Luận văn thạc sĩ Di truyền học, Ký sinh trùng, Bệnh sốt rét, Tính đa hình

Đại học quốc gia hà nội Tr-ờng đại học khoa học tự nhiên Tr-ơng Văn Hạnh Nghiên cứu tính đa hình di truyền của ký sinh trùng sốt rét và tính kháng thuốc sốt rét của Plasmodium falcipa

Đại học quốc gia hà nội

Tr-ờng đại học khoa học tự nhiên

Tr-ơng Văn Hạnh

Nghiên cứu tính đa hình di truyền của ký sinh trùng sốt rét và tính kháng thuốc sốt rét

của Plasmodium falciparum tại một số tỉnh biên giới

thuộc khu vực Bắc Tr-ờng Sơn, Việt Nam

Luận án tiến sĩ sinh học

Đại học quốc gia hà nội

Tr-ờng đại học khoa học tự nhiên

Tr-ơng Văn Hạnh

Nghiên cứu tính đa hình di truyền của ký sinh trùng sốt rét và tính kháng thuốc sốt rét

của Plasmodium falciparum tại một số tỉnh biên giới

thuộc khu vực Bắc Tr-ờng Sơn, Việt Nam

Lêi cam ®oan T«i xin cam ®oan ®©y lµ c«ng tr×nh nghiªn cøu cña b¶n th©n t«i C¸c sè liÖu, kÕt qu¶ trong luËn ¸n nµy lµ trung thùc vµ ch-a tõng ®-îc c«ng bè trong bÊt kú c«ng tr×nh hoÆc tµi liÖu nµo

T¸c gi¶

Tr-¬ng V¨n H¹nh

Lời cảm ơn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Trịnh Đình Đạt, PGS.TS Hồ Đình Trung đã tận tình h-ớng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi vô cùng biết ơn cố PGS.TS Nguyễn Đức Mạnh, Thầy đã h-ớng dẫn và giúp đỡ tôi trong những năm đầu học tập nghiên cứu sinh và thực hiện đề tài nghiên cứu

Tôi xin trân trọng cảm ơn Lãnh đạo Viện Sốt rét-KST-CTTƯ đã tạo

điều kiện thuận lợi, ủng hộ tôi về vật chất, thời gian và tinh thần trong quá trình thực hiện luận án

Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô trong Bộ môn Di truyền, các thầy cô Khoa Sinh học, Phòng Đào tạo Sau đại học, các thầy cô trong Ban giám hiệu Tr-ờng Đại học Khoa học Tự nhiên đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập tại Tr-ờng

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ nghiên cứu Khoa Sinh học Phân tử và cán bộ các Khoa/Phòng của Viện Sốt rét-KST-CTTƯ, cán bộ các Trung tâm phòng chống sốt rét tỉnh Quảng Bình, Quảng Trị và Thừa Thiên Huế đã giúp đỡ, ủng hộ và động viên tôi trong quá trình học tập và thực hiện

đề tài trong phòng thí nghiệm cũng nh- ở tại các địa điểm nghiên cứu

Cảm ơn gia đình thân yêu và bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ, tạo

điều kiện cho tôi học tập và nghiên cứu

Tr-ơng Văn Hạnh

Mục Lục

Mở Đầu 1

Ch-ơng 1- Tổng quan tài liệu 5

1.1 Bệnh sốt rét 5

1.2 Các loài ký sinh trùng gây bệnh sốt rét ở ng-ời 5

1.2.1 Thành phần loài ký sinh trùng gây bệnh sốt rét ở ng-ời 5

1.2.2 Chu kỳ phát triển của ký sinh trùng sốt rét 5

1.3 Muỗi truyền bệnh sốt rét 7

1.4 Tình hình sốt rét trên thế giới và Việt Nam 8

1.4.1 Tình hình sốt rét trên thế giới 8

1.4.2 Tình hình sốt rét tại Việt Nam 10

1.4.3 Đặc điểm về điều kiện tự nhiên, kinh tế xã hội và tình hình sốt rét tại các tỉnh biên giới thuộc khu vực Bắc Tr-ờng Sơn, Việt Nam 12

1.5 Một số kỹ thuật sử dụng trong chẩn đoán, phân biệt 4 loài KSTSR 15 1.5.1 Kỹ thuật xét nghiệm lam máu nhuộm giemsa 15

1.5.2 Kỹ thuật chẩn đoán nhanh bằng que thử (Rapid diagnostic test) 16

1.5.3 Kỹ thuật PCR chẩn đoán, phân biệt bốn loài ký sinh trùng sốt rét 16

1.6 Nghiên cứu tính đa hình di truyền của ký sinh trùng sốt rét 19

1.6.1 Đa hình di truyền của P falciparum 19

1.6.2 Đa hình di truyền của P vivax 25

1.7 Ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc 28

1.7.1 Định nghĩa và phân loại ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc 28

1.7.2 Một số loại thuốc sử dụng trong điều trị bệnh sốt rét 29

1.7.3 Tình hình KSTSR kháng thuốc trên thế giới và Việt Nam 31

1.7.4 Cơ chế tác động của thuốc sốt rét đối với KSTSR 35

1.7.5 Đột biến gen ở P falciparum liên quan đến kháng thuốc sốt rét 38

1.7.6 Một số kết quả nghiên cứu phân tích đột biến gen của P falciparum

kháng thuốc sốt rét 41

Ch-ơng 2 - Đối t-ợng, vật liệu Và ph-ơng pháp nghiên cứu 43

2.1 Đối t-ợng nghiên cứu 43

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 43

2.2.1 Địa điểm nghiên cứu 43

2.2.2 Thời gian nghiên cứu 43

2.3 Vật liệu nghiên cứu 43

2.3.1 Dụng cụ và hóa chất cho kỹ thuật xét nghiệm lam máu 43

2.3.2 Thiết bị và hóa chất tách chiết ADN 43

2.3.3 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất để tiến hành phản ứng PCR 44

2.3.4 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất cho điện di phân tích kết quả PCR 45

2.4 Ph-ơng pháp nghiên cứu 45

2.4.1 Thiết kế nghiên cứu 45

2.4.2 Mẫu nghiên cứu 45

2.4.3 Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu 47

2.4.4 Cách đánh giá kết quả 58

2.4.5 Công thức tính các chỉ số và phân tích số liệu nghiên cứu 60

Ch-ơng 3 - Kết quả và thảo Luận 62

3.1 Thành phần, cơ cấu loài KSTSR tại các tỉnh Quảng Bình, Quảng Trị và Thừa Thiên Huế thuộc khu vực Bắc Tr-ờng Sơn, Việt Nam 62

3.1.1 Kết quả xác định thành phần, cơ cấu loài KSTSR bằng kỹ thuật xét nghiệm lam máu nhuộm giemsa 62

3.1.2 Kết quả xác định thành phần, cơ cấu loài KSTSR bằng kỹ thuật PCR 64

3.2 Tính đa hình di truyền của quần thể P falciparum tại khu vực

Bắc Tr-ờng Sơn, Việt Nam 71

3.2.1 Tính đa hình di truyền của P falciparum theo locus msp1 71

3.2.2 Tính đa hình di truyền của P falciparum theo locus msp2 79

3.2.3 Tính đa hình di truyền của P falciparum theo locus glurp 86

3.3 Tính đa hình di truyền của P vivax ở khu vực Bắc Tr-ờng sơn, Việt Nam 89

3.3.1 Tính đa hình di truyền của P vivax theo locus Pvcs 89

3.3.2 Tính đa hình di truyền theo locus Pvmsp1 93

3.4 Đặc điểm KSTSR kháng thuốc tại 3 tỉnh Quảng Bình, Quảng Trị và Thừa Thiên Huế thuộc khu vực Bắc Tr-ờng Sơn Việt Nam 97

3.4.1 Tỷ lệ đột biến của P falciparum kháng thuốc pyrimethamin 97

3.4.2 Tỷ lệ đột biến của P falciparum kháng thuốc sulfadoxin 101

3.4.3 Tỷ lệ đột biến của P falciparum kháng thuốc chloroquin 106

KếT LUậN Và KIếN NGHị 112

Kết luận 112

Kiến nghị 113

Danh mục các công trình khoa học liên quan đến Nội dung luận án 114

Tài liệu tham khảo 115

Phụ lục 138

Danh mục bảng

Bảng 1.1 Tình hình sốt rét ở khu vực Tây Thái Bình D-ơng năm 2008 11 Bảng 1.2 Tình hình sốt rét theo khu vực ở Việt Nam năm 2006 và 2010 12 Bảng 1.3 Tình hình sốt rét tại khu vực Bắc Tr-ờng Sơn năm 2008 và 2011 15 Bảng 1.4 Thành phần và tên của một số thuốc sốt rét 30

Bảng 1.5 Thời gian KSTSR P falciparum kháng với các loại thuốc sốt rét 33 Bảng 1.6 Đột biến điểm trên gen dhfr của P falciparum liên quan

đến kháng pyrimethamin 38

Bảng 1.7 Mối liên quan giữa đột biến điểm trên gen dhfr và đáp ứng

với pyrimethamin trên in vitro của một số chủng, phân lập chuẩn 39 Bảng 1.8 Đột biến điểm trên gen dhps của P falciparum liên quan

đến kháng sulfadoxin 40

Bảng 1.9 Mối liên quan giữa đột biến điểm trên gen dhps và đáp ứng

với sulfadoxin trên in vitro của một số chủng, phân lập chuẩn 40 Bảng 2.1 Trình tự các cặp mồi nhân bản các kiểu gen của P falciparum 50

Bảng 2.2 Trình tự các cặp mồi xác định kiểu gen nhạy và đột biến ở các

vị trí đột biến trên gen dhfr 54

Bảng 2.3 Trình tự các cặp mồi xác định kiểu gen nhạy và đột biến ở các

vị trí đột biến trên gen dhps 56

Bảng 3.1 Tỷ lệ ng-ời dân mắc sốt rét tại 3 tỉnh Quảng Bình, Quảng Trị

và Thừa Thiên Huế bằng kỹ thuật xét nghiệm lam máu nhuộm giemsa 62 Bảng 3.2 Kết quả xác định tỷ lệ nhiễm đơn, nhiễm phối hợp các loài

KSTSR bằng kỹ thuật xét nghiệm lam máu nhuộm giemsa 63 Bảng 3.3 Cơ cấu loài KSTSR tại khu vực Bắc Tr-ờng Sơn bằng kỹ thuật xét nghiệm lam máu nhuộm giemsa 64 Bảng 3.4 Tỷ lệ phát hiện bệnh nhân nhiễm đơn, nhiễm phối hợp loài

KSTSR theo kỹ thuật PCR 65 Bảng 3.5 So sánh tỷ lệ bệnh nhân nhiễm đơn và nhiễm phối hợp ở khu

vực Bắc Tr-ờng Sơn Việt Nam 67

Bảng 3.6 Cơ cấu loài KSTSR tại khu vực Bắc Tr-ờng Sơn theo kỹ thuật xét nghiệm lam máu nhuộm giemsa và PCR 69

Bảng 3.7 Tỷ lệ phân bố các kiểu gen của P falciparum theo locus msp1 71

Bảng 3.8 Tỷ lệ mẫu nhiễm đơn và nhiễm phối hợp kiểu gen theo locus msp1……… 72

Bảng 3.9 Tần suất xuất hiện của các alen ở kiểu gen K1 73

Bảng 3.10 Tần suất xuất hiện của các alen ở kiểu gen MAD20 75

Bảng 3.11 Tỷ lệ phân bố các kiểu gen của P falciparum theo locus msp2 79

Bảng 3.12 Tần suất xuất hiện của các alen ở kiểu gen FC 81

Bảng 3.13 Tần suất xuất hiện của các alen ở kiểu gen IC 83

Bảng 3.14 Số l-ợng và tần suất các alen theo locus glurp 86

Bảng 3.15 Số l-ợng và tần suất alen của P vivax theo locus Pvcs 90

Bảng 3.16 Tỷ lệ kiểu gen và nhiễm đơn, nhiễm phối hợp theo locus Pvcs 91

Bảng 3.17 Tần suất các alen của P vivax theo locus Pvmsp1 95

Bảng 3.18 Kết quả phân tích đột biến trên gen dhfr của P falciparum 98

Bảng 3.19 Tỷ lệ mẫu bệnh nhân nhạy, kháng với pyrimethamin 98

Bảng 3.20 Tỷ lệ P falciparum mang kiểu gen nhạy và đột biến kháng pyrimethamin trong quần thể 99

Bảng 3.21 Số l-ợng đột biến điểm và mức độ đáp ứng với pyrimethamin 100

Bảng 3.22 Kết quả phân tích đột biến trên gen dhps 102

Bảng 3.23 Tỷ lệ mẫu bệnh nhân nhạy, kháng với sulfadoxin 103

Bảng 3.24 Tỷ lệ P falciparum mang kiểu gen nhạy và đột biến kháng với thuốc sulfadoxin trong quần thể 109

Bảng 3.25 Số l-ợng đột biến điểm và mức độ đáp ứng với sulfadoxin 105

Bảng 3.26 Kết quả phân tích đột biến điểm 76 trên gen Pfcrt 106

Bảng 3.27 Tỷ lệ mẫu bệnh nhân nhạy, kháng với thuốc chloroquin 107

Bảng 3.28 Tỷ lệ P falciparum mang kiểu gen nhạy, và kiểu gen đột biến kháng với thuốc chloroquin trong quần thể 107

Danh mục hình

Hình 1.1 Chu trình phát triển của ký sinh trùng sốt rét 6

Hình 1.2 Bản đồ các quốc gia và vùng lãnh thổ có lan truyền sốt rét năm 2012 10

Hình 1.3 Bản đồ địa hình khu vực Bắc Tr-ờng Sơn 13

Hình 1.4 Sơ đồ cấu trúc locus msp1 của P falciparum 19

Hình 1.5 Sơ đồ cấu trúc locus msp2 của P falciparum 20

Hình 1.6 Sơ đồ mô tả cấu trúc locus Pvcs của P vivax 26

Hình 1.7 Sơ đồ mô tả cấu trúc locus Pvmsp1 của P vivax 26

Hình 1.8 Tác động của pyrimethamin và sulfadoxin lên enzym dihydrofolate reductase và dihydropteroate synthase trong chu trình sinh tổng hợp axit folic 36

Hình 1.9 (A,B) Cơ chế tác động của chloroquin trong lysosome của KST 37

Hình 2.1 Sơ đồ kỹ thuật PCR lồng chẩn đoán, phân biệt 4 loài KSTSR 49

Hình 2.2 Sơ đồ kỹ thuật PCR xác định kiểu gen của P falciparum 51

Hình 3.1 ảnh điện di sản phẩm PCR mẫu bệnh nhân nhiễm đơn P falciparum và P vivax 66

Hình 3.2 ảnh điện di sản phẩm PCR các mẫu bệnh nhân nhiễm phối hợp 2, 3 loài KSTSR 66

Hình 3.3 Tỷ lệ bệnh nhân nhiễm đơn và nhiễm phối hợp theo kỹ thuật xét nghiệm lam máu nhuộm giemsa và PCR 67

Hình 3.4 Biểu đồ cơ cấu loài KSTSR ở khu vực Bắc Tr-ờng Sơn, Việt Nam 68

Hình 3.5 Biểu đồ biểu diễn sự phân bố các kiểu gen theo locus msp1… 72

Hình 3.6 Biểu đồ tần suất xuất hiện của các alen ở kiểu gen K1 74

Hình 3.7 ảnh điện di sản phẩm PCR một số mẫu nhiễm kiểu gen K1 74

Hình 3.8 Biểu đồ tần suất xuất hiện của các alen ở kiểu gen MAD20 76

Hình 3.9 ảnh điện di một số mẫu bệnh nhân nhiễm kiểu gen MAD20 76

Hình 3.10 ảnh điện di một số mẫu bệnh nhân nhiễm kiểu gen RO33 77

Hình 3.11 Biểu đồ biểu diễn sự phân bố các kiểu gen theo locus msp2 80

Hình 3.12 Biểu đồ tần suất xuất hiện của các alen ở kiểu gen FC 82

Hình 3.13 ảnh điện di một số bệnh nhân nhiễm kiểu gen FC 82

Hình 3.14 Biểu đồ tần suất xuất hiện của các alen ở kiểu gen IC 84

Hình 3.15 ảnh điện di một số bệnh nhân nhiễm kiểu gen IC 84

Hình 3.16 Biểu đồ tần suất xuất hiện của các alen của locus glurp 87

Hình 3.17 ảnh điện di sản phẩm PCR của một số mẫu bệnh nhân nhiễm các alen theo locus glurp 87

Hình 3.18 ảnh điện di sản phẩm PCR của các alen ở locus Pvcs 89

Hình 3.19 ảnh điện di các mẫu mang kiểu gen VK210 và VK247 90

Hình 3.20 Biểu đồ tần suất xuất hiện của các alen ở locus Pvcs 91

Hình 3.21 ảnh điện di các alen đặc tr-ng ở đoạn F1 93

Hình 3.22 ảnh điện di các alen đặc tr-ng ở đoạn F2 94

Hình 3.23 ảnh điện di các alen đặc tr-ng ở đoạn F3 94

Hình 3.24 Tần suất của các alen ở đoạn F1, F2 và F3 của quần thể P vivax 96

Hình 3.25 ảnh điện di phát hiện đột biến ở vị trí 108 của gen dhfr 99

Hình 3.26 ảnh điện di phát hiện đột biến ở vị trí 581 của gen dhps 103

Hình 3.27 ảnh điện di phát hiện đột biến ở vị trí 613 của gen dhps 103

Hình 3.28 ảnh điện di phát hiện đột biến kháng với chloroquin 108

C¸c ch÷ viÕt t¾t

AO Acridine Orange

dhfr dihydrofolate reductase gene

dhps dihydropteroate synthase gene

dNTPs deoxynucleotide triphosphate

EDTA ethylenediaminetetraaetic acid

ELISA Enzyme linked Immuno-Sorbant

Assay

glurp glutamate rich protein gene

IFA Indirect Fluorescent Antibody

IHA Indirect Heamagglutination

ph©n tö ADN MOI Multiplicity Of Infection NhiÔm ®a alen

msp1 merozoite surface protein 1 gene Gen m· hãa protein bÒ

mÆt 1

msp2 merozoite surface protein 2 Gen m· hãa protein bÒ

mÆt 2 RFLP Restriction Fragment Length

PCR: Polymerase Chain Reaction

Pfcrt Chloroquine resistance transporter

gene

Gen vËn chuyÓn kh¸ng chloroquin

Pvcs Plasmodium vivax

circumsporozoite protein gene

Gen m· hãa protein thÓ

thoa trïng cña P vivax

Pvmsp1 Plasmodium vivax merozoite

surface protein 1 gene

Gen m· hãa protein bÒ

mÆt merozoit 1 cña P

vivax

QBC Quantitative Buffy Coat

SDS Sodium dodecyl sulphate

WHO World Heath Organization Tæ chøc Y tÕ ThÕ giíi

Mở Đầu

Sốt rét (SR) là một trong những bệnh phổ biến, ảnh h-ởng nghiêm trọng tới sức khoẻ con ng-ời cũng nh- đời sống kinh tế - xã hội, đặc biệt là ở các n-ớc nghèo Theo báo cáo của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), hiện có 99 quốc

gia và vùng lãnh thổ có SR l-u hành -ớc tính khoảng 3,3 tỉ ng-ời sống trong vùng có nguy cơ SR và ng-ời dân sống trong vùng cận sa mạc Sahara của Châu Phi có nguy cơ mắc bệnh cao nhất Năm 2010, -ớc tính trên thế giới có khoảng 216 triệu ca bệnh sốt rét và 655 nghìn ng-ời tử vong trong đó chủ yếu

là trẻ em d-ới 5 tuổi và phụ nữ có thai ở Châu Phi [152]

Việt Nam nằm trong vùng SR l-u hành, điều kiện thời tiết, sinh cảnh phù hợp cho bệnh phát triển Từ năm 1980, bệnh SR quay trở lại và ngày càng nghiêm trọng với đỉnh cao là năm 1991 cả n-ớc có hơn 1 triệu ng-ời mắc, có 4.646 ng-ời chết, hơn 144 vụ dịch lớn xảy ra ở nhiều địa ph-ơng [3] Việc thực hiện tốt các hoạt động phòng chống SR những năm qua đã làm giảm rõ rệt tỷ lệ mắc và tử vong do SR và Việt Nam trở thành một trong những quốc gia thành công nhất trong công tác phòng chống SR trên thế giới [48] Năm

2011, cả n-ớc có 45.588 bệnh nhân SR và 14 ng-ời tử vong do sốt rét [58]

Các tỉnh Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Quảng Trị và Thừa Thiên Huế nằm trong khu vực Bắc Tr-ờng Sơn, có đ-ờng biên giới với Lào [45] Ng-ời dân sinh sống tại vùng biên giới này chủ yếu là ng-ời dân tộc thiểu số, giao thông khó khăn, kinh tế chậm phát triển, cùng với sự giao l-u lớn giữa ng-ời dân hai vùng biên giới cho nên công tác phòng chống sốt rét gặp nhiều khó khăn [17, 32, 46] Theo kết quả phân vùng dịch tễ sốt rét can thiệp tại Việt Nam năm 2009, vùng trọng điểm sốt rét ở khu vực này tập trung chủ yếu ở hai tỉnh Quảng Bình và Quảng Trị trong đó sốt rét l-u hành nặng ở các huyện có biên giới với Lào nh- huyện Lệ Thủy tỉnh Quảng Bình, huyện H-ớng Hóa tỉnh Quảng Trị [22] Huyện A L-ới tỉnh Thừa Thiên Huế năm 2005 còn là vùng sốt rét l-u hành nặng nh-ng đến nay tình hình SR đã giảm nhiều [21] Ba huyện

này mang nhiều điểm đặc tr-ng cho tình hình lan truyền sốt rét của khu vực Bắc Tr-ờng Sơn, Việt Nam nên đ-ợc lựa chọn làm địa điểm nghiên cứu

Các ph-ơng pháp cổ điển nh- ph-ơng pháp chẩn đoán ký sinh trùng sốt rét (KSTSR) bằng kỹ thuật xét nghiệm lam máu nhuộm giemsa, đánh giá

KSTSR nhạy, kháng với thuốc điều trị sốt rét bằng kỹ thuật in vivo và in vitro

tại thực địa đ-ợc áp dụng trong công tác phòng chống sốt rét ở nhiều n-ớc trên thế giới và ở Việt Nam [55] Tuy vậy, các ph-ơng pháp này còn có một số hạn chế nh- kỹ thuật xét nghiệm lam máu nhuộm giemsa khó phát hiện đ-ợc những tr-ờng hợp ng-ời bệnh nhiễm KSTSR với mật độ thấp hoặc những tr-ờng hợp bệnh nhân nhiễm phối hợp nhiều loài KSTSR trong đó chỉ có một loài trội hẳn về số l-ợng [9, 74] Đánh giá KSTSR nhạy, kháng với thuốc điều

trị sốt rét bằng kỹ thuật in vivo và in vitro tại thực địa đòi hỏi phải theo dõi dài

ngày, tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân nghiêm ngặt và khó phân biệt chính xác các tr-ờng hợp tái phát hay nhiễm mới [11, 138, 152]

Việc áp dụng các ph-ơng pháp sinh học phân tử trong nghiên cứu về thành phần, cơ cấu loài KSTSR [9, 136], tính đa hình di truyền của quần thể KSTSR [102, 138], xác định KSTSR mang đột biến gen liên quan đến kháng một số loại thuốc điều trị sốt rét [8, 125, 146] sẽ khắc phục đ-ợc những khó khăn mà các ph-ơng pháp cổ điển không giải quyết đ-ợc, cung cấp các số liệu chính xác với độ tin cậy cao, đem lại hiệu quả cho công tác phòng chống và loại trừ SR Để góp phần đánh giá chính xác tình hình sốt rét, mức độ đa hình

di truyền của các quần thể KSTSR và cung cấp số liệu về thực trạng KSTSR kháng thuốc tại một số tỉnh thuộc khu vực Bắc Tr-ờng Sơn, Việt Nam chúng

tôi tiến hành đề tài: “ Nghiên cứu tính đa hình di truyền của ký sinh trùng

sốt rét và tính kháng thuốc sốt rét của Plasmodium falciparum tại một số

tỉnh biên giới thuộc khu vực Bắc Tr-ờng Sơn, Việt Nam”

Mục tiêu của đề tài:

1 Xác định đ-ợc thành phần, cơ cấu loài KSTSR tại 3 tỉnh Quảng Bình, Quảng Trị và Thừa Thiên Huế thuộc khu vực Bắc Tr-ờng Sơn, Việt Nam

2 Đánh giá đ-ợc tính đa hình di truyền của quần thể P falciparum và P

vivax

3 Xác định đ-ợc tỷ lệ đột biến kháng của P falciparum đối với thuốc sốt rét

pyrimethamin, sulfadoxin và chloroquin

Nội dung của đề tài:

1 Điều tra cắt ngang tại các điểm nghiên cứu ở 3 tỉnh Quảng Bình, Quảng Trị

và Thừa Thiên Huế để thu thập lam máu và mẫu máu trên giấy thấm Whatman 3MM, phát hiện và phân biệt KSTSR bằng kỹ thuật xét nghiệm lam máu nhuộm giemsa và PCR

2 Phân tích kiểu gen của P falciparum dựa trên 3 locus gen msp1, msp2 và

glurp; kiểu gen của P vivax dựa trên locus gen Pvcs và Pvmsp1 để đánh

giá tính đa hình di truyền của các quần thể P falciparum và P vivax

3 Phân tích các vị trí đột biến điểm trên gen dhfr để xác định tỷ lệ P

falciparum mang đột biến kháng với thuốc pyrimethamin

4 Phân tích các vị trí đột biến điểm trên gen dhps để xác định tỷ lệ P

falciparum mang đột biến kháng với thuốc sulfadoxin

5 Phân tích đột biến điểm ở vị trí 76 trên gen Pfcrt để xác định tỷ lệ P

falciparum mang đột biến kháng với thuốc chloroquin

ý nghĩa của luận án:

• Về mặt khoa học: Kết quả của luận án cung cấp những số liệu khoa học để

đánh giá chính xác thành phần, cơ cấu loài KSTSR; tính đa hình di truyền

của các quần thể KSTSR và tính kháng thuốc sốt rét của P falciparum ở

khu vực Bắc Tr-ờng Sơn, Việt Nam

• Về mặt thực tiễn: Kết quả thu đ-ợc của nghiên cứu góp phần đánh giá tình hình lan truyền sốt rét, thực trạng KSTSR kháng một số thuốc sốt rét ở 3

tỉnh thuộc khu vực Bắc Tr-ờng Sơn, Việt Nam Đây là cơ sở khoa học giúp Ch-ơng trình Quốc gia phòng chống và loại trừ sốt rét lựa chọn biện pháp phòng chống và thuốc điều trị sốt rét thích hợp, góp phần bảo vệ sức khỏe

cộng đồng

Đóng góp mới của luận án:

1 Lần đầu tiên có đ-ợc số liệu về đặc điểm kiểu gen của quần thể P

vivax tại các tỉnh Quảng Bình và Thừa Thiên Huế thuộc khu vực Bắc

Tr-ờng Sơn, Việt Nam

2 Lần đầu tiên có đ-ợc số liệu về tỷ lệ đột biến kháng của P falciparum

với thuốc pyrimethamin, sulfadoxin và chloroquin tại 2 tỉnh Quảng Bình và Thừa Thiên Huế

Ngoài ra, luận án đã cung cấp các số liệu t-ơng đối đầy đủ về thành phần cơ cấu loài, đa hình di truyền của các quần thể KSTSR, kết quả

nghiên cứu kháng thuốc ở giai đoạn 2008-2012 khẳng định P falciparum

có tỷ lệ đột biến kháng cao với thuốc pyrimethamin, sulfadoxin và chloroquin Đây là nguồn thông tin quan trọng để Ch-ơng trình phòng chống và loại trừ sốt rét lựa chọn thuốc điều trị sốt rét thích hợp

Bố cục của luận án:

- Luận án có 138 trang trong đó có 40 bảng và 39 hình

- Mở đầu (4 trang)

- Ch-ơng 1 – Tổng quan tài liệu (38 trang)

- Ch-ơng 2 - Đối t-ợng, vật liệu và ph-ơng pháp nghiên cứu (19 trang)

- Ch-ơng 3 – Kết quả và thảo luận (50 trang)

- Kết luận và kiến nghị (2 trang)

- Các công trình khoa học có liên quan đến luận án (1 trang)

- Tài liệu tham khảo (23 trang, 59 tài liệu tiếng Việt, 95 tài liệu tiếng Anh)

- Phụ lục (từ trang 138)

Ch-ơng 1- Tổng quan tài liệu 1.1 Bệnh sốt rét

Bệnh sốt rét là một bệnh truyền nhiễm do ký sinh trùng Plasmodium ở ng-ời gây nên Bệnh lây qua đ-ờng máu, do muỗi Anopheles truyền Bệnh

biểu hiện lâm sàng bằng những cơn sốt rét với ba triệu chứng cơ bản: rét run, sốt, ra mồ hôi Có nhiều thể sốt rét ở ng-ời khác nhau nh-: thể mang ký sinh trùng lạnh, thể thông th-ờng điển hình (sốt rét ch-a biến chứng), thể sốt rét ác tính, thể sốt rét đái huyết cầu tố

Sốt rét l-u hành khác nhau ở từng địa ph-ơng, trong điều kiện thuận lợi

có thể gây thành dịch Bệnh có thuốc điều trị đặc hiệu và có thể phòng chống

đ-ợc [24, 26, 29]

1.2 Các loài ký sinh trùng gây bệnh sốt rét ở ng-ời

1.2.1 Thành phần loài ký sinh trùng gây bệnh sốt rét ở ng-ời

Ký sinh trùng (KST) sốt rét thuộc ngành động vật nguyên sinh, lớp

Protozoa, họ Plasmodidae, giống Plasmodium Có 4 loài KST gây bệnh sốt

rét ở ng-ời là P falciparum (Welch, 1897), P vivax (Grassi và Feletti, 1890),

P malariae (Laveran, 1881, Grassi và Feletti, 1890) và P ovale (Stephens,

1922) Gần đây, đã phát hiện một số tr-ờng hợp ng-ời mắc sốt rét do nhiễm

KSTSR P knowlesi của khỉ (từ khỉ lây sang ng-ời) tại Ma-lai-xi-a, Thái Lan,

Việt Nam [35, 42]

1.2.2 Chu kỳ phát triển của ký sinh trùng sốt rét

Chu kỳ phát triển của KSTSR gồm 2 giai đoạn:

Giai đoạn phát triển vô tính ở ng-ời: Sau khi thâm nhập vào cơ thể,

thoa trùng do muỗi truyền sẽ qua đ-ờng máu xâm nhập vào nhu mô gan, phân

chia thành các merozoite Sau khoảng 6-16 ngày tùy thuộc vào loài KST, tế bào gan bị phá vỡ giải phóng ra các merozoite Các merozoite gan xâm nhập

hồng cầu phát triển thành thể t- d-ỡng, thể phân liệt, cuối cùng phá vỡ hồng

cầu Các merozoite hồng cầu đ-ợc giải phóng ra ngoài, một số xâm nhập vào

hồng cầu khác tiếp tục giai đoạn vô tính hồng cầu, một số phát triển thành thể

hữu tính là các giao bào (gametocyte) [35]

Giai đoạn phát triển hữu tính ở muỗi: Muỗi Anopheles hút máu ng-ời

có giao bào sẽ bị nhiễm và KST lại tiếp tục một giai đoạn sinh sản hữu tính trong cơ thể muỗi, vào cuối của chu kỳ này sản sinh một thế hệ mới KST gọi

là thoa trùng Thoa trùng di chuyển về tuyến n-ớc bọt của muỗi để tiếp tục truyền khi muỗi đốt ng-ời Chu kỳ phát triển ở muỗi từ 8 đến 35 ngày phụ thuộc vào nhiệt độ bên ngoài [35, 49] Chu trình phát triển của KSTSR đ-ợc

trình bày tổng quát ở Hình 1.1

Hình 1.1 Chu trình phát triển của ký sinh trùng sốt rét

(theo tài liệu của Jan A Rozendaal [49])

1.3 Muỗi truyền bệnh sốt rét

Ronald Roos (ng-ời Anh) đã xác định đ-ợc muỗi Anopheles là thủ

phạm truyền bệnh sốt rét vào năm 1897 tại ấn Độ Ông đã phát hiện KSTSR

phát triển trong cơ thể muỗi Anopheles hút máu bệnh nhân sốt rét [31]

Sự phân bố thành phần Anopheles và sự có mặt của các vectơ chính

truyền bệnh sốt rét có vai trò quan trọng chi phối các đặc điểm dịch tễ học sốt

rét của một vùng [47] Trên thế giới có khoảng 493 loài Anopheles khác nhau,

trong đó có khoảng 70 loài đ-ợc xác định là vectơ truyền bệnh sốt rét Do các

đặc điểm về địa lý,khí hậu, sinh thái ở mỗi vùng, mỗi n-ớc có khác nhau nên các loài muỗi truyền bệnh sốt rét chính cũng khác nhau [47, 153]

ở Việt Nam, các công trình nghiên cứu về Anopheles của Trần Đức Hinh, Nguyễn Đức Mạnh, Lê Khánh Thuận cho thấy có 62 loài Anopheles [18, 28, 47] Trong đó vectơ truyền bệnh chính gồm 3 loài là: An minimus,

An dirus và An epiroticus Trong đó:

+ An minimus sống ở trong nhà, bìa rừng, trong rừng, vùng đồi Bọ gậy

sống ở ven suối quang, n-ớc chảy chậm

+ An dirus sống ở rừng rậm, vùng bìa rừng th-a Bọ gậy sống ở vũng

n-ớc đọng d-ới bóng râm trong rừng

+ An epiroticus sống ở vùng n-ớc lợ ven biển Nam Bộ

- Vectơ truyền bệnh phụ gồm 7 loài:

+ An maculatus, An aconitus, An jeyporiensis: các loài muỗi này sống

ở vùng rừng, bìa rừng, đồi núi

+ An sinensis, An vagus, An subpictus, An indefinitus: các loài muỗi

này sống ở vùng n-ớc lợ, ven biển

1.4 Tình hình sốt rét trên thế giới và Việt Nam

1.4.1 Tình hình sốt rét trên thế giới

Theo báo cáo của WHO, trên thế giới hiện có 99 quốc gia và vùng lãnh

thổ có sốt rét l-u hành -ớc tính có khoảng 3,3 tỉ ng-ời sống trong vùng có nguy cơ mắc sốt rét và ng-ời dân sống tại vùng cận sa mạc Sahara của Châu Phi có nguy cơ mắc cao nhất Năm 2010, thế giới có khoảng 216 triệu l-ợt ng-ời mắc sốt rét và 655 nghìn ng-ời chết do sốt rét, trong đó khoảng 81% ca bệnh và 91% tr-ờng hợp tử vong xảy ra tại Châu Phi mà phần lớn ở trẻ em d-ới 5 tuổi (86%) và phụ nữ có thai [152]

Dựa trên các nguồn dữ liệu về tình hình bệnh sốt rét đ-ợc báo cáo từ hệ thống y tế của các quốc gia thành viên, WHO mô tả thực trạng tình hình sốt rét trên thế giới theo các khu vực dịch tễ khác nhau nh- sau [152]:

Tại Châu Phi năm 2010, 43 quốc gia có sốt rét l-u hành và đ-ợc chia thành bốn vùng dịch tễ gồm: Trung Phi, Tây Phi, Đông Phi và một số quốc gia vùng Nam Phi Trong đó các quốc gia thuộc vùng Trung và Tây Phi có mức

độ lan truyền sốt rét cao nhất, các quốc gia vùng Nam Phi có mức độ lan

truyền sốt rét thấp hơn Tại Châu Phi, P falciparum là loài gây bệnh sốt rét

chính, các loài khác chiếm tỷ lệ rất nhỏ

Tại Châu Mỹ, lan truyền sốt rét còn xảy ra tại 21 quốc gia với khoảng 30% dân số toàn khu vực có nguy cơ mắc sốt rét và chủ yếu tập trung tại vùng Nam và Trung Mỹ Năm 2010, có khoảng 630 nghìn ca bệnh đã đ-ợc báo cáo

và Bra-xin là quốc gia có nhiều ca sốt rét nhất Loài P vivax gây ra khoảng

70% số ca bệnh tại khu vực này

Vùng phía Đông Địa Trung Hải, tình hình sốt rét vẫn còn khá phức tạp

Một số quốc gia có mức độ lan truyền sốt rét cao nh- Xu-đăng, xtan, Gi-bu-ti, Pa-ki-xtan Năm 2010, có khoảng 7,3 triệu ca bệnh đ-ợc báo cáo từ 9 quốc gia có sốt rét l-u hành trong 23 quốc gia tại khu vực này Loài

ga-ni-ma-li, Xu-đăng, Y-ê-men trong khi đó loài P vivax gây bệnh chủ yếu tại

áp-ga-ni-xtan, I-ran và Pa-ki-xtan

Tại Châu âu, đây là vùng có thể hoàn thành mục tiêu thanh toán sốt rét trong vòng vài năm tới (mục tiêu năm 2015) Năm 2010 chỉ còn một số ca

bệnh do P vivax gây ra đ-ợc ghi nhận tại một số quốc gia nh- Tát-gi-ki-xtan,

A-déc-bai-dan, Gru-di-a, C rơ-g dơ-xtan, Thổ Nhĩ Kỳ, U-dơ-bê-ki-xtan với

số l-ợng rất ít là 176 ca bệnh

Vùng Đông Nam Châu á, sốt rét giảm nhanh ở các quốc gia nhỏ nh-ng

duy trì ổn định tại các quốc gia nh- Băng-la-đét, ấn Độ, In-đô-nê-xia,

Mi-an-ma Khoảng 70% dân số sống tại khu vực này có nguy cơ mắc sốt rét, trong

đó 25% có nguy cơ mắc cao Các ca bệnh tại đây chủ yếu do hai loài P

falciparum và P vivax gây ra nh-ng có sự khác nhau giữa các quốc gia Trong

khi P falciparum là tác nhân gây bệnh chủ yếu tại Băng-la-đét, Mi-an-ma,

Đông Ti-mo thì loài P vivax là tác nhân gây bệnh chủ yếu tại Nê-pan,

Xri-Lan-ca và đặc biệt là ở Triều Tiên Năm 2010, khu vực này có 4,3 triệu ca bệnh trong đó có 2,4 triệu ca bệnh khẳng định có KSTSR Ba quốc gia có tỷ lệ

ca bệnh lớn nhất là ấn Độ (66%), Mi-an-ma (18%) và In-đô-nê-xia (10%) Có 2.426 ng-ời tử vong do sốt rét và chủ yếu là ở 3 quốc gia trên

Vùng Tây Thái Bình D-ơng, 9 trong 10 quốc gia thuộc khu vực này có sốt rét l-u hành Mức độ lan truyền sốt rét cao tại Pa-pu-a Niu Ghi-nê, đảo Xô-lô-môn, Va-nu-a-tu Các quốc gia thuộc Tiểu vùng sông Mê Kông nh- Trung Quốc (tỉnh Vân Nam), Lào, Cam-pu-chia và Việt Nam có mức độ lan truyền sốt rét ở mức độ trung bình Tuy vậy, tại các quốc gia này, lan truyền sốt rét cao ở các vùng sinh sống của các dân tộc thiểu số, vùng núi hẻo lánh và

đối t-ợng dân di c- Các quốc gia có mức độ lan truyền sốt rét thấp hơn là Ma-lai-xi-a, Phi-líp-pin, Hàn Quốc Năm 2010, có khoảng 262 nghìn ca bệnh

đ-ợc báo cáo, trong đó 70% tập trung tại 3 quốc gia Pa-pu-a Niu Ghi-nê

(36%), Cam-pu-chia (19%), đảo Xô-lô-môn (15%) Hai loài P falciparum và

P vivax gây bệnh chủ yếu ở hầu hết các quốc gia này, loài P vivax gây bệnh

chủ yếu ở Hàn Quốc và tỉnh Vân Nam, Trung Quốc

Hình 1.2 d-ới đây là bản đồ các quốc gia và vùng lãnh thổ trên thế gới có

sự lan truyền sốt rét theo WHO năm 2012

Hình 1.2 Bản đồ các quốc gia và vùng lãnh thổ có lan truyền sốt rét

năm 2012 (theo nguồn WHO, 2012)

1.4.2 Tình hình sốt rét tại Việt Nam

Việt Nam nằm trong vùng sốt rét l-u hành của thế giới Ch-ơng trình Quốc gia “ Tiêu diệt bệnh sốt rét” đã đạt đ-ợc nhiều thành tựu to lớn trong giai

đoạn từ năm 1958-1980 Sau 1980, bệnh sốt rét quay trở lại và ngày càng nghiêm trọng trong đó đỉnh cao là năm 1991 cả n-ớc có hơn 1 triệu ng-ời mắc, 4.646 ng-ời chết, hơn 144 vụ dịch lớn xảy ra ở nhiều địa ph-ơng trong cả n-ớc [3, 48]

Tr-ớc tình hình SR quay trở lại, Ch-ơng trình phòng chống sốt rét Quốc gia đ-ợc Chính phủ phê duyệt và triển khai từ năm 1992 Kết quả của ch-ơng trình đã làm giảm nhanh tỷ lệ chết và tỷ lệ mắc sốt rét Theo báo cáo tổng kết

năm 2008, cho thấy tỷ lệ mắc sốt rét giảm từ 3,07/1000 dân trong năm 2001 xuống còn 0,70/1000 dân; tỷ lệ chết do sốt rét giảm từ 0,12/100.000 dân trong năm 2001 xuống còn 0,03/100.000 dân Đến nay, tình hình sốt rét đã t-ơng

đối ổn định nh-ng sốt rét vẫn còn là mối đe dọa sức khỏe đối với ng-ời dân ở vùng sâu, vùng xa, vùng biên giới và dân di c- [24]

Theo số liệu thống kê năm 2010, số ca bệnh nhiễm P falciparum chiếm

từ 70% đến 80%; loài P vivax trội hơn ở các tỉnh Miền Bắc (từ khu 4 trở ra),

đặc biệt tại các tỉnh Miền núi phía Bắc có tỷ lệ P vivax chiếm từ 40% đến 70%; hai loài P malariae và P ovale phát hiện đ-ợc ở một số tỉnh với tỷ lệ

rất thấp Nhiễm phối hợp chiếm tỷ lệ từ 1-2% [23, 24, 57]

Trong khu vực Tây Thái Bình D-ơng, tỷ lệ mắc và chết do sốt rét của Việt Nam là t-ơng đối thấp (Bảng 1.1) Đến năm 2010, các n-ớc trong khu vực Tây Thái Bình D-ơng gồm Trung Quốc, Ma-lai-xi-a, Phi-líp-pin đã bắt

đầu triển khai Chiến l-ợc loại trừ sốt rét Cuối năm 2011, Việt Nam bắt đầu thực hiện Chiến l-ợc quốc gia phòng chống và loại trừ bệnh sốt rét giai đoạn 2011-2020 và định h-ớng đến năm 2030” [58]

Bảng 1.1 Tình hình sốt rét ở khu vực Tây Thái Bình D-ơng năm 2008 Quốc gia Số ca mắc sốt rét Số ng-ời chết do sốt rét

Các tỉnh duyên hải miền Trung (bao gồm cả khu vực Bắc Tr-ờng Sơn), Tây Nguyên vẫn là khu vực có số ca mắc và ng-ời chết do sốt rét nhiều nhất hàng năm, tiếp đến là các tỉnh miền Đông Nam Bộ Tuy vậy, đến năm 2010 tỷ

lệ ng-ời mắc và chết do sốt rét ở các tỉnh này đã giảm mạnh so với năm 2006 (Bảng 1.2) Năm 2010, cả n-ớc có 54.297 ng-ời mắc sốt rét (tỷ lệ 0,62/1000 dân); 21 ng-ời chết do sốt rét (tỷ lệ 0,02/100.000 dân) [58]

Bảng 1.2 Tình hình sốt rét theo khu vực ở Việt Nam năm 2006 và 2010

Miền núi phía Bắc 21.978 1.495 0 11.490 355 0

1.4.3.1 Đặc điểm về điều kiện tự nhiên, kinh tế xã hội

Theo Lê Bá Thảo (1977), khu vực Bắc Tr-ờng Sơn gồm 5 tỉnh Nghệ

An, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Quảng Trị và Thừa Thiên Huế Khu vực Bắc Tr-ờng Sơn bắt đầu từ phía Nam thung lũng sông Cả của tỉnh Nghệ An đến

vùng phía Bắc thung lũng sông Bung, ngăn cách 2 tỉnh Thừa Thiên Huế và Quảng Nam, phía Đông giáp với biển và phía Tây giáp với Lào (Hình 1.3)

Hình 1.3 Bản đồ địa hình khu vực Bắc Tr-ờng Sơn

(Theo Lê Bá Thảo, 1977 [45])

Địa hình tự nhiên của khu vực Bắc Tr-ờng Sơn gồm nhiều dãy núi đá vôi thấp có độ cao trung bình từ 600 đến 800 mét so với mặt n-ớc biển, hẹp bề ngang và đổ dốc xuống phía đồng bằng duyên hải Khí hậu chia thành các mùa đặc tr-ng nh- mùa đông lạnh của miền Bắc, mùa hè với gió phơn khô và nóng, m-a kéo dài với l-ợng m-a lớn xảy ra vào mùa thu đông từ tháng tám

đến tháng một Thảm thực vật của khu vực Bắc Tr-ờng Sơn rất đa dạng và phong phú gồm nhiều loài động thực vật khác nhau, đây đ-ợc coi là nơi gặp

gỡ của hai luồng động, thực vật di c-: luồng từ dãy Hi-ma-lay-a qua Vân Nam xuống và luồng từ Mã Lai lên [45]

Vùng biên giới các tỉnh Quảng Bình, Quảng Trị và Thừa Thiên Huế là

nơi sinh sống chủ yếu đồng bào dân tộc thiểu số nh- Vân Kiều, Pa Kô, Tà ôi, Cơ Tu …, chủ yếu sống bằng nghề nông và khai thác lâm sản Trình độ dân trí của ng-ời dân còn thấp, kinh tế chậm phát triển, nhiều tập quán và phong tục lạc hậu Những đặc điểm về điều kiện tự nhiên và xã hội tại khu vực này làm cho công tác phòng chống bệnh sốt rét gặp nhiều khó khăn [17, 19, 46]

1.4.3.2 Tình hình sốt rét tại khu vực Bắc Tr-ờng Sơn

Theo số liệu thống kê và các đánh giá về tình hình sốt rét tại hai tỉnh Nghệ An, Hà Tĩnh cho thấy tình hình sốt rét những năm gần đây đã giảm và

có nhiều thay đổi, bệnh nhân sốt rét phát hiện đ-ợc tại nhiều huyện ngay cả những huyện trung du và đồng bằng do những nơi này ng-ời dân đi làm ăn tại các vùng khác mang về, các huyện miền núi tr-ớc đây đã từng là vùng trọng

điểm của bệnh sốt rét nh- T-ơng D-ơng, Quế Phong của tỉnh Nghệ An thì đến nay sốt rét còn lan truyền thấp [43] Tại tỉnh Thừa Thiên Huế, tình hình sốt rét cũng giảm nhanh và hiện nay tình hình sốt rét còn tập trung chủ yếu tại 2 huyện miền núi là A L-ới và Nam Đông [20, 21] Theo kết quả phân vùng dịch tễ can thiệp tại Việt Nam năm 2009, trọng điểm sốt rét tại khu vực Bắc Tr-ờng Sơn xảy ra tại 2 tỉnh Quảng Bình và Quảng Trị Trong đó, huyện Lệ Thủy tỉnh Quảng Bình, huyện H-ớng Hóa tỉnh Quảng Trị là vùng sốt rét l-u hành nặng [22] Bảng 1.3 trình bày số liệu thống kê tình hình sốt rét tại các tỉnh thuộc khu vực Bắc Tr-ờng Sơn năm 2008 và 2011

Bảng 1.3 Tình hình sốt rét tại khu vực Bắc Tr-ờng Sơn năm 2008 và 2011

1.5 Một số kỹ thuật sử dụng trong chẩn đoán, phân biệt 4 loài KSTSR

Hiện nay có nhiều kỹ thuật đ-ợc sử dụng trong chẩn đoán, phân biệt KSTSR nh- kỹ thuật xét nghiệm lam máu nhuộm giemsa, kỹ thuật QBC (Quantitative Buffy Coat), kỹ thuật nhuộm AO (Acridine Orange), các kỹ thuật miễn dịch (ELISA - Enzym Linked Immuno- Sorbant Assay), IFA- Indirect Fluorescent Antibody), kỹ thuật chẩn đoán nhanh bằng que thử (Rapid diagnostic test) và kỹ thuật PCR [24, 39, 78] Trong đó 3 kỹ thuật xét nghiệm lam máu nhuộm giemsa, chẩn đoán nhanh bằng que thử và kỹ thuật PCR đ-ợc sử dụng rộng rãi trên thế giới cũng nh- tại Việt Nam

1.5.1 Kỹ thuật xét nghiệm lam máu nhuộm giemsa

Lấy lam máu để nhuộm giemsa và soi d-ới kính hiển vi để phát hiện KSTSR là kỹ thuật cổ điển đ-ợc ứng dụng ở hầu hết các quốc gia trên thế giới

Kỹ thuật dựa vào nguyên lý: Khi nhuộm dung dịch giemsa thì nguyên sinh chất của KSTSR bắt màu xanh, nhân bắt màu đỏ Đây là một trong những

đặc điểm để có thể nhận dạng và phân biệt đ-ợc hình thể của các loài KSTSR

Kỹ thuật xét nghiệm lam máu nhuộm giemsa có -u điểm là đơn giản, giá thành rẻ, có thể thực hiện đ-ợc ở nhiều điều kiện khác nhau, đảm bảo độ tin cậy, xác định đ-ợc mật độ, chủng loài và các thể KSTSR trong máu Tuy vậy, kỹ thuật này cũng có những hạn chế nh- là rất khó phát hiện những tr-ờng hợp có mật độ KSTSR thấp hoặc những tr-ờng hợp nhiễm phối hợp hai hay nhiều loài, trong đó chỉ có một loài trội hẳn về số l-ợng, đòi hỏi kỹ thuật viên có nhiều kinh nghiệm [39, 55]

1.5.2 Kỹ thuật chẩn đoán nhanh bằng que thử (Rapid diagnostic test)

Test chẩn đoán nhanh dựa vào phát hiện kháng nguyên đặc hiệu l-u thông trong hệ tuần hoàn Kháng nguyên phổ biến cho test nhanh là protein-2

giàu histidin của P falciparum (PfHRP2) và enzym đặc hiệu ký sinh trùng

lactose dehydrogenase (PLDH)

Chẩn đoán sốt rét bằng que thử rất thuận lợi khi tiến hành ở những nơi không có kính hiển vi và cho kết quả nhanh, sử dụng máu đầu ngón tay hay tĩnh mạch, không cần điều kiện phòng thí nghiệm và không phải cán bộ y tế cũng có thể thực hiện đ-ợc Tuy vậy, que thử khó phát hiện đ-ợc KSTSR ở mật độ thấp, có hiện t-ợng d-ơng tính giả, âm tính giả, phản ứng chéo giữa

các loài Plasmodium và giá thành cao [24]

1.5.3 Kỹ thuật PCR chẩn đoán, phân biệt bốn loài KSTSR

1.5.3.1 Một vài nét về kỹ thuật PCR chẩn đoán, phân biệt bốn loài KSTSR

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) do Kary Mullis và cộng sự phát minh và hoàn thiện vào năm 1985 [16, 27] Từ khi ra đời tới nay kỹ thuật PCR đã trở thành một trong những kỹ thuật đ-ợc sử dụng nhiều nhất trong lĩnh vực sinh học phân tử với khả năng ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực nghiên cứu nông - lâm - ng- nghiệp, y- sinh học và khoa học hình sự [6, 41]

Nguyên lý chung: Kỹ thuật PCR dựa trên sự xúc tác của enzym polymerase để nhân bản nhanh một đoạn ADN nhờ các đoạn mồi oligonucleotide t-ơng ứng bổ sung với hai đầu 3’ OH ở cả hai mạch của đoạn

ADN đích Mỗi chu kỳ nhân bản gồm 3 giai đoạn: giai đoạn biến tính, giai

đoạn gắn mồi và giai đoạn tổng hợp Kết quả sau thời gian khoảng 3 đến 4 giờ

có thể thu đ-ợc hàng triệu bản sao ADN đích [6, 16]

Trong chẩn đoán KSTSR, kỹ thuật PCR có độ nhạy và chính xác cao, phát hiện đ-ợc những tr-ờng hợp mẫu máu bệnh nhân có mật độ nhiễm KST thấp (< 1 KST/l máu), có khả năng phân biệt chính xác 4 loài KSTSR trong ng-ời [74, 136] Đoạn ADN đích cần nhân bản trong kỹ thuật PCR này là gen mã hoá cho 18S-RNA ribosome (18 small subunit ribosomal RNA - 18S - rRNA) Đoạn gen này đã đ-ợc xác định trình tự và mang tính đặc hiệu cho từng loài trong 4 loài KSTSR [99, 108, 116] Sự khác nhau về trình tự nucleotide cho phép thiết kế những cặp mồi đặc hiệu cho từng loài Sử dụng

kỹ thuật PCR lồng cho phép tăng độ nhạy lên hàng trăm triệu lần so với kỹ thuật PCR đơn [137]

1.5.3.2 Một số kết quả ứng dụng kỹ thuật PCR phát hiện KSTSR trên ng-ời

Năm 1991, kỹ thuật PCR đ-ợc áp dụng để phát hiện KSTSR trên ng-ời

Kỹ thuật này đã phát hiện đ-ợc những tr-ờng hợp nhiễm phối hợp hai loài P

falciparum và P vivax mà kính hiển vi không thể phát hiện đ-ợc [74, 140]

Đến năm 1993, Snounou G và cs sử dụng kỹ thuật PCR lồng phân tích các mẫu máu nhiễm KSTSR ở Thái Lan Kết quả đã phát hiện đ-ợc nhiều mẫu nhiễm phối hợp KSTSR trong đó có mẫu nhiễm 4 loài KSTSR Đây là những phát hiện mới mà các kỹ thuật khác tr-ớc đây không phát hiện đ-ợc [136]

Gần đây, kỹ thuật này đ-ợc sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu về dịch tễ học phân tử bệnh sốt rét tại nhiều quốc gia trên thế giới [95] Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy bằng kỹ thuật PCR phát hiện đ-ợc tỷ lệ nhiễm KSTSR, thành phần loài và tỷ lệ nhiễm phối hợp cao hơn so với sử dụng các ph-ơng pháp cổ điển Một số kết quả cụ thể nh- sau:

Mehlotra R.K và cs năm 2000, nghiên cứu tỷ lệ nhiễm phối hợp các loài KSTSR trên bệnh nhân tại Pa-pu-a Niu Ghi-nê bằng 2 ph-ơng pháp soi

kính hiển vi và kỹ thuật PCR Kết quả cho thấy kỹ thuật PCR lồng phát hiện

đ-ợc tỷ lệ nhiễm KSTSR cao hơn 3,0 lần và tỷ lệ nhiễm phối hợp cao hơn 17,5 lần so với phát hiện đ-ợc bằng kính hiển vi [118]

Mehdi A và cs năm 2003, nghiên cứu dịch tễ học phân tử bệnh sốt rét tại các vùng có l-u hành sốt rét tại I-ran Kỹ thuật PCR đã phát hiện đ-ợc tỷ lệ nhiễm phối hợp là 29%, cao hơn nhiều so với 0,6% nhiễm phối hợp phát hiện bằng kính hiển vi Tỷ lệ nhiễm phối hợp cao đã làm thay đổi tỷ lệ cơ cấu giữa các loài so với kết quả phát hiện bằng kính hiển vi [117]

Al-Mekhlaf M.M.Q và cs năm 2010, phân tích 511 mẫu máu ở ng-ời dân vùng sốt rét l-u hành có biểu hiện sốt rét lâm sàng tại Yê-men đã phát hiện đ-ợc tỷ lệ nhiễm KSTSR là 16,8% Trong đó nhiễm đơn chiếm 86,1%, nhiễm phối hợp 2 loài 13,9% [60]

Tại Việt Nam, kỹ thuật PCR lồng đ-ợc áp dụng vào nghiên cứu cơ cấu, thành phần loài KSTSR từ năm 1996 Theo kết quả từ một số nghiên cứu của

Lê Đức Đào và cs thì kỹ thuật PCR lồng đã phát hiện sự có mặt 4 loài KSTSR trên ng-ời tại một số tỉnh nh- Khánh Hòa, Lâm Đồng, Bình Ph-ớc, Đắc Lắc

và tỷ lệ nhiễm phối hợp các loài KST phát hiện đ-ợc rất cao nh- tại Khánh Hòa năm 1996 là 81%, năm 1998 tại Lâm Đồng là 41%, Đắc Lắc là 40% và ở Bình Ph-ớc là 22% Đặc biệt có 3 tr-ờng hợp trẻ em nhiễm phối hợp cả 4 loài

KSTSR Tỷ lệ cơ cấu giữa các loài KST có sự khác nhau trong đó P

falciparum chiếm khoảng 55 - 65%, P vivax khoảng 30 - 40%, P malariae

th-ờng phát hiện đ-ợc với tỷ lệ ít hơn 5,3% và P ovale ít hơn 2% [9, 10]

ở khu vực Bắc Tr-ờng Sơn, nghiên cứu của Lê Đức Đào, Tr-ơng Văn Hạnh và cs năm 2005 tại Quảng Bình phát hiện sự có mặt của 3 loài KSTSR

trong đó P falciparum chiếm 59%, P vivax là 39,76%, P malariae 1,24%

Tỷ lệ nhiễm phối hợp 2 loài chiếm 29,1% và 3 loài là 0,9% [12] Bùi Quang

Phúc và cs năm 2004 phát hiện đ-ợc 2 loài KSTSR tại Quảng Trị Trong đó P

1.6 Nghiên cứu tính đa hình di truyền của ký sinh trùng sốt rét

Chu trình sinh tr-ởng và phát triển của KSTSR phức tạp, trải qua nhiều giai đoạn thay đổi hình thái Một số thể trung gian trong chu trình phát triển của KSTSR đ-ợc các nhà khoa học hết sức quan tâm Trong đó, giai đoạn các merozoite xâm nhập hồng cầu vật chủ đ-ợc quan tâm hơn cả Các gen mã hóa các protein bề mặt của KSTSR này có những khác biệt nhỏ trong trình tự ADN tạo nên tính đa hình

1.6.1 Đa hình di truyền của P falciparum

1.6.1.1 Đặc điểm của locus gen mã hóa protein bề mặt của P falciparum

Mối liên hệ giữa merozoite với màng hồng cầu liên quan tới một số protein bề mặt của ký sinh trùng Các gen mã hóa cho các protein này có tính

đa hình di truyền cao nh-: msp1 (merozoite surface protein 1 gene – msp1) mã hóa cho protein bề mặt 1, msp2 (merozoite surface protein 2 gene –

msp2) mã hóa cho protein bề mặt 2 và glurp (glutatmate rich protein gene) mã

hóa cho protein giàu glutamat [62, 63] Các locus gen này mang các đoạn trình tự lặp lại khác nhau Các cá thể ký sinh trùng khác nhau thì có thể khác nhau về số l-ợng đoạn lặp lại (alen khác nhau)

Locus msp1 đ-ợc chia thành 17 đoạn [62, 139, 142] Trong đó có 5

đoạn bảo thủ, 5 đoạn bán bảo thủ, 6 đoạn nhị hình và 1 đoạn lặp lại Đoạn lặp

lại nằm trong đoạn thứ 2 của locus msp1 (Hình 1.4)

Hình 1.4 Sơ đồ cấu trúc locus msp1 của P falciparum

Qua nghiên cứu tách dòng và giải trình tự các chủng ký sinh trùng nhiễm trên bệnh nhân thu từ thực địa, các nhà khoa học đã xác định có 3 kiểu gen khác nhau: Kiểu gen K1 (đ-ợc tách từ chủng ở Thái Lan), kiểu gen MAD20 (đ-ợc tách từ chủng ở Pa-pu-a Niu Ghi-nê) và kiểu gen RO33 (đ-ợc tách từ chủng ở Gha-na) Kiểu gen K1 chứa đoạn lặp lại 9 nucleotide có trình

tự là AGTGCTCAA Trong tự nhiên các ký sinh trùng thuộc kiểu gen K1 có thể chứa số l-ợng đoạn lặp lại khác nhau (các alen khác nhau) Kiểu gen MAD20 chứa đoạn lặp lại 9 nucleotide có trình tự là GGTTCAAGT Trong tự nhiên kiểu gen MAD20 có nhiều alen khác nhau Đoạn lặp lại 9 nucleotide

của kiểu gen RO33 có trình tự là CTGCAGATG Kiểu gen RO33 rất hiếm gặp các alen khác nhau mà chỉ phát hiện thấy 1 alen có 9 đoạn lặp lại [105, 139]

Locus msp2 được chia thà nh 5 đoạn, trong đó đoạn 1 và 5 là đoạn bảo

thủ, đoạn 2 và 4 là các đoạn nhị hình và đoạn 3 chứa các đoạn trình tự lặp lại

Sự khác nhau về số l-ợng đoạn lặp lại ở các KST khác nhau tạo nên tính đa hình (Hình 1.5)

Hình 1.5 Sơ đồ cấu trúc locus msp2 của P falciparum

(Theo Viriyakosol S và cs (1995) [142]) Các chủng KST thu đ-ợc từ thực địa đã đ-ợc tách dòng và giải trình tự cho thấy có 2 kiểu gen khác nhau là FC27 và IC1/3D7 (trong quần thể tự nhiên gọi chung là kiểu gen FC và IC) Kiểu gen FC27 (đ-ợc tách từ chủng tại Pa-pu-a Niu Ghi-nê) chứa 5 đoạn lặp lại với trình tự 36 nucleotide nh- sau:

Đoạn lặp lại

Đoạn bảo thủ

Đoạn nhị hình

kiểu gen FC có nhiều alen khác nhau Kiểu gen IC1 (đ-ợc tách từ chủng ở khu vực Đông D-ơng (giống với kiểu gen 3D7 ở Nam Mỹ) Kiểu gen IC1 chứa 12

đoạn lặp lại với trình tự 12 nucleotide là: GGTGGTAGTGCT Trong tự nhiên, kiểu gen IC có nhiều alen khác nhau [89, 142]

Locus glurp đ-ợc phân chia thành 3 đoạn: đoạn đầu R0 không chứa các

đoạn lặp lại mã hóa kháng nguyên  100 axit amin, đoạn giữa RI mã hóa kháng nguyên  100 - 200 axit amin và đoạn cuối RII chứa các đoạn lặp lại mã hóa kháng nguyên  70-100 axit amin [72, 142] Đoạn lặp lại vùng RII

chứa 57 nucleotide Trong tự nhiên locus glurp có nhiều alen khác nhau

Ba locus gen msp1, msp2 và glurp nằm trên các nhiễm sắc thể khác nhau,

là các gen có tính đa hình cao Sử dụng kỹ thuật PCR với các đôi mồi đặc hiệu

cho phép xác định đ-ợc kiểu gen của P falciparum ở các mẫu máu của bệnh

nhân SR và qua đó xác định đ-ợc tỷ lệ phân bố các kiểu gen, mức độ đa hình của từng kiểu gen, tỷ lệ nhiễm phối hợp kiểu gen và giá trị nhiễm đa alen (Multiplicity Of Infection - MOI) trong quần thể Các chỉ số này mô tả cấu trúc di truyền của quần thể KST trong vùng dịch tễ sốt rét [81, 87, 96]

1.6.1.2 Một số kết quả nghiên cứu về tính đa hình di truyền của P falciparum

Ferreira M.U (1998), nghiên cứu so sánh mức độ đa hình ở locus msp1 của P falciparum tại 3 vùng dịch tễ sốt rét khác nhau bao gồm vùng có mức

độ lan truyền sốt rét thấp tại Tây Nam A-ma-dôn của Bra-xin, vùng lan truyền sốt rét cao tại Tan-da-ni-a của Châu Phi và vùng có mức độ lan truyền sốt rét

trung bình là tỉnh Lâm Đồng, Việt Nam Kết quả đã xác định quần thể P

falciparum tại Bra-xin có 10 alen, 39% số mẫu nhiễm phối hợp kiểu gen, giá

trị MOI là 1,42; tại Tan-da-ni-a phát hiện đ-ợc 13 alen, 60% số mẫu nhiễm phối hợp kiểu gen, giá trị MOI là 2,37 và tại Việt Nam là 24 alen, 44% số mẫu nhiễm phối hợp kiểu gen, giá trị MOI là 1,76 Trong số 24 alen đ-ợc tìm thấy tại ba vùng có khoảng 90% tần suất xuất hiện của các alen nằm trong 7 alen

chung, nh-ng quần thể tại Việt Nam chỉ t-ơng đồng với khoảng 60% trong 7 alen này [91]

Nghiên cứu của Agnes Aubouy (2003) tại Ga-bông, phân tích 52 mẫu

máu lấy từ trẻ em nhiễm P falciparum xác định đ-ợc 25 alen ở msp1 (14 K1,

8 MAD20 và 3 RO33) và 19 alen ở msp2 (11 FC và 8 IC) Tổng số có 50/52

mẫu đ-ợc xác định nhiễm phối hợp từ 2 kiểu gen trở lên với giá trị MOI trung bình của 2 locus là 4,0 Tuy nhiên, kết quả cho thấy không có mối t-ơng quan giữa mật độ KSTSR và độ tuổi với giá trị MOI [66]

Basco L K và cs (2004), nghiên cứu tính đa hình ở locus gen msp2 trên

các mẫu bệnh nhân sốt rét tại Ca-mơ-run Trong 137 mẫu phát hiện 53% mẫu nhiễm phối hợp cả 2 kiểu gen Tỷ lệ kiểu gen FC chiếm 49,2% và kiểu gen IC chiếm 50,8% Tổng số phát hiện đ-ợc 23 alen khác nhau [70]

Nghiên cứu tại Buốc-ki-na-Pha-xô của Soulama I (2009), phân tích 75

mẫu bệnh nhân sốt rét trên 2 locus msp1 và msp2 cho thấy kiểu gen K1 phổ

biến với tần suất xuất hiện >90% Nhiễm phối hợp nhiều kiểu gen chiếm trên

90% số mẫu Quần thể KST tại đây có sự đa hình rất cao ở locus msp1 phát hiện 41 alen, locus msp2 phát hiện 29 alen Giá trị MOI > 3,0 [134]

Joshi H và cs (2006), nghiên cứu đa hình di truyền ở các phân lập P

faciparum thu thập tại 5 vùng có mức độ truyền nhiễm sốt rét khác nhau tại

ấn độ Kết quả phân tích 130 mẫu bệnh nhân sốt rét ở 2 locus gen msp1 và

msp2 cho thấy tại tất cả các điểm nghiên cứu có sự tồn tại của 3 kiểu gen K1,

MAD20, RO33 của msp1 và 2 kiểu gen FC và IC của msp2 Tại các vùng có

sự khác khác nhau về tỷ lệ xuất hiện của kiểu gen K1 từ 33,8% đến 72,7% và kiểu gen MAD20 có tỷ lệ từ 13,6% - 72,7% và kiểu gen RO33 chỉ phát hiện

đ-ợc 1 alen có kích th-ớc 160 bp và tỷ lệ dao động từ 15% - 41,7% Phát hiện

có 15 alen ở locus msp2 (kiểu gen FC có 6 alen, tỷ lệ kiểu gen FC từ 18,2%

đến 85%; kiểu gen IC có 9 alen, tỷ lệ kiểu gen IC từ 57,9% - 82,1%) Tỷ lệ

nhiễm phối hợp kiểu gen có sự khác nhau giữa các vùng từ 13,6% đến 83,3%

Giá trị MOI của msp1 từ 1,1 đến 2,1 và MOI của msp2 từ 1,0 đến 1,6 [104]

Ghanchi N.K và cs (2009), nghiên cứu phân tích 2 locus gen msp1 và

msp2 của P falciparum tại Pa-ki-xtan ở locus msp1, phát hiện đ-ợc 25 alen

(12 K1, 8 MAD20 và 5 RO33), có 24% (56/231) số mẫu nhiễm phối hợp kiểu

gen và ở locus msp2 có 33 alen (14 FC và 19 IC), có 22% (51/236) số mẫu nhiễm phối hợp kiểu gen Giá trị MOI là 1,25 ở locus msp1 và 1,22 ở locus

msp2 [98]

Tại khu vực Đông Nam á, Snounou G và cs [139] nghiên cứu tính đa

hình di truyền ở locus msp1, msp2 và glurp trong quần thể P falciparum tại

Thái Lan năm 1999 Phân tích tổng số 113 mẫu bệnh nhân sốt rét thu đ-ợc 76% các mẫu nhiễm phối hợp từ 2 kiểu gen trở lên, phát hiện 10 alen ở locus

msp1, 17 alen ở locus msp2 và 12 alen ở locus glurp

Nghiên cứu của Khang J.M và cs tại Mi-an-ma năm 2010, phân tích 63

mẫu nhiễm P falciparum cho thấy tỷ lệ nhiễm phối hợp nhiều kiểu gen trên một bệnh nhân là rất cao (63,5% ở locus msp1 và 68,3% ở locus msp2), phát hiện 14 alen ở locus msp1 (5 alen của K1, 9 alen của MAD20), 22 alen ở locus msp2 (7 alen của FC và 15 alen của IC) Tại nghiên cứu này tác giả

không phát hiện có kiểu gen RO33 [107]

Atroosh W.M và cs nghiên cứu đa hình di truyền ở 2 locus msp1 và

msp2 trên 65 mẫu nhiễm P faciparum tại Ma-lai-xi-a cho thấy RO33 là kiểu

gen trội chiếm 80% (52/65) trong khi đó kiểu gen K1 có tần số xuất hiện thấp, 66,2% các mẫu là nhiễm một kiểu gen, 33,8% các mẫu nhiễm phối hợp từ 2

kiểu gen Locus msp2 xác định đ-ợc 76% thuộc kiểu gen IC Giá trị MOI là 1,37 ở locus msp1 và 1,20 ở locus msp2 Mức độ đa hình của P falciparum rất thấp chỉ xác định đ-ợc 3 alen ở locus msp1 và 4 alen ở locus msp2 [65]

Nghiên cứu của Khaminsou N và cs (2011) tại Lào trên 230 mẫu bệnh

nhân Locus msp1 xác định đ-ợc 26 alen (11 alen của K1, 8 alen của MAD20

và 7 alen RO33) Nhiễm đơn K1 chiếm 27,83%, MAD20 là 11,74% và RO33

là 5,22% còn lại là nhiễm phối hợp nhiều kiểu gen (45,65%) Giá trị MOI là 1,6 [109]

Irawati N (2011), nghiên cứu tại In-đô-nê-xi-a, phân tích 56 mẫu trên

locus msp1 phát hiện đ-ợc 7 alen (3 K1, 2 MAD20 và 2 RO33) Tần suất xuất

hiện của các kiểu gen K1 chiếm 36,84%, MAD20 34,21% và RO33 là 28,9% tại vùng núi Tại điểm nghiên cứu ven biển K1 chiếm 44,8%, MAD20 là 37,93% và RO33 là 17,24% [103]

Tại Việt Nam, kết quả nghiên cứu đa hình di truyền quần thể P

falciparum tại Quảng Bình giai đoạn 2004-2005, phân tích 113 mẫu bệnh

nhân sốt rét ở locus msp1 thu đ-ợc 33 alen (17 K1, 15 MAD20 và 1 RO33)

Tần suất xuất hiện của K1 là 37,42%, MAD20 là 41,1% và RO33 là 21,48%

ở locus msp2 phát hiện 26 alen, trong đó 16 alen IC với tỷ lệ kiểu gen IC là

76,57% và 10 alen FC với tỷ lệ kiểu gen là 32,43% ở locus glurp xác định

đ-ợc 13 alen Giá trị MOI của msp1 > 1,3 (K1 là 1,34 và MAD20 là 1,37); MOI của msp2 là 1,83 (IC 2,04 và FC 1,61) và glurp là 1,61 [12]

Tại tỉnh Bình Ph-ớc giai đoạn 2005-2009, kết quả phân tích 3 locus gen

msp1, msp2 và glurp ở 100 mẫu cho thấy: ở locus msp1, kiểu gen K1 chiếm

32,58%, MAD20 chiếm 45,04% và RO33 chiếm 22,36% Tỷ lệ nhiễm phối

hợp kiểu gen rất cao chiếm 47% và giá trị MOI của msp1 là 1,56 ở locus

msp2 kiểu gen FC chiếm 44,56% và IC chiếm 55,44%, tỷ lệ nhiễm phối hợp 2

kiểu gen chiếm 42,5%, giá trị MOI là 1,43 ở locus glurp phát hiện 10 alen,

giá trị MOI là 1,19 [13]

Tại Ninh Thuận, kết quả phân tích 50 mẫu nhiễm P falciparum phát hiện đ-ợc 15 alen ở locus msp1 (9 alen của kiểu gen K1, 5 alen của MAD20

và 1 alen của RO33), 14 alen ở locus msp2 (5 alen của FC và 9 alen của IC), 6 alen ở locus glurp (với kích th-ớc sản phẩm tử 582 – 981bp) Giá trị MOI của K1 là 1,06, MAD20 là 1,00, FC là 1,08, IC là 1,24 và glurp là 1,24 [56]

1.6.2 Đa hình di truyền của P vivax

1.6.2.1 Đặc điểm các locus gen mã hóa protein bề mặt của P vivax

Cũng giống nh- ở KST P falciparum, nghiên cứu tính đa hình và đặc

điểm cấu trúc của quần thể P vivax đ-ợc tiến hành trên một số locus gen mã

hóa các protein bề mặt xuất hiện ở một số giai đoạn trong quá trình phát triển

của KSTSR Có bốn gen mã hóa protein bề mặt của P vivax nh- gen mã hóa protein thể thoa trùng (Pvcs - Plasmodium vivax circumsporozoite protein), gen mã hóa protein bề mặt merozoite 1 (Pvmsp1 - Plasmodium vivax

merozoite surface protein 1), gen mã hóa protein bề mặt merozoite 3 alpha (Pvmsp3 - Plasmodium vivax merozoite surface protein 3 alpha) và gen mã hóa kháng nguyên giao bào 1 (Pvgam1 - Plasmodium vivax gametocyte antigen 1) có tính đa hình cao Trong đó 2 locus Pvcs và Pvmsp1 đ-ợc nhiều tác giả lựa chọn để phân tích tính đa hình của quần thể P vivax [83, 102,

154]

Đặc điểm cấu trúc của locus Pvcs: Mỗi loài Plasmodium đều có giai

đoạn thoa trùng mà trên bề mặt có chứa loại protein gọi là circumsporozoite

protein do gen Pvcs mã hóa [102, 129] Cấu trúc của locus Pvcs gồm 5 đoạn

(Hình 1.6) trong đó đoạn 3 chứa trình tự lặp lại 27 nucleotide mà sự khác nhau

về số lần lặp lại tạo nên tính đa hình Locus gen này đã đ-ợc giải trình tự từ các mẫu trong tự nhiên và đ-ợc xác định là biểu hiện ở 2 kiểu gen Kiểu gen VK210 có chứa những đoạn trình tự lặp lại mã hóa 9 axit amin có trình tự là GDRA(A/D)GQPA và kiểu gen VK247 chứa đoạn trình tự lặp lại mã hóa 9 axit amin có trình tự là ANGAGNQPG [92, 102] Phân tích tính đa hình của

các quần thể P vivax dựa trên locus Pvcs biểu hiện ở sự khác nhau về sự phân

bố giữa tỉ lệ của 2 kiểu gen và sự khác nhau về số l-ợng của đoạn lặp lại tạo nên các alen khác nhau

Hình 1.6 Sơ đồ mô tả cấu trúc locus Pvcs của P vivax

(theo Imwong M và cs 2005 [102])

2: Đoạn tr-ớc của trình tự lặp lại 4: Đoạn sau trình tự lặp lại

Đặc điểm cấu trúc locus gen Pvmsp1: locus Pvmsp1 của P vivax mã

hóa cho khoảng 1720 axit amin và đ-ợc chia làm 13 đoạn Xen kẽ những đoạn bảo thủ là những đoạn đa hình nh- đoạn số 2, 4, 6, 8, 10 và 12 Ba vùng biểu

hiện tính đa hình cao trong toàn locus Pvmsp1 đ-ợc sử dụng để phân tích đa hình di truyền của P vivax ký hiệu F1, F2, F3 [102] ( Hình 1.7)

Hình 1.7 Sơ đồ mô tả cấu trúc locus Pvmsp1 của P vivax

(Theo Imwong M và cs 2005 [102])

 Các đoạn 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 biểu thị đoạn bảo thủ

 Các đoạn 2, 4, 6, 8, 10, 12 biểu thị đoạn lặp lại

Sự khác biệt giữa các phân lập P vivax đ-ợc biểu hiện trong những

đoạn này là số l-ợng và trình tự của các đoạn lặp lại tạo nên tính đa hình

1.6.2.2 Một số nghiên cứu về tính đa hình di truyền của P vivax

Cho đến nay, những hiểu biết của chúng ta về sự lan truyền và gây bệnh

của P vivax về mặt dịch tễ học phân tử còn ít ở các quốc gia đang thực hiện chiến l-ợc phòng chống và loại trừ sốt rét đã có sự giảm mạnh về tỷ lệ mắc P

falciparum nh-ng mắc P vivax đang là một trở ngại và thách thức lớn [129]

Nghiên cứu đặc điểm di truyền quần thể ở mức độ phân tử cho phép xác định mức độ đa hình, sự phân bố các đặc điểm kiểu gen và động lực học của sự lan

truyền sốt rét do P vivax [92] Một số nghiên cứu về đa hình di truyền của P

vivax đ-ợc báo cáo đã chỉ ra có sự khác nhau giữa các quần thể ở các khu vực

địa lý khác nhau, nguyên nhân gây ra bởi nhiều nhân tố nh- tần suất xuất hiện, loài vectơ truyền bệnh, đặc điểm di truyền của vật chủ và ảnh h-ởng bởi các nhân tố khác [119]

Imwong M và cs (2005) nghiên cứu kiểu gen của P vivax sử dụng locus Pvcs và Pvmsp1 trên 100 mẫu nhiễm P vivax tại Thái Lan Kết quả cho thấy: ở locus Pvcs xác định 90 mẫu mang kiểu gen VK210, 9 mẫu mang kiểu

gen VK247 và 1 mẫu nhiễm phối hợp 2 kiểu gen Tổng số phát hiện đ-ợc 10

alen Giá trị MOI là 1,2 ở locus Pvmsp1, phân tích dựa trên đoạn F1 đã phát

hiện đ-ợc 5 alen, đoạn F3 phát hiện đ-ợc 4 alen và 2 alen ở đoạn F2 Giá trị MOI là 1,29 [102]

Kim J.R và cs nghiên cứu đa hình di truyền của P vivax tại vùng

Kolkata, ấn Độ sử dụng 3 locus Pvcs, Pvmsp1 và Pvsmp3 để phân tích 151

mẫu nhiễm P vivax ở locus Pvcs, kết quả xác định có 150 mẫu mang kiểu

gen VK210, chỉ có 1 mẫu mang kiểu gen VK247 Xác định có 3 alen trong đó alen B có kích th-ớc 710 bp chiếm 65%, có 2 mẫu nhiễm phối hợp alen A và

B [110]

Tại Việt Nam, có rất ít nghiên cứu về đa hình di truyền của của quần

thể P vivax đ-ợc thực hiện Năm 2007, Lê Đức Đào và cs phân tích 45 mẫu nhiễm P vivax thu tại tỉnh Bình Ph-ớc ở 2 locus Pvcs và Pvmsp1 Kết quả cho

thấy quần thể P vivax tại Bình Ph-ớc có tính đa hình cao ở locus Pvcs phát

hiện có 49,2% số mẫu mang kiểu gen VK210 và 50,8% mang kiểu gen VK247, tỷ lệ nhiễm phối hợp 2 kiểu gen chiếm 37,8%, phát hiện 6 alen và giá