Luận văn thạc sĩ Hóa hữu cơ, Cây thuốc, Hợp chất Cacbonyl, Hoạt tính sinh học

Theo hướng này, chúng tôi quan tâm đặc biệt những loại hợp chất cacbonyl αβ không no trong một số cây thuốc y học cổ truyền của dân tộc với đề tài: “Nghiên cứu hoạt tính sinh học của các

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Văn Ngọc Hướng

HÀ NỘI - 2014

MỤC LỤC

Trang

CHƯƠNG I 2

1.1 Nhóm chức cacbonyl αβ không no 2

1.1.1 Đặc điểm cấu tạo của nhóm chức cacbonyl α β không no 2

1.1.2 Hoạt tính sinh học của nhóm cacbonyl αβ không no 3

1.1.3 Các hợp chất cacbonyl αβ không no trong một số cây thuốc Việt Nam 6

1.3Vài nét về bệnh ung thư nguyên nhân gây bệnh 15

1.3.1 Khái niệm về ung thư 15

1.3.2 Nguyên nhân gây bệnh 15

1.3.3 Phát hiện và chuẩn đoán ung thư 16

1.4 Bệnh dạ dày và vi khuẩn Helicobacter pylori 17

CHƯƠNG 2 TÊN ĐỀ TÀI, MỤC TIÊU, NỘI DUNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 20

2.1 Tên đề tài 20

2.2 Mục tiêu đề tài 20

2.3 Nội dung nghiên cứu 20

2.4 Phương pháp nghiên cứu 21

2.5 Các phương tiện nghiên cứu 21

2.5.1 Các thiết bị nghiên cứu 21

2.5.2 Các hóa chất và dung môi 21

2.5.3 Dòng ung thư 21

2.5.4 Helicobacter pylori 21

2.6 Thực nghiệm 21

2.6.1.Phân lập Tonkinin từ cây khổ sâm Bắc Bộ 21

2.6.2 Phân lập Zerumbone từ cây gừng gió 22

2.6.3 Phân lập Curcumin I (Bis feruloylmetan) 23

2.6.4 Phân lập Rutin từ hoa hòe (Sophora Japonica L) 24

2.7 Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư gan và ung thư vú 25

2.7.1.Phương pháp phân tích 25

2.7.2.Dòng tế bào 25

2.7.3.Môi trường nuôi cấy 25

2.7.4.Các dụng cụ dùng 1 lần 25

2.7.5.Chất chuẩn chứng dương tính 25

2.7.6.Tính kết quả 25

2.8.Thử nghiệm hoạt tính chống HP của các hợp chất phân lập được 26

2.8.1.Phương pháp 26

2.8.2.Hóa chất và môi trường 26

2.8.3.Chuẩn bị môi trường nuôi cấy có mẫu cần thử tính diệt khuẩn 26

2.8.4.Chuẩn bị canh khuẩn thử nghiệm 27

2.8.5.Pha loãng mẫu để thử nghiệm: đạt nồng độ 10mg/1ml 27

2.8.6.Nuôi cấy chủng vi khuẩn 27

2.8.7.Kiểm tra tính diệt khuẩn 27

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 29

3.1.Đề tài và mục tiêu 29

3.2.Phân lập các hợp chất cacbonyl αβ không no trong các cây thuốc dân tộc đã chọn 33

3.2.1.Phân lập Tonkinin từ cây khổ sâm Bắc Bộ 33

3.2.2.Phân lập Zerumbone từ củ gừng gió 35

3.2.3.Phân lập Curcumin từ củ nghệ vàng 37

3.2.4.Phân lập Rutin từ hoa hòe 39

3.3.Khảo sát hoạt tính sinh học của các chất phân lập đƣợc 40

3.3.1.Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các chất phân lập được 41

3.3.2.Khảo sát hoạt tính diệt vi khuẩn Helicobacter Pylori (HP) của các chất phân lập được 44

KẾT LUẬN 46

Danh mục bảng biểu

Bảng 1.1: Hằng số vật lý của 13 dẫn suất ent kauran 10

Bảng 3.1: Số liệu phổ 1H & 13C-NMR của Tonkinin 34

Bảng 3.2: Số liệu phổ 1H & 13C -NMR của Zerumbone 36

Bảng 3.3: Số liệu phổ 1H & 13C -NRM của hợp chất Của Curcumin I 38

Bảng 3.4: Hàm lượng % tế bào ung thư sống sót sau phép thử 41

Bảng 3.5: Nồng độ ức chế tối thiểu của các chất thử đối với tế bào ung thư 42

Bảng 3.6: Kết quả thử tiêu diệt HP của các chất phân lập được 45

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian nghiên cứu và thực hiện luận văn này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của các cơ quan, các tổ chức và các cá nhân Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc nhất tới tất cả các tập thể, cá nhân đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu luận văn này

Trước hết tôi xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên và Khoa Hóa, Phòng Đào tạo và Khoa Sau đại học của nhà trường cùng các thầy cô giáo, những người đã trang bị kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập

Với lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất, tôi xin trân trọng cảm ơn thầy giáo- PGS.TS Văn Ngọc Hướng, người thầy đã trực tiếp chỉ bảo, hướng dẫn khoa học và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu, hoàn thành luận văn này

Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến các đồng chí, đồng nghiệp trong Trung tâm Nghiên cứu Sản xuất Vắc xin và Sinh phẩm Y tế đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi đi học tập và nghiên cứu

Xin chân thành cảm ơn tất các bạn bè, đồng nghiệp đã động viên, giúp đỡ nhiệt tình và đóng góp nhiều ý kiến quý báu để tôi hoàn thành luận văn này

Do thời gian nghiên cứu có hạn, luận văn của tôi chắc hẳn không thể tránh khỏi những sơ suất, thiếu sót, tôi rất mong nhận đuợc sự đóng góp của các thầy cô giáo cùng toàn thể bạn đọc

Xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày 25 tháng 12 năm 2014 TÁC GIẢ LUẬN VĂN Nguyễn Nghĩa Vũ

Đặt vấn đề

Với diện tích trên 33 vạn km2và 1/3 là rừng núi lại nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa độ ẩm cao, mưa nắng nhiều, do đó thảm thực vật nước ta vô cùng phong phú và đa dạng Theo thống kê mới nhất,hiện nước ta có trên 12 nghìn loài thực vật khác nhau, đặc biệt có trên 320 loài thực vật được dùng trong y học dân tộc để chữa bệnh[1] Đây là một nguồn tài nguyên phong phú của đất nước Nghiên cứu các hoạt chất trong cây thuốc dân tộc để chữa bệnh cho con người không chỉ là một nhiệm vụ chiến lược lâu dài mà còn là nguồn cảm hứng thú vị Nghiên cứu không chỉ có ý nghĩa khoa học với việc tìm kiếm các chất mới, các chất có tác dụng sinh học quí giá chữa các bệnh hiểm nghèo, các mô hình chất chữa bệnh cho tổng hợp hóa học mà còn góp phần làm hiện đại hóa nền y học dân tộc của đất nước

Trong những năm gần đây, các hợp chất có nhóm cacbonyl αβ không no được các nhà khoa học thế giới đặc biệt quan tâm Hàng năm có hàng chục công trình công bố về hoạt tính chống ung thư, chống viêm…của loại hợp chất này Theo hướng này, chúng tôi quan tâm đặc biệt những loại hợp chất cacbonyl αβ không no trong một số cây thuốc y học

cổ truyền của dân tộc với đề tài: “Nghiên cứu hoạt tính sinh học của các hợp chất

cacbonyl α β không no phân lập từ các cây thuốc dân tộc Việt Nam”

1.1.1 Đặc điểm cấu tạo của nhóm chức cacbonyl αβ không no

Khung cơ sở của nhóm chức này có một nguyên tử oxy và 3 nguyên tử cacbon

Hình 1.1

Đáng chú ý, cả 3 nguyên tử cacbon này đều có lai hóa sp2 Ở nhóm cacbonyl, liên kết σ được tạo thành do sự xen phủ orbital py của oxi và orbital lai hóa sp2 của nguyên tử cacbon1; còn liên kết π được tạo hành do sự xen phủ orbital pz của oxi với orbital không lai hóa của nguyên tử cacbon 1 Ở liên kết đôi α β, liên kết hình thành là do sự xen phủ của

2 orbital lai hóa sp2 của 2 nguyên tử cabon 1 và cacbon 2; Còn liên kết hình thành là do

sự xen phủ của 2 orbital pz không lai hóa của 2 nguyên tử cacbon này Mô tả các spin của các điện tử π, được chỉ trên hình 1.2

Hình 1.2

Nếu các nhóm thế ở các nguyên tử cacbon không có hiệu ứng không gian thì các mặt phẳng điện tử π này song song với nhau một cách tuyệt đối và các liên kết π liên hợp với nhau thành orbital π phân tử Như chỉ ra trên hình 1.3

C

C C





2

Nhưng ở đây, oxi có độ âm điện lớn nên nó hút đôi điện tử π giữa nó với cabon lệch

về phía nó và kèm theo đó là đôi điện tử π giữa Cα và Cβ cũng lệch về phía Cα Kết quả sự lôi kéo này làm xuất hiện điện tích dương phần trên nguyên tử Cβ (Hình 1.4) Chính sự phân cực liên kết đôi αβ do nhóm cacbonyl gây ra làm nên sự khác biệt của liên kết đôi này với các liên kết đôi của các hợp chất không có nhóm cacbonyl liên hợp

Hình 1.4

1.1.2 Hoạt tính sinh học của nhóm cacbonyl αβ không no

Chính cấu trúc đặc biệt trên mà ngoài các tính chất hóa học thông thường của liên kết đôi như cộng hợp ái điện tử, oxy hóa, khử hóa, ở nhóm cacbonyl không no còn xuất hiện một phản ứng đặc biệt gọi là phản ứng Michael; Đó là phản ứng cộng hợp ái nhân vào liên kết đôi αβ ở cacbon β của hợp chất cacbonyl αβ không no[2] và chính sự xuất hiện phản ứng này mà các hợp chất có nhóm cacbonyl αβ không no có các hoạt tính sinh học quí giá mà các hợp chất có liên kết đôi khác không có, đáng chú ý nhất là hoạt tính chống ung thư và chống viêm

Minh chứng cho vấn đề này, chúng tôi lấy Zerumbone và Humulene làm ví dụ Zerumbone là một Sesquiterpenxeton vòng lớn αβ không no, có công thức cấu tạo như hình 1.5a và tên hóa học là 2,6,9,9- Tetramethyl-E,E,E-cycloundecatri-2,6,9-ene-1-one

O





Hình 1.5a

Nó được phát hiện và phân lập lần đầu tiên vào năm 1960[3], từ cây gừng gió

(Zingiber zerumbet Smith) và được xác định công thức cấu tạo một cách đầy đủ chính xác

vào năm 1997.Humulene cũng được phân lập từ cây gừng gió vào 1968, có công thức cấu tạo như hình 1.5b

Hình 1.5b

Trong 25 năm trở lại đây, Zerumbone được các nhà khoa học thế giới đặc biệt quan tâm nghiên cứu hoạt tính sinh học Các kết quả nghiên cứu invitro và invivo cho thấy Zerumbone không những có hoạt tính chống viêm mà còn có tác dụng ức chế mạnh sự phát triển tế bào ung thư của 18 dòng ung thư người khác nhau : Ung thư gan[5], ung thư máu[6] ung thư vú[7], ung thư cổ tử cung và buồng chứng[8],…

Trong khi đó Humulene không có hoạt tính chống viêm mà cũng chẳng có hoạt tính chống ung thư

O

1 2 3 4

5 6 7

8 9 10

13 14

15

1234

5678910

1314

15

Nghiên cứu hoạt tính ức chế mạnh sự phát triển tế bào ung thư của Zerumbone, người ta thấy Zerumbone loại trừ NF-kB và I-kB hoạt động, chúng là những tác nhân gây ung thư nên Zerumbone không những có tác dụng chống ung thư mạnh mà còn có tác dụng

phòng ngừa ung thư tốt[9] Zerumbone thúc đẩy sự tự chết (apoptosis) của tế bào ung thư

bằng cách loại trừ Glutathiol S-transferases hoạt động nhờ phản ứng cộng hợp ái nhân vào liên kết đôi αβ của hợp chất có nhóm cacbonyl αβ không no (Hình 1.6a) Vì thế Akira Murakami và cộng sự kết luận rằng, nhóm cacbonyl αβ không no quyết định cho hoạt tính chống ung thư và chống viêm của loại hợp chất này (Hình 1.6a)[10]

HSHS

HSHS

Hình 1.6b

+

=

Sự trình bày trên cho thấy, nhóm cacbonyl αβ không no là nhóm chức sinh học của các hợp chất cacbonyl αβ không no Khả năng tham gia phản ứng Michael của nhóm này quyết định khả năng hoạt động sinh học của chúng nhất là chống ung thư và chống viêm

1.1.3-Các hợp chất cacbonyl αβ không no có trong một số cây thuốc Việt Nam

1.1.3.1-Các hợp chất cacbonyl αβ không no trong củ cây gừng gió (Zingiber zerumbet Smith)

Ở nước ta, gừng gió có ở khắp các tỉnh miền núi, nhất là vùng Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc Dân tộc Sán Dìu ở vùng này coi gừng gió là cây thuốc dân tộc quí, nó dùng để chữa các bệnh về đường ruột, đau nhức xương, cảm cúm…

Hình 1.7

Trong củ gừng gió có khoảng 0,4→0,65% tinh dầu, có 50→60 thành phần hóa học khác nhau; Thành phần chủ yếu của tinh dầu gừng gió là Zerumbone chiếm từ 50→75% hoàn lượng tinh dầu[11]; Ngoài ra còn có Humulene, Humulene oxit… Ngoài Zerumbone người ta còn phân lập được 13 dẫn xuất Flavonoit khác nhau đều có nhóm cacbonyl αβ không no, có công thức tổng quát (Hình 1.8)

So sánh hoạt tính chống ung thư và chống viêm của Zerumbone và dẫn xuất của nó người thấy khi khử hóa nhóm cacbonyl thành nhóm carbinol hay Metylen thì hoạt tính giảm một cách nhanh chóng

Hình 1.9

Từ IC50 0,14µM của Zerumbone lên IC50 100µM của Humulen Điều này khẳng định rằng, nhóm cacbonyl αβ không no quyết định hoạt tính chống ung thư và chống viêm của Zerumbone và là nhóm chức sinh học của Zerumbone[12] Zerumbone không những

có hàm lượng nhiều nhất trong củ gừng gió mà còn có hoạt tính ức chế mạnh sự phát triển

tế bào ung thư của 18 loại ung thư khác nhau[4] Hơn nữa nguyên liệu cho sản xuất Zerumbone ở nước ta có nhiều, cây gừng gió dễ trồng, dễ mọc, có năng xuất cao Với các lí

do trên Zerumbone được đưa vào chương trình trọng điểm phát triển Công nghệ hóa dược quốc gia đến năm 2020 với Đề tài nghiên cứu công nghệ chiết tách Zerumbone từ cây gừng

gió (Zingiber zerumbet Smith) làm thuốc chống ung thư do PGS.TS Văn Ngọc Hướng làm

chủ nhiệm đề tài và thực hiện trong 2 năm 2010-2011 Đề tài đã được nghiệm thu xuất sắc

và đã chuyển sang dự án sản xuất thử nghiệm 2 triệu viên nang Zezunbone cho hỗ trợ điều trị ung thư, thực hiện trong 3 năm từ năm 2013 đến năm 2015 tại Công ty Dược phẩm Bắc Ninh

1.1.3.2-Các hợp chất cacbonyl αβ không no trong cây khổ sâm Bắc Bộ(Croton tonkinensis Gagnep)

Khổ sâm Bắc Bộ là cây thuốc dân tộc nổi tiếng từ lâu đời, nó thuộc chi Croton và được Gagnep tìm thấy lần đầu tiên ở các tỉnh Bắc Bộ Việt Nam nên nó có tên khoa học là

Cronton tonkinensis Gagnep Cho đến nay, người ta vẫn chưa tìm thấy cây này ở các nước

khác, do đó có thể nói đây là cây đặc hữu của Việt Nam

Hình 1.10

Nhân dân sử dụng khổ sâm Bắc Bộ để chữa bệnh viêm loét dạ dày là chủ yếu Điều này thể hiện trong Bài thuốc chữa bệnh viêm loét dạ dày của GS Dược sĩ Đỗ Tất Lợi[13] Nhưng hợp chất gì trong cây khổ sâm Bắc Bộ có tác dụng chữa bệnh viêm loét dạ dày thì cho đến nay chưa ai khẳng định được Đây là vấn đề lý thú mà chúng tôi quan tâm

Ở Việt Nam, nhóm các nhà khoa học Phan Tống Sơn, Văn Ngọc Hướng và Phan Minh Giang là những người đầu tiên nghiên cứu hoạt chất sinh học trong cây khổ sâm Bắc

Bộ và cũng là những người đầu tiên phân lập và xác định cấu trúc phân tử hợp chất thuộc loại Diterpene có khung cơ bản ent-kauran là ent-7α-hydroxy-18-axetoxykaur-15-ene-16-one và vì thế khổ sâm Bắc Bộ trở thành đề tài nghiên cứu khoa học cấp nhà nước:

“Nghiên cứu quy trình chiết tách ent-kauran diterpenoit có tác dụng chống ung thư và chống viêm từ cây khổ sâm Bắc Bộ, mã số ĐT/ĐL 2005/05 do GS.TSKH Phan Tống Sơn làm chủ nhiệm, PGS.TS Văn Ngọc Hướng và Phan Minh Giang là thành viên Kết quả nghiên cứu cho thấy các hợp chất phân lập được vừa có hoạt tính chống ung thư vừa có tác dụng chống viêm invitro Về sau Phan Minh Giang và Phạm Hồng Minh trong luận văn thạc sĩ và tiến sĩ của mình phân lập thêm một số dẫn xuất của ent-kauran từ cây khổ sâm Bắc Bộ Chúng được liệt kê trong bảng 1.1

910

111214

18-axetoxykaur-16-ene-15-one mà Phan Tống Sơn và cộng sự lần đầu tiên phân lập và xác định cấu trúc phân tử của nó[14]

1.1.3.3-Các hợp chất cacbonyl αβ không no trong cây nghệ vàng (Curcuma longa Lin)

Nghệ vàng là cây mọc hoang dại và cũng là cây được trồng tại nhiều nơi ở nước ta, đặc biệt là tỉnh Hưng Yên Ở miền Bắc Việt Nam thực tế có 2 loại cây nghệ vàng, một loại

có củ nhỏ và có màu vàng nhạt (vàng hoàng yến); Một loại có củ to, năng xuất cao có màu vàng đỏ (vàng da cam) Ở Hưng Yên người ta thường trồng loại này có màu vàng đỏ (vàng

da cam); Về mặt thực vật chưa có tài liệu phân biệt 2 loại nghệ này

Hình 1.12

Dân gian sử dụng nghệ vàng cả trong thực phẩm và dược phẩm Trong thực phẩm, bột củ nghệ vàng dùng làm chất màu gọi là bột cari, hay bột cao chiết các chất màu vàng gọi là Turmeron Người ta dùng nghệ vàng làm thuốc chống bệnh đau dạ dày là phổ biến Nhưng hợp chất gì trong củ nghệ vàng có tác dụng với vi khuẩn HP kẻ gây ra 90% bệnh đau dạ dày thì chưa ai xác định được Đây là điều mà chúng tôi quan tâm

Cho đến nay, người ta đã tìm thấy 2 loại hợp chất cacbonyl αβ không no trong củ nghệ vàng Loại chất thứ nhất là Sesquiterpene đó là Turmeron (1), Turmeron (2) và Curlon (3)[15]

5 Curcumin I (Bisferuloylmetan) R1=R2= OCH3

6 Curcumin II ( 4-Hydroxycinnamoyl metan) R1=OCH3 R2=OH

7 Curcumin III (Bis-4-hydroxycinnamoyl metan) R1=R2=OH

R2

OH

O

O

OCH3H

Hình 1.15

Đáng chú ý nhất trong các loại hợp chất cacbonyl αβ không no là Curcumin I vì nó

là chất có hàm lượng lớn nhất và có hoạt tính sinh học chống viêm, làm liền da và chữa bệnh đau dạ dày theo y học dân tộc[13]

1.1.3.4-Các hợp chất cacbonyl αβ không no trong cây hoa hòe (Sophora japonica L)

Hoa hòe nổi tiếng từ lâu đối với các vị thuốc dân gian để chữa các bệnh về tim mạch[13] Chất có hoạt tính chính trong hoa hòe là Rutin, đây là một Flavonoit glycosid, một hợp chất cacbonyl αβ không no mà nhóm cacbonyl αβ không no nằm trong hệ thơm liên hợp

O

O

OCH3H

O

OCH3

OCH3

OH O

O

Hình 1.17: Rutin

Cây hoa hòe có ở nhiều nước trên thế giới, đặc biệt ở các nước Đông Nam Á Ở nước ta cây có ở nhiều nơi như Hà Nội, Ninh Bình, Nghệ An…Nhưng trồng nhiều nhất là huyện Thái Thụy và huyện Tiền Hải, tỉnh Thái Bình Cây hoa hòe Việt Nam có 2 loại: Hoa hòe nếp và hoa hòe tẻ

Hoa hòe nếp có chất lượng tốt hơn hoa hòe tẻ nên ở Tiền Hải và Thái Thụy chủ yếu trồng cây hoa hòe nếp

Hình 1.18

Hợp chất phổ biến nhất trong cây hoa hòe là Flavonoit, nó có trong tất cả các bộ phận của cây hòe, nhưng hàm lượng cao nhất là trong nụ của cây hoa hòe Cho đến nay, người ta đã tìm thấy 14 loại Flavonoit trong nụ hoa của cây hoa hòe chúng chiếm từ 15→30% tùy theo vùng trồng; trong đó Rutin có hàm lượng lớn nhất Vì vậy, chúng tôi chú ý nhiều đến Rutin trong cây hoa hòe

1.3 Vài nét về bệnh ung thƣ nguyên nhân gây bệnh[17]

1.3.1 Khái niệm về ung thư

Ung thư là một nhóm các loại bệnh liên quan đến phân chia tế bào một cách vô tổ chức không bị kiểm soát tạo thành các khối u gọi là ung thư Các tế bào này có khả năng xâm lấn vào các mô khác bằng cách phát triển trực tiếp vào mô lân cận, hoặc di chuyển đến nơi xa (di căn) để phát triển và gây bệnh Hiện nay, người ta biết đến 200 loại ung thư khác nhau

1.3.2 Nguyên nhân gây bệnh

Nguyên nhân gây ung thư là sự hư hỏng của ADN, tạo nên các đột biến ở gen thiết yếu là gen điều khiển quá trình phân chia phát triển tế bào (NF-kB) và gen kìm chế và kiểm soát phân chia tế bào (I-kB) Ở tế bào bình thường NF-kB và I-kB luôn đi kèm nhau, liên kết với nhau bằng lực hóa trị NF-kB chịu trách nhiệm phân chia và phát triển tế bào; I-kB chịu trách nhiệm kìm chế và điều khiển NF-kB để cho sự phát triển tế bào diễn ra một cách bình thường theo đúng lập trình của sự phát triển Trong trường hợp bất thường, vì một lý

do nào đó như môi trường bị ô nhiễm, hóa chất độc, nhiễm phóng xạ hạt nhân, I-kB bị hư hỏng trở thành I-kB hoạt động, nó không điều khiển được sự phân chia phát triển tế bào của NF-kB và NF-kB bị biến thành NF-kB hoạt động, nó điều khiển sự phân chia phát triển

tế bào một cách vô tội vạ và vô tổ chức tạo nên những khối u

Khối u là một khối mô bất thường, khi phát triển chậm chạp chỉ chèn ép các mô xung quanh gọi là u lành tính và khi đó không gọi là bệnh ung thư; Nhưng khi nó phát triển nhanh không những chèn ép dữ dội gây tổn hại các mô xung quanh mà còn di chuyển đến các bộ phận khác hay cơ quan khác trongcơ thể để phát triển và gây tổn hại tại đó thì gọi là

u ác tính hay u di căn, lúc này gọi là bệnh ung thư và ung thư ác tính hay u ung thư di căn,

bệnh này vô cùng nguy hiểm tử vong là phổ biến Khái niệm u lành tính hay ác tính ở đây nên hiểu theo giải phẫu bệnh học Vì u lành nằm ở nơi không quan trọng như phần mềm cơ thể hay ở da thì bệnh nhân có thể cùng chung sống suốt đời vói nó, nhưng u lành mà ở nơi quan trọng như ở não thì bệnh nhân sẽ bị tai biến nảo và tử vong trong thời gian ngắn

1.3.3 Phát hiện và chuẩn đoán ung thư

Ở đâu có phát triển bất thường trong cơ thể nghĩa là có khối u thì nên nghĩ ngay đến

có thể là ung thư Vì ban đầu hầu hết bệnh nhân ung thư không có triệu chứng lâm sàng rõ ràng Bệnh ung thư có thời gian ủ bệnh lâu có khi đến 10 năm, nên khi đã có triệu chứng

rõ ràng thì bệnh đã phát triển trầm trọng việc chữa trị vì vậy vô cùng khó khăn Do đó, phát hiện sớm ung thư vô cùng quan trọng Kinh nghiệm điều trị bệnh ung thư của y học thế giới cho thấy rằng, ung thư phát hiện sớm có thể điều trị khỏi đến 60%-70%, còn ung thư phát hiện muộn có thể trở thành nan y vô phương cứu chữa, không điều trị được Vì vậy, WHO khuyến cáo mọi người nên thường xuyên khám sức khỏe định kỳ để phát hiện bệnh ung thư trước khi mới có mầm mống Khoa học hiện đại đã tạo ra các phướng pháp xét nghiệm nên phẩu thuật và xạ trị không cho phép phát hiện sớm bệnh ung thư để có biện pháp phòng ngừa, chẩn đoán và điều trị sớm Khi đã có khối u thì lập tức đi khám và sinh tiết tế bào nhằm xác định u lành hay u ác tính để có phương pháp điều trị kịp thời và thích hợp Cho đến nay có 4 phương pháp điều trị ung thư: phẫu thuật, xạ trị liệu, hóa trị liệu và một số phương pháp khác

Phương pháp hóa trị liệu truyền thống, không chỉ dùng độc lập mà còn hỗ trợ của các phương pháp phẫu thuật và xạ trị liệu

Hóa trị liệu điều trị ung thư là dùng các hóa chất làm thuốc để điệu trị bệnh ung thư Hóa trị liệu có ưu điểm là dùng phổ biến và dùng điều trị cho nhiều dòng ung thư khác nhau, đặc biệt là ung thư máu (Leukenia), loại bệnh ung thư không có khối u và định vị nên phẫu thuật và xạ trị là vô nghĩa; Số loại thuốc cho hóa trị liệu lại phong phú và đa dạng Nhưng hóa trị liệu cũng có nhược điểm là gây tác dụng phụ cho các tế bào bình thường và gây hại cho một số cơ quan Vì vậy, việc chọn các chất chỉ tác dụng gây độc với tế bào ung thư nhưng không ảnh hưởng hay gây tác dụng phụ đối với tế bào bình thường và các cơ quan trong cơ thể là vô cùng quan trọng

Cho đến nay, hóa trị liệu bệnh ung thư theo ba hướng chính: Thứ nhất tìm kiếm các chất đóng vai trò I-kB để điều chỉnh sự sinh sản của tế bào; Thứ hai tìm kiếm các chất có hoạt tính loại trừ NF-kB và I-kB hoạt động làm cho ung thư không phát triển được; Thứ

ba là tìm kiếm các chất có tác dụng thúc đẩy sự tự chết (Apoptosis) của tế bào ung thư làm đình trệ sự phát triển của ung thư

Taxos phân lập từ cây thông đỏ (Taxus wallichiana) là một ví dụ điển hình.Vinblastine và Vincristine phân lập từ cây dừa cạn (Catharanthus Roseus (L.) cũng

là những thuốc chống ung thư nổi tiếng hay Cisplatin là một thuốc chống ung thư vú, cổ

tử cung và buồng trứng truyền thống

Zerumbone phân lập từ cây gừng gió (Zingiber zerumbet Smith) đang được các nhà

khoa học thế giới quan tâm nghiên cứu làm thuốc ung thư

Việc tìm kiếm các chất có hoạt tính chống ung thư cũng có nhiều thuận lợi vì ngày nay người ta đã phân lập được nhiều dòng ung thư và nuôi cấy chúng để thử nghiệm sự gây độc invitro của các loại hóa chất khác nhau, nhằm tìm kiếm các chất có cường độ mạnh để nghiên cứu làm thuốc chống ung thư

Kho tàng thảo dược nước ta rất phóng phú và đa dạng, kinh nghiệm sử dụng cây thuốc dân tộc đã có hàng nghìn năm nay nên hướng tìm kiếm nghiên cứu các chất trong thảo dược làm thuốc chống ung thư là nghiên cứu hấp dẫn và có triển vọng Hơn nữa, ngày nay một vấn đề rất lớn đối với bệnh ung thư là phòng ngừa ung thư và chống tái phát ung thư nên nhu cầu thuốc càng thêm lớn

1.4 Bệnh dạ dày và vi khuẩn Helicobacter pylori[18]

Trước đây, người ta cho rằng, cơ chế sinh bệnh của loét dạ dày - tá tràng là do sự mất cân bằng giữa hệ thống phá hủy niêm mạc (acid dịch vị, pepsin) và hệ thống bảo vệ (lớp mucin, niêm mạc dạ dày) Do đó, mục tiêu điều trị là làm giảm tiết acid và tăng cường bảo vệ niêm mạc dạ dày Sau khi điều trị lành và ngưng thuốc, các ổ loét lại rất dễ bị tái phát, cho nên người bệnh cần phải uống thuốc duy trì lâu dài

Năm 1983, sự phát hiện ra Campylobacter pylori và mối liên quan của nó với bệnh loét dạ dày tá tràng đã đưa hai nhà khoa học người Úc được giải thưởng Nobel Y học vào năm 2005 Tuy nhiên, khi nghiên cứu các đặc tính của vi khuẩn, người ta nhận thấy nó

không hoàn toàn giống như Campylobacter, vì vậy vi khuẩn đã được chính thức đổi tên thành Helicobacter pylori (HP)

Nhiễm HP là một trong những nhiễm khuẩn mạn tính thường gặp nhất ở người.Việt Nam cũng thuộc vùng có tỷ lệ nhiễm HP cao, khoảng >70% ở người lớn Đường lây nhiễm chủ yếu là đường ăn uống (phân - miệng) hoặc lây trực tiếp (miệng - miệng) qua nước bọt

Ở những nơi có điều kiện vệ sinh kém, nguồn lây lan quan trọng là nước và thức ăn bị nhiễm

HP là một loại xoắn khuẩn Gram âm, có 3-5 chiên mao Nhờ cấu tạo này mà vi khuẩn có thể chui sâu và sống được trong lớp nhầy bao phủ trên niêm mạc dạ dày Ngoài

ra, nó còn có khả năng tiết ra men urease làm thủy phân urê thành CO2 và amôniăc (NH3) tạo nên một lớp có tính kiềm bao bọc xung quanh nó Khi gặp môi trường không thuận lợi,

vi khuẩn có thể biến đổi thành dạng hình cầu, tạm ngưng hoạt động và ngưng tiết men urease Đến khi gặp điều kiện thích hợp, nó sẽ hoạt động trở lại

- Nhiễm HP xảy ra trên 90% người bệnh có loét tá tràng, trên 70% người bệnh có loét dạ dày

- Nhiễm HP xảy ra trên 90% người bệnh có viêm dạ dày

- Nhiễm HP xảy ra trên 50% người bệnh có chứng khó tiêu không do loét

- Nhiễm HP gây nguy cơ ung thư dạ dày (tỷ lệ 90%) cao gấp 2-6 lần so với những người chưa bị nhiễm

Ngoài ra nhiễm HP còn liên quan đến một số bệnh khác như:

 Bệnh trào ngược dạ dày - thực quản (GERD)

 Bệnh tim thiếu máu cục bộ

 Ban xuất huyết giảm tiểu cầu vô căn (ITP)

 Thiếu máu thiếu sắt không rõ nguyên nhân

Nhiễm HP mãn tính làm cho hệ thống bảo vệ chống lại acid dạ dày bị yếu đi Có nhiều loại thuốc có hiệu quả trong việc điều trị loét dạ dày như thuốc trung hoà axit (antacids), thuốc ức chế thụ thể H2 và các thuốc ức chế bơm proton (PPI).Tuy nhiên, các nhóm thuốc này không diệt được hoàn toàn HP trong dạ dày Do đó, loét dạ dày có thể tái phát sau khi ngưng thuốc Vì vậy, nếu tìm thuốc diệt được HP thì sẽ ngăn chặn được loét

dạ dày và không tái phát; Tìm được thuốc diệt được HP nhất là HP kháng với thuốc kháng sinh là một nhiệm vụ quan trọng của dược học hiện đại

Ngoài ra, điều trị HP cũng được cho là yếu tố quan trọng trong việc ngăn ngừa các bệnh ung thư dạ dày, đại tràng

CHƯƠNG II

TÊN ĐỀ TÀI, MỤC TIÊU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU VÀ THỰC NGHIỆM

2.1 Tên đề tài:Nghiên cứu hoạt tính sinh học của các hợp chất cacbonyl αβ không no

phân lập từ các cây thuốc dân tộc Việt Nam

2.2 Mục tiêu của đề tài

2.2.1 Nghiên cứu phương pháp phân lập các hợp chất cacbonyl αβ không no từ một số cây thuốc dân tộc Việt Nam

2.2.2 Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất cacbonyl phân lập được

2.2.3 Khảo sát hoạt tính chống vi khuẩn gây bệnh đau dạ dày Helicobacter pylori (HP) của các chất phân lập được

2.2.4 Nghiên cứu mối liên hệ giữa cấu trúc phân tử của các hợp chất cacbonyl αβ không no và hoạt tính sinh học của các hợp chất đưa thử

2.3 Nội dung nghiên cứu

2.3.1 Tổng quan về hợp chát cacbonyl αβ không no và hoạt tính sinh học

2.3.2 Tổng quan về hợp chất cacbonyl αβ không no trong các cây thuốc dân tộc: Gừng

gió(Zingiber zerumbet Smith);Khổ sâm Bắc Bộ(Croton tonkinensis Gagnep); Nghệ vàng

(Curcuma longa L)và Hoa hòe(Sophora japonica L)

2.3.3 Xây dựng phương pháp phân lập các hợp chất cacboxyl αβ không no trong 4 loại cây thuốc nêu trên

2.3.4 Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư gan G2, ung thư vú biểu mô MCF7 và hoạt tính chống vi khuẩn HP của các sản phẩm phân lập được

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Dùng phương pháp chiết chọn lọc và các phương pháp sắc ký để phân lập các

hợp chất cacbonyl αβ không no trong 4 cây thuốc đã nêu ở trên

2.4.2 Dùng các phương pháp phổ hiện đại để khẳng định cấu trúc phân tử của các

chất phân lập được

2.4.3 Dùng phương pháp do WHO quy định để thử hoạt tính chống vi khuẩn gây đau

dạ dày Helicobater Pylori của các chất nghiên cứu

2.4.4 Dùng phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư của NCI để thử hoạt

tính chống ung thư của các chất nghiên cứu

2.5.1 Các thiết bị nghiên cứu

 Phổ IR ghi trên máy Impact 410- Nicolet 760 FT-IQ; Ép viền KBr

 MS ghi trên máy Hewlett Pachard HP5890 Serie II

 Các loại phổ cộng hưởng từ hạt nhân ghi trên máy Brucker Advance

500MHz chuẩn nội TMS, độ chuyển dịch hóa học được biểu thị ppm, hằng

số J Hz

 Bảng mỏng sắc ký 60F254 của Merck

 Silicagel cột cỡ 40-60µm của Merck

2.5.2 Các loại hóa chất và dung môi đều dùng của Merck

2.5.3 Dòng ung thư gan Hep-G2 (Hepatocullutar carcinoma) do NCI cung cấp

Ung thư biểu mô vú MCF7 (Human Breast adenocarcinoma) 20 NCI cung cấp

2.5.4 Helicobacter pylori NCTC 11638 Quốc tế

Helicobacter pylori 524N13 chúng tôi phân lập từ bệnh phẩm lâm sàng

1a Mẫu thực vật và phương pháp xử lý:

 Mẫu khổ sâm Bắc Bộ thu mua tại Hòa Bình vào tháng 8 năm 2011 Mẫu do

TS Nguyễn Quốc Bình, Viện Tài nguyên Thực vật cung cấp

 Mẫu sau khi thu mua loại bỏ các lá vàng úa chỉ lấy những lá xanh tốt không sâu bệnh Rồi phơi khô trong phòng và nghiền thành bột có cỡ là 1-1,5mm

 Chiết ngâm ở nhiệt độ phòng, 2kg bột lá khổ sâm Bắc Bộ (đã chuẩn bị ở 2a), bằng 6 lít MeOH chia làm 3 lần, mỗi lần 3 ngày Gộp dịch chiết MeOH, cất quay chân không ở 600C đến còn 500ml, pha thêm 250ml nước cất và chiết bằng n-hexan để loại hết Bigment rồi pha thêm 250ml nước nữa và dùng 600ml hỗn hợp dung môi n-hexan/ Etylaxetat tỷ lệ thể tích 1:1, mỗi lần 200ml để chiết hoạt chất, gộp dịch chiết làm khô bằng Na2SO4 khan, cất loại dung môi thu 25g cao H1, hiệu xuất 1,25% tính theo nguyên liệu thô

 Sắc ký cột H1 trên cột dài 120cm,  3cm nhồi silicagel cỡ hạt 40-60µm theo phương pháp nhồi ướt, rửa cột bằng dung môi n-hexan, axeton 2/1; thu các phân đoạn, mỗi phân đoạn 10ml; sắc ký lớp mỏng các phân đoạn thu được và gộp phân đoạn 1535 có sắc phổ giống hệt nhau và có 1 vết: loại dung môi

và kết tinh lại nhiều lần trong hệ dung môi EtOH/ H2o thu được chất rắn, ký hiệu là Tonkinin, kết tinh hình kim mầu trắng, nóng chảy 85-860C, sắc ký lớp mỏng cho 1 vết Rf=0,72 dung môi n-hexan/EtOAc 7,5/2,5 V/V hiện màu tím với Vanillin,… Phổ của sản phẩm xem phụ lục 5,6

 Các tư liệu phổ của Tonkinin xem phụ lục 1→9 số liệu phổ và phân tích xem phần kết quả nghiên cứu và thảo luận 3.2.1

2.6.2 Phân lập Zerumbone từ cây gừng gió(Zingiber zerumbet Smith)

2a Mẫu thực vật và phương pháp xử lý:

 Mẫu củ gừng gió được thu mua tại Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc vào tháng 11 năm 2011 Mẫu do TS Nguyễn Quốc Bình Viện Tài nguyên Thực vật cung cấp

 Mẫu sau khi thu mua được rửa sạch đất và cát loại bỏ phần hư hỏng và nghiền thành bột mịn cỡ 1-2 mm và bảo quản trong tủ lạnh

2b Phân lập Zerumbone

 Ép thủy lực 2 kg bột củ gừng gió tươi đến khô kiệt Nước ép được chiết bằng n-hexan ba lần mỗi lần 150ml; Bã ép cũng được chiết với n-hexan ba lần mỗi lần 150ml trong 3 ngày

 Gộp 2 dịch chiết n-hexan, làm khô bằng Na2SO4 khan rồi cất loại n-hexan thu dấu không phân cực B

 Kết tinh chậm B ở -150C rồi lọc qua phễu thủy tinh G1 thu Zerumbone thô

và đầu không phân cực C Kết tinh phân đoạn Zerumbone thô trong dung môi thích hợp n-hexan-axeton-Etylaxetat thu được Zerumbone tinh khiết 4

g Hiệu xuất theo nguyên liệu tươi 0,2%

3a Mẫu thực vật và phương pháp xử lý

 Củ nghệ vàng da cam (Curcumin lorga L) thu mua tại tỉnh Hưng Yên vào tháng 11 năm 2011 do GS.TSKH Nguyễn Nghĩa Thìn phân loại và giám định

 Mẫu sau khi thu mua được rửa sạch đất cát và loại bỏ phần hư hỏng rồi thái thành lát mỏng 1-2mm, phơi sấy ở ≤ 500C và nghiền thành bột mịn với cỡ hạt ≤ 2mm

CHCl3/CH3COOH 9/1 V/V cho 3 vết có Rf 0,69; 0,56 và 0,35 hiện màu sắc phổ với tử ngoại cho 3 màu tương ứng vàng, xanh sáng và hồng Sắc ký C trên cột cao 80cm, đường kính là 1,7cm, nhồi Silicagel cỡ hạt 40-60 µm theo phương pháp nhồi ướt, trong CHCl3 tỷ lệ chất phân tách và chất hấp phụ 1/60, rửa cột bằng CHCl3/ CH3COOH 9/1 V/V với tốc độ 1ml/phút và thu

150 phân đoạn mỗi phân đoạn 5ml Các phần đoạn 2 đến 32 có sắc phổ giống hệt nhau cả về Rf và màu sắc phổ được gộp lại và loại dung môi thu được 12g chất kết tinh màu vàng và nhiệt độ nóng chảy 183-1840

C; hiệu xuất 78,7% tính theo trọng lượng chất phân tách ký hiệu là C1, các phổ C1xem phụ lục 20 đến 28 Số liệu phổ và xác định cấu trúc phân tử xem kết quả và thảo luận 3.2.2

2.6.4 Phân lập Rutin từ hoa hòe (Sophora japonica L)

4a Mẫu thực vật và phương pháp xử lý:

 Nụ hoa hòe nếp được thu mua từ huyện Tiền Hải tỉnh Thái Bình vào tháng 8 năm 2010 Mẫu được GS.TSKH Nguyễn Nghĩa Thìn phân loại và giám định Mẫu được phơi khô ở 40-500C nghiền thành bột

4b Phân lập Rutin

 Đun 50g bột hoa hòe với 300ml EtOH 78% có 5% NaDBSA trong 40 phút rồi lọc nóng, bã lọc được đun lại 2 lần nữa Gộp 3 dịch lọc lại và cô quay đến 1/4 thể tích rồi axit hóa đến pH=5 bằng HCl 1M Lọc kết tủa, rửa bằng nước lạnh đến pH=6,5, sấy khô thu được 20g Rutin thô, hiệu xuất 40% Kết tinh lại Rutin thô trong EtOH/H2O thu được Rutin tinh khiết, có điểm nóng chảy 195-1970C; Sắc ký lớp mỏng với MeOH/HCOOH 6/4 V/V cho Rf=0,65 hiện màu vàng với Vanillin/H2SO4 2%

 Phổ UV và IR xem phụ lục 29, 30

2.7 Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ gan và ung thƣ vú

- Thực hiện thử nghiệm này tại Viện hóa học các hợp chất thiên nhiên thuộc Viện hàn

lâm khoa học và công nghệ Việt Nam

2.7.1 Phương pháp phân tích

- Theo phương pháp của Skehan & CS (1990) và Likhiwitayawuid & CS (1993) hiện đang được áp dụng tại Viện nghiên cứu ung thư Quốc gia của Mỹ (NCI) và trường Đại học Dược, Đại học Tổng hợp Iilinois, Chicago, Mỹ

2.7.2 Dòng tế bào

- Dòng Hep –G2 (Hepatocellular carcinoma – Ung thư gan)

- MCF7: Human Breast adenocarcinoma (Ung thư biểu mô vú)

2.7.3 Môi trường nuôi cấy

- DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) hoặc MEM (Minimum Essential Medium With Eagle’s salt) Có bổ sung L- glutamine, Sodium piruvat, NaHCO3, PSF (Penixillin- Streptomycin sulfate- Fungizone); NAA (Non- Essential Amino Acids); 10% BCS (Bovine Calf Serum)

- Tripsin-EDTA 0,05%; DMSO (Dimethyl Sufoside); TCA (Trichloro Acetic acid); Tris Base; PBS (Phosphate Buffered Saline); SRB (Sulfo Rhodamine B); Acid Acetic

- Giá trị CS: Là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ nào đó của chất thử tính theo

% so với đối chứng Dựa trên kết quả đo được của chúng OD (ngày 0), DMSO 10% và

so sánh với giá trị OD khi trộn mẫu để tìm giá trị CS (%) theo công thức:

ODmâutrang m

ODthínghie sc

- Giá trị CS% sau khi tính theo công thức trên, được đưa vào tính toán Excel để tìm ra

% trung bình ± độ lệch tiêu chuẩn của phép thử được lặp lại 3 lần theo công thức của Ducan như sau: Độ lệch tiêu chuẩn σ

 Kết quả thử xem bảng 3.4 và 3.5 phần bàn luận kết quả

2.8 Thử nghiệm hoạt tính chống HP của các hợp chất phân lập đƣợc

- Thử nghiệm này được thực hiện tại Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương

2.8.1 Phương pháp

- Dựa vào phương pháp thử nghiệm của tổ chức Y tế thế giới (WHO)

2.8.2 Hóa chất và môi trường

- Thạch máu ngựa 10%

- Khoáng Oxydase

- Dung dịch Catalase

- Urease

2.8.3 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy có mẫu cần thử tính diệt khuẩn

- Thạch máu cơ bản (Blood agar base) được chuẩn bị theo hướng dẫn của hãng sản xuất

(Merck)

- Để nguội thạch đến 500C thêm 10% máu ngựa và huyết dịch của mẫu thử nghiệm

- Đổ các đĩa thạch (đường kính 60mm) ở các nồng độ khác nhau (mỗi mẫu cần 3 đĩa)

2.8.4 Chuẩn bị canh khuẩn thử nghiệm

- Vi khuẩn được pha loãng trong dung dịch nước muối sinh lý 8,5‰ đạt nồng độ 3x108

cfu/ml (Mc Faland 1.0)

- Pha loãng bậc 10 đạt nồng độ vi khuẩn thử nghiệm 106 cfu/ml

2.8.5 Pha loãng mẫu để thử nghiệm: đạt nồng độ 10mg/1ml

- Các tuýp được lắc, trộn đều cho đến khi lượng bột tan đều thành huyết dịch

2.8.6 Nuôi cấy chủng vi khuẩn

- Cấy chủng vi khuẩn chuẩn:

 H.pylori NCTC 11638 (chủng quốc tế)

 Chủng H.Pylori 524N13 (chủng được phân lập từ bệnh phẩm lâm sàng)

- Helicobacter pylori 133 trên môi trường thạch máu ngựa 10%, ở điều kiện 5-6% O2, 10% CO2, 80-85% N2 (túi Gas CampyGentm Oxoid, Anh), 370C/72h

8-2.8.7 Kiểm tra tính diệt khuẩn

- Cấy huyết dịch vi khuẩn 106 lên các đĩa thạch ở các nồng độ khác nhau

- Cho các đĩa thạch đã cấy vi khuẩn vào bình nuôi ở điều kiện kiện 5-6% O2, 8-10% CO2, 80-85% N2(túi Gas CampyGentm Oxoid, Anh), 370C/72h

- Sau 48-72 giờ nhuộm soi khuẩn lạc rồi xác định tính chất sinh vật hoá học của vi khuẩn

(Kết quả xem bảng 3.6 phần biện luận kết quả nghiên cứu và thảo luận)

có thể có hy vọng tìm ra chất làm thuốc mới làm mô hình cho tổng hợp hóa học

Để đạt được hai mục tiêu trên, việc lựa chọn loại bệnh tật có mô hình thử nghiệm chính xác và loại cây thuốc dân tộc có cấu trúc phân tử hợp chất cacbonyl αβ không no có

ý nghĩa quyết định cho sự thành công của nghiên cứu

Về bệnh tật, chúng tôi chọn bệnh ung thư và bệnh viêm loét dạ dày là hai loại bệnh phổ biến trên thế giới Bệnh ung thư đang phát triển mạnh nước ta theo thống kê của Viện Nghiên cứu phòng ngừa ung thư Trung ương Hàng năm có hàng vạn người mắc bệnh mới, hàng vạn người chết vì ung thư Nguyên nhân là môi trường ngày càng ô nhiễm, thực phẩm ngày càng nhiễm độc… Bệnh viêm loét dạ dày là bệnh phổ biến ở nước ta khoảng 20% dân

số; 95% nguyên nhân gây viêm loét dạ dày là do vi khuẩn Helicobater pylori (HP) Vi

khuẩn này tuy mới phát hiện gần đây do các nhà khoa học Úc, những người đã phát hiện phân lập và nuôi cấy được nó để thử nghiệm và xét nghiệm với các thuốc một cách chính xác Sự lựa chọn hai bệnh này nhằm đưa các kết quả nghiên cứu vào phục vụ sức khỏe cộng đồng một cách rộng rãi

Về cây thuốc, cây thứ nhất chúng tôi chọn cây khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis Gagnep) Đây là cây thuốc dân tộc nổi tiếng và là cây đặc hữu Việt Nam Hiện nay chưa có

tài liệu thử hoạt tính chống bệnh viêm loét dạ dày của cây này, mặc dù nhân dân sử dụng cây này để chữa bệnh đau dạ dày bao đời nay Một cây mà hàm lượng các Diterpen khung ent-kaur-16-ene-15-one (Hình 3.1) chiếm đa số, đây là các hợp chất cacbonyl αβ không no với nhóm Xeton vòng 5 liên hợp với 1 liên kết đội đầu mạch Cho đến nay, người ta đã tìm

được 13 loại hợp chất này trong cây khổ sâm Bắc Bộ Đây là một nguồn nguyên liệu giàu hợp chất cacbonyl αβ không no

Hình 3.1

Trong 13 dẫn xuất ent-kaur-16-en-15-on có nhiều hợp chất có hoạt tính chống ung thư mạnh invitro như đề tài cấp Nhà nước mã số ĐT-ĐL 2005/05 do GS TSKH Phan Tống Sơn làm chủ nhiệm đề tài đã khẳng định Nhưng hợp chất nào trong cây khổ sâm Bắc Bộ

có tác dụng tiêu diệt vi khuẩn gây ra bệnh viêm loét dạ dày thì chưa có một tài liệu nào ở trong nước và trên thế giới công bố Do đó, cơ sở khoa học cho việc dân gian dùng cây khổ sâm Bắc Bộ để chữa bệnh viêm loét dạ dày còn bỏ ngỏ Đây là vấn đề lý thú mà luận án này quan tâm

Cây thứ 2 chúng tôi chọn là cây gừng gió (Zingiber zerumbet Smith), đây là cây

thuốc dân tộc được nhân dân sử dụng để chữa bệnh về tiêu chảy, thấp khớp, cảm cúm Nó

là cây hoang dại và phổ biến ở các tỉnh miền núi nước ta, là cây dễ trồng dễ mọc, cho năng xuất cao, có tinh dầu và hàm lượng Zerumbone lớn Các nghiên cứu hiện đại cho thấy Zerumbone là chất có hoạt tính ức chế mạnh sự phát triển tế bào ung thư của 18 loại ung thư khác nhau[4] theo cơ chế loại trừ NF-kB I-kB Kinase hoạt động và thúc đẩy sự tự chết (Apoptosis)[9] của tế bào ung thư Zerumbone là một Xeton vòng lớn 11 cạnh trong phân

tử có một nhóm cacbonyl và 2 liên kết đôi αβ liên hợp ở 2 bên (Hình 3.2)

O

OH

A C O

1 2 3

Hình 3.2

Về hoạt động tính chống ung thư của Zerumbone đã có hàng trăm công trình đề cập đến Cơ chế chống ung thư của Zerumbone cũng đã nghiên cứu rõ ràng Nhưng hoạt tính chống vi khuẩn HP và các vi khuẩn gây tiêu chảy thì chưa có tài liệu nào đề cập đến Do đó việc dùng gừng gió để chữa trị các bệnh đường ruột chưa có cơ sở khoa học để khẳng định Đây là vấn đề chúng tôi quan tâm trong luận án này

Cây số 3 được chọn là cây hoa hòe (Sophora japonica L) Nó là cây được trồng

nhiều nhất ở Tiền Hải, Thái Thụy tỉnh Thái Bình Nhân dân sử dụng hoa để chữa các bệnh

về tim mạch, huyết áp Chất hoạt động sinh học của hoa hòe là Rutin, nó là một flovonoit

có công thức cấu tạo hình 3.3

Hình 3.3

Rutin là hợp chất cacbonyl αβ không no nhưng liên kết π của nhóm này nằm trong một hệ π liên hợp mang tính thơm của nhân Flavonoit C6-C3-C6

Cây thứ 4 được chọn là cây nghệ vàng(Curcuma longa L).Nghệ vàng là cây thuốc

dân tộc nổi tiếng từ lâu đời Nhân dân sử dụng đểchữa viêm loét dạ dày[13] Như trong phần tổng quan đã trình bày hoạt chất chính của nghệ vàng là Curcuminoit là hỗn hợp của

3 loại Curcumin: Curcumin I, Curcumin II, Curcumin III Cả 3 loại Curcumin này đều có nhóm chức cacbonyl αβ không no trong phân tử Nhưng thành phần chính của các

Curcumin trong nghệ vàng là Curcumin I chiếm 60-70% tổng các Curcumin.Vì vậy, chúng tôi chọn Curcumin I cho nghiên cứu của mình

Curcumin I có tên khoa học là Bis feruloyl metan công thức cấu tạo hình 3.4

Những vấn đề trình bày trên cho thấy sự lựa chọn hợp chất cacbonyl αβ không no theo logic: Hợp chất có một nhóm cacbonyl liên hợp với một liên kết đôi ở vị trí αβ (Tonkinin, hình 3.1) Hợp chất có một nhóm cacbonyl liên hợp với hai liên kết đôi ở vị trí

αβ ở hai bên (Zerumbone, hình 3.2), hợp chất có một nhóm cacbonyl liên hợp với nhiều liên kết đôi trong một hệ liên hợp mang tính thơm (Rutin, hình 3) và hợp chất có 2 nhóm cacbonyl αβ không no giống hệt nhau (Curcumin I hình 3.4) Logic lựa chọn này có thể có nhiều hy vọng tìm ra được những điều lý thú về mối liên hệ giữa hoạt tính sinh học và cấu trúc phân tử hợp chất cacbonyl αβ không no Sự lựa chọn các cây để thử nghiệm hoạt tính chống các bệnh ung thưhiểm nghèo và bệnh viêm loét dạ dày phổ biển là dựa vào kinh nghiệm của y học dân tộc và các kết quả nghiên cứu của khoa học thế giới

CH3OHO

OCH3OH

3.2 Phân lập các hợp chất cacbonyl αβ không no trong các cây thuốc dân tộc đã chọn

3.2.1 Phân lập Tonkinin từ cây khổ sâm Bắc Bộ(Croton tonkinensis Gagnep)

Như phần tổng quan đã trình bày, cây đặc hữu Việt Nam khổ sâm Bắc Bộ là nguồn nguyên liệu giàu hợp chất cacbonyl αβ không no có nhiều dẫn xuất của ditecpen ent-kauran Cho đến nay người ta đã phân lập và xác định cấu trúc được 13 dẫn xuất của ent-Kaur-15-ene-16-one từ cây này Chúng tôi phân lập hợp chất cacbonyl αβ không no trong cây khổ sâm Bắc Bộ theo tài liệu[14], nhưng thay vì chiết các hoạt chất bằng CH2CH2chúng tôi chiết bằng hỗn hợp dung môi n-hexan/EtoAc tỷ lệ 1:1, sau đó phân lập các hợp chất trong cặn chiết bằng sắc ký cột và kết tinh lại sản phẩm trong etanol/nước Bằng cách này, chúng tôi phân lập được một chất có tinh thể hình kim, không màu nóng chảy ở 85-

860C, Rf=0,75 (n-hexan/EtoAc;95/5.V/V hiện màu vàng chanh với Vanillin khi nguội và tím khi nóng Các hằng số vật lý này không trùng với các hằng số vật lý của ent-Kauran phân lập được từ cây khổ sâm Bắc Bộ đã công bố[14], và chúng tôi đặt tên là Tonkinin, có công thức cấu tạo phân tử như hình 3.5

Hình 3.5

Phổ hồng ngoại (phụ lục 1) cho thấy trong phân tử có nhóm OH

υ=3482 cm-1, Metyl, Metylen υCH=2945cm-1, nhóm xeton vòng 5 υxeton = 1712 cm-1liên kết đôi 2 nhóm thế đầu mạch υc=c=1642 cm-1 và σCH=85 cm-1

Phổ13C-MMR (phụ lục 2,3) cho thấy phân tử Tonkinin có 20 nguyên tử cacbon trong đó theo DEPT (phụ lục 4) có 3CH3, 8CH2, 4CH và 5 cacbon bậc 4 Đáng chú ý có nhóm cacbonyl C= 210ppm,liên kêt đôi C = 151.34 và 115,40ppm

O

OH

A C O

1 2 3

16 17

20