Luận văn thạc sĩ Hóa phân tích, Phương pháp sắc kí, Anthocyanin, Chemical Engineering and Technology, Chemistry, Analytic -- Methodology.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --- VŨ THỊ HƯƠNG QUỲNH XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ANTHOCYANIN TRONG MỘT SỐ LOẠI RAU BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ Chuyên ngành: Hóa phân tích

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

VŨ THỊ HƯƠNG QUỲNH

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ANTHOCYANIN TRONG MỘT SỐ LOẠI RAU

BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS NGUYỄN XUÂN TRUNG

Hà Nội – 2015

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhất đến PGS.TS Nguyễn Xuân Trung, NCS Vũ Thị Trang đã giao đề tài, chỉ dẫn tận tình và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm luận văn

Tôi in được g i lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo Viện ki m nghiệm

An toàn vệ sinh th c ph m Quốc gia, các anh chị trong Khoa chất lượng ph gia và chất h trợ chế biến th c ph m - Viện Ki m nghiệm an toàn vệ sinh th c ph m Quốc gia đã quan tâm, giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi được học tập và nghiên c u trong môi trường hiện đại

Tôi in bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô giảng dạy tại khoa Hoá, đặc biệt là các thầy cô trong bộ môn Hoá Phân tích đã cho tôi những kiến th c quý giá trong quá trình học tập và th c hiện đề tài này

Cuối c ng, tôi in g i lời biết ơn sâu s c tới gia đình, bạn b đã luôn bên cạnh chia s kh khăn, động viên và giúp đỡ tôi trong học tập cũng như trong cuộc sống

Do thời gian th c hiện đề tài c hạn nên không tránh những thiếu s t, rất mong nhận được ý kiến đ ng g p c a thầy cô và các bạn đ luận văn này được hoàn thiện hơn

Hà Nội, ngày 30 tháng 11 năm 2015

Học viên

Vũ Thị Hương Quỳnh

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Giới thiệu chung về anthocyanin 3

1.1.1 Cấu trúc h a học c a anthocyanin 3

1.1.2 Tính chất c a anthocyanin 5

1.1.3 Tác d ng c a anthocyanin 6

1.1.4 S phân bố c a anthocyanin 7

1.2 Một số phương pháp xác định anthocyanin 8

1.2.1 Phương pháp pH vi sai 8

1.2.2 Phương pháp s c ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 9

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 13

2.1 Mục tiêu 13

2.2 Nội dung nghiên cứu 13

2.3 Đối tượng nghiên cứu 13

2.4 Chất chuẩn, hoá chất, thiết bị 13

2.4.1 Chất chu n 13

2.4.2 Hoá chất 13

2.4.3 Thiết bị 14

2.5 Phương pháp nghiên cứu 15

2.6 Thẩm định phương pháp 16

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17

3.1 Tối ưu các điều kiện xác định anthocyanin trên hệ thống HPLC 17

3.1.1 Chọn detector 17

3.1.2 Chọn bước s ng phát hiện 18

3.1.3 Chọn cột tách 19

3.1.4 Chọn th tích bơm mẫu 20

3.1.5 Khảo sát thành phần pha động 21

3.1.6 Khảo sát nồng độ a it trong pha động 22

3.1.7 Khảo sát chương trình r a giải 23

3.1.8 Khảo sát tốc độ pha động 27

3.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu 28

3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng c a thời gian đến quá trình th y phân 30

3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng c a nhiệt độ đến quá trình th y phân 31

3.2.3 Khảo sát tỷ lệ dung môi chiết mẫu 33

3.3 Thẩm định phương pháp phân tích 34

3.3.1 Tính đặc hiệu/chọn lọc 34

3.3.2 Khoảng tuyến tính 36

3.3.3 Độ lặp lại 38

3.3.4 Độ thu hồi 40

3.4 Ứng dụng phương pháp xác định anthocyanin trong một số rau củ 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Cấu trúc c a 6 chất phổ biến nhất trong nh m anthocyanin 4

Bảng 1.2: Thông tin chung về 3 chất nghiên c u 4

Bảng 1.3: Hàm lượng Anthocyanin tổng c trong một số mẫu th c vật tại Việt Nam [7] 8

Bảng 3.1: Ảnh hưởng c a cột tách đến độ rộng đáy pic (W) và thời gian lưu (tR) 20

Bảng 3.2: Ảnh hưởng c a thành phần pha động đến độ rộng đáy pic (W), thời gian lưu (tR), độ phân giải (RS) c a del, cya, pel 21

Bảng 3.3: R a giải chất phân tích theo chế độ đẳng dòng 23

Bảng 3.4: Chương trình gradient 1 24

Bảng 3.5: Chương trình gradient 2 25

Bảng 3.6: Chương trình gradient 3 25

Bảng 3.7: Chương trình gradient 4 26

Bảng 3.8: Ảnh hưởng c a chương trình gradient đến hệ số đối ng pic 27

Bảng 3.9: Ảnh hưởng c a tốc độ dòng đến thơi gian lưu và chiều cao pic 27

Bảng 3.10: Hàm lượng các chất theo thời gian th y phân 31

Bảng 3.11: Hàm lượng các chất tại các nhiệt độ th y phân khác nhau 32

Bảng 3.12: Hàm lượng các chất tại các tỷ lệ dung môi chiết khác nhau 33

Bảng 3.13: Nồng độ và diện tích pic trung bình c a các chất 36

Bảng 3.14: Kết quả so sánh giữa giá trị a với giá trị 0 c a phương trình đường chu n c a 3 anthocyanin 38

Bảng 3.15: Độ lặp lại trên nền mẫu b p cải tím 39

Bảng 3.16: Độ lặp lại trên nền mẫu khoai lang tím 39

Bảng 3.17: Độ thu hồi trên nền mẫu rau dền đỏ 40

Bảng 3.18: Độ thu hồi trên nền mẫu c dền 41

Bảng 3.19: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng c a các chất phân tích 43

Bảng 3.20: Kết quả phân tích một số mẫu rau c 43

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1: Cấu trúc cơ bản aglycon c a anthocyanin 3

Hình 1.2: S ph thuộc cấu trúc anthocyanin vào pH 5

Hình 2.1: Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC 14

Hình 3.1: Phổ hấp th c a delphinidin 18

Hình 3.2: Phổ hấp th c a cyanidin 18

Hình 3.3: Phổ hấp th c a pelargonidin 18

Hình 3.4: S c ký đồ c a dung dịch chu n 3 chất với cột s c kí 1 19

Hình 3.5: S c ký đồ c a dung dịch chu n 3 chất với cột s c kí 2 20

Hình 3.6: S c ký đồ r a giải các anthocyanin với thành phần pha động là nước và ACN 21

Hình 3.7: S c ký đồ del, cya tại các nồng độ a it trifloa etic khác nhau 22

Hình 3.8: S c ký đồ c a h n hợp dung dịch chu n với chương trình gradient 1 24

Hình 3.9: S c ký đồ h n hợp dung dịch chu n với chương trình gradient 2 25

Hình 3.10: S c ký đồ h n hợp dung dịch chu n với chương trình gradient 3 25

Hình 3.11: S c ký đồ h n hợp dung dịch chu n với chương trình gradient 4 26

Hình 3.12: Hàm lượng các chất khi th y phân trong thời gian khác nhau (60, 90, 120, 150 phút) 30

Hình 3.13: Hàm lượng các chất tại nhiệt độ th y phân khác nhau 32

Hình 3.14: Hàm lượng các chất theo phần trăm HCl 2 N trong dung môi chiết mẫu 33

Hình 3.15: S c ký đồ dung dịch chu n h n hợp 35

Hình 3.16: S c ký đồ c a mẫu rau không ch a anthocyanin 35

Hình 3.17: S c ký đồ c a mẫu rau không ch a anthocyanin được thêm chu n h n hợp 35

Hình 3.18: Đường chu n bi u thị mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ delphinidin 36

Hình 3.19: Đường chu n bi u thị mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ cyanidin 37

Hình 3.20: Đường chu n bi u thị mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ pelargonidin 37

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AOAC Association of Official Analytical

Community

Hiệp hội cộng đồng phân tích chính th c

HPLC High performance liquid

HPTLC High performance thin layer

chromatography

S c ký lớp mỏng hiệu năng cao

RSD Relative standard deviation Độ lệch chu n tương đối

S/N Signal to noise ratio Tỷ lệ tín hiệu chia cho

nhiễu

MỞ ĐẦU

Ngày nay, do ảnh hưởng c a điều kiện sống như: ô nhiễm môi trường, tiếng

ồn, căng thẳng, lo l ng hay s d ng các th c ph m ch a nhiều chất o y h a đã tạo điều kiện làm gia tăng gốc t do, kéo theo sau đ là s gia tăng các dạng o y hoạt động Các dạng o y hoạt động gia tăng, gây ra nhiều phản ng bất lợi, tổn thương cho cơ th và là nguyên nhân c a nhiều căn bệnh nan y Những nghiên c u tìm hi u

về các chất c khả năng chống o y h a mang lại những tác d ng tốt, c lợi cho s c khỏe con người đang ngày càng phát tri n

Chất chống o y h a là những “chiến binh tốt” chống lại các chất độc hại - các gốc t do Chúng được hình thành một cách t nhiên như là một sản ph m ph c a quá trình sống liên quan tới o y Các chất chống o y h a c khả năng giải ph ng ra những điện t , chúng vô hiệu h a khả năng oxy h a c a các gốc t do và ngăn chặn chúng tấn công các tế bào khỏe mạnh Đ bảo vệ chính mình, cơ th luôn t sản sinh ra các cơ chế chống o y h a thiết yếu, nhưng với thời gian chúng dần trở nên kém hiệu quả theo tuổi tác Đây là lý do tại sao mà việc s d ng các chất chống o y

h a cũng như các th c ph m ch a chất chống o y h a là rất quan trọng [3], [11] Ngày nay, th c ăn không chỉ đảm bảo đ calo, ngon, sạch, mà còn phải ch a các hoạt chất sinh học t nhiên cần cho s c kho và s c đẹp, không chỉ điều khi n được các ch c năng hoạt động c a từng bộ phận trong cơ th , tạo cho con người khả năng miễn dịch cao, chống s lão hoá, tăng tuổi thọ, mà còn giúp phòng chống được một số bệnh, k cả ung thư Theo các nghiên c u thì các hợp chất anthocyanin

có các hoạt tính rất tốt như: chống viêm, chống ơ vữa động mạch, c chế đông t

ti u cầu, chống ung thư, thúc đ y hình thành cytokin điều hòa phản ng miễn dịch,

ác không cao Việc phân tích riêng l từng hợp chất trong nhóm anthocyanin trong đối tượng mẫu th c vật là cơ sở đ đánh giá hoạt tính chống o y hoá c a từng chất trong nhóm, đề uất nguồn nguyên liệu cho chế biến th c ph m ch c năng Xuất phát từ th c tiễn trên, chúng tôi đặt vấn đề nghiên c u đề tài:

“Xác định hàm lượng Anthocyanin trong một số loại rau bằng phương pháp sắc ký”

Với các m c tiêu sau đây:

1 Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định hàm lượng Anthocyanin trong một số loại rau bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

2 Áp dụng quy trình kỹ thuật đã xây dựng phân tích một số mẫu rau trên thị trường

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu chung về anthocyanin

Các anthocyanin thuộc một trong những nh m các chất màu t nhiên flavonoid tan trong nước lớn nhất trong thế giới th c vật Thuật ngữ anthocyanin

b t nguồn từ tiếng Hy Lạp, trong đ anthocyanin là s kết hợp giữa Anthos – nghĩa

là hoa và Kyanos – nghĩa là anh thẫm [27] Tuy nhiên, không chỉ c màu anh,

anthocyanin còn mang đến cho th c vật nhiều màu s c r c rỡ khác như hồng, đỏ, cam và các gam màu trung gian [30]

1.1.1 Cấu trúc hóa học của anthocyanin

Anthocyanin là những glycozit do gốc đường glucozơ, glactozơ kết hợp với gốc aglycon c màu (anthocyanidin) Các anthocyanin khi mất hết nh m đường được gọi là anthocyanidin hay aglycon M i anthocyanidin c th bị glycosyl h a acylate bởi các loại đường và các axit khác tại các vị trí khác nhau Aglycon c a chúng c cấu trúc cơ bản được mô tả trong hình 1.1 Các gốc đường c th được

g n vào vị trí 3,5,7; thường được g n vào vị trí 3 và 5 còn vị trí 7 rất ít Phân t anthocyanin g n đường vào vị trí 3 gọi là monoglycozit, ở vị trí 5 và 7 gọi là diglycozit S khác biệt giữa chúng là số lượng các nh m hydro y, bản chất và số lượng các gốc đường liên kết với cấu trúc c a chúng Đến nay c những báo cáo

c a hơn 500 anthocyanin khác nhau và 23 anthocyanidin, tuy nhiên trong đ chỉ c sáu chất phổ biến nhất là pelargonidin, peonidin, cyanidin, malvidin, petunidin và delphinidin [30] Trong đề tài này, chúng tôi ác định pelargonidin, cyanidin, delphinidin trong rau c

Hình 1.1: Cấu trúc cơ bản aglycon của anthocyanin

Bảng 1.1: Cấu trúc của 6 chất phổ biến nhất trong nhóm anthocyanin

H H Pelargonidin Glucozơ Pelargonidin 3-glucozit

H H Pelargonidin Glucozơ Glucozơ Pelargonidin 3,5-diglucozit

OH H Cyanidin Glucozơ Glucozơ Cyanidin 3,5-diglucozit

OH OH Delphinidin Glucozơ Delphinidin 3-glucozit

OH OH Delphinidin Glucozơ Glucozơ Delphinidin 3,5-diglucozit OCH3 OH Petunidin Glucozơ Petunidin 3-glucozit

OCH3 OH Petunidin Glucozơ Glucozơ Petunidin 3,5-diglucozit

OCH3 H Peonidin Glucozơ Glucozơ Peonidin 3,5-diglucozit OCH3 OCH3 Malvidin Glucozơ Malvidin 3-glucozit

OCH3 OCH3 Malvidin Glucozơ Glucozơ Malvidin 3,5-diglucozit Các aglycon c a anthocyanin khác nhau chính là do các nh m g n vào vị trí R1 và

R2, thường là H, OH hoặc OCH3

Bảng 1.2: Thông tin chung về 3 chất nghiên cứu

Tên hóa học 3,5,7,3’,4’,5’- hexa

hydroxy flavylium

3,5,7,3’,4’- penta hydroxy flavylium

3,4’,5,7-tetra hydroxy flavylium

1.1.2 Tính chất của anthocyanin

Anthocyanin tinh khiết ở dạng tinh th hoặc vô định hình là hợp chất khá phân

c c nên tan tốt trong dung môi phân c c

Anthocyanin hòa tan tốt trong nước, etanol, metanol,… Trong đ khả năng tan trong CH3OH – HCl và C2H5OH – HCl là tương đương nhau và cao nhất [6]

Màu s c anthocyanin thay đổi ph thuộc vào nhiệt độ, các chất màu và nhiều yếu tố khác,… Khi tăng số lượng nh m OH trong vòng benzen thì màu càng xanh đậm

M c độ metyl h a các nh m OH ở vòng benzen càng cao thì màu càng đỏ Nếu nh m OH ở vị trí th ba kết hợp với các gốc đường thì màu s c cũng sẽ thay đổi theo số lượng các gốc đường được đính vào nhiều hay ít [30]

Các anthocyanin cũng ph thuộc rất mạnh vào pH c a môi trường:

- Khi pH > 7 các anthocyanin có màu xanh và khi pH < 7 các anthocyanin có màu đỏ

- Ở pH = 1 các anthocyanin thường ở dạng muối o onium màu cam đến đỏ

- Ở pH = 4÷5 chúng c th chuy n về dạng bazơ cacbinol hay bazơ chalcon không màu

- Ở pH = 7÷8 lại về dạng bazơ quinoidal anhydro màu xanh

Hình 1.2: Sự phụ thuộc cấu trúc anthocyanin vào pH

Màu s c c a anthocyanin còn c th thay đổi do hấp th ở trên polysaccarit Khi đun n ng lâu dài các anthocyanin c th phá h y và mất màu

Anthocyanin c bước s ng hấp th trong miền nhìn thấy, khả năng hấp th c c đại tại bước s ng 510–540 nm Độ hấp th quang là yếu tố liên quan mật thiết đến màu s c c a các anthocyanin, ph thuộc vào pH c a dung dịch, nồng độ anthocyanin: thường pH thuộc v ng axit mạnh c độ hấp th quang lớn Nồng độ anthocyanin càng lớn độ hấp th quang càng mạnh

Như vậy, trong môi trường axit, các anthocyanin là những bazơ mạnh và c

th tạo muối bền vững với axit Anthocyanin cũng c khả năng cho muối với bazơ Như vậy chúng c tính chất lưỡng tính Muối với axit thì c màu đỏ, còn muối với kiềm thì c màu anh

1.1.3 Tác dụng của anthocyanin

Trong th c vật, anthocyanin c tính kháng khu n, kháng nấm, c vai trò tạo điều kiện cho s th phấn, phát tán do hình thành nên màu s c sặc sỡ trên cành hoa

và quả Mặt khác, anthocyanin là chất c khả năng hấp th tia UV cho phép bảo vệ

bộ gen c a th c vật trước nh m tác nhân c th gây đột biến gen này Sinh tổng hợp anthocyanin ở vỏ được tăng cường đ đáp ng ph hợp với môi trường: hạn hán, ánh sáng mạnh, nhiệt độ cao, thiếu nitơ và phốt pho, nhiễm nấm, vi khu n, tổn thương, côn tr ng, ô nhiễm…[20], [36]

Đối với s c khỏe c a con người, theo nghiên c u c a G C Cretu và cộng s [15], các anthocyanin c th c t được cơn đau tim, giảm thi u các tổn thương não liên quan đột quỵ và ngăn cản s tạo thành các c c máu đông trong lòng mạch máu (nguyên nhân dẫn đến t c mạch, gây tai biến mạch máu não và những cơn nhồi máu

cơ tim đột ngột), hạn chế s suy giảm s c đề kháng Các nhà khoa học cũng đã

ch ng minh được rằng anthocyanin c tác d ng tốt trong chống lão h a, ngăn ngừa

s phát tri n c a các khối u, bướu, hạn chế nguy cơ bị đột quỵ, giảm nguy cơ m c ung thư… Khi tiêm một lượng nhỏ anthocyanin chiết uất từ khoai lang vào các tế bào ung thư ruột già, chất này đã ch ng tỏ khả năng ngăn chặn tế bào ung thư phát tri n Các nhà nghiên c u cũng phát hiện trong một số trường hợp về s biến đổi cấu trúc c a các phân t anthocyanin cũng làm tăng khả năng chống ung thư c a chúng Các nghiên c u còn cho thấy anthocyanin còn c tác d ng tốt trong việc điều hòa lượng đường huyết c a những bệnh nhân đái tháo đường Khả năng chữa

bệnh c a anthocyanin vẫn đang được nghiên c u đ tìm hi u cơ chế và ng d ng trong y học Các ng d ng trên đã mở ra một tri n vọng về việc sản uất th c ph m, dược ph m ch c năng chữa bệnh c hiệu quả [14]

Trong lĩnh v c th c ph m, với khả năng chống o y h a cao, anthocyanin được

s d ng đ bảo quản th c ph m, kháng khu n, kháng nấm, chống o y h a cho th c

ph m [35] Kết quả nghiên c u cho thấy, với một lượng nhỏ nguyên liệu vỏ khoai lang (1% khối lượng), khả năng bảo quản c a các sản ph m th c ph m c ch a mỡ được kéo dài khá lâu và c th so sánh với chất chống o y h a tổng hợp butylated hydro yanisol là chất chống o y hoá, h n hợp hai đồng phân: 2-tert-butyl-4-hydroxy anisole và 3-tert-butyl-4-hydroxy anisole [35] Ngoài các tác d ng chống oxy hóa, anthocyanin còn được s d ng như chất màu t nhiên tạo ra nhiều màu s c hấp dẫn cho th c ph m và khá an toàn Ví d , dịch chiết anthocyanin từ các loại rau

c c màu đỏ như vỏ quả nho, dâu tây, vỏ khoai lang… đã được d ng đ làm chất màu thay thế màu tổng hợp trong sản uất kẹo c ng [36]

Anthocyanin bên cạnh vai trò là màu thiên nhiên được s d ng trong th c

ph m, còn là hợp chất c nhiều hoạt tính sinh học quý như: khả năng chống o y h a cao, chống lão h a, tăng cường s c đề kháng, làm bền thành mạch, chống viêm, hạn chế s phát tri n c a các tế bào ung thư, tác d ng chống các tia ph ng ạ [19], [20]

1.1.4 Sự phân bố của anthocyanin

Anthocyanin tập trung ở những cây hạt kín và những loài ra hoa, phần lớn nằm ở hoa và quả, ngoài ra cũng c ở lá và rễ Trong những loại th c vật này, anthocyanin được tìm thấy ch yếu ở các lớp tế bào nằm bên ngoài như bi u bì Các hợp chất anthocyanin uất hiện rộng rãi trong khoảng ít nhất 27 họ, 73 loài và trong vô số giống th c vật s d ng làm th c ph m [20] Các họ th c vật như vitaceae (họ nho) và rosaceae (họ hoa hồng) là các nguồn anthocyanin ch yếu Bên cạnh đ còn c các họ th c vật khác như solanaceae (cà tím), sa ifragaceae (quả lý

đỏ và đen), ericaceae (quả việt quất) và brassicaceae (b p cải tím) Các loại anthocyanin phổ biến nhất là các glycozit c a cyanidin, kế đến là pelargonidin, peonidin và delphinidin, sau đ petuidin và maldivin Số lượng các 3–glycozit nhiều gấp 2,5 lần các 3,5–glycozit Loại anthocyanin hay gặp nhất chính là cyanidin-3-

glycozit [33]

Bảng 1.3: Hàm lượng Anthocyanin tổng có trong một số mẫu thực vật tại Việt Nam [7]

Hàm lượng anthocyanin tổng

(%)

2 Lá chua, b p giấm (Hibiscus sabdariffa L.) 1,49

3 Hoa c a loài chuối tiêu (Musa pardisiaca L.) 0,34

5 Lá c a loài tía tô (Perilla frutescens (L.) Britt.) 1,72

6 C c a loài khoai lang tím (Ipomoea batatas (L.) Poir.) 0,46

8 Lá c a loài mơ leo (Paederia scandens (Lour.)

Merr.)

1,05

9 Lá c a loài rau dền tía (Amaranthucs tricolor L.) 1,74

1.2 Một số phương pháp xác định anthocyanin

Ở Việt Nam và trên thế giới, việc ác định hàm lượng anthocyanin trong th c

ph m n i chung và trong rau c n i riêng là vấn đề đang rất được quan tâm Nhiều nhà khoa học tiến hành nghiên c u ác định hợp chất này bằng nhiều phương pháp khác nhau Dưới đây là một số phương pháp phổ biến đã được tiến hành th c nghiệm

1.2.1 Phương pháp pH vi sai

Tác giả Huỳnh Thị Kim Cúc và cộng sự [2] đã ác định hàm lượng

anthocyanin tổng trong một số nguyên liệu rau quả (quả dâu, b p cải tím, lá tía tô, trà đỏ, vỏ quả nho, vỏ quả cà tím) bằng phương pháp pH vi sai Hàm lượng anthocyanin trong quả dâu là 1,188%; b p cải tím: 0,909%; lá tía tô: 0,397%; trà đỏ: 0,335%; vỏ quả nho: 0,564%; vỏ cà tím: 0,441%

Tác giả Phạm Thị Thanh Nhàn và cộng sự [7] đã tách chiết và phân tích hàm

lượng anthocyanin trong một số loài th c vật Tác giả đã trình bày một số dung môi tách chiết anthocyanin và kết quả ác định hàm lượng anthocyanin trong một số

nguyên liệu tươi bằng phương pháp pH vi sai Hàm lượng anthocyanin toàn phần ở thân cây ngô non là 0,59%; lá chua 1,49%; hoa chuối 0,34%; lá cây hoa s i 0,56%;

lá huyết d 1,28%; quả dâu ta 1,75%; lá tía tô 1,72%; c khoai lang tím 0,46%; vỏ quả nho 1,27%; lá mơ 1,05%; lá rau dền tía 1,74%

Tác giả Nguyễn Thị Hiển và cộng sự [5] đã nghiên c u chiết uất chất màu

anthocyanin từ đài hoa b p giấm bằng phương pháp so màu và phương pháp pH vi sai, đã ác định được các điều kiện tối ưu cho quá trình chiết chất màu là dung môi etanol:nước = 50:50 bổ sung 1% HCl; tỉ lệ dung môi/nguyên liệu là 14 ml/g; thời gian chiết 6 ngày, tiến hành ở nhiệt độ phòng Bằng phương pháp chiết phân đoạn, các tác giả đã tách được chất màu thô anthocyanin từ dịch chiết c a đài hoa b p giấm và ác định được hàm lượng chất màu trong nguyên liệu khô là 15,2%, tương

ng trong nguyên liệu tươi là 1,06%

1.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Hiện nay, HPLC là một phương pháp tách và phân tích các hợp chất được s

d ng rộng rãi và phổ biến nhất Do phương pháp này c độ nhạy tương đối cao, c khả năng định lượng tốt, thích hợp cho việc tách các hợp chất kh bay hơi hoặc dễ

bị phân h y nhiệt Đồng thời phương pháp này cũng c phạm vi ng d ng trải rộng trong nhiều lĩnh v c từ nghiên c u khoa học, trong các phòng thí nghiệm đến công nghiệp và một số lĩnh v c khác

Phương pháp này rất ph hợp cho việc ác định anthocyanin trong th c ph m

n i chung Do đ , n được s d ng rộng rãi ở nhiều phòng thí nghiệm Đã c rất nhiều công trình nghiên c u ng d ng phương pháp này đ ác định anthocyanin

Bhornchai Harakotr [12] đã ác định 4 anthocyanin, 7 hợp chất phenolic trong

ngô tím s d ng HPLC/DAD Các anthocyanin chính được tìm thấy trong ngô tím bao gồm: cyanidin-3-glucozit, cyanidin-3-(6’-malonyl glucozit) và cyanidin-3-(3’,6’-dimalonyl glucozit) Hầu hết các anthocyanin được tìm thấy ở dạng acylated anthocyanin (chiếm 46,2-88% hàm lượng tổng anthocyanin) mà được s d ng rất hiệu quả làm chất màu th c ph m bởi tính bền màu c a chúng Nghiên c u cũng chỉ

ra ngô tím là nguồn cung cấp các chất c hoạt tính sinh học và nguồn cung cấp hiệu quả các chất chống o y h a t nhiên ph c v hữu ích cho một số ngành công

nghiệp: th c ph m ch c năng, ph gia th c ph m và mỹ ph m

Nafiz Oncu Can và cộng sự [29] đã nghiên c u phương pháp ác định nhanh 6

anthocyanin phổ biến nhất trong th c ph m Các dạng 3-glycozit c a pelargonidin, cyanidin, peonidin, delphinidin, petunidin và malvidin được tách và định lượng bằng HPLC-DAD trong 18 phút s d ng nội chu n aglycon cyanidin Quá trình lý mẫu đơn giản với việc hòa tan trong nước, lọc và bơm vào máy s c ký Tác giả tập trung l a chọn điều kiện s c ký tối ưu đ tách và định lượng các chất Giới hạn phát hiện cho 6 anthocyanin trong khoảng 3,92-19,26 ng/ml Hàm lượng anthocyanin trong các mẫu rau, quả tươi và sản ph m chế biến trong khoảng 0-1837 µg/g và hàm lượng anthocyanin trong rau quả tươi cao hơn trong các sản ph m đã qua chế biến Phương pháp ph hợp đ ác định nhanh anthocyanin trong các sản ph m c hàm lượng trong khoảng 80-420 ng/ml với độ đúng 99,2 ± 0,2% và độ ch m trung bình 0,8%

Yafang Shao [37] ác định các axit phenolic, anthocyanin và hoạt tính chống

o y h a c a chúng trong gạo (Oryza sativa) Tác giả đã ác định đồng thời 11 axit

phenolic bằng HPLC/DAD và ác nhận bằng LC/MS/MS Hàm lượng phenolic tổng trong các loại gạo khác nhau: gạo tr ng (14,6-33,4 mg/100 g), gạo đỏ (66,8-422,2 mg/100 g), gạo đen (56,5-82,0 mg/100 g) Chỉ c gạo đen được phát hiện

ch a anthocyanin (26,5-174,7 mg/100 g) bao gồm 2 loại chính: cyanidin-3-glucozit

và peonidin-3-glucozit

Antonieta Ruiz [10] đã ác định đồng thời 22 anthocyanin dạng liên kết trong

một số loại bery dại ở phía nam Patagonian bằng HPLC-DAD-ESI-MS/MS Chiếm hàm lượng cao nhất là delphinidin (22,91-35,99 µmol/g), petunidin (16,11-21,40 µmol/g ) và malvidin (13,70 µmol/g)

Francesca Leri [18] đã ác định đồng thời anthocyanin, coumarin và axit

phenolic trong quả, hạt và rượu c a các loài cây họ mơ mận (Prunus mahaleb L)

Tác giả s d ng các kỹ thuật HPLC/DAD, HPLC/MS và HPLC/MS/MS đ nhận biết và ác định được ba nh m phenolic đặc trưng gồm: các dẫn uất axit phenolic

(hợp chất chính là o-coumaric axit glucozit), quercetin glycozit và anthocyanin

(cyanidin 3,5-diglucozit, cyanidin 3-sambubiozit, cyanidin 3-xylosyl-rutinozit và cyanidin 3-rutinozit) Coumarin chiếm hàm lượng cao trong hạt (0,87 mg/g),

flavonoid tập trung trong vỏ và thịt quả (0,55 mg/g) Trong sản ph m truyền thống

sản uất từ P.mahaleb, anthocyanin chiếm tới 16,5%, axit phenolic chiếm 43,3%,

coumarin 36,2% và flavonoid 4% c a tổng các chất `

Fumi Tatsuzawa và cộng sự [32] đã khảo sát một dãy liên tiếp 8 giống hoa c

màu s c khác nhau ch a anthocyanin đ ác định mối quan hệ giữa màu s c hoa và thành phần anthocyanin trong một họ Tác giả s d ng các điều kiện phân tích như sau: cột C18Waters (250 x 4,6 mm, 5 µm); pha động: A (H3PO4 1,5%) B (H3PO41,5%, CH3COOH 20% trong h n hợp CH3CN-H2O (25-75); tốc độ dòng: 1,0 ml/phút; nhiệt độ cột: 400C; detector: PDA ở bước s ng 530 nm Mẫu được th y phân bằng HCl ở nhiệt độ 900C trong 2 giờ, lọc sau đ chạy s c ký

Zhe Zhang và cộng sự [38] đã phát tri n phương pháp HPLC đ phân tích các

anthocyanin và anthocyanidin trong dịch chiết quả việt quất D a trên việc kết hợp phương pháp HPLC với detector khối phổ đã ác định được 11 anthocyanin trong dịch chiết quả việt quất, trong đ chuy n đổi được 5 aglycon anthocyanin lớn là: delphinidin, cyanidin, petunidin, peonidin và malvidin M i một aglycon c th tách rời hoàn toàn và phân tích định lượng chính ác với các tiêu chu n bên ngoài Tác giả s d ng cột Beckman Ultrasphere ODS (250 x 4,6 mm, 5 µm) Pha động A: 0,4% TFA trong nước và B: 0,4% TFA trong acetonitril Các điều kiện gradient là: 0-6 phút, 15% B; 6 - 20 phút, 15-22% B; và 20-35 phút, 22-30% B Các điều kiện

s c ký như sau: tốc độ dòng chảy 1 ml/phút; nhiệt độ cột 35°C; bước s ng phát hiện

525 nm; th tích tiêm mẫu 20 µl Phương pháp cho độ chính ác cao, độ lệch chu n tương đối (RSD) cho tổng anthocyanidin là 1,8% đối với phương pháp HPLC và 0,3% cho phương pháp th y phân

Tác giả Veridiana Vera de Rosso và các cộng sự [31] đã tiến hành nghiên c u

các anthocyanin từ hai loại trái cây nhiệt đới nổi tiếng là quả sơ ri và quả acai bằng phương pháp s c ký lỏng hiệu năng cao kết nối với mảng đi-ốt quang và detector khối phổ 2 lần (HPLC–PDA–MS/MS) Cột: Shim-pack CLCODS C18 (250 × 4,6

mm, 5 µm); pha động: axit fomic 5% - MeOH (85:15); tốc độ dòng: 1ml/phút; nhiệt độ cột: 250C; th tích tiêm: 20 µL Chiết bằng MeOH c 0,5% HCl đ qua đêm ở 500C; lọc trước khi chạy s c ký Kết quả chỉ ra hàm lượng anthocyanin tổng

trong trái cây sơ ri là 6,5-7,6 mg/100 g

Delphinidin, cyanidin, pelargonidin là 3 anthocyanin trong số 6 anthocyanin phổ biến nhất Trong t nhiên, chúng thường tồn tại dưới dạng glucozit, có nhiều tác giả l a chọn phân tích dạng glucozit c a các anthocyanin này Khi đ quá trình

x lý mẫu chỉ bao gồm giai đoạn hoà tan trong nước và phân tích tr c tiếp trên hệ thống s c ký lỏng Tuy nhiên, các glucozit c a các anthocyanin rất đa dạng (vài

ch c chất), đ phân tích được các dạng này khá ph c tạp Do đ , l a chọn tối ưu hiện nay là chuy n các dạng glucozit về dạng t do bằng quá trình thuỷ phân trong môi trường axit Delphinidin, cyanidin, pelargonidin trong mẫu sau khi thuỷ phân

về dạng t do thường c hàm lượng cao (khoảng mg/100 g), c bước sóng phát hiện chọn lọc trong vùng VIS nên l a chọn phương pháp HPLC với detector PDA đ tách và định lượng Hệ thống HPLC-PDA phổ biến trong các phòng thí nghiệm hiện nay nên khả năng ng d ng cao

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM

2.1 Mục tiêu

- Xây d ng được quy trình phân tích 3 chất: delphinidin, cyanidin, pelargonidin thuộc nh m anthocyanin c trong một số mẫu rau c bằng kỹ thuật s c

ký lỏng hiệu năng cao HPLC

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát tìm các điều kiện tối ưu phân tích delphinidin, cyanidin, pelargonidin bằng phương pháp s c ký lỏng hiệu năng cao HPLC

- Khảo sát ây d ng quy trình lý mẫu tách chiết các chất delphinidin, cyanidin, pelargonidin khỏi các loại rau c

- Xác nhận giá trị s d ng c a phương pháp

- Áp d ng quy trình phân tích các mẫu th c tế

2.3 Đối tượng nghiên cứu

Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành nghiên c u phương pháp ác định hàm lượng c a delphinidin, cyanidin, pelargonidin trong một số loại rau c bằng phương pháp HPLC

Đối tượng mẫu nghiên c u là các rau c như: b p cải tím, khoai lang tím, rau dền đỏ, c dền, tía tô… Các mẫu phân tích được lấy ngẫu nhiên trên địa bàn thành phố Hà Nội

2.4 Chất chuẩn, hoá chất, thiết bị

(TFA) (Merck)

- Nước cất 2 lần lọc qua bộ lọc màng 0,45 µm sau đ rung siêu âm

Dung dịch chất chuẩn gốc delphinidin 100 ppm : hòa tan 1,0 mg chất chu n

delphinidin với khoảng 5 ml CH3OH, chuy n toàn bộ vào bình định m c 10 ml rồi thêm CH3OH tới vạch định m c ở nhiệt độ phòng, l c kỹ Bảo quản ở điều kiện lạnh, tránh ánh sáng

Dung dịch chuẩn gốc pelargonidin 100 ppm : Hòa tan 5,0 mg chất chu n với

khoảng 20 ml CH3OH rồi chuy n vào bình định m c 50 ml, rồi thêm CH3OH tới vạch định m c ở nhiệt độ phòng, l c kĩ ta được dung dịch chu n nồng độ 100 ppm Bảo quản ở điều kiện lạnh, tránh ánh sáng

Dung dịch chuẩn gốc cyanidin 100 ppm: Hòa tan 1,0 mg chất chu n cyanidin

với khoảng 5 ml CH3OH, chuy n toàn bộ vào bình định m c 10 ml rồi thêm

CH3OH tới vạch định m c ở nhiệt độ phòng, l c kỹ Bảo quản ở điều kiện lạnh, tránh ánh sáng

- Dung dịch chu n làm việc: hút chính ác 1,0 ml từng dung dịch chu n gốc ở trên vào bình định m c 10 ml, thêm CH3OH vừa đ

- Các dung dịch chu n c nồng độ nhỏ hơn được pha từ dung dịch chu n làm việc

2.4.3 Thiết bị

Hình 2.1: Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC

Hình 2.2: Sơ đồ khối của một máy HPLC

- Hệ thống s c ký lỏng hiệu năng cao HPLC Shimadzu (LC 20AD) trang bị detector PDA

- Cột s c ký XBridge® BEH C18 (100 mm 4,6 mm; 2,6 µm) và tiền cột tương ng

- Cân kỹ thuật XT1200 c độ chính ác 0,01g

- Cân phân tích Mettler Toledo c độ chính ác 0,0001 g

- Máy đo pH: pH Meter 744

- Máy l c siêu âm Elma (Germany)

- Máy ly tâm HermLe Z383K

- Máy l c Vorte IKA

- Máy xay Philips 600W

Hệ thống cấp

dung môi Bơm Bộ phận tiêm mẫu

Cột s c ký Detector

Hệ thống thu

nhận và lý số

liệu (máy ghi,

thời gian thí nghiệm và mẫu dễ bị ảnh hưởng bởi các yếu tố bên ngoài trong quá trình lý Các anthocyanin trong nền mẫu thường tồn tại ở dạng liên kết với các gốc đường Đ phân tích tất cả các dạng này sẽ tốn nhiều thời gian và kinh phí Việc thuỷ phân các dạng liên kết đ đưa về dạng aglycon là cần thiết Phương pháp HPLC cho phép tách và định lượng riêng l từng chất Đây là phương pháp hiện đại,

c độ tin cậy cao, c tính ng d ng rộng rãi

Trong phạm vi và thời gian nghiên c u, chúng tôi th c hiện ác nhận giá trị s

d ng c a phương pháp thông qua việc đánh giá các thông số: tính chọn lọc, khoảng tuyến tính và đường chu n, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng, độ đúng (thông qua hiệu suất thu hồi), độ ch m (thông qua độ lặp lại)

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Tối ưu các điều kiện xác định anthocyanin trên hệ thống HPLC

Anthocyanin là hợp chất c khả năng hấp th bước s ng trong v ng t ngoại

và khả kiến, c cấu trúc vòng ch a nhiều nối đôi, c khả năng hấp th UV-VIS mạnh, đây là cơ sở đ chúng tôi th c hiện định lượng bằng phương pháp HPLC với detector PDA

Trong nghiên c u này, đ quy trình ây d ng được c khả năng ng d ng rộng, chúng tôi l a chọn detector mảng đi-ốt quang (photodiode array - PDA), loại detector phổ biến trong cấu hình tiêu chu n c a thiết bị HPLC hiện tại Ưu đi m c a detector này là quét được phổ UV-VIS c a các chất phân tích trong khoảng bước

s ng đã chọn, ki m tra s tinh khiết c a pic s c ký và định danh pic bằng cách so sánh phổ tương ng c a đỉnh s c ký với phổ c a một ngân hàng dữ liệu hoặc với phổ c a chất chu n biết trước [1], [4]

C th s d ng detector UV-VIS đ thay thế Tuy nhiên, detector PDA c nhiều ưu đi m hơn là c khả năng quét được một dải bước s ng và em được hình dạng phổ c a chất phân tích Hơn nữa, trong rau c nghiên c u c ch a rất nhiều các chất thuộc nh m anthocyanin c khả năng hấp th tại bước s ng 520 nm, nếu chỉ d a vào thời gian lưu đ khẳng định chất đ là anthocyanin c th dễ bị nhầm lẫn Vì vậy, khi kết hợp giữa thời gian lưu và hình dạng phổ hấp th c th khẳng định chính ác chất cần phân tích Do đ , trong nghiên c u này chúng tôi đã s

d ng detector PDA đ ác định chất phân tích

Chúng tôi nhận thấy 3 anthocyanin trên c bước s ng hấp th tương đối gần nhau: 513 nm, 526 nm, 529 nm nên khi tiến hành định lượng đồng thời cả 3 chất chúng tôi quyết định l a chọn bước s ng chung là 520 nm làm bước s ng phát hiện

3.1.3 Chọn cột tách

Cột s c ký c vai trò quan trọng trong việc tách các chất phân tích ra khỏi nhau,

n được ví như trái tim c a hệ thống s c ký Hiện nay s c ký pha đảo được s d ng rộng rãi do tính phổ biến, tính kinh tế và c hiệu quả cao Hệ này c th tách các chất

c độ phân c c đa dạng từ rất phân c c, ít phân c c đến không phân c c Ngoài ra trên cấu trúc c a anthocyanin còn c nhiều nhóm –OH t do, phân c c mạnh và dễ dàng tan với dung môi phân c c khác như nước, metanol, etanol,…thích hợp cho việc tiến hành

s c ký trên cột s c ký pha đảo Do đ chúng tôi l a chọn hệ s c ký pha đảo, ph hợp với điều kiện phòng thí nghiệm chúng tôi tiến hành khảo sát 1 số cột pha đảo, phổ biến nhất là cột C18 Chúng tôi chọn khảo sát 2 loại cột C18 và tiền cột tương ng đ tiến hành tách một số anthocyanin

Cột 1: Loại cột C18 c chiều dài cột 150 mm; đường kính trong 4,6 mm; cỡ hạt

Delphinidin Cyanidin Pelargonidin

W (phút)

t R (phút)

W (phút)

t R (phút)

W (phút)

t R (phút)

C18(150x4,6x5) 13439 2,0 7,28 1,8 13,11 1,0 18,10 C18(100x4,6x2,6) 17230 1,5 8,95 1,2 13,37 0,8 17,35

D a vào bảng 3.1, hình 3.4 và hình 3.5 chúng tôi nhận thấy cả 2 cột đều tách được chất phân tích, tuy nhiên cột s c kí 2 (100 mm x 4,6 mm; 2,6 µm) c độ rộng đáy pic hẹp hơn, pic s c kí nhọn hơn Do đ , chúng tôi quyết định chọn cột C18 (100

mm 4,6 mm; 2,6 µm) làm cột pha tĩnh đ tiến hành tách các anthocyanin

3.1.4 Chọn thể tích bơm mẫu

Trên th c tế, một trong những kh khăn c a phép tách s c ký là: s doãng chân pic dẫn đến hiện tượng chồng pic Trong đ th tích bơm mẫu vào cột cũng là một nguyên nhân gây ra hiện tượng này, nếu vòng mẫu quá dài, lượng mẫu bơm vào cột quá lớn sẽ dẫn đến hiện tượng doãng pic càng lớn, các pic càng chèn lên nhau trong khi tách [8] Đ là do, lượng mẫu quá lớn sẽ dẫn đến hiện tượng một phần mẫu vào cột tách trước, một phần ra sau dẫn đến trong quá trình tách trên cột

sẽ có một phần chất phân tích ra trước và một phần ra sau gây ra hiện tượng doãng chân pic Nếu th tích bơm mẫu là quá nhỏ thì sai số cũng sẽ rất lớn Ví d nếu sai

số c a van bơm mẫu là 0,05 l, khi bơm th tích mẫu là 1 l thì sai số sẽ là 5%, còn nếu th tích mẫu bơm là 50 l thì sai số là 0,1% Ngày nay, van bơm mẫu 6 chiều

rất phổ biến, do đ , chúng tôi l a chọn loại van này và th tích mẫu bơm là 10 l

3.1.5 Khảo sát thành phần pha động

Trong s c ký pha đảo, các dung môi được l a chọn phổ biến là nước, acetonitril và metanol Các pha động khác nhau c độ phân c c khác nhau dẫn đến khả năng r a giải khác nhau Chúng tôi đã tiến hành khảo sát thành phần pha động

là nước với acetonitril hoặc metanol cho thấy ở bất kỳ tỉ lệ nào c a nước với acetonitril hoặc metanol đều không r a giải được các anthocyanin

Hình 3.6: Sắc ký đồ rửa giải các anthocyanin với thành phần pha động là nước và ACN

Do cấu tạo c a các anthocyanin c nhiều nh m OH nên đ r a giải các anthocyanin ra khỏi cột C18 thì pha động phải c độ phân c c cao Tham khảo một

số tài liệu [31], [38], chúng tôi l a chọn 2 a it là axit axetic và axit trifloaxetic thêm vào thành phần pha động cho kết quả như sau:

Bảng 3.2: Ảnh hưởng của thành phần pha động đến độ rộng đáy pic (W), thời gian

Nhận ét: Khi thành phần pha động c bổ sung axit axetic hoặc axit trifloaxetic thì các anthocyanin được r a giải ra khỏi cột Tuy nhiên, khi s d ng axit trifloaxetic cho pic s c ký hẹp cân đối, độ rộng đáy pic nhỏ, độ phân giải giữa hai pic liền kề lớn Điều này c th do pKa c a a it trifloa etic nhỏ hơn pKa c a axit axetic nên axit trifloaxetic c tính chất a it cao gấp 34 lần so với a it a etic Do

đ , chúng tôi l a chọn pha động ch a axit trifloaxetic

3.1.6 Khảo sát nồng độ axit trong pha động

Sau khi l a chọn được thành phần pha động ch a axit trifloaxetic, chúng tôi khảo sát tỉ lệ axit trifloaxetic trong pha động với các nồng độ: 0,025%; 0,05%; 0,1% thu được kết quả sau:

C18 hiện tại c khoảng pH hoạt động từ 2-7 Dung dịch a it trifloaxetic 0,1% có pH

= 1,8-2 là khoảng pH giới hạn c a cột, làm cho hiệu l c c a cột giảm, khả năng r a giải và hình dạng pic kém Mặt khác, khi hoạt động nhiều ở điều kiện pH thấp, tuổi thọ c a cột giảm Do đ , chúng tôi không khảo sát tại các m c nồng độ a it > 0,1%

Đ đảm bảo độ nhạy, hình dạng pic s c ký cân đối, chúng tôi l a chọn nồng độ a it trong pha động là 0,05%

3.1.7 Khảo sát chương trình rửa giải

Cố định pha động bao gồm 2 thành phần tối ưu là acetonitril và axit trifloaxetic, chúng tôi tiến hành khảo sát chương trình r a giải Trong s c ký lỏng c hai chế độ r a giải hiện nay là chế độ isocratic (đẳng dòng) và gradient Chế độ đẳng dòng c thành phần pha động được giữ cố định trong suốt quá trình chạy Chế

độ gradient c thành phần pha động thay đổi theo thời gian Ở các tỉ lệ pha động khác nhau, l c r a giải khác nhau ph thuộc vào độ phân c c c a dung môi và thành phần dung môi theo công th c [8]:

Minutes 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00

0.0000 0.0002 0.0004 0.0006 0.0008 0.0010 0.0012 0.0014

Minutes 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 16.00 17.00 18.00 19.00 20.00 21.00 22.00 23.00 24.00 25.00 26.00 27.00 28.00 29.00

Nhận ét: Tại tỉ lệ pha động là 90/10 với độ phân c c dung môi PI = 9,74 chưa

r a giải được các anthocyanin ra khỏi cột Tại tỉ lệ pha động 75/25 với độ phân c c dung môi PI = 9,06 đã r a giải được các anthocyanin nhưng chưa tách được hoàn toàn và pic s c ký bị doãng Tỉ lệ 85/15 với độ phân c c dung môi PI = 9,64 các anthocyanin đã tách nhau tương đối rõ ràng nhưng pic pelargonidin ra chậm (19,3 phút) gây doãng pic (độ rộng chân pic gần 4 phút) làm giảm độ nhạy c a phương pháp Như vậy, chế độ đẳng dòng không ph hợp đ tách các chất trong c ng nh m

do tính chất và độ phân c c c a các chất gần nhau Đ tách được hoàn toàn các anthocyanin trong thời gian ph hợp, chúng tôi khảo sát chương trình r a giải gradient

 Chế độ r a giải gradient: Chúng tôi tiến hành thay đổi chương trình r a giải gradient với hệ pha động CF3COOH 0,05 % - CH3CN

Hình 3.11: Sắc ký đồ hỗn hợp dung dịch chuẩn với chương trình gradient 4

Nhận ét: Khi s d ng chương trình gradient, các anthocyanin đã tách nhau hoàn

toàn, tuy nhiên hình dạng pic s c ký tại các chương trình khác nhau cho kết quả khác nhau Đ đánh giá pic s c ký đẹp và cân đối, chúng tôi s d ng hệ số đối ng pic theo công th c:

Bảng 3.8: Ảnh hưởng của chương trình gradient đến hệ số đối xứng pic

Nhận xét: Bảng 3.8 cho thấy với chương trình gradient 4 cho kết quả pic s c

ký có hệ số đối x ng pic là đẹp nhất Do đ chúng tôi l a chọn chương trình r a giải gradient 4 s d ng hệ pha động là dung dịch axit trifloaxetic 0,05% - acetonitril

đ tiến hành chạy s c ký

3.1.8 Khảo sát tốc độ pha động

Tốc độ pha động cũng g p phần ảnh hưởng tới hiệu quả tách s c ký vì nó liên quan đến quá trình thiết lập cân bằng c a chất tan trong hai pha tĩnh và pha động Khi tốc độ pha động nhỏ, chất phân tích ra muộn, gây doãng pic, giảm độ nhạy và tốn dung môi Khi tốc độ pha động quá lớn c th làm cho chất phân tích chưa tách

ra khỏi nhau đã bị đ y ra khỏi cột dẫn đến hiện tượng chồng pic và gây áp suất lớn trong bơm Ph hợp với thông số cột (100 mm x 4,6 mm x 2,6 µm), chúng tôi khảo sát khả năng tách c a các anthocyanin ở các tốc độ: 0,5 ml/phút; 0,4 ml/phút; 0,3 ml/phút thu được kết quả sau:

Bảng 3.9: Ảnh hưởng của tốc độ dòng đến thơi gian lưu và chiều cao pic

Tốc độ dòng

(ml/phút)

0,5 ml/phút 8,715 10,301 12,381 90274 79019 110387

0,4 ml/phút 9,874 11,656 14,276 70037 58836 100140

0,3 ml/phút 11,541 13,405 16,676 60885 65836 99739 Nhận ét: Cột s c ký được s d ng là cột hạt nhỏ (2,6 µm) nên áp suất đầu cột tương đối lớn Đ đảm bảo độ bền c a cột và áp suất hệ thống, chúng tôi không khảo sát ở các tốc độ cao hơn 0,5 ml/phút Với tốc độ dòng trong khoảng 0,3–0,5 ml/phút, khi tốc độ dòng giảm, thời gian lưu c a các anthocyanin giảm gây doãng

pic và làm giảm tín hiệu (th hiện qua chiều cao pic) Do đ , chúng tôi l a chọn tốc

độ dòng 0,5 ml/phút đ tách các anthocyanin

Tóm lại, các thông số tối ƣu cho quá trình chạy sắc ký là:

- Cột pha tĩnh: cột XBridge® BEH C18 (100 mm 4,6 mm; 2,6 µm) và tiền cột tương ng

3.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu

D a vào khả năng hòa tan c a anthocyanin và tham khảo nhiều bài báo [6], [10], [12] chúng tôi khảo sát khả năng chiết anthocyanin từ nền mẫu bằng cách th y phân mẫu ở nhiệt độ 500C, 600C, 700C, 800C với thời gian 60 phút, 90 phút, 120 phút, 150 phút, bằng h n hợp dung môi sau đây: metanol- dung dịch axit clohydric

2 M với các tỷ lệ như sau: 90:10; 85:15; 80:20; 75:25

Sơ đồ 1: Qui trình xử lý mẫu dự kiến

Quy trình chiết anthocyanin cho đối tượng phân tích là rau c d kiến gồm các bước sau:

- Đồng nhất mẫu: nghiền, ay mẫu

- Cân chính ác khoảng 10 g mẫu sau khi đồng nhất vào ống ly tâm 50 ml

- Thêm khoảng 35 ml dung môi chiết h n hợp MeOH – dung dịch HCl 2 M vào ống ly tâm

- L c vorte , rung siêu âm 15-30 phút ở nhiệt độ phòng

- Th y phân mẫu

- Ly tâm 5 phút, tốc độ 6000 vòng/phút

- Gạn lấy phần dịch trong, định m c 50 ml bằng c ng dung môi và lọc qua

Cân ~10 g mẫu vào ống ly tâm 50 ml

Rung siêu âm (15-30 phút ở nhiệt độ phòng)

Lọc qua màng lọc 0,45 µm