Luận văn thạc sĩ Hóa phân tích, Phương pháp định tính, Phương pháp định lượng, Dược liệu.

Chính vì vậy, việc sử dụng các phương pháp quang phổ UV-VIS, IR, huỳnh quang,… để phân tích định lượng một thành phần trong dược liệu gặp nhiều khó khăn và hầu như là không thể thực hiện

1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NGUYỄN THỊ HÀ LY

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG CÁC HOẠT CHẤT CHÍNH TRONG DƯỢC LIỆU HÀ THỦ Ô

ĐỎ FALLOPIA MULTIFLORA (THUNB.) HARALDSON

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2013

2

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NGUYỄN THỊ HÀ LY

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG CÁC HOẠT CHẤT CHÍNH TRONG DƯỢC LIỆU HÀ THỦ Ô

ĐỎ FALLOPIA MULTIFLORA (THUNB.) HARALDSON

Chuyên ngành: Hóa phân tích

3

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên cho em gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Phương Thiện Thương và PGS.TS Tạ Thị Thảo đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài và viết luận văn

Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo Viện Dược liệu và các anh chị, các bạn công tác tại khoa Hoá phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu

đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi được học tập và nghiên cứu trong môi trường hiện đại

Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô giáo giảng dạy tại khoa Hoá, đặc biệt là các thầy cô trong bộ môn Hoá Phân tích, đã cho em những kiến thức quý giá trong quá trình học tập và thực hiện đề tài này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn các anh chị, bạn bè của tập thể lớp cao học hoá k22, đặc biệt là những người bạn trong nhóm hoá phân tích k22 đã giúp đỡ, chia sẻ những khó khăn trong suốt quá trình tôi học tập và thực hiện đề tài này

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên, chia sẻ mọi khó khăn cùng tôi

Hà Nội, tháng 12 năm 2013

Học viên

Nguyễn Thị Hà Ly

4

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU……… 01

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 03

1.1.Tổng quan về dược liệu hà thủ ô đỏ……… 03

1.1.1 Cây hà thủ ô đỏ……… 03

1.1.2 Dược liệu hà thủ ô đỏ……… 04

1.1.2.1 Thành phần hoá học……… 04

1.1.2.2 Công dụng và tác dụng sinh học của hà thủ ô đỏ………… 05

1.2 Tổng quan về các phương pháp phân tích thành phần hóa học……… 07

1.2.1 Các phương pháp phân tích thành phần hóa học của dược liệu …… 07

1.2.2 Phân tích thành phần hóa học của dược liệu hà thủ ô đỏ ………… 08

1.2.3 Kiểm nghiệm dược liệu hà thủ ô đỏ….……… 11

1.3 Các phương pháp xử lý mẫu dược liệu……… 12

1.4 Các vấn đề cần giải quyết……… 13

1.5 Mục tiêu nghiên cứu……… 14

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 15

2.1 Đối tượng nghiên cứu……… 15

2.2 Chất chuẩn, hóa chất, thiết bị……… 16

2.2.1 Chất chuẩn……… 16

2.2.2 Hóa chất……… 17

2.2.3 Thiết bị, dụng cụ……… 17

2.3 Phương pháp nghiên cứu.………… ……… 18

2.3.1 Chuẩn bị dung dịch mẫu chuẩn và mẫu đối chiếu……… 18

2.3.2 Phương pháp xử lý mẫu……… 18

2.3.3 Phương pháp phân tích……… 19

2.4 Nghiên cứu điều kiện tối ưu và đánh giá phương pháp phân tích………… 21

2.4.1 Phương pháp nghiên cứu các điều kiện tối ưu cho quá trình phân tích HPLC……… 21

5

2.4.2 Đánh giá phương pháp phân tích……… 22

2.4.2.1 Đánh giá độ lặp lại và tái lặp lại……… 22

2.4.2.2 Đánh giá độ đúng của phương pháp……… 22

2.4.3 Phân tích mẫu thực tế……… 23

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24

3.1 Nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện đo của hệ thống sắc ký……… 24

3.1.1 Khảo sát bước sóng hấp thụ cực đại của các chất nghiên cứu….… 24

3.1.2 Khảo sát thành phần pha động……… 25

3.1.3 Khảo sát ảnh hưởng pH của pha động và loại axit dùng trong pha động……… 32

3.1.4 Khảo sát ảnh hưởng của thể tích mẫu tiêm vào cột……… 36

3.1.5 Điều kiện tối ưu cho quá trình tách các anthaquinon và stilben…… 38

3.1.6 Định tính các hợp chất THSG, RV và EM trong mẫu hà thủ ô đỏ… 38 3.2 Đường chuẩn, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng……… 39

3.2.1 Khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn……… 39

3.2.2 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng……… 42

3.2.3 Đánh giá phương trình đường chuẩn……… 43

3.2.3.1 Kiểm tra sự khác nhau có nghĩa giữa hệ số a và giá trị 0… 43

3.2.3.2 Kiểm tra sự sai khác giữa b và b′……… 45

3.3 Khảo sát phương pháp xử lý mẫu……… 46

3.3.1 Khảo sát tỷ lệ dung môi chiết……… 47

3.3.2 Khảo sát phương pháp chiết siêu âm……… 48

3.3.2.1 Khảo sát nhiệt độ chiết siêu âm……… 48

3.3.2.2 Khảo sát thời gian chiết siêu âm……… 48

3.3.3 Khảo sát phương pháp chiết hồi lưu……… 49

3.3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ chiết hồi lưu……… 49

3.3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết và số lần chiết…… 50

3.3.4 Phương pháp xử lý mẫu dược liệu hà thủ ô đỏ……… 51

3.4 Đánh giá phương pháp phân tích……… 52

6

3.4.1 Đánh giá độ đúng của phương pháp……… 52

3.4.1.1 Đánh giá độ thu hồi của phương pháp……… 52

3.4.1.2 Đánh giá sự sai khác giữa giá trị phân tích lại và giá trị thêm chuẩn……… 54

3.4.2 Đánh giá độ lặp lại và tái lặp lại……… 55

3.4.2.1 Đánh giá độ lặp lại của thiết bị……… 55

3.4.2.2 Đánh giá độ chụm, độ lệch chuẩn lặp lại và tái lặp của phương pháp phân tích……… 56

3.5 Phân tích mẫu thực tế……… 58

3.5.1 Mẫu dược liệu hà thủ ô đỏ……… 58

3.5.2 Mẫu sản phẩm từ hà thủ ô đỏ……… 61

BÀN LUẬN……… 63

KẾT LUẬN……… 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO

7

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 2.1: Thông tin về các mẫu phân tích……… 16

Bảng 2.2: Chương trình dung môi rửa giải……… 21

Bảng 3.1: Các gradient thử nghiệm với pha động MeOH – nước……… 27

Bảng 3.2: Thời gian lưu, độ phân giải và hệ số đối xứng pic của các cấu tử ứng với từng chế độ gradient……… 27

Bảng 3.3: Các gradient thử nghiệm với pha động ACN – nước……… 29

Bảng 3.4: Thời gian lưu, độ phân giải và hệ số đối xứng pic của các cấu tử ứng với từng chế độ gradient……… 29

Bảng 3.5: Các gradient thử nghiệm với pha động ACN – nước chứa 0,01% axit photphoric……… 31

Bảng 3.6: Thời gian lưu, độ phân giải và hệ số đối xứng pic của các cấu tử ứng

với từng chế độ gradient……… …… 31

Bảng 3.7: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH (axit axetic)……… 34

Bảng 3.8: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH (axit fomic)……… 34

Bảng 3.9: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH (axit photphoric)………… 35

Bảng 3.10: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thể tích mẫu tiêm vào cột……… 37

Bảng 3.11: Nồng độ và diện tích pic trung bình của các chất……… 40

Bảng 3.12: Phương trình đường chuẩn của các chất……… 41

Bảng 3.13: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của các chất……… 43

Bảng 3.14: Kết quả so sánh giữa giá trị a với giá trị 0 của phương trình đường

chuẩn THSG……… 44

Bảng 3.15: Kết quả so sánh giữa b và b′ trong phương trình đường chuẩn

của THSG……… 45

Bảng 3.16: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi chiết……… 47

Bảng 3.17: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ chiết siêu âm……… 48

Bảng 3.18: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết siêu âm……… 49

Bảng 3.19: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ chiết hồi lưu……… 50

8

Bảng 3.20: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết và số lần chiết……… 51

Bảng 3.21: Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi đối với phương pháp phân tích THSG……… 54

Bảng 3.22: Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi đối với phương pháp

phân tích EM……… 54

Bảng 3.23: Kết quả phân tích lặp lại các mẫu dược liệu hà thủ ô đỏ thêm chuẩn… 55

Bảng 3.24: Các đại lượng thống kê……… 55

Bảng 3.25: Độ lặp lại thời gian lưu và diện tích pic của các chất……… 56

Bảng 3.26: Kết quả hàm lượng THSG và EM tìm lại được bằng phương pháp

thêm chuẩn của 3 kỹ thuật viên khác nhau……… 56

Bảng 3.27: Các dữ kiện thống kê đánh giá độ lặp lại của phương pháp phân

tích tiến hành bởi ba kỹ thuật viên khác nhau……… 57

Bảng 3.28: Các dữ kiện đánh giá độ tái lặp lại của phương pháp phân tích……… 58

Bảng 3.29: Kết quả phân tích mẫu dược liệu hà thủ ô đỏ……… 59

Bảng 3.30: Kết quả phân tích mẫu sản phẩm hà thủ ô của công ty Traphaco……… 61

9

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Hình ảnh cây hà thủ ô đỏ……….……… 03

Hình 1.2: Hình ảnh dược liệu và phiến dược liệu hà thủ ô đỏ……… 04

Hình 1.3: Công thức cấu tạo một số thành phần hóa học trong dược liệu hà thủ ô đỏ……… 05

Hình 2.1: Hình ảnh dược liệu hà thủ ô đỏ và sản phẩm từ hà thủ ô đỏ……… 16

Hình 3.1: Phổ UV-VIS của các chất……… 24

Hình 3.2: Sắc ký đồ HPLC đối với các chế độ gradient thử nghiệm với

hệ dung môi MeOH – nước……… 28

Hình 3.3: Sắc ký đồ HPLC đối với các chế độ gradient thử nghiệm với

hệ dung môi ACN – nước……… 30

Hình 3.4: Sắc ký đồ HPLC đối với các chế độ gradient thử nghiệm với

hệ dung môi ACN – nước chứa 0,01% axit photphoric……… 32

Hình 3.5: Sắc ký đồ định tính THSG, RV, EM trong mẫu hà thủ ô đỏ……… 39

Hình 3.6: Khoảng tuyến tính……… 40

Hình 3.7: Đường chuẩn các chất……… 41

Hình 3.8: Sắc ký đồ HPLC phân tích định lượng THSG (A) và EM (B) trong các mẫu dược liệu hà thủ ô đỏ……… 60

Hình 3.9: Sắc ký đồ HPLC phân tích định lượng THSG (A) và EM (B) trong mẫu thuốc T-TPC……… 62

Abs Absorbance: Độ hấp thụ quang

AS Asymmetry factor: Hệ số đối xứng pic

DĐTQ Dược Điển Trung Quốc

HPLC-DAD/FLD Sắc ký lỏng ghép nối detector PDA và phát quang

HPLC-DAD-APCI/MSn

Sắc ký lỏng ghép nối detector PDA và khối phổ với hệ ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển

LOD Limit of Detection: Giới hạn phát hiện

LOQ Limit of Quantitation: Giới hạn định lượng

PDA Photo-diode-array: Mảng điot điện tử

ppm Parts per million: Phần triệu

ppb Parts per billion: Phần tỷ

ppt Parts per trillion: Phần nghìn tỷ

R Correlation coefficient: Hệ số tương quan

RS Resolution: Độ phân giải

RP-HPLC Reverse phase-HPLC: Sắc ký lỏng pha đảo

% RSD % Relative standard deviation: % Độ lệch chuẩn tương đối

% RSDR % Reproducibility standard deviation: % Độ lệch chuẩn tái

lặp tương đối

SD Standard deviation: Độ lệch chuẩn

tR Retention time: Thời gian lưu

THSG 2,3,5,4′-tetrahydroxystilben-2-O-β-D-Glucosid

UV-VIS Ultraviolet-Visible: Tử ngoại và khả kiến

VWD Variable Wavelength Detector

IR Infrared: Hồng ngoại

Tuy nhiên, hiện nay trên thị trường, vị thuốc quý này đang bị giả mạo bằng một số loại rễ củ như: hà thủ ô trắng, củ nâu, củ cọc hoặc tình trạng người sử dụng mua phải dược liệu rác đã bị chiết hết các hoạt chất, gây ảnh hưởng đến sức khoẻ người bệnh và quyền lợi người tiêu dùng Vì vậy, việc nghiên cứu đánh giá chất lượng, tiêu chuẩn hoá dược liệu hà thủ ô đỏ là vấn đề hết sức cần thiết

Ở Việt Nam, qui định chính thống việc kiểm tra chất lượng dược liệu hà thủ

ô đỏ còn rất sơ sài Chuyên luận hà thủ ô đỏ trong Dược Điển Việt Nam IV (2009)

chỉ quy định hàm lượng chất chiết được trong etanol 30%, tiêu chí đánh giá này không phản ánh được chính xác chất lượng dược liệu hà thủ ô đỏ Trên thế giới đã

có rất nhiều công trình nghiên cứu về phương pháp phân tích định tính, định lượng dược liệu hà thủ ô đỏ Trong đó, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) thường được sử dụng nhất bởi độ nhạy tốt, phù hợp với đối tượng phân tích là dược liệu và giá thành không quá cao Dược Điển Trung Quốc (2010) có sử dụng phương

pháp này để định lượng hai thành phần emodin và

2,3,5,4′-tetrahydroxystilben-2-O-β-D-glucosid trong dược liệu hà thủ ô đỏ, là tiêu chí đánh giá chất lượng dược liệu

hà thủ ô đỏ

12

Trong phạm vi luận văn thạc sĩ “Nghiên cứu xây dựng phương pháp định

tính, định lượng các hoạt chất chính trong dược liệu hà thủ ô đỏ Fallopia

multiflora (Thunb.) Haraldson” chúng tôi tiến hành khảo sát các điều kiện HPLC

thích hợp để định tính, định lượng các hoạt chất chính trong dược liệu hà thủ ô đỏ Sau đó, áp dụng phương pháp này để đánh giá chất lượng dược liệu hà thủ ô đỏ và các sản phẩm chế biến từ hà thủ ô đỏ Kết quả của nghiên cứu này nhằm gợi ý cho việc nâng cấp chuyên luận dược liệu hà thủ ô đỏ trong Dược Điển Việt Nam IV

Mục tiêu nghiên cứu:

 Xây dựng được phương pháp định tính ba hợp chất

13

CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về dược liệu hà thủ ô đỏ

1.1.1 Cây hà thủ ô đỏ

Hà thủ ô đỏ có tên khoa học là: Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson,

thuộc họ Rau răm (Polygonaceae), bộ Cẩm chướng (Caryophyllales), còn có một số

tên khác như: dạ giao đằng, dạ hợp

Cây hà thủ ô đỏ là loại dây leo, sống nhiều năm Thân mềm, nhẵn, mọc xoắn vào nhau Rễ phình thành củ, màu nâu đỏ, củ nguyên có hình giống như củ khoai lang Lá mọc so le, hình mũi tên, gốc hình tim, đầu thuôn nhọn, dài 5-8 cm, rộng 3-

4 cm; 3-5 gân xuất phát từ gốc lá, hai mặt nhẵn, mặt trên sẫm bóng; cuống dài khoảng 2 cm, phủ lông tơ, bẹ chìa mỏng, ngắn, có lông dài Cụm hoa mọc ở kẽ lá hoặc đầu cành thành chùy phân nhánh, dài hơn lá; lá bấc ngắn; hoa nhỏ nhiều, màu trắng; nhị 8, thường dính vào gốc của bao hoa Quả hình 3 cạnh, nhẵn bóng, nằm trong bao hoa mà 3 mảnh ngoài phát triển thành những cánh rộng Mùa hoa từ tháng 9-11; mùa quả từ tháng 12-2 hàng năm Bộ phận dùng là rễ củ của cây [3],[8]

Hình 1.1: Hình ảnh cây hà thủ ô đỏ

Ở Việt Nam, hà thủ ô đỏ chỉ có ở một số vùng núi cao (từ 1000 m trở lên) phía bắc, mọc nhiều ở Hà Giang, Lai Châu, Lào Cai, Sơn La Các tỉnh ít gặp hơn như Hòa Bình (Mai Châu, Đà Bắc), Thanh Hóa (Sơn Bá Mười), Nghệ An (Kỳ Sơn), Lạng Sơn (núi Mẫu Sơn), Cao Bằng (Bảo Lạc), Yên Bái (Mù Cang Chải) Hà thủ ô

đỏ là loại cây ưa khí hậu ẩm mát của vùng cận nhiệt đới và nhiệt đới núi cao, cây ưa sáng và có thể hơi chịu bóng Nơi mọc tự nhiên thích hợp nhất là các quần thể rừng

14

núi đá vôi, độ cao tới 1700 m, nhiệt độ trung bình quanh năm dưới 20o

C Hà thủ ô

đỏ thường mọc ở đất ẩm, xốp, nhiều mùn, nhất là loại ở chân núi đá [3]

Hà thủ ô đỏ ra quả hàng năm, mỗi cây có thể ra nhiều quả Sau khi quả già, phần thân leo trên mặt đất làm hạt giống phát tán xung quanh và sẽ nảy mầm vào mùa xuân hè năm sau [8]

1.1.2 Dược liệu hà thủ ô đỏ

Dược liệu hà thủ ô đỏ (Radix Fallopia multiflora) là phần rễ củ phơi hay sấy

khô của cây Hà thủ ô đỏ [1], có dạng hình củ tròn, hoặc hình thoi, không đều, củ nhỏ để nguyên, củ to bổ đôi theo chiều dọc, hay chặt thành từng miếng to Mặt ngoài có những chỗ lồi lõm do các nếp nhăn ăn sâu tạo thành Mặt cắt ngang có lớp bần mỏng màu nâu sẫm, mô mềm vỏ màu đỏ hồng, có nhiều bột, ở giữa có ít lõi gỗ

-6-acetyl-7-methyljuglon, emodin-8-O-(6′-O-malonyl)-glucosid; các dẫn xuất stilben

như: resveratrol, 2,3,5,4′-tetrahydroxystilben-2-O-β-D-glucosid,

2,3,5,4′-tetrahydroxystilben- 2,3-di-O-β-D-glucosid [23]; protid; tinh bột; lipid; chất vô cơ; các chất tan trong nước, lecitin, rhaponticin (rhapontin, ponticin) Trong đó,

2,3,5,4′-tetrahydroxystilben-2-O-β-D-glucosid và emodin là các thành phần chính

15

trong hà thủ ô đỏ Dược Điển Trung Quốc (2010) quy định hàm lượng

2,3,5,4′-tetrahydroxystilben-2-O-β-D-glucosid không được thấp hơn 1,0%, hàm lượng emodin và physcion không được thấp hơn 0,1% Đặc biệt, hàm lượng các hoạt chất này thay đổi rõ rệt sau khi chế biến Lúc chưa chế, hà thủ ô đỏ chứa 7,68% tanin; 0,25% dẫn chất anthraquinon tự do; 0,8058% dẫn chất anthraquinon toàn phần Sau khi chế, còn 3,82% tanin; 0,1127% dẫn chất anthraquinon tự do và 0,2496% dẫn chất anthraquinon toàn phần [3]

Hà thủ ô đỏ có vị đắng chát, hơi ngọt, tính bình, có tác dụng bổ huyết, cố tinh, điều hoà khí huyết, bổ gan thận, mạnh gân xương, nhuận tràng Nó được dùng

để điều trị thần kinh suy nhược, ngủ kém, thiếu máu, đau lưng, mỏi gối, di mộng tinh, bạch đới, đại tiểu tiện ra máu, mẩn ngứa Uống lâu làm đen râu tóc đối với người bạc tóc sớm, làm tóc đỡ khô, đỡ rụng [3],[4],[8]

16

Trong y học cổ truyền Trung Quốc, hà thủ ô đỏ sống tươi và khô có tác dụng thông tiểu, giải độc, tiêu ung thũng, chữa táo bón cho phụ nữ sau khi đẻ hoặc người già, mụn nhọn, ghẻ lở, tràng nhạc Hà thủ ô đỏ chế có tác dụng bổ gan thận, ích tinh huyết, dùng làm thuốc an thần, bổ và tăng lực trong các chứng thân thể suy yếu, hoa mắt, chóng mặt, tim hồi hộp, nhức đầu, mất ngủ,… Ở Ấn Độ, rễ hà thủ ô đỏ được dùng làm thuốc bổ và làm đen tóc [3]

Theo y học hiện đại, hà thủ ô đã được chứng minh là có tác dụng làm giảm lượng đường trong máu, chống viêm, chống ho, lợi tiểu, điều kinh, hạ sốt, kích thích tiêu hóa, có tác dụng tốt đối với các trường hợp suy nhược thần kinh, làm tăng hoạt động của tim, làm tăng sự co bóp của ruột, kích thích tiêu hóa, cải thiện dinh dưỡng [3]

Trong hà thủ ô đỏ có ba thành phần hóa học có nhiều tác dụng sinh học lý

thú đã được tìm thấy là 2,3,5,4′-tetrahydroxystilben-2-O-β-D-glucosid, emodin, resveratrol Qua nghiên cứu, các nhà khoa học thấy rằng emodin có nhiều đặc tính đáng quý như:

 Tác dụng làm giảm yếu tố gây bệnh tiểu đường typ 2 [16]

 Tác dụng chống một số căn bệnh ung thư trong đó có cả ung thư tuyến tụy [25], [29], [20]

 Tác dụng bảo vệ hệ thần kinh, ngăn ngừa độc tính của các glutamat [17]

 Tác dụng an thần, chống rối loạn thần kinh cho bệnh nhân tâm thần phân liệt Các anthraquinon là dẫn xuất của emodin giúp cải thiện sự thiếu hụt của chức năng an thần [33]

 Tác dụng nhanh làm liền vết thương [22]

Các dẫn xuất stilben (2,3,5,4′-tetrahydroxystilben-2-O-β-D-glucosid, resveratrol) cũng được tìm thấy trong hà thủ ô đỏ với nhiều tác dụng sinh học như:

 Tác dụng chống oxi hóa

 Điều hòa cân nặng

 Tác dụng trên tim mạch [22]

 Tác dụng chống dị ứng [32]

1.2.Tổng quan về các phương pháp phân tích thành phần hóa học

1.2.1 Các phương pháp phân tích thành phần hóa học của dược liệu

Dược liệu là đối tượng phân tích có thành phần nền phức tạp Thông thường, trong dược liệu không chỉ có một chất, một hỗn hợp chất có tính chất khác nhau, mà thường chứa một nhóm các chất có tính chất tương đối giống nhau (flavonoid, anthraquinon, terpenoid, nhóm các dẫn xuất stilben,…) Các chất trong cùng một nhóm chất đều giống nhau về khung cơ bản, khác nhau một vài nhóm thế hoặc các thành phần khác, tức là khác nhau không nhiều về tính chất vật lý, tính chất hoá học Chính vì vậy, việc sử dụng các phương pháp quang phổ (UV-VIS, IR, huỳnh quang,…) để phân tích định lượng một thành phần trong dược liệu gặp nhiều khó khăn và hầu như là không thể thực hiện được

Sắc ký là một trong những phương pháp xác định hàm lượng các chất thông dụng nhất hiện nay trong phân tích hiện đại Khác với các phép định lượng hoá học,

18

các phương pháp sắc ký cho phép định lượng riêng từng chất cụ thể trong một hỗn hợp, phù hợp với quá trình phân tích các mẫu dược liệu Người ta có thể định lượng một chất hay định lượng đồng thời nhiều chất trong một lần định lượng nếu chọn được điều kiện thích hợp Các phương pháp sắc ký thường dùng là: sắc ký khí (GC), sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký điện di mao quản, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [2] Trong đó, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp có nhiều ứng dụng trong nghiên cứu các hợp chất tự nhiên nói chung và nghiên cứu dược liệu nói riêng Ưu điểm lớn nhất của phương pháp này là có thể phân tích nhiều loại hợp chất khác nhau, nên khả năng phân tích rộng hơn nhiều so với sắc ký khí (thường dùng với các đối tượng dễ bay hơi) Có thể dùng HPLC để phân tích các chất từ phân cực tới không phân cực, từ các chất bay hơi tới các chất không bay hơi,

từ các chất trung tính tới các chất điện ly,…Trong lĩnh vực dược liệu, HPLC thường được sử dụng nhất trong định lượng riêng lẻ các chất trong hỗn hợp phức tạp của dịch chiết dược liệu bằng việc so sánh diện tích pic với chất chuẩn trong cùng điều kiện phân tích Với pha tĩnh ngày càng được hoàn thiện và đổi mới để nâng cao hiệu năng tách, detector ngày càng nhạy, HPLC ngày nay có thể dễ dàng phân tích các chất trong hỗn hợp ở mức ppm tới ppb, thậm chí ppt [2] Với mục tiêu đặt ra là xây dựng một phương pháp phân tích định lượng nhanh, chính xác các hợp chất thuộc nhóm anthraquinon và dẫn xuất stilben trong dược liệu hà thủ ô đỏ, chúng tôi lựa chọn phương pháp nghiên cứu là sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

1.2.2 Phân tích thành phần hóa học của dược liệu hà thủ ô đỏ

Có rất nhiều kỹ thuật HPLC đã được dùng để phân tích các chất thuộc nhóm stilben và anthraquinon như: HPLC – ESI – MS/MS, HPLC – DAD/FLD, HPLC – DAD – APCI/MSn,… Các kỹ thuật này đều hiện đại, đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền nên khó có thể áp dụng rộng rãi ở các đơn vị kiểm nghiệm và sản xuất Kỹ thuật HPLC – UV/VIS khắc phục được những nhược điểm trên vì vậy chúng tôi chọn phương pháp này để phân tích các thành phần hóa học trong dược liệu hà thủ ô đỏ

Một số tác giả [24] đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để xác định EM, THSG, physcion trong mẫu dược liệu hà thủ ô đỏ trên hệ thống HPLC

19

của hãng Agilent, bơm G1311A Quart, bộ đuổi bọt khí G1322A, bộ tiêm mẫu tự động G1313A và detector PDA Quá trình phân tích sử dụng cột phân tích pha đảo Alltima C18 (250 mm x 4,6 mm; 5 μm) Hệ dung môi pha động gồm kênh A là ACN chứa 0,1% axit fomic, kênh B là nước chứa 0,1% axit fomic, sử dụng chế độ rửa giải gradient:

T (phút) 0 – 8 8 – 20 20 – 25 25 – 35

A (%) 23 23 – 70 70 – 75 75 - 100 Tốc độ dòng 1 ml/phút, thể tích mẫu tiêm vào cột là 20 μl và detector được đặt tại bước sóng 290 nm Kết quả cho thứ tự các chất ra khỏi cột là THSG → EM → physcion Tổng thời gian chạy một mẫu là 35 phút Ngoài ra, nghiên cứu này đã đưa

ra một phương pháp xử lý mẫu sử dụng 50 ml MeOH và chiết hồi lưu với 0,3 g mẫu trong 120 phút Các tác giả còn khẳng định rằng phương pháp này cho hiệu suất chiết cao hơn so với các phương pháp chiết soxhlet và chiết siêu âm Phương pháp này đã được thẩm định về tính tuyến tính, độ thu hồi, độ lặp lại và tái lặp lại, độ chụm, giới hạn định lượng và được dùng để đánh giá chất lượng các mẫu dược liệu

hà thủ ô đỏ trên thị trường ở Quảng Đông – Trung Quốc

Nhóm các tác giả [19] cũng đã sử dụng đồng thời hai phương pháp PDA và HPLC-VWD để tách 13 chất thuộc các nhóm anthraquinon, stilben, axit phenolic và flavonoid, nhằm đánh giá chất lượng 3 loài dược liệu thuộc cùng một chi là: hà thủ ô đỏ, cốt khí củ và đại hoàng Các mẫu được chiết siêu âm bằng MeOH 70% trong 60 phút, sau đó lọc qua màng cellulose axetat 0,45 μm để thu được dịch chạy sắc ký HPLC Các chất được dùng để phân tích gồm: axit gallic, epicatechin, piceid, THSG, sennosid A, sennosid B, RV, aloe-emodin, rhein, EM, chrysophanol, physcion, emodin-8-O--D-glucosid Hệ dung môi pha động gồm kênh A là ACN, kênh B là nước chứa 0,1% axit fomic, chế độ rửa giải gradient:

HPLC-T (phút) 0 – 2 2 – 4 4 – 10 10 – 11 11 – 14 14 – 21

B (%) 5 - 10 10 - 15 15 15 - 21 21 21 - 29

T (phút) 21 – 23 23 – 25 25 – 26 26 – 28 28 – 30 30 – 32

B (%) 29 - 40 40 – 50 50 50 – 80 80 - 100 100

20

Tốc độ dòng là 0,8 ml/phút, thể tích mẫu tiêm vào cột là 5 μl Đối với hệ PDA, detector được đặt quan sát tại ba bước sóng 280 nm, 254 nm và 320 nm Đối với hệ HPLC-VWD, detector VWD được đặt theo một chương trình như sau: 0 – 6 phút (280 nm), 6 – 12 phút (320 nm), 12 – 14,5 phút (254 nm), 14,5 – 18 phút (320 nm), 18 – 24 phút (280 nm), 24 – 32 phút (254 nm) Kết quả cho thấy cả hai kỹ thuật sử dụng đều cho độ nhạy tốt, có thể xác định các chất có hàm lượng cỡ ng trong mẫu Kỹ thuật HPLC-PDA vốn được sử dụng rộng rãi do có thể quan sát tại nhiều bước sóng sau một lần phân tích và cho ta nhiều thông tin về đối tượng phân tích hơn detector VWD Tuy nhiên, kỹ thuật HPLC-VWD cho các kết quả về độ chọn lọc, độ chụm và độ tuyến tính tốt hơn so với kỹ thuật HPLC-PDA Điều này được giải thích bởi sử khác nhau về cấu tạo và sơ đồ truyền ánh sáng trong từng loại detector [26]

HPLC-Thêm một nghiên cứu nữa về phương pháp định lượng EM và THSG, theo tài liệu [31], tác giả Yu Jie và các cộng sự đã nghiên cứu và ứng dụng phương pháp HPLC-PDA xác định EM, THSG và physcion trong các mẫu hà thủ ô sống và hà thủ ô chế Sử dụng hệ máy Dionex Ultimate 3000 (Dionex Technologies, USA), cột Zobax SB-C18 (4,6 mm x 250 mm) Pha động gồm kênh A là nước chứa 0,1% axit photphoric (H3PO4) và kênh B là MeOH, sử dụng chế độ rửa giải gradient:

T (phút) 0 – 5 5 – 10 10 – 15 15 – 20 20 – 25

B (%) 40 - 70 70 - 80 80 – 85 85 - 90 90 Tốc độ dòng là 1 ml/phút, thời gian chạy là 25 phút, nhiệt độ cột là 300C và detector được đặt tại 254 nm Kết quả thu được cho thấy hàm lượng THSG trong các mẫu hà thủ ô chế thấp hơn trong các mẫu hà thủ ô sống, ngược lại, hàm lượng EM và physcion thì tăng sau quá trình chế hà thủ ô đỏ Phương pháp này có ưu điểm là sử dụng MeOH là dung môi rẻ tiền hơn ACN, thời gian phân tích ngắn hơn (25 phút)

so với các nghiên cứu [24],[19]

21

1.2.3 Kiểm nghiệm dược liệu hà thủ ô đỏ

Dược điển là tài liệu chính thống thường được các đơn vị nghiên cứu, kiểm nghiệm và sản xuất áp dụng để kiểm tra, đánh giá chất lượng dược liệu ở Việt Nam cũng như các nước khác trên toàn thế giới

Ở Việt Nam, việc kiểm nghiệm chất lượng dược liệu hà thủ ô đỏ thường được thực hiện theo chuyên luận hà thủ ô đỏ trong Dược Điển Việt Nam IV (2009) [1] với các chỉ tiêu như: mô tả, soi bột, vi phẫu, định tính, định lượng chất chiết được, độ ẩm, tạp chất và độ tro Các chỉ tiêu này không phản ánh được chính xác chất lượng dược liệu, đặc biệt chỉ tiêu định lượng chất chiết được bằng phương pháp cân không đặc trưng nên không thể đánh giá chính xác chất lượng dược liệu hà thủ ô đỏ

Dược Điển Trung Quốc (2010) có qui định sử dụng HPLC để định lượng THSG, EM và physcion trong các mẫu hà thủ ô đỏ Đối với chỉ tiêu định lượng hỗn hợp antharquinon (EM và physcion), thành phần pha động là MeOH : nước chứa 0,01% axit photphoric (80 : 20), detector UV 254 nm và quy định hàm lượng hỗn hợp anthraquinon không được thấp hơn 0,1% Đối với chỉ tiêu định lượng THSG, mẫu chuẩn được hoà tan trong EtOH, 0,2 g mẫu dược liệu được chiết hồi lưu với 25

ml EtOH trong 30 phút Hệ dung môi pha động sử dụng là ACN : H2O (25 : 75), cột C18, detector UV 320 nm và quy định hàm lượng THSG trong các mẫu hà thủ ô đỏ không được thấp hơn 1,0% (tính theo dược liệu khô tuyệt đối) Nhược điểm của chuyên luận này đó là hai phương pháp sử dụng khác nhau về thành phần pha động,

vì vậy không định lượng đồng thời được các chất trong cùng một lần phân tích [28] Dược Điển Hồng Kông [18] cũng quy định hàm lượng THSG và EM là tiêu chí định lượng để đánh giá chất lượng các mẫu dược liệu hà thủ ô đỏ Phương pháp

sử dụng là HPLC với hệ dung môi gồm kênh A là nước chứa 0,1% axit photphoric

và kênh B là ACN Chương trình rửa giải gradient tương đối đơn giản:

22

Tốc độ dòng là 1 ml/phút, sử dụng cột ODS (4,6 x 250 mm) Ứng với chương trình này, THSG và EM có thời gian lưu lần lượt là 19,5 phút và 49 phút Nhận xét thấy phương pháp này có ưu điểm là phân tích đồng thời được cả hai thành phần THSG

và EM, tuy nhiên nhược điểm là thời gian phân tích dài, gây tốn kém về thời gian và nguyên vật liệu, hoá chất

1.3 Các phương pháp xử lý mẫu dược liệu

Một trong những yếu tố quyết định đến hiệu quả của phương pháp định lượng đó là phương pháp xử lý mẫu Thông thường, đối với các mẫu thực vật, sử dụng dung môi hữu cơ hoặc nước để lấy các chất tan ra khỏi mô thực vật, quá trình

đó gọi là chiết xuất Sản phẩm thu được của quá trình này là một dung dịch các chất tan hoà tan trong dung môi, gọi là dịch chiết [2] Có nhiều cách chiết, phổ biến nhất

là chiết bằng nước đun sôi, tuy nhiên, trong thực vật có rất nhiều chất không tan trong nước, khi đó ta phải dùng thay thế bằng các dung môi hữu cơ như: EtOH, MeOH, AC, CHCl3,… Hiệu quả của quá trình chiết xuất phụ thuộc vào bản chất của chất tan, dung môi, nhiệt độ, áp suất, cấu tạo vách tế bào,… [2]

Có rất nhiều kỹ thuật chiết khác nhau Trong phòng thí nghiệm, một số các phương pháp chiết xuất cổ điển thường được sử dụng ở quy mô phân tích như: chiết soxhlet, chiết hồi lưu, chiết siêu âm,…Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học công nghệ, có nhiều phương pháp chiết khác được sử dụng với mục đích giảm lượng dung môi, hoá chất sử dụng để tránh độc hại và không gây ô nhiễm môi trường như: chiết pha rắn, chiết bằng chất lỏng quá tới hạn,… tuy nhiên, các kỹ thuật này đều tương đối phức tạp và kinh phí tốn kém, vì vậy khó có thể áp dụng rộng rãi ở mọi đơn vị kiểm nghiệm

Với mục đích chiết tách và phân lập chất, các tác giả [12] đã chiết tách và tinh chế được 6 hợp chất từ 14,5 kg dược liệu hà thủ ô đỏ, trong đó có 5 hợp chất thuộc nhóm stilben glycosid EtOH 95% là dung môi được sử dụng để chiết các chất này ra khỏi dược liệu, cao EtOH 95% được hòa tan trong nước và chiết lỏng lỏng với lần lượt các dung môi ete dầu hỏa, etylaxetat và BuOH Phân đoạn BuOH được xác định là chứa các hợp chất định tách Phân đoạn này được tách sơ bộ bằng

23

cột HP-20 và cột silica gel pha thường trước khi sử dụng phương pháp sắc ký lỏng điều chế với cột tách sử dụng là cột pha đảo Hệ dung môi rửa giải là MeOH – H2O với tỷ lệ biến đổi dần từ 35 : 65 đến 100 : 0, tại tỷ lệ dung môi MeOH : H2O (35 : 65) thu được 2 g THSG

Với mục đích phân tích định lượng [30], các tác giả đã sử dụng EtOH 70% làm dung môi để chiết 2 hợp chất stilben và 6 hợp chất flavonoid ra khỏi nền mẫu dược liệu hà thủ ô đỏ Phương pháp chiết siêu âm được áp dụng sau khi đã khảo sát các ảnh hưởng về thời gian chiết, dung môi chiết và tỷ lệ dung môi chiết/dược liệu Các tác giả đã khẳng định điều kiện chiết tốt nhất là tại nhiệt độ phòng, thời gian siêu âm 30 phút và tỷ lệ dung môi chiết/dược liệu là 30 ml/0,5 g Phương pháp này

đã được kiểm tra về độ lặp lại, độ đúng, độ thu hồi và đã được áp dụng để phân tích các mẫu rễ, thân và lá của cây hà thủ ô đỏ

Ngoài ra, một số công trình khác [19],[31],[24] sử dụng MeOH hoặc MeOH/H2O làm dung môi chiết trong quá trình xử lý mẫu dược liệu hà thủ ô đỏ Nhận xét thấy, việc sử dụng EtOH làm dung môi chiết có nhiều ưu điểm hơn MeOH, đặc biệt EtOH ít gây độc hại và thân thiện với môi trường hơn, vì vậy có thể

áp dụng rộng rãi ở các đơn vị kiểm nghiệm và sản xuất

1.4 Các vấn đề cần giải quyết

Theo tài liệu [6], tổng nhu cầu sử dụng hà thủ ô đỏ ở nước ta khoảng 500 tấn khô/năm Trong đó, riêng công ty Traphaco hàng năm dùng khoảng 100 tấn để sản xuất thuốc Nguồn nguyên liệu này một phần được thu hái tự nhiên ở Việt Nam, còn lại chủ yếu được nhập từ Lào, Trung Quốc nên rất dễ bị giả mạo bằng các dược liệu khác có hình thái khá giống như: hà thủ ô trắng, củ nâu, củ cọc, Vì vậy việc kiểm soát tính đúng và chất lượng nguyên liệu đầu vào là rất quan trọng Tuy nhiên, việc kiểm nghiệm chất lượng dược liệu hà thủ ô đỏ ở nước ta vẫn còn nhiều hạn chế dẫn tới tình trạng người dân sử dụng nhầm dược liệu hoặc mua phải dược liệu rác đã bị chiết hết hoạt chất, kém chất lượng Điều này không những gây ảnh hưởng đến sức khỏe của người bệnh, quyền lợi người tiêu dùng mà còn gây mất lòng tin của mọi

Các công trình nghiên cứu [18],[19],[26],[28],[31] đều đưa ra các phương pháp HPLC với từng điều kiện khác nhau để phân tích các mẫu dược liệu hà thủ ô

đỏ, tuy nhiên mỗi phương pháp đều có các ưu, nhược điểm và chưa đạt được các điều kiện tối ưu về: định lượng đồng thời, thời gian phân tích, giá thành Vì vậy trong nghiên cứu này, chúng tôi hướng tới xây dựng một phương pháp phân tích định tính, định lượng đồng thời 03 chất bằng HPLC với các ưu điểm về độ nhạy, độ lặp lại tốt, thời gian phân tích nhanh và giá thành không quá đắt, để có thế áp dụng rộng rãi ở mọi đơn vị kiểm nghiệm và sản xuất

1.5 Mục tiêu nghiên cứu

 Xây dựng được phương pháp định tính ba hợp chất

25

CHƯƠNG 2 – THỰC NGHIỆM

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Hầu hết các mẫu hà thủ ô đỏ đều có thành phần THSG, RV và EM với hàm lượng rất khác nhau Trong đó, hàm lượng THSG thường khá lớn (> 1,0%) [25], hàm lượng EM nhỏ hơn nhiều Một số mẫu có thành phần RV, một số mẫu không

có Vì vậy, trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn mẫu dược liệu hà thủ ô đỏ thu hái tại Hà Giang (là mẫu chứa cả 3 thành phần) để tiến hành các khảo sát nhằm xây dựng phương pháp phân tích Từ đó, tiếp tục định lượng THSG và EM trong các mẫu dược liệu hà thủ ô đỏ thu hái tại nhiều vùng khác nhau, mỗi vùng được lấy 3 mẫu để phân tích Ngoài ra, chúng tôi phân tích mẫu dược liệu hà thủ ô đỏ được mua trên thị trường và mẫu sản phẩm thuốc từ hà thủ ô của Công ty cổ phần dược phẩm Traphaco

Dược liệu hà thủ ô đỏ Radix Fallopia multiflora dùng làm mẫu nghiên cứu

được thu hái tự nhiên ở các vùng khác nhau ở Việt Nam Mẫu được lấy là bộ phận

rễ củ của cây hà thủ ô đỏ Mẫu thu hái được rửa sạch, thái lát mỏng (độ dày khoảng

2 – 3 mm), phơi, sấy ở 60oC đến khô và bảo quản trong túi nilon kín Các mẫu nghiên cứu đều đạt theo tiêu chuẩn của DĐVN IV Mẫu hiện được lưu tại khoa Hoá phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu Mỗi mẫu được lấy đồng đều một lượng ra nghiền thành bột mịn kích thước khoảng 1 mm, đủ dùng cho việc nghiên cứu

Mẫu sản phẩm hà thủ ô của Công ty Cổ phần Dược phẩm TRAPHACO, kí hiệu là T-TPC (Xem hình 2.1 và bảng 2.1)

A

26

B

Hình 2.1: Hình ảnh dƣợc liệu hà thủ ô đỏ (A) và sản phẩm từ hà thủ ô đỏ (B)

Bảng 2.1: Thông tin về các mẫu phân tích

mẫu

Độ ẩm (%)

1 HTO Sơn La Long Hẹ, Thuận Châu, Sơn La 15/7/2013 12,17

4 HTO Hà Giang Quyết Tiến, Quản Bạ, Hà Giang 18/10/2013 11,56

5 HTO Lai Châu Phăng Sô Lin, Sìn Hồ, Lai Châu 15/9/2013 12,43

6 HTO Hƣng Yên Bình Kiều, Khoái Châu, Hƣng

27

- Chất chuẩn emodin (viết tắt là EM) của hãng Sigma - Aldrich, độ tinh khiết 97,0%; CTPT: C15H10O5; KLPT: 270,24 ĐvC

- Chất đối chiếu resveratrol (viết tắt là RV) là sản phẩm phân lập được từ dược liệu

hà thủ ô đỏ, do khoa Hoá phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu cung cấp, độ tinh khiết đạt 95,0% (kiểm tra bằng HPLC, tính theo phần trăm diện tích pic) [7]; CTPT:

C14H12O3; KLPT: 228,24 ĐvC

2.2.2 Hoá chất

- Các dung môi dùng cho sắc ký lỏng hiệu năng cao (MeOH, ACN) của hãng Merck

- Axit photphoric (H3PO4) đặc (d=1,685 g/cm3) của hãng Merck

- Các dung môi, hoá chất dùng để xử lý mẫu (EtOH, MeOH) mua của Trung Quốc

và đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích (P.A.)

- Nước cất sử dụng là nước cất hai lần đã được deion hoá

2.2.3 Thiết bị, dụng cụ

 Thiết bị

- HPLC (Shimadzu, Nhật Bản), gồm: bơm LC-20AD, bộ tiêm mẫu tự động 20AHT, detector UV-VIS, phần mềm Labsolution để truy xuất hình ảnh và số liệu trên máy HPLC

SIL Cột pha đảo Ascentis C18 (250 mm x 4,6 mm; 5 µm) và cột bảo vệ Supelguard Ascentis C18 (20 mm x 4,0 mm, 5 μm)

- Cân phân tích Precisa XT 220A, độ chính xác 0,0001 g

- Máy đo pH MP220K của hãng Toledo với điện cực thủy tinh và điện cực calomen bão hòa và các dung dịch pH chuẩn để hiệu chỉnh điểm chuẩn của máy đo pH (Merck)

- Máy rung siêu âm, có gia nhiệt của hãng Power sonic 405

- Máy quang phổ hấp thụ phân tử (UV – VIS) UV1800 của hãng Shimadzu, Nhật Bản

 Dụng cụ

- Bình cầu đáy bằng có nút nhám, dung tích 100 ml, của hãng Isolab – Đức

28

- Bình định mức: 5,10, 25, 50 mL, cùng hãng

- Pipetman các loại từ 0 – 1000 µL

- Bình nón 100ml, cốc 100, 50, 25 mL, cốc cân

Tất cả các dụng cụ thủy tinh đều phải được rửa sạch, tráng bằng nước cất,

sau đó tráng bằng MeOH và để khô, tráng n-hexan 3 lần sau đó sấy ở 1050

C trong vòng 1 giờ, lấy ra để nguội trước khi sử dụng

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Chuẩn bị dung dịch mẫu chuẩn và mẫu đối chiếu

2.3.1.1 Dung dịch chuẩn gốc THSG 1 mg/ml: cân chính xác 5,0 mg chất chuẩn

THSG, hòa tan trong 5,00 ml EtOH Các dung dịch chuẩn THSG có nồng độ nhỏ hơn được chuẩn bị bằng cách pha loãng dung dịch chuẩn gốc trong EtOH

2.3.1.2 Dung dịch đối chiếu RV 1 mg/ml: chuẩn bị tương tự dung dịch chuẩn gốc

THSG nhưng thay dung môi EtOH bằng MeOH

2.3.1.3 Dung dịch chuẩn gốc EM 1 mg/ml: chuẩn bị tương tự dung dịch chuẩn gốc

THSG nhưng thay dung môi EtOH bằng MeOH

2.3.2 Phương pháp xử lý mẫu

Theo như tính chất đã biết của các stilben và anthraquinon, tan tốt trong các dung môi hữu cơ như EtOH, MeOH… Công thức cấu tạo của THSG có chứa 1 gốc đường glucose, vì vậy việc sử dụng hỗn hợp dung môi hữu cơ/nước sẽ chiết THSG

ra khỏi mẫu thực vật kiệt hơn Tham khảo các tài liệu [24],[28] và so sánh về độ phân cực của các dung môi, chúng tôi lựa chọn hỗn hợp dung môi chiết là EtOH/H2O bởi EtOH ít gây độc hại, thân thiện với môi trường hơn MeOH

Đối với các mẫu dược liệu hà thủ ô đỏ, chúng tôi đã khảo sát và đưa ra phương pháp xử lý mẫu như sau:

Phương pháp 1: Cân chính xác khoảng 0,5 g mẫu thử bằng cân phân tích (độ chính xác 0,0001 gam), chuyển mẫu vào bình cầu dung tích 100,0 ml, có nút nhám, thêm 50,0 ml dung môi EtOH 50% (v/v), thấm ẩm dược liệu trong 10 phút, cân và ghi lại khối lượng (m1) Lắp bình cầu vào hệ thống chiết hồi lưu đã đặt ở nhiệt độ

70oC Tiến hành chiết hồi lưu trong 1h Sau đó để nguội bình cầu về nhiệt độ phòng,

29

cân bình cầu và bổ sung bằng EtOH 50% đến khối lượng ban đầu (m1) Lọc, thu được dịch chiết mẫu thử (dung dịch A) Lọc dịch chiết này qua màng lọc cellulose axetat 0,45 µm thu được dung dịch tiến hành sắc ký HPLC (dung dịch B)

Đối với mẫu sản phẩm từ dược liệu hà thủ ô của công ty Traphaco, do trong

tá dược có nhiều thành phần đường, vì vậy sau khi chiết để thu được dung dịch A, mẫu được loại tạp chất bằng quá trình chiết lỏng – lỏng với dung môi BuOH trước khi phân tích HPLC Phương pháp xử lý mẫu được đưa ra như sau:

Phương pháp 2: Lấy khoảng 30 viên thuốc khác nhau, cạo sạch phần bao đường của từng viên, cân khối lượng từng viên trên cân phân tích (độ chính xác 0,0001 gam) và xác định khối lượng trung bình viên Nghiền nhỏ viên và trộn đều thu được mẫu thử Cân chính xác khoảng 5,0000 g mẫu thử, chuyển mẫu vào bình cầu dung tích 100,0 ml, có nút nhám, thêm 50,0 ml dung môi EtOH 50% (v/v), thấm ẩm dược liệu trong 10 phút, cân và ghi lại khối lượng (m1) Lắp bình cầu vào

hệ thống chiết hồi lưu đã đặt ở nhiệt độ 70oC Tiến hành chiết hồi lưu trong 1h Sau

đó để nguội bình cầu về nhiệt độ phòng, cân bình cầu và bổ sung bằng EtOH 50% đến khối lượng ban đầu (m1) Lọc, thu được dịch chiết mẫu thử (dung dịch A) Đem toàn bộ dung dịch A cho bay hơi đến cắn trên bếp cách thuỷ, hoà tan cắn trong 10

ml nước cất, chiết với BuOH cho đến khi phân đoạn BuOH nhạt mầu Gom tất cả dịch BuOH lại, cô đến cắn trên bếp cách thuỷ, hoà tan cắn trong chính xác 25,0 ml dung môi EtOH 50% (v/v), lọc qua màng lọc cellulose axetat 0,45 µm thu được dung dịch tiến hành sắc ký HPLC (dung dịch B)

2.3.3 Phương pháp phân tích

Phép phân tích THSG, RV và EM được thực hiện trên hệ sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC của Shimadzu, kết nối với hệ bơm gồm 4 kênh, bộ điều khiển, lò cột, bộ trộn dung môi và detector UV-VIS

Detector là một bộ phận có vai trò theo dõi, phát hiện các chất tan trong pha động từ cột sắc ký rửa giải ra một cách liên tục, nó là một bộ phận thu nhận và phát hiện các hợp chất dựa theo một tính chất nào đó của chất phân tích Trên thực tế, hầu hết các chất nghiên cứu đều hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại UV – VIS, vì

30

vậy detector UV – VIS thường được sử dụng nhiều nhất trong các nghiên cứu Hiện

nay mảng diot – photo – array (PDA) phát triển, chúng có vai trò như một detector

UV – VIS nhưng có khả năng theo dõi chất ở nhiều bước sóng khác nhau ở cùng

một thời điểm, và độ nhạy của nó cao hơn detector UV – VIS, tuy nhiên giá thành

của detector PDA đắt hơn nhiều so với detector UV-VIS, vì vậy không phải đơn vị

kiểm nghiệm, sản xuất nào cũng có thể trang bị được Dựa vào điều kiện phòng thí

nghiệm và nhằm xây dựng một phương pháp có thể ứng dụng rộng rãi ở các đơn vị

kiểm nghiệm và sản xuất, chúng tôi quyết định chọn detector UV – VIS sử dụng chế

độ theo dõi chất tại 2 bước sóng để thuận lợi cho việc định lượng đồng thời các hợp

chất

Cột tách có vai trò rất quan trọng trong một phép tách sắc ký, nó quyết định

hiệu quả tách của quá trình Để chọn được một pha tĩnh hay một cột tách phù hợp

nhất, ta phải dựa trên những đặc điểm như: độ phân cực của chất phân tích, chất

phân tích được pha trong môi trường như thế nào, có pH ra sao thì mới quyết định

chọn pha tĩnh phù hợp Chất phân tích được chọn là các hợp chất hữu cơ thuộc

nhóm stilben và anthraquinon, được pha trong MeOH và EtOH Do các chất phân

tích kém phân cực nên phải sử dụng pha tĩnh có bản chất kém phân cực giống như

chất phân tích Vì vậy, cột pha đảo RP-HPLC là lựa chọn tối ưu nhất Trong điều

kiện phòng thí nghiệm, chúng tôi đã sử dụng cột tách Ascentis C18 (250 mm x 4,6

mm; 5 µm) để tách các hợp chất stilben, anthraquinon và định lượng chúng

Các điều kiện phân tích trên hệ thống HPLC được tóm tắt như sau:

- Nhiệt độ cột: t0phòng (250C – 300C)

- Detector UV-VIS: bước sóng 254 nm và 320 nm

- Thể tích mẫu tiêm vào cột: 10 μl

- Hệ dung môi gồm 2 kênh Kênh A: pha nước chứa H3PO4 0,01% (pH ≈ 3,3); Kênh B là ACN

- Chế độ gradient tỷ lệ dung môi: như ở bảng 2.2

31

Bảng 2.2: Chương trình dung môi rửa giải

T

(phút) 0 - 5 5 - 10 10 - 15 15 - 20 20 - 25 25 - 35 35 – 40 45 ACN

(%) 10 - 30 30 30 - 70 70 70 - 100 100 100 - 10 Stop

2.4 Nghiên cứu điều kiện tối ưu và đánh giá phương pháp phân tích

2.4.1 Phương pháp nghiên cứu các điều kiện tối ưu cho quá trình phân tích HPLC

Thứ nhất là khảo sát để chọn hệ dung môi pha động, với 3 hệ dung môi là: MeOH-nước, ACN-nước, ACN- nước chứa 0,01% axit photphoric (pH ≈ 3,3)

Sau khi chọn được hệ dung môi phù hợp chúng tôi đi khảo sát thành phần của pha động, loại axit và nồng độ axit dùng để điều chỉnh pH của pha động (axit fomic, axit axetic và axit photphoric) Giá trị pH pha động cũng được khảo sát trong khoảng từ 2 đến 5

Chế độ chạy gradient đã được khảo sát ở nhiều chương trình khác nhau để chọn được một chế độ chạy phù hợp nhất, hiệu quả tách tốt nhất Với tốc độ cố định

là 1 ml/phút, tỷ lệ dung môi thay đổi từ 10% ACN đến 95% ACN trong khoảng thời gian 40 phút

Thể tích mẫu tiêm vào cột cũng được khảo sát trong khoảng từ 5 μl đến 50

μl

Các kết quả thu được ứng với từng khảo sát được đánh giá, so sánh về thời gian lưu của các chất định phân tích (tR), về độ phân giải (RS) và hệ số đối xứng pic (AS) Phương pháp đánh giá này dựa trên lý thuyết Van Deemter sao cho 1,5 < RS <

2, 0,9 < AS < 1,2, tR của các chất phải không quá lớn nhưng đảm bảo phải tách xa nhau [27]

32

2.4.2 Đánh giá phương pháp phân tích

2.4.2.1 Đánh giá độ lặp lại và tái lặp lại

Sau khi có đầy đủ các điều kiện tối ưu, tiến hành dựng các đường chuẩn và thu được 02 phương trình đường chuẩn Đánh giá sai số hệ thống của các hệ số trong phương trình hồi quy sử dụng các chuẩn Student và Fisher để đánh giá và kết luận, sau đó mới tiến hành phân tích mẫu thực tế

Một phương pháp phân được gọi là tối ưu trước tiên phải thể hiện độ lặp lại tốt Trong nghiên cứu chúng tôi đã khảo sát độ lặp lại của hệ thiết bị HPLC sau khi chọn các điều kiện tối ưu, đánh giá độ lặp của hệ thiết bị dựa trên độ lặp diện tích và thời gian lưu của các cấu tử trong dung dịch khảo sát Dung dịch khảo sát là một mẫu có nồng độ xác định nằm trong giới hạn tuyến tính của đường chuẩn đã xây dựng, được bơm vào hệ 6 lần sau đó lấy diện tích pic và thời gian lưu trung bình của các lần và tính được giá trị % RSD Giá trị này đánh giá độ lặp cần khảo sát

Khi phân tích mẫu thực thì độ lặp lại và tái lặp lại của quá trình xử lý mẫu cũng được khảo sát và đánh giá Để đánh giá độ lặp lại, cùng một mẫu được cân khối lượng gần giống nhau, xử lý cùng một điều kiện Mỗi mẫu sau xử lý được bơm

3 lần để thu được kết quả trung bình Các giá trị trung bình đó được sử dụng để đánh giá độ lặp của phương pháp xử lý mẫu Giá trị % RSD cũng được dùng làm giá trị đánh giá độ lặp của phương pháp xử lý mẫu Để đánh giá độ tái lặp lại, 3 kỹ thuật viên (KTV) khác nhau cùng thực hiện phép phân tích trên cùng một mẫu Các kết quả thu được dùng làm giá trị đánh giá về độ lệch chuẩn tái lặp tương đối (% RSDR)

2.4.2.2 Đánh giá độ đúng của phương pháp

Ngoài độ lặp thì độ đúng là một yếu tố để đánh giá phương pháp phân tích Phương pháp thêm chuẩn được thực hiện để đánh giá độ thu hồi của phương pháp

xử lý mẫu Mẫu thực được thêm một lượng nhất định các chất chuẩn vào ở 3 mức nồng độ sao cho tổng hàm lượng các chất phân tích sau khi xử lý không bị vượt quá đường chuẩn Xử lý mẫu theo quy trình đã chọn và phân tích trên hệ thống HPLC thu được hàm lượng các chất được thêm vào và đánh giá độ thu hồi của phương

(CT 1) Trong đó C là nồng độ EM (THSG) trong dung dịch mẫu thử tính theo phương trình hồi quy (ppm); P là độ tinh khiết của chất chuẩn; V là hệ số pha loãng của dung dịch mẫu thử; m là khối lượng mẫu thử đem phân tích (mg); B là độ ẩm mẫu thử (%)

34

CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Nghiên cứu tối ưu hoá các điều kiện đo của hệ thống sắc ký

3.1.1 Khảo sát bước sóng hấp thụ cực đại của các chất nghiên cứu

Mục đích của nghiên cứu này nhằm định tính 03 hợp chất (THSG, RV, EM)

và định lượng 02 hợp chất (THSG và EM) Phổ UV - VIS của từng hợp chất được quét trên hệ thống máy đo quang phổ hấp thụ phân tử (UV – VIS) Hình 3.1 biểu diễn phổ UV – VIS của từng chất

Pha động trong sắc ký lỏng hiệu năng cao thường là nước có trộn với một số dung môi hữu cơ để thu được dung dịch có độ phân cực từ cao tới thấp, phù hợp với quá trình tách Căn cứ theo tài liệu số [10] ta có chỉ số độ phân cực của nước là 10,2 đơn vị, của MeOH là 5,1 đơn vị, từ đó ta tính được độ phân cực của các hệ dung môi đã chọn ứng với từng thời điểm trong quá trình chạy Công thức tính độ phân cực là:

PI = %V i x PI i / 100 (CT 2) Các chất phân tích là các chất kém phân cực, pha tĩnh được chọn cũng là cột pha đảo kém phân cực, vậy pha động dùng để tách phải có độ phân cực vừa phải thì quá trình tách mới tối ưu

Chúng tôi đã nghiên cứu và thử nghiệm các hệ dung môi sau:

+ Hệ dung môi 1: MeOH – nước + Hệ dung môi 2: ACN – nước + Hệ dung môi 3: ACN – nước chứa 0,01% axit photphoric (pH ≈ 3,3)

Đối với quá trình rửa giải các chất ra khỏi cột, có hai chế độ rửa giải là:

+ Rửa giải đẳng dòng (isocratic)

+ Rửa giải gradient dòng

Chế độ rửa giải đẳng dòng thường được sử dụng khi phân tích một chất hoặc trong các mẫu có thành phần nền đơn giản Đối với hỗn hợp có nhiều chất, khi phân tích bằng HPLC sử dụng chế độ rửa giải đẳng dòng, quá trình rửa giải sẽ mất thời

36

gian (thời gian lưu của các chất lớn) hoặc các chất sẽ không tách ra khỏi nhau, khi

đó nên dùng chế độ rửa giải gradient dòng để tách các chất ra khỏi nhau và rút ngắn thời gian lưu của các chất ra sau Với mục tiêu đặt ra của luận văn là nhằm định tính, định lượng các chất trong mẫu dược liệu hà thủ ô đỏ và các sản phẩm chế biến

từ dược liệu hà thủ ô đỏ, nên thành phần mẫu thường phức tạp Vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành khảo sát để chọn ra một chương trình rửa giải gradient tối ưu nhất

3.1.2.1 Dung môi pha động là MeOH – nước

Đối với hệ dung môi này, thời gian lưu của từng cấu tử được xác định bằng cách bơm riêng lẻ từng cấu tử vào hệ thống HPLC Thứ tự ra khỏi cột của từng chất là:

THSG → RV → EM Trên cơ sở đó, chúng tôi đã khảo sát và thu được các kết quả như sau: pic của THSG và RV có thời gian lưu khá gần nhau (∆tR ≈ 1 phút) nên dễ bị trùng pic trong một số mẫu có thành phần nền phức tạp Mặt khác, khi theo dõi ở 254 nm cho thấy đường nền nhiễu, không ổn định Pic của EM không cân đối sẽ dẫn tới quá trình định lượng không chính xác Bên cạnh đó, thời gian lưu của cả 3 chất đều tương đối dài Chúng tôi đã thử thay đổi một số chương trình rửa giải gradient khác để nhằm thay đổi khả năng tách, tuy nhiên sự tách vẫn chưa được cải thiện Bảng 3.1 cho biết các chế độ gradient thử nghiệm với pha động MeOH – nước

Bảng 3.2: Thời gian lưu (tR), độ phân giải (RS) và hệ số đối xứng pic (AS)

của các cấu tử ứng với từng chế độ gradient

Tên chất

tR (phút) RS AS tR (phút) RS ASTHSG 23,898 1,358 1,168 13,158 0,831 1,244

RV 25,133 4,269 1,184 15,597 4,640 1,240

EM 36,549 0,654 0,958 30,885 0,844 0,942

25 50 75 100 125 150 175 200 225 250 275

SPD-20A Ch2:254nm

Hình 3.2: Sắc ký đồ HPLC đối với các chế độ gradient thử nghiệm với hệ dung môi

MeOH – nước Kết quả trên cho thấy, đối với hệ dung môi rửa giải là MeOH – nước, hiệu quả tách chưa tốt (RS,EM < 1) Vì vậy, chúng tôi đã thay thế hệ dung môi khác có hiệu quả tách tốt hơn Hệ dung môi pha động ACN – nước được lựa chọn để khảo sát tiếp theo

3.1.2.2 Dung môi pha động là ACN – nước

Đối với hệ dung môi này, thời gian lưu của từng cấu tử cũng được xác định bằng cách bơm riêng lẻ từng cấu tử vào hệ thống HPLC Thứ tự ra khỏi cột của từng chất là:

THSG → RV → EM Các chương trình gradient thử nghiệm với hệ dung môi pha động ACN – nước được biểu diễn trên bảng 3.3

39

Bảng 3.3: Các gradient thử nghiệm với pha động ACN – nước

T (phút)

ACN (%)

PI (đơn vị)

T (phút)

ACN (%)

PI (đơn vị)

Thời gian lưu (tR), độ phân giải (RS) và hệ số đối xứng pic (AS) của các cấu

tử và sắc ký đồ HPLC ứng với từng chế độ gradient ở trên được thể hiện trong bảng 3.4 và hình 3.3

Bảng 3.4: Thời gian lưu (tR), độ phân giải (R) và hệ số đối xứng pic (As)

của các cấu tử ứng với từng chế độ gradient Tên

tR(phút) RS As THSG 11,376 2,942 1,192 11,392 2,964 1,193 9,411 4,727 0,889

RV 16,340 3,472 1,042 16,403 3,684 1,048 21,091 0,721 1,112

EM 24,244 0,602 0,782 24,186 0,409 1,008 24,765 0,022 1,016