase

Ở Việt Nam, hiện nay chưa có nhiều nghiên cứu về phân hủy hợp chất 2,2 DCPS bằng con đường sinh học sử dụng các vi sinh vật, phần lớn các nghiên cứu chỉ tập trung vào các hợp chất trong thuốc trừ sâu như DDT, hay Dioxin [6,9,1] Đây có thể coi là những nghiên cứu mang tính định hướng đầu tiên góp phần vào

việc giải quyết ô nhiễm hay tồn dư thuốc trừ cỏ 2,2 DCPS trong môi trường đất, nước, không khí ở Việt Nam

1.5 Enzym dehalogenase

Dehalogenases là nhóm gồm nhiều enzym xúc tác cho việc loại bỏ các nguyên tử halogen từ các hợp chất hữu cơ có chứa halogen liên kết với cacbon Các enzym thuộc nhóm này từ vi sinh vật đã được thu hút rất nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học vì chúng có thể ứng dụng cho ngành công nghiệp hóa chất và công nghệ môi trường Một số enzym thuộc nhóm này đã được phát hiện, tách chiết và nghiên cứu [28] Sự phân tách của halogen khỏi liên kết với sự tham gia của các enzym xúc tác theo nhiều cơ chế khác nhau: (i) Loại nhóm halogen là quá trình thay thế nhóm halogen bởi nguyên tử hydro (ii) Loại nhóm halogen với có sự tham gia của phân tử oxy Phản ứng trong nhóm này được xúc tác bởi monooxygenases (hoặc dioxygenases) (iii) Thủy phân các dẫn xuất nhóm halogen, phản ứng thủy phân được xúc tác bởi halidohydrolases, nhóm halogen được thay thế bởi sự tham gia của nucleophin một nhóm hydroxy có nguồn gốc từ nước (iv) "Thiolytic" dehalogenation, một số nhóm vi khuẩn phân hủy dichloromethane với sự tham gia của glutathione S-transferase xúc tác sự hình thành của một liên kết glutathione S-chloromethyl dẫn tới với việc khử clo.(v) Loại bỏ nhóm halogen khỏi phân tử qua việc hình thành của một liên kết đôi (vi) Loại bỏ nhóm halogen có sự tham xúc tác của hydratase [38] Hiện nay cách thức để thu nhận enzym dehalogen chủ yếu là nuôi cấy các chủng vi sinh vật trong môi trường dinh dưỡng có bổ sung cơ chất là dẫn xuất halogen làm nguồn cung cấp carbon Một số chủng vi khuẩn có khả năng

sản sinh enzym dehalogenase đã được phân lập như Methylobacterium sp HJ1(Jing

và Huyop;2007, 2008) [24], Pseudomonas putida (Motosugi và cộng sự., 1982) [36], Xanthobacter autotrophicus GJ10 (Janssen và cộng sự, 2005) [26],

Pseudomonas B6P (Mesri và cộng sự,2009) [34] và Rhizobium sp (Berry và cộng

sự, 1979) [20] Hầu hết, các vi khuẩn sản sinh dehalogenase đều có hơn 1 loại dehalogenase Cho đến nay chỉ mới phát hiện duy nhất 1 loài có khả năng sản sinh

phân halogenase đó là: Dehalogenase L (DehL), Dehalogenase E (DehE), Dehalogenase D (DehD) để phân hủy các dẫn xuất halogen của axít propionic trong

đó có 2,2 DCPS được phân hủy bởi dehalogenase E [19]

Tùy vào các chủng vi sinh vật khác nhau và vị trí nhóm chlo được cắt trên dẫn xuất hợp chất halogen mà DehE có trọng lượng phân tử khác nhau Hiện nay có

một số DehE đã được phân lập và tinh sạch từ các chủng như: Rhizobium sp có trọng lượng phân tử 32 kDa trên cơ chất 2-chloropropionic acid; Methylobacterium

sp HJ1 có kích thước 36 kDa và là một ―dimer protein‖, hoạt động tốt nhất ở pH 7,2, nhiệt độ 35oC, bị bất hoạt ở 50oC trong vòng 15 phút; Rhizobium sp có kích

thước 62 kDa khi điện di không biến tính [45, 22, 20]

Chương 2 – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu

Các chủng vi sinh vật dùng trong nghiên cứu được tuyển chọn từ các chủng

vi khuẩn phân lập từ mẫu đất thu thập tại khu vực Làng hoa Ngọc Hà – Ba Ðình –

Hà Nội Đây là nơi có sử dụng thường xuyên thuốc bảo vệ thực vật trong việc trồng hoa, và khu tái chế rác thải Triều Khúc Các mẫu sau khi thu thập được bảo quản lạnh và chuyển về phòng thí nghiệm phân tích trong thời gian 24 giờ

2.2 Hóa chất và thiết bị

2.2.1 Hóa chất và môi trường nuôi cấy

 Môi trường chọn lọc MGB (1 lít) [49]

100 ml BS 10 (BS là dung dịch muối khoáng cơ bản)

100 ml TMSS 10 (TMSS là dung dịch muối của các kim loại)

4 20g NaH

2 O 120mg MnSO

2 O 23mg ZnSO

2 O 18mg CoCl

2 O 10mg EDTA 0,5M pH=7,5

 Môi trường Luria Bertani (LB)

Các hóa chất khác trong sử dụng đều có độ tinh sạch cao đảm bảo cho các nghiên cứu phân tích

2.2.2 Máy móc, thiết bị

Các thiết bị chính sử dụng trong nghiên cứu gồm: Nồi khử trùng (ALP - Nhật Bản); Máy lắc (Satorius - Đức), Wibecuse (Hàn Quốc); Tủ cấy vi sinh vật (Aura vertical - Ý); Máy đo mật độ quang học (Bionate - Anh); Cân Kern (Satorius

- Đức); Cân Pressica XT 220A (Ý); Tủ ấm (Memmert - Đức); Máy li tâm sigma 3K30 (Sartorius - Đức); Vortex (Ika - Đức); Tủ sấy (Memmert - Đức); Máy khuấy

từ (Ika - Đức); Nguồn và bể điện di (BIORAD – Mỹ); Nguồn và cột chạy sắc ký trao đổi ion và sắc ký lọc gel; Máy siêu âm phá tế bào; Kính hiển vi điện tử quét JSM-5421LV (Nhật Bản) tại Trung tâm Khoa học vật liệu, Khoa Vật lý, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp thu mẫu

Mẫu đất và nước tại hai khu vực làng hoa Ngọc Hà - Hà Nội và khu tái chế rác thải Triều Khúc được thu vào các falcon bằng các dụng cụ đã khử trùng và đạt quy chuẩn về độ sạch Mẫu đất được lấy ở độ sâu 5cm so với bề mặt, mẫu nước thu

ở khu vực nước đọng

2.3.2 Phương pháp phân lập

 Phương pháp nuôi cấy làm giàu

Các chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy 2,2 DCPS trong mẫu tự nhiên có

số lượng ít nên được làm giàu nhằm tăng số lượng các vi khuẩn có trong mẫu Các mẫu nghiên cứu được nuôi cấy làm giàu 2 lần, 5 ngày/1 lần trên môi trường MGB

có chứa 20mM 2,2 DCPS Mẫu được nuôi lắc trong môi trường MGB, lắc ở 200rpm, 30oC trong vòng 5 ngày Sau 5 ngày, 5ml dịch vi khuẩn đã làm giàu lần 1 được chuyển sang tục làm giàu lần 2 [21]

 Phương pháp cấy gạt

Môi thạch MGB bao gồm các thành phần dung dịch BS 10x, TMSS 10x, thạch agar 20g/l, EDTA 0.5M pH 7,5 và cơ chất 2,2 DCPS với nồng độ cuối cùng là 20mM được đổ vào các đĩa petri sạch Pha loãng dịch nuôi cấy vi khuẩn thành các

độ pha loãng 10-1, 10-2, ,10-6 Sau đó bổ sung 100µl dịch vi khuẩn từ các nồng độ pha loãng trên vào các đĩa thạch MGB, dùng que cấy gạt trải đều cho đến khi bề mặt thạch khô, nuôi ở điều kiện 37oC trong 2 ngày để các khuẩn lạc phát triển

 Phương pháp bảo quản giống

Tinh sạch, ria cấy 3 pha các chủng để thu nhận chủng thuần khiết, sau đó giữ giống trong ống nghiệm môi trường thạch nghiêng

Vi khuẩn được nuôi trong ống thạch nghiêng LB, nuôi ở nhiệt độ phòng Sau khoảng 2-3 ngày khi vi khuẩn đã phát triên tốt được bảo quản ở nhiệt độ 4-6oC để bảo quản Sau 1-2 tháng cấy truyền lại một lần

2.3.3 Phương pháp tuyển chọn các chủng vi sinh vật

Môi trường thạch MGB được bổ sung Bromothymol lue (75mg/l) Đây là chất chỉ thị màu cho khả năng phân giải 2,2 DCPS có sản phẩm tạo ra là Cl- Khi vi khuẩn sử dụng cơ chất 2,2 DCPS dehalogenase sẽ cắt đứt liên kết C-Cl, gắn nhóm

OH- của nước vào vị trí của ion Cl- tạo thành axít HCl làm giảm pH của môi trường, điều đó khiến cho Bromothymol blue từ màu xanh sẽ chuyển sang màu vàng [18] Các chủng vi khuẩn có khả năng tạo màu rõ rệt nhất sau 3 ngày nuôi cấy sẽ được lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo

2.3.4 Phương pháp phân loại chủng vi sinh vật

 Nhuộm Gram

Dựa vào sự khác biệt giữa thành tế bào vi khuẩn Gram (+) và Gram (-) Vi khuẩn Gram (+) có peptidoglican hoạt động như một hàng rào thẩm thấu ngăn cản

sự thất thoát của tinh thể tím [2]

Kết quả khi nhuộm gram vi khuẩn Gram (+) bắt màu xanh tím, vi khuẩn Gram (-) bắt màu đỏ hồng

 Chụp ảnh hiển vi điện tử quét

- Chuẩn bị mẫu vi khuẩn: Các mẫu vi khuẩn được nuôi cấy trên đĩa thạch LB không quá 24 giờ ở 37C

- Gắn mẫu vi khuẩn lên lamen, hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn để cố định mẫu

- Soi và chụp ảnh trên kính hiển vi điện tử quét JSM-5421LV (Nhật Bản) tại phòng Chụp hiển vi điện tử quét - Trung Tâm Khoa Học Vật Liệu - Khoa Vật lý - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

 Giải trình tự gen 16S rRNA

Để xác định sau hơn về cây phát sinh chủng loại chủng H11 chúng tôi đã tiến hành giải trình tự gen mã hóa 16S ARNr của chủng H11 Phương pháp tách chiết, khuếch đại và xác định trình tự ADNr 16S theo quy trình của Sakiyama và cộng sự [43] Trình tự ADNr 16S được phân tích trên phần mềm CLUSTAL X của Thompson và cộng sự [46] Trình tự tham khảo được lấy từ dữ liệu của DDBJ, EMBL và ngân hàng gen Cây phát sinh chủng loại được xây dựng theo Kimura sử dụng phương pháp của Saitou và Nei [30,42]

Các mẫu vi khuẩn được nuôi trên môi trường thạch LB trong vòng 24 giờ sau

đó được giải trình tự bởi Viện Vi Sinh Vật và Công Nghệ Sinh Học, ĐHQG Hà Nội

Phản ứng khuếch đại ADN:

Thành phần phản ứng (l): 10X buffer-10; dNTP 2 mM-10; mồi xuôi 9F (10 pmol/l)-4; mồi ngược (10 pmol/l)-4; Taq polymerase (5u/l)-1; ADN khuôn (50-100g/l)-1-2; H2O đủ 100l

Chu trình nhiệt: 95oC - 3 phút, 35 chu kỳ; 95oC – 30 giây; 55oC - 30 giây ;

72oC - 1 phút 30 giây; 4oC - 

- Mồi cho khuếch đại ADNr 16S

Mồi xuôi 9F: 5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′

Mồi ngược 1492R: 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′

- Mồi cho đọc trình tự : sử dụng 2 mồi 1492R và 800R

800R : 5’-CAGGACTACCAGGGTATCTAAT-3’

2.3.5 Nghiên cứu các đặc điểm hóa sinh của các chủng vi sinh vật

Để kiểm tra khả năng đồng hóa các hợp chất hữu cơ điển hình của các chủng

vi khuẩn, chúng tôi tiến hành thử với Kit thử API 20NE cho vi khuẩn Gram (-) của hãng BioMérieus Hóa chất và thuốc thử được cung cấp cùng với bộ kit tương ứng

Các bước tiến hành:

- Chuẩn bị mẫu vi khuẩn mới, không quá 24 giờ

- Sau khi nuôi cấy tiến hành bổ sung vi khuẩn vào nước cất khử trùng sao cho

OD 600nm đạt giá trị 0,132

- Bổ sung 0,2ml dịch vi khuẩn đã pha loãng vào các giếng từ NO3 (potassium nitrae) đến PNPG (4-nitrophenyl- D-galactopyranoside) bổ sung thêm dầu khoáng vào các ống kí hiệu GLU (D-glucose), ADH (L-arginine), URE (urea)

- Thêm 0,2ml dịch vào các ống API AUX, trộn nhẹ cho đều, rồi bổ sung 0,2ml dịch này vào các ống còn lại từ GLU (D-glucose) đến PAC (phenylacetic axít)

- Đóng hộp, ủ trong 24 giờ

- Sau 24 giờ kiểm tra NO3- bằng thuốc thử NIT 1 và NIT 2, nếu phản ứng dương tính, sau 5 phút dịch trong ống sẽ chuyển thành màu hồng đỏ, nếu âm tính sẽ không có màu Nếu phản ứng âm tính thì cần kiểm tra việc sản xuất nitơ bằng cách

bổ sung thêm 2-3mg Zn2+ Sau 5 phút nếu dịch trong ống không màu thì là phản ứng dương tính, nếu chuyển sang màu hồng là âm tính

- Kiểm tra TRP (L-tryptophane) bằng cách thêm 1 giọt thuốc thử JAMES, phản ứng dương tính sẽ cho màu hồng ngay tức khắc; ESC (esculin ferric citrate) kết quả dương tính cho màu đen, âm tính cho màu vàng; GEL (gelatin) dương tính cho màu đen bị khuếch tán