Ứng dụng phương pháp giải trình tự thế hệ mới (ngs) để phân tích gen hbb ở người nghi ngờ mang đột biến gây bệnh b thalassemia​

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰNHIÊN ------Ngô Kim Ngân ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ THẾ HỆ MỚI NGS ĐỂ PHÂN TÍCH GEN HBB Ở NGƯỜI NGHI NGỜ MANG ĐỘT BIẾN GÂY B

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ

NHIÊN

- -Ngô Kim Ngân

ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ THẾ HỆ MỚI (NGS)

ĐỂ PHÂN TÍCH GEN HBB Ở NGƯỜI NGHI NGỜ MANG ĐỘT

BIẾN GÂY BỆNH β-THALASSEMIA

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

- -Ngô Kim Ngân

ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ THẾ HỆ MỚI (NGS)

ĐỂ PHÂN TÍCH GEN HBB Ở NGƯỜI NGHI NGỜ MANG ĐỘT

BIẾN GÂY BỆNH β-THALASSEMIA

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 8420101.21

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS DƯƠNG QUỐC

CHÍNH TS TRẦN ĐỨC LONG

Lời cảm ơn

Để thực hiện thành công khóa luận tốt nghiệp này, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Tiến sĩ Dương Quốc Chính, Trưởng khoa Di truyền - Sinh học phân tử, Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương cùng với Tiến sĩ Trần Đức Long người

đã hướng dẫn, chỉ bảo tận tình trong suốt thời gian em thực hiện luận văn.

Em xin gửi lời cảm ơn đến Thạc sĩ Nguyễn Lê Anh, Thạc sĩ Trần Tuấn Anh cùng toàn thể nhân viên khoa Di truyền - Sinh học phân tử, Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương đã luôn giúp đỡ chia sẻ những kiến thức chuyên môn, thường xuyên động viên về tinh thần giúp em vững tin trong suốt quá trình thực hiện luận văn.

Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo Khoa Sinh học đã giảng dạy cho em nhiều kiến thức quý báu Em xin cảm ơn Bộ môn Di truyền học, Phòng sau đại học, Phòng công tác chính trị Học sinh - Sinh viên đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành luận văn thạc sỹ.

Xin cảm ơn dự án “Nghiên cứu sản xuất chip sinh học trên nền DNA microarray để chẩn đoán một số bệnh ở người” mã số 01/2017/CNC_HDKHCN của công ty BIMEDTECH đã hỗ trợ tôi thực hiện nghiên cứu này.

Cuối cùng em xin gửi lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè thân thiết đã động viên, bên cạnh em trong thời gian em thực hiện luận văn này.

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 30 tháng 12 năm

2020 Sinh viên

Ngô Kim Ngân

BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DNA Deoxyribonucleic Acid

Cluster Cụm khuếch đại của DNA khuôn được gắn trên bề mặt flowcell

Mỗi cụm được khuếch đại từ một sợi DNA khuôn ban đầu cho đếnkhi có khoảng 1000 bản sao Mỗi cluster sẽ tạo ra một trình tự đọcduy nhất

Index Là trình tự DNA tag được gắn vào các trình tự đích, cho phép

kết hợp nhiều mẫu trong một bể thư viện và phân tách dữ liệusau khi đã hoàn thành lần chạy

kb kilobase = 1000 bp

MCH Mean Cell Hemoglobin: lượng hemoglobin trung bình hồng cầuMCV Mean Corpuscular Volume: thể tích trung bình hồng cầu

PCR Polymerase Chain Reaction

RNA Ribonucleic Acid

WHO World Health Organization: Tổ chức Y tế thế giới

MỤC LỤC

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 Đại cương về β-thalassemiathalassemia 2

1.1.1 Đặc điểm và cơ chế sinh bệnh Thalassemia 2

1.1.2 Đặc điểm và phân loại bệnh β-thalassemiathalassemia 3

1.1.3 Dịch tễ học bệnh β-thalassemiathalassemia 5

1.1.4 Cơ sở phân tử bệnh β-thalassemiathalassemia 6

1.1.5 Các phương pháp chẩn đoán bệnh β-thalassemiathalassemia 11

1.2 Các kỹ thuật sinh học phân tử chẩn đoán bệnh β-thalassemiathalassemia 13

1.2.1 Kỹ thuật ARMS-thalassemiaPCR (Amplification Refractory Mutation System) 13

1.2.2 Kỹ thuật lai điểm ngược (Reverse hybridization -thalassemia kit Strip Assay) 15

1.2.3 Giải trình tự 16

1.3 Hệ thống giải trình tự thế hệ mới của Illumina -thalassemia MiSeq 20

1.3.1 Lịch sử phát triển 20

1.3.2 Nguyên tắc hoạt động 21

1.4 Các nghiên cứu về các đột biến gây bệnh β-thalassemiathalassemia ở Việt Nam 24

1.4.1 Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật multiplex ARMS-thalassemia PCR 24

1.4.2 Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật lai phân tử 25

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 28

2.1 Đối tượng, hóa chất và thiết bị 28

2.1.1 Đối tượng 28

2.1.2 Hóa chất 28

2.1.3 Trình tự mồi sử dụng 29

2.1.4 Thiết bị 29

2.2 Phương pháp nghiên cứu 29

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 29

2.2.2 Quy trình thí nghiệm 30

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 37

3.1 Kết quả tối ưu quy trình giải trình tự gen HBB trên hệ thống NGS 37

3.1.1 Thiết kế mồi và tối ưu phản ứng PCR 37

3.1.2 Tối ưu quy trình chuẩn hóa mẫu 40

3.2 Kết quả phân tích đột biến trên gen HBB ở các mẫu nghiên cứu 42

3.2.1 Thông tin lần chạy máy MiSeq 42

3.2.2 Kết quả phân tích đột biến gen HBB 42

3.2.3 Kết quả phân tích đột biến trên gen HBB kiểm chứng lại bằng phương pháp giải trình tự gen Sanger 46

3.2.4 Giá trị của các chỉ số sàng lọc trong nghiên cứu 48

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50

PHỤ LỤC 1: KẾT QUẢ PHẢN ỨNG PCR KHUẾCH ĐẠI GEN HBB a

PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ XÉT NGHIỆM CẬN LÂM SÀNG CỦA ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU b

DANH MỤC HÌNH

Hình 1: Cấu trúc của gen HBB, vị trí và mức độ nghiêm trọng của các đột biến gây

ra bệnh β-thalassemiathalassemia [7] 7

Hình 2: Tên và vị trí trên gen HBB của 9 đột biến gây bệnh β-thalassemiathalassemia thường gặp ở Việt Nam 9

Hình 3: Mô tả đột biến tạo vị trí cắt nối intron – exon mới [48] 11

Hình 4: Sơ đồ sàng lọc bệnh β-thalassemiathalassemia [2], [16] 12

Hình 5: Sơ đồ mô tả nguyên lý kỹ thuật ARMS-thalassemiaPCR 14

Hình 6: Quy trình giải trình tự thế hệ mới của Illumina 21

Hình 7: Thông tin lần chạy trên phần mềm Sequencing Analysis Viewer 23

Hình 8: Kết quả phân tích đột biến trên Miseq Reporter 24

Hình 9: Kết quả phân tích đột biến trên phần mềm IGV 24

Hình 10: Sơ đồ nghiên cứu 30

Hình 11: Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại gen HBB chưa tối ưu 31

Hình 12: Kết quả blast cặp mồi HBB trên NCBI 37

Hình 13: Kết quả điện di sản phầm PCR trước tối ưu trên gel agarose 1,5% 38

Hình 14: Kết quả tối ưu nhiệt độ gắn mồi điện di trên gel agarose 1.5% 38

Hình 15: Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại gen HBB sau tối ưu 39

Hình 16: Kết quả điện di sản phẩm sau tối ưu trên gel agarose 1,5% 39

Hình 17: Kết quả chất lượng giải trình tự NGS gen HBB trước khi tối ưu 40

Hình 18: Kết quả chất lượng giải trình tự NGS gen HBB sau khi tối ưu 41

Hình 19: Kết quả giải trình tự NGS mẫu đột biến codon 26 45

Hình 20: Kết quả so sánh đột biến tại codon 26(G→T) và codon 26 (G→A) với 46

Hình 21: Kết quả kiểm chứng bằng phương pháp giải trình tự Sanger 47

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1: Đặc điểm của các thể bệnh β–thalassemia [3], [31] 3

Bảng 2: Đặc điểm của các thể HbE phối hợp β-thalassemiathalassemia [3] [31] 4

Bảng 3: Trình tự mồi HBB 29

Bảng 4: Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen HBB 31

Bảng 5: Kết quả phân tích đột biến gen HBB 42

Bảng 6: Tỷ lệ các loại đột biến phổ biến ở Việt Nam 43

Bảng 7: Tỷ lệ các dạng đột biến HbE 43

Bảng 8: Tỷ lệ các dạng đột biến ít gặp ở Việt Nam 44

Bảng 9: Kết quả giải trình tự NGS và Sanger 47

Bảng 10: Tỷ lệ phát hiện đột biến của MCH và MCV 49

Bảng 11: Tỷ lệ phát hiện đột biến ở các chỉ số Hb 49

ĐẶT VẤN ĐỀ

Beta thalassemia (β-thalassemiathalassemia) là bệnh thiếu máu, tan máu di truyền gây ra

do giảm hoặc mất tổng hợp hoàn toàn chuỗi β-thalassemiaglobin, thành phần chính của

hemoglobin do gen HBB nằm trên cánh ngắn nhiễm sắc thể số 11 quy định Ở Việt

Nam, đây là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây ra tình trạng thiếu máu,tan máu nặng ở trẻ em Người mắc bệnh β-thalassemiathalassemia thể nặng đòi hỏi phải đượcđiều trị bằng truyền hồng cầu thay thế suốt đời và thải sắt định kỳ Việc điều trị nàykhá tốn kém và lâu dài, là gánh nặng lớn cho gia đình, xã hội và làm tăng chi tiêungân sách nhà nước cho lĩnh vực y tế Đến nay, trên thế giới đã phát hiện hơn 200đột biến gây bệnh β-thalassemiathalassemia [11], [17], [43] Vì vậy, rất cần có một chươngtrình tầm soát bệnh β-thalassemiathalassemia trong cộng đồng nhằm hạn chế sự phổ biến củagen bệnh, trong đó việc sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử giúp xác định chínhxác loại đột biến và kiểu gen của bệnh

Giải trình tự gen được coi là tiêu chuẩn vàng trong việc phát hiện nhiều độtbiến Next-thalassemiaGeneration Sequencing (NGS) là phương pháp giải trình tự thế hệ mới

có ưu thế về hiệu suất, cho phép phát hiện nhiều đột biến cùng lúc và đang dần trởthành công cụ trong chẩn đoán thường quy [21] Năm 2011, hãng Illumina đưa rathị trường hệ thống giải trình tự thế hệ mới – MiSeq và được sử dụng trong nhiềuphòng xét nghiệm sinh học phân tử với ưu điểm cho phép phân tích ít mẫu hơntrong mỗi lần chạy, giảm giá thành, thuận lợi hơn cho các xét nghiệm

Vì vậy, để tăng cường hiệu quả trong việc chẩn đoán bệnh β-thalassemiathalassemia

chúng tôi thực hiện đề tài “Ứng dụng phương pháp giải trình tự thế hệ mới

(NGS) để phân tích gen HBB ở người nghi ngờ mang đột biến gây bệnh

β-thalassemia” Đề tài được thực hiện tại khoa Di truyền và Sinh học phân tử -thalassemia Viện

Huyết học -thalassemia Truyền máu Trung ương với 2 mục tiêu:

Generation Sequencing – NGS) để phân tích gen HBB”.

nghi ngờ mang đột biến gây bệnh β-thalassemia.thalassemia.

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Đại cương về β-thalassemia

1.1.1 Đặc điểm và cơ chế sinh bệnh Thalassemia

Thalassemia là nhóm bệnh tan máu di truyền, xảy ra do đột biến gen quyđịnh việc sản xuất hemoglobin – thành phần chính trong hồng cầu, đảm nhiệm việcvận chuyển oxy trong cơ thể Cấu trúc của một phân tử Hb bình thường bao gồm 2chuỗi α-thalassemiaglobin liên kết với 2 chuỗi β-thalassemiaglobin (α2β2) và bốn nhân Hem, phân tử này

có khả năng vận chuyển được bốn phân tử oxy Bệnh thalassemia gây ra do sự mấtcân bằng tổng hợp giữa chuỗi α-thalassemiaglobin và chuỗi β-thalassemiaglobin Nguyên nhân là do rốiloạn quá trình tổng hợp một trong hai chuỗi dẫn đến gây thiếu hụt một loại chuỗi vàthừa lượng chuỗi còn lại làm thay đổi tỷ lệ của các phân tử huyết sắc tố dẫn đến tìnhtrạng bệnh lý Số lượng chuỗi globin thừa sẽ trùng hợp tạo nên các thể vùi huyết sắc

tố Những thể vùi này không có tác dụng vận chuyển oxy mà chúng lắng xuốngmàng hồng cầu và nguyên sinh chất của hồng cầu Với hồng cầu ở máu ngoại vi, thểvùi huyết sắc tố làm thay đổi tính thấm, tính mềm dẻo của màng cùng với sự giatăng diện tích tiếp xúc, dễ bị phá hủy bởi các tác nhân oxi hóa, từ đó dẫn đến hồngcầu bị vỡ sớm gây nên hiện tượng tan máu Còn ở tủy xương, các thể vùi trên gắnlên nguyên sinh chất và màng của các hồng cầu non, làm hồng cầu bị chết trước khitrưởng thành, dẫn đến tăng sinh mạnh các hồng cầu non trong tủy xương làm choxương bị biến dạng, tăng hấp thụ sắt gây ra nhiễm sắt cho cơ thể [13], [14].Thalassemia là bệnh di truyền phổ biến nhất trên thế giới với ước tính khoảng 7%dân số mang gen bệnh [31] Theo thống kê, ở nước ta, ước tính có khoảng 12 triệungười đang mang gen bệnh (chiếm khoảng 12% dân số Việt Nam), mỗi năm có trên8.000 trẻ sinh ra bị bệnh, trong đó có hơn 2.000 trẻ mắc bệnh ở mức độ nặng cầnđược điều trị cả đời và hơn 20.000 bệnh nhân đang cần được điều trị theo loại gennào bị ảnh hưởng mà phân biệt thành bệnh alpha thalassemia (α-thalassemiathalassemia) vàbeta thalassemia (β-thalassemiathalassemia) [52]

1.1.2 Đặc điểm và phân loại bệnh β-thalassemia.thalassemia

Bệnh β-thalassemiathalassemia xảy ra do đột biến gen HBB dẫn đến không tổng hợp

chuỗi globin β (β0-thalassemiathalassemia, ký hiệu β0) hoặc giảm tổng hợp (β+-thalassemiathalassemia, kýhiệu β+) hoặc giảm rất ít (β++-thalassemiathalassempia ký hiệu β++)

Theo tổ chức y tế thế giới WHO, hiện nay có tới 1,5% dân số thế giới manggen bệnh β-thalassemiathalassemia [20] Căn cứ vào đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và sốlượng alen bị đột biến, bệnh β-thalassemiathalassemia được chia thành ba thể: thể nặng, thểtrung bình và thể nhẹ Đặc điểm của các thể này được mô tả trong bảng 1

Bảng 1: Đặc điểm của các thể bệnh β–thalassemia [3], [31].

Chẩn đoán Kiểu gen Huyết đồ Đặc điểm Hb Triệu chứng

β++/ β Hb nam 9-thalassemia15 g/dLβ-thalassemiathalassemia β+/ β Hb nữ 9-thalassemia13 g/dL HbA2> 3,2%

thể nhẹ

β0/ β

MCV 55-thalassemia75 fL HbF 0,5-thalassemia6%

Thiếu máu nhẹMCH 19 -thalassemia 25 pg

β-thalassemia thể nặng: bệnh thường xuất hiện trong vòng 2 năm đầu đời

3

β-thalassemia thể trung gian: người bệnh có biểu hiện lâm sàng nhẹ hơn và

thường xuất hiện muộn hơn thể nặng, không yêu cầu hoặc chỉ thỉnh thoảng truyềnmáu [20]

β-thalassemia thể nhẹ: người mắc β-thalassemiathalassemia thể nhẹ thường không có

triệu chứng lâm sàng hoặc đôi khi bị thiếu máu nhẹ Khi cả hai cha mẹ đều là ngườimắc β-thalassemiathalassemia thể nhẹ, có nguy cơ 25% ở mỗi lần mang thai có con mắc bệnhβ-thalassemiathalassemia đồng hợp tử [20]

Ngoài ra, còn có các thể β-thalassemiathalassemia khác như: thể phối hợp Hemoglobin E(HbE) và β-thalassemiathalassemia; thể phối hợp β-thalassemiathalassemia và α-thalassemiathalassemia

Thể phối hợp β-thalassemia và Hemoglobin E (HbE): HbE là 1 biến thể

của hemoglobin khi gen HBB bị đột biến ở codon thứ 26 (GAG→AAG), làm thay

đổi acid amin thứ 26 là Glutamic thành Lysin Người có kiểu gen dị hợp tử hoặcđồng hợp tử HbE mà không phối hợp với β-thalassemiathalassemia chỉ có biểu hiện thiếu máunhẹ, chậm phát triển ở mức vừa phải Ở thể phối hợp, tùy vào thể β-thalassemiathalassemia màmức độ biểu hiện của bệnh trở nên đa dạng và được mô tả trong bảng 2

Bảng 2: Đặc điểm của các thể HbE phối hợp β-thalassemia.thalassemia [3] [31].

Thể bệnh Kiểu gen Huyết đồ Đặc điềm Hb Triệu chứng

đặc trưng

HbE + HbA2:

HbE phối hợp

25-thalassemia80% Thiếu máu

β+-thalassemiathalassemia HbF 6-thalassemia50% nhược sắc vừa

Thể phối hợp β-thalassemia và α-thalassemia: người có kiểu gen đồng hợp

tử hoặc dị hợp tử β-thalassemiathalassemia khi kết hợp với α-thalassemiathalassemia làm giảm chuỗi α-thalassemiaglobin dư thừa làm giảm mức độ nghiêm trọng của β-thalassemiathalassemia từ thể nặng sangthể trung gian [8]

1.1.3 Dịch tễ học bệnh β-thalassemia.thalassemia

a β-thalassemia trên thế giới

β -thalassemiathalassemia là loại bệnh di truyền liên quan chặt chẽ với nguồn gốc dântộc, phân bố khắp toàn cầu, song mang tính chất địa dư rõ rệt, số người mang gen bệnhtrên thế giới rất lớn [59]

Những trường hợp thalassemia phát hiện đầu tiên năm 1925 là βthalassemia

ở bờ Địa Trung Hải, là người có nguồn gốc Hy Lạp và Italia Sau đó bệnh đã đượcphát hiện ở rất nhiều nước trên thế giới Gen bệnh β-thalassemiathalassemia phân bố rất rộng trên thếgiới, từ vùng Địa Trung Hải, qua khu vực Trung Đông, tới Đông Nam Châu

Á và Bắc Phi Theo Liên đoàn Thalassemia quốc tế (2005) ước tính có 1,5% dân sốthế giới mang gen β-thalassemiathalassemia, ít nhất có từ 80-thalassemia90 triệu người mang gen bệnh, và cứmỗi năm có tới 60.000 trường hợp mới sinh mang gen bệnh Toàn Châu Á có trên 60triệu người mang gen β-thalassemiathalassemia Riêng khu vực Đông Nam Châu Á trong đó có ViệtNam, ước tính số người mang gen βthalassemia chiếm tới 50% người mang gen toàn cầu,khoảng 40 triệu người Còn ở các nước phát triển, Châu Âu và Châu Mỹ, ước tính ngườimang gen βthalasemia chỉ chiếm 10-thalassemia13% người mang gen trên thế giới [51][55]

Tần số mang gen β-thalassemiathalassemia rất cao ở nhiều nước ở bờ Địa Trung Hải,Châu Âu, như ở Cyprus là 10%, Hy Lạp là 8%, Albania là 8%, Italia là 4,8% ỞChâu Mỹ, tỷ lệ mang gen β-thalassemiathalassemia ở Guyana tới 10% dân số Ở khu vực Châu

Á tần số mang gen β-thalassemiathalassemia ở Ấn Độ từ 3-thalassemia17% dân số, ở Lào là 9,6%, ở Thái Lan từ 3-thalassemia9%, ở Indonesia là 4% [56] [57]

Do gen β-thalassemiathalassemia phân bố rất rộng rãi trên toàn cầu, đồng thời cùng vớiviệc lưu hành nhiều bệnh hemoglobin khác như HbE, HbS do đó hàng năm sinh ramột số lớn trẻ bị thể đồng hợp tử β-thalassemiathalassemia cũng như thể dị hợp tử kép, phối

hợp với một hemoglobin bệnh khác như HbE/β-thalassemiathalassemia, HbS/β-thalassemiathalassemia.Đây là những thể bệnh nặng của β-thalassemiathalassemia, đòi hỏi phải điều trị suốt đời, sốđông phải phụ thuộc vào truyền máu [50] [58].

b β-thalassemia ở Việt Nam

Bệnh hemoglobin nói chung và thalassemia nói riêng đã được chú ý khá sớm

ở Việt Nam Những nghiên cứu ban đầu từ thập kỷ 70, 80 và 90 ở thế kỷ XX, đềuhướng về nghiên cứu dịch tễ học và lâm sàng Tiếp theo những năm gần đây đã có một sốnghiên cứu tiếp về điều trị, về đột biến gen thalassemia Các nghiên cứu cho đến nay ởViệt Nam đều thống nhất bệnh hemoglobin khá phổ biến, phổ biến là α-thalassemiathalasemia, β-thalassemiathalassemia và HbE Bệnh phát hiện thấy ở tất cả các tỉnh thành trong cả nước, ở nhiềudân tộc khác nhau [52] Bệnh phổ biến nhiều hơn ở dân tộc ít người, ở các tỉnh miền núi

và cao nguyên, so với người Kinh và vùng đồng bằng [5] β -thalassemiathalassemia phổ biến ởngười dân tộc ít người miền Bắc hơn Hemoglobin E phổ biến ở miền Trung và miềnNam hơn [53] [54] Ở Việt Nam, β0 -thalassemia thalassemia phổ biến hơn β+ -thalassemiathalassemia [52]

1.1.4 Cơ sở phân tử bệnh β-thalassemia.thalassemia

1.1.4.1 Vị trí, cấu trúc gen HBB

HBB là gen mã hóa phân tử β-thalassemiaglobin, nó nằm trên cụm gen dài 70kb trên

cánh ngắn NST 11 [10] Cụm gen bao gồm các gen chức năng 5’-thalassemia ε – Gγ – Aγ – ψβ– δ – β – 3’ được sắp xếp theo thứ tự biểu hiện trong quá trình phát triển của cơ thể [24], [36]

Gen HBB dài 1600bp, mã hóa cho 146 acid amin gồm vùng 5’ không dịch

mã, 3 exon xen kẽ là 2 intron và kết thúc là vùng 3’ không dịch mã (hình 1) [7] [36],[46] Exon đầu tiên dài 89bp, exon 2 dài 221bp, exon 3 dài 123bp Intron 1 có kíchthước nhỏ dài khoảng 130bp nằm giữa nucleotide thứ hai và nucleotide thứ ba củacodon 30, intron 2 có kích thước lớn hơn, dài khoảng 850bp nằm giữa codon 104 và

105 [7], [18]

Hình 1: Cấu trúc của gen HBB, vị trí và mức độ nghiêm trọng của các đột biến

gây ra bệnh β-thalassemia.thalassemia [7].

Trình tự bảo thủ quy định sự biểu hiện của gen HBB được tìm thấy ở các

vùng promoter, vị trí nối intron-thalassemia exon, vùng 5’ và 3’ không dịch mã

• Promoter của HBB bao gồm 3 trình tự bảo thủ: TATA box (vị trí

−28 đến −31), CCAAT box (vị trí −72 đến −76) và các trình tự CACCC lặp lại (ở vị trí từ −86 đến −90 và từ −101 đến

−105) [7],‐ [23], [46].

• Vùng 5’ không dịch mã (5′ UTR) là vùng dài 50bp nằm giữa vị trí

CAP – vị trí bắt đầu phiên mã và codon mở đầu (ATG) Có hai trình tự được bảo thủ nổibật là CTTCTG và CACC [7], [46]

• Vùng 3’-UTR dài 132bp nằm giữa codon kết thúc (TAA) và đuôi

poly (A) chứa một trình tự mang tín hiệu để gắn đuôi poly A là ATAAA [7], [46]

Một số đột biến tại các trình tự này là nguyên nhân gây ra β-thalassemiathalassemia

1.1.4.2 Cơ chế đột biến trên gen HBB gây bệnh β-thalassemia

Cho đến nay, có khoảng hơn 200 đột biến đã tìm thấy trên gen HBB chủ yếu

là đột biến điểm, rất ít đột biến mất đoạn [7], [36] Các đột biến này xảy ra ở cáctrình tự exon, intron, promoter hoặc vùng 3’-thalassemia5’ không dịch mã Những đột biến nàygây ảnh hưởng tới khả năng biểu hiện của chuỗi β-thalassemiaglobin, do vậy người ta chia cácđột biến này thành 3 nhóm:

 Đột biến ảnh hưởng tới quá trình phiên mã:

• Đột biến điểm tại vùng khởi động (promoter): đột biến thay

thế nucleotide tại vị trí TATA hoặc CACCC dẫn đến giảm tổng hợp 10 -thalassemia 25% lượngchuỗi β-thalassemiaglobin so với bình thường, gây β+-thalassemiathalassemia [48] Ví dụ: -thalassemia90 (C→T), -thalassemia88(C→T), -thalassemia28 (A→G); -thalassemia29 (A→G)

• Đột biến vùng 5’ không dịch mã: làm giảm hiệu suất quá

trình dịch mã [48] Ví dụ: đột biến tại vị trí +33 (C→G) làm giảm tổng hợp mRNA 33%

so với bình thường [41]

 Đột biến ảnh hưởng tới quá trình cải biến mARN

• Đột biến tại vị trí cắt- nối intron – exon: quá trình cắt nối

intron và exon xảy ra sau phiên mã cần các nucleotide GT (vị trí cho nối) đầu 5’, AG (vịtrí nhận nối) ở đầu 3’ của các intron và vùng bảo thủ xung quanh, gây cản trở việc nốiexon, do đó không tạo được mARN β-thalassemiaglobin nên gây β0-thalassemiathalassemia

[48] như IVS1-thalassemia1 (G→T)

• Đột biến tạo vị trí ghép nối giả tại vùng intron và exon: Dọc

các exon và intron đều chứa những trình tự giống với trình tự bảo thủ ở vùng biên intron-thalassemiaexon nhưng thường không được sử dụng cho quá trình cắt nối Các đột biến này xảy ratại các vị trí trên tạo ra các trình tự gần giống với trình tự cắt nối bình thường Ví dụ:IVS2-thalassemia654 (C→T), IVS2-thalassemia705 (T→G) và IVS2-thalassemia745 (C→G)

• Đột biến tại vị trí poly A và vùng 3’ không dịch mã: vị trí

AATAAA tại vùng không dịch mã là vị trí gắn poly Adenin cần thiết cho mARN dichuyển từ nhân ra tế bào chất để tham gia vào quá trình dịch mã tạo sản phẩm protein.Các đột biến điểm xảy ra tại vị trí AATAAA sẽ gây β+-thalassemiathalassemia, như:

AATAAA → AATGAA, AATAAA → CATAAA

 Đột biến ảnh hưởng tới quá trình dịch mã mARN

• Đột biến codon mở đầu: là những đột biến liên quan tới codon

ATG mang tín hiệu mở đầu dịch mã

• Đột biến vô nghĩa: những đột biến thay thế hoặc thêm, mất

một vài nucleotide tạo ra codon mang tín hiệu kết thúc làm kết thúc sớm chuỗi và tạo sản

như: codon17 (AAG→TAG), codon 35 (TAC→TAA), codon 39 (CAG→TAG) [45].

• Đột biến dịch khung: những đột biến thêm hoặc mất một vài

nucleotide làm thay đổi khung đọc mở, làm kết thúc sớm hoặc thay đổi trình tự các codon41/42 (–TTCT), codon 71/72 (+A) gây β0-thalassemiathalassemia [48]

1.1.4.3 Một số dạng đột biến thường gặp ở Việt Nam

Ở Việt Nam, có 9 đột biến gây ra 95% các trường hợp β-thalassemiathalassemia gồm:-thalassemia28 (A→G), codon 17 (AAG→TAG), codon 26 (GAG→AAG), IVS1-thalassemia1 (G→T),IVS1-thalassemia5 (G→C), codon 41/42(-thalassemiaTCTT), codon 71/72 (+A), codon 95 (+A), IVS2-thalassemia654(C→T) được mô tả ở hình 2 [43] Những đột biến này được chia làm 2 nhóm nhưsau:

Hình 2: Tên và vị trí trên gen HBB của 9 đột biến gây bệnh β-thalassemia.thalassemia thường gặp ở Việt Nam.

 Nhóm đột biến gây β 0 -thalassemia:

• Đột biến codon 17 (AAG→TAG): đột biến làm thay đổi bộ ba mã

hóa acid amin lysin (AAG) thành bộ ba kết thúc (TAG) gây β0-thalassemiathalassemia [15], [48]

• Đột biến codon 41/42 (-TCTT): đột biến gây mất 4 nucleotide (-thalassemia

TCTT) làm thay đổi khung đọc tạo ra bộ ba kết thúc ở bộ ba thứ 59, gây β0-thalassemiathalassemia[43], [48]

• Đột biến codon 95 (+A): thêm 1 nucleotide A dẫn đến sự thay đổi

khung đọc tạo ra bộ ba kết thúc ở bộ ba thứ 101 mới gây β0-thalassemiathalassemia [49]

• Đột biến codon 71/72 (+A): thêm 1 nucleotide A ở giữa codon 71 và

72 làm thay đổi khung đọc tạo thành bộ ba kết thúc ở vị trí 72 gây β0-thalassemiathalassemia [48]

• Đột biến IVS1 -1 (G→T): đột biến ở intron 1 tại vị trí 1 gây biến đổi

G thành T, làm bất hoạt hoàn toàn vị trí mối nối nên không tạo được mRNA, gây β0-thalassemiathalassemia [47]

 Nhóm đột biến gây β + - thalassemia:

• Đột biến -28 (A→G): đột biến thay thế nucleotide ở vị trí -thalassemia28 biến

đổi A thành G làm giảm sự biểu hiện của gen HBB, biểu hiện giảm mức mARN từ 3 đến

5 lần so với mức bình thường, hậu quả làm giảm tổng hợp chuỗi β globin gây β+-thalassemiathalassemia [43]

• Đột biến IVS1-5 (G→C): đột biến ở intron 1 tại vị trí thứ 5 biến đổi

G thành C, dẫn tới giảm khả năng nối ARN chính xác nhưng còn tổng hợp được chuỗi β-thalassemiaglobin, gây đột biến β+-thalassemiathalassemia

• Đột biến IVS2-564 (C→T): đột biến ở intron 2 tại vị trí 654, C đổi

thành T (AAGGCAATA→AAGGTAATA), tạo ra vị trí ghép nối mới, gây đột biến β+-thalassemiathalassemia [43]

• Đột biến codon 26 (GAG→AAG): tại vị trí codon thứ 26 thuộc exon

1 xảy ra đột biến GAG→AAG, sự thay thế một nucleotide này gây ra 2 biểu hiện:-thalassemia Quá trình cắt intron nối exon xảy ra bình thường, tạo nên chuỗi β-thalassemiaglobin có sự thay đổi ở acid amin thứ 26 là glutamic thành lysin hình thành nênHemoglobin E [48]

-thalassemia Kích hoạt một vị trí cắt-thalassemia nối mới trên phân tử tiền mRNA làm ngắn chuỗi β-thalassemiaglobin gây nên β+-thalassemiathalassemia (hình 3) [48]

Hình 3: Mô tả đột biến tạo vị trí cắt nối intron – exon mới [48].

Đột biến tại codon 26 kích hoạt mối nối mới giữa vị trí cho nối GT của codon 25 trên exon 1 với vị trí nhận nối AG của codon 30 thuộc exon 2 làm mất 16 nucleotide trên phân tử mRNA, làm ngắn chuỗi β–globin gây ra β + -thalassemia.

Đột biến này vừa tạo nên biến thể HbE vừa gây β+-thalassemiathalassemia Chính vì vậyđột biến tại codon 26 gây bệnh HbE là một thể β-thalassemiathalassemia đặc biệt

1.1.5 Các phương pháp chẩn đoán bệnh β-thalassemia.thalassemia

Những phương pháp trong sàng lọc và chẩn đoán bệnh thalassemia được chialàm 3 nhóm chính tương ứng với 3 giai đoạn trong quá trình sàng lọc Một là nhómphương pháp sàng lọc ban đầu bao gồm những kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện, chiphí thấp, thời gian thao tác nhanh, áp dụng với lượng mẫu ít và có thể dễ dàng ápdụng ở cả các cơ sở y tế Hai là nhóm phương pháp phân tích và định lượnghemoglobin cho phép phân loại bệnh thalassemia với 2 kỹ thuật là điện di mao quản

và sắc ký lỏng hiệu năng cao Ba là nhóm phương pháp sử dụng các kỹ thuật sinhhọc phân tử nhằm xác định cụ thể những đột biến gây bệnh Sơ đồ sàng lọc cụ thểđược mô tả ở hình 4

Hình 4: Sơ đồ sàng lọc bệnh β-thalassemia.thalassemia [2], [16].

1.1.5.1 Phân tích tế bào máu ngoại vi

Hầu hết các quy trình chẩn đoán bệnh nhân thalassemia hiện nay đều sử dụngphương pháp phân tích các chỉ số hồng cầu để để sàng lọc người mang gen bệnhthalassemia Hai chỉ số cần quan tâm là thể tích trung bình hồng cầu (MCV) vàlượng hemoglobin trung bình hồng cầu MCV < 80 fL trong trường hợp thiếu máuthiếu sắt hoặc bị thalassemia, MCH < 27pg có nghĩa là hồng cầu nhược sắc KhiMCH < 27 pg kết hợp với MCV < 80fL sẽ có đặc điểm thiếu máu nhược sắc, đây làbiểu hiện đặc trưng của bệnh thalassemia (hình 4) [16] Tuy nhiên ở một số nơi có

tỷ lệ mắc bệnh cao nhưng nguồn lực còn hạn chế và cơ sở vật chất không đầy đủnhư khu vực nông thôn ở Đông Nam Á, Ấn Độ và các quốc gia Nam Á thì việc sửdụng xét nghiệm tủa HbE (Dichlorophenol Indophenol)-thalassemia DCIP để sàng lọc HbE làlựa chọn thay thế đơn giản và chi phí thấp để sàng lọc sơ bộ β-thalassemiathalassemia [13]

Tuy vậy, DCIP lại có tỉ lệ dương tính giả rất cao, những người dương tính sẽ phảitiếp tục tầm soát bằng huyết đồ.

1.1.5.2 Điện di huyết sắc tố

Tất cả những mẫu có kết quả xét nghiệm tế bào máu ngoại vi MCV < 80fL,MCH < 27 pg phải tiếp tục kiểm tra bằng điện di huyết sắc tố Kết quả điện di huyếtsắc tố cho biết lượng huyết sắc tố bình thường cũng như sự xuất hiện của các huyếtsắc tố bất thường trong máu

Hemoglobin trong hồng cầu thay đổi tùy từng giai đoạn phát triển của cơ thể.Hemoglobin thời kì bào thai (từ tháng thứ 3 đến khi sinh) là HbF, được tạo thành từ

2 chuỗi alpha globin và gamma globin (α2γ2) Sau khi sinh, chuỗi γ không đượctổng hợp, thay thế vào đó là chuỗi β tạo hemoglobin ở người trưởng thành gồmHbA1 (α2β2) và HbA2 (α2δ2) [3] Trong bệnh β-thalassemiathalassemia, chuỗi β-thalassemiaglobin khôngđược tổng hợp đầy đủ, làm tăng sản xuất các chuỗi γ, δ, α dẫn tới tình trạng giảmHbA1, tăng HbF và HbA2 HbA2 ≥ 4.0% là chỉ số thường được dùng để chẩn đoánβ-thalassemiathalassemia Trường hợp có HbA2 ≥ 4,0% và các chỉ số hồng cầu MCH, MCVđều giảm sẽ nghi ngờ mang gen bệnh β-thalassemiathalassemia [13] Còn khi HbA2 > 4.0%nhưng chỉ số hồng cầu bình thường thì có thể gặp trong trường hợp thiếu vitaminB12/folate, trong bệnh gan hoặc nhiễm HIV Các trường hợp có HbA2 từ 3.3-thalassemia3.9%cần khẳng định thêm bằng các kỹ thuật sinh học phân tử Đối với các trường hợp cóđột biến codon 26 (G→A) gây thể HbE sẽ xuất hiện HbE ≥ 25% Do đó, HbA1,HbF, HbA2 và HbE được coi là các tiêu chuẩn sàng lọc trong điện di hemoglobinđóng vai trò quyết định để chẩn đoán bệnh β-thalassemiathalassemia (hình 4) [3]

1.2 Các kỹ thuật sinh học phân tử chẩn đoán bệnh β-thalassemia

1.2.1 Kỹ thuật ARMS-thalassemia.PCR (Amplification Refractory Mutation System)

1.2.1.1 Nguyên lý kỹ thuật ARMS-PCR

ARMS-thalassemiaPCR là PCR đặc hiệu alen hay PCR khuếch đại alen đặc hiệu, được

sử dụng hiệu quả trong việc phát hiện đột biến điểm [33], [42], [44]

Kỹ thuật này dựa trên đặc tính DNA polymerase yêu cầu nucleotide ở đầu 3’của mồi bắt cặp với nucleotide trên sợi khuôn Nếu nucleotide ở đầu 3’ của trình tựmồi không bổ sung với trình tự đích thì Taq polymerase không thể kéo dài để tổnghợp sợi mới được Do đó, kỹ thuật này đòi hỏi nucleotide đầu 3’ phải mang tính đặchiệu [33] Mồi sử dụng cho một phản ứng ARMS-thalassemiaPCR bao gồm mồi bình thường

và mồi đột biến Mồi bình thường đặc hiệu cho trình tự DNA bình thường, khôngkhuếch đại được trình tự DNA đột biến và ngược lại (hình 5) Sự có mặt của độtbiến được thể hiện bằng sản phẩm DNA được khuếch đại với các kích thước đã biếttrước Trong phản ứng ARMS-thalassemiaPCR còn có một cặp mồi nội chuẩn nhằm khuếch đạivùng gen đích không có đột biến để tránh trường hợp âm tính giả do các nguyênnhân như: quá ít hoặc quá nhiều khuôn DNA, chất lượng DNA không tốt, không cómồi, không có Taq DNA polymerase hay các thành phần khác hoặc có mặt chất ứcchế phản ứng PCR [33], [39]

Hình 5: Sơ đồ mô tả nguyên lý kỹ thuật ARMS-thalassemia.PCR

Hai cặp mồi được thiết kế để khuếch đại kiểu đột biến và kiểu bình thường có một mồi chung Forward (F) và hai mồi Reverse riêng biệt (Rm và Rw) Sự khác nhau của hai mồi này nằm ở vị trí đánh dấu X Mồi dành cho đột biến chỉ khuếch đại được DNA có chứa đột biến X và ngược lại.

1.2.1.2 Ưu điểm

− Phù hợp để phát hiện các đột biến điểm

− Cho phép phát hiện thể thường với thể đột biến đồng hợp đột biến và dị hợp

− Nhanh, ít tốn kém, không yêu cầu mồi phải đánh dấu hay hệ thống phát hiện phức tạp [33].

1.2.1.3 Nhược điểm

− Kỹ thuật này chỉ có thể phát hiện được các đột biến và đa hình đã biết Do đó,muốn phát hiện một đột biến hoặc đa hình chưa biết cần kết hợp với các phương phápchẩn đoán phân tử khác như giải trình tự

− Đối với phản ứng đơn ARMS-thalassemiaPCR, trong một lần thực hiện phản ứng chỉ cóthể phát hiện được một đột biến, dẫn tới chi phí khá tốn kém Để giải quyết vấn đề này,

kỹ thuật multiplex ARMS-thalassemiaPCR đã được phát triển cho phép phát hiện nhiều đột biếntrong cùng một phản ứng [33]

1.2.2 Kỹ thuật lai điểm ngược (Reverse hybridization -thalassemia kit Strip Assay)

Kỹ thuật lai điểm ngược thường được dùng để đột biến điểm Các cặp đầu dò(probe) là các oligonucleotide đặc hiệu có trình tự bổ sung với trình tự DNA thường

và DNA đột biến được gắn cố định trên màng DNA khuôn bao gồm DNA thường

và DNA đột biến được khuếch đại bằng phản ứng PCR sử dụng các cặp mồi đánhdấu bằng biotinylate Sản phẩm PCR được lai với các oligonucleotide trên màng.Khi bổ sung streptavidin-thalassemia horseradish peroxidase lên màng, chất này sẽ tạo màu vớibiotinylate và dễ dàng nhận thấy bằng mắt thường [32]

Strip assay là bộ kit xây dựng dựa trên hai kỹ thuật Multiplex PCR và laiDNA ngược (Reverse hybridization), sử dụng thanh test strip có đính nhiều đầu dò

để phát hiện đồng thời nhiều đột biến và xác định tính đồng hợp/ dị hợp tử của đột

biến Các dầu dò đặc hiệu (Alen specific oligonucleotit –ASO probes) cho alen bìnhthường và đầu dò cho alen đột biến được gắn cố định trên các dải nitrocenlullose cómàng nilon Sản phẩm DNA được đánh dấu bằng biotin-thalassemia16-thalassemiadUTP trong phản ứngkhuyếch đại (PCR) Các sản phẩm này được lai với các đầu dò đặc hiệu alen độtbiến (mutant) và alen bình thường (wild type) Sau khi rửa, sản phẩm lai đặc hiệu ởtrên các băng vạch của thanh test trip có thể được phát hiện bằng mắt thường [4].

1.2.2.2 Ưu điểm [4], [38]:

− Dễ thực hiện, có thể cùng lúc phát hiện được nhiều đột biến điểm, đột biếnmất đoạn, xác định được các đột biến đồng hợp tử hay dị hợp tử Thời gian nhanh chóng(6 -thalassemia 8 giờ)

− Lượng mẫu cần ít (10 – 50 ng DNA cho 1 phản ứng PCR duy nhất)

− Phương tiện máy móc đơn giản: phân tích kết quả đơn giản từ các băng vạch trên thanh phản ứng bằng mắt thường hoặc qua máy đọc tự động

1.2.3.2 Các phương pháp giải trình tự

a Phương pháp giải trình tự Sanger

Giải trình tự DNA theo phương pháp Sanger được phát triển bởi nhà hoá sinhhọc người Anh Fred Sanger và cộng sự vào năm 1977 [35] Phương pháp nàythường được sử dụng để giải trình tự các đoạn DNA ngắn dưới 1kb

Giải trình tự DNA theo Sanger thực hiện các bước gần giống kỹ thuật PCRtuy nhiên giải trình tự chỉ sử dụng một mồi đơn thay vì sử dụng một cặp mồi đểkhuếch đại trong PCR Do đó thành phần của phản ứng cũng bao gồm những chấtcần thiết để nhân bản DNA bao gồm:

− Mạch đơn DNA cần giải trình tự

− Một primer: là một đoạn DNA sợi đơn ngắn kết hợp với DNA, là trình tự khởiđầu cho polymerase

− 4 loại deoxynucleotide (dNTP): dATP, dTTP, dCTP, dGTP

− 4 loại dideoxynucleotide (ddNTP): ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP được

đánh dấu đồng vị phóng xạ

Các ddNTP khác với dNTP tương ứng của chúng ở chỗ tại vị trí C-thalassemia 3’ củaphân tử đường của các ddNTP chỉ có gốc –H thay cho gốc –OH bình thường dẫnđến không thể hình thành liên kết phosphodiester với nucleotide tiếp theo Do vậy,nếu ddNTP gắn vào chuỗi polynucleotide thì phản ứng kéo dài chuỗi sẽ không thểthể diễn ra Theo nguyên tắc đó, mỗi khi ddNTP được thêm vào chuỗipolynucleotide đang kéo dài thì phản ứng tổng hợp chuỗi DNA sẽ dừng lại tại đótạo ra 1 loạt các mạch mới có độ dài khác nhau [37] Do khác nhau về kích thước vàkhối lượng, các mạch mới này sẽ tách khỏi nhau trên gel điện di Trình tự nucleotideđược đọc theo chiều từ đáy bảng điện di tương ứng với chiều 5’-thalassemia3’ trên mạch DNAđược tổng hợp mới và đây là trình tự bổ sung với mạch cần giải trình tự ban đầu[26], [37], [40]

Dựa trên nền tảng của kỹ thuật Sanger, ngày nay, người ta sử dụng các máygiải trình tự động để thay thế cho kỹ thuật này Kỹ thuật Sanger cải tiến sử dụng cácddNTP có đánh dấu huỳnh quang thay cho việc đánh dấu phóng xạ như trước đây

đã giúp cho việc sắp xếp trình tự DNA trở nên nhanh chóng và hiệu quả hơn Mỗiloại ddNTP được gắn một màu có bước sóng phát xạ huỳnh quang khác nhau chophép thực hiện giải trình tự trong một phản ứng duy nhất Hệ thống điện di mao

quản được sử dụng để đọc trình tự DNA một cách tự động Cấu tạo của máy gồm 16mao quản chứa gel polyacrylamide cho phép phân tích nhiều mẫu trong một lầnđiện di Hệ thống phát hiện gồm các camera có chùm tia laser đi qua nó để ghi nhậntín hiệu huỳnh quang một cách chính xác Nguyên tắc hoạt động của máy là trongsuốt quá trình điện di, khi có một vạch điện di đi qua chùm tia laser thì vạch điện di

sẽ phát sáng và được camera ghi nhận và lưu lại thành một cường độ đỉnh sáng(peak) trong biểu đồ Từ biểu đồ của các đỉnh cường độ sáng này, máy sẽ so dòngcủa các đỉnh tương ứng với nhau và phân tích thành trình tự của đoạn DNA [37]

Phương pháp này thường được sử dụng để giải trình tự các đoạn DNA có

kích thước dưới 1kb [26] Với những đoạn gen kích thước trên 1kb (HBB dài 1.6kb)

thì cần tăng số lượng phản ứng khuếch đại gen vì thế làm giảm số lượng mẫu trongmột lần chạy Không phù hợp với việc phân tích những gen có nhiều đột biến như

HBB.

b Giải trình tự thế hệ mới (Next- generation sequencing)

Next-thalassemia generation sequencing là thuật ngữ được sử dụng để mô tả một số côngnghệ giải trình tự hiện đại khác nhau bao gồm: Pyrosequencing -thalassemia Roche 454;SOLiD; Solexa của Illumina; Ion torrent: giải trình tự Proton / PGM [9]

Năm 2005, Roche giới thiệu hệ thống giải trình tự hệ genome 454 – là hệthống giải trình tự dữ liệu đầu ra lớn theo phương pháp pyrosequencing đầu tiêntrên thế giới Hệ thống này có thể tạo ra 200.000 đoạn đọc có độ dài khoảng 110 bp.Thay vì sử dụng các ddNTP để chấm dứt khuếch đại chuỗi, công nghệ này dựa vào

việc phát hiện pyrophosphate được giải phóng trong quá trình kết hợp nucleotidetạo ra một tín hiệu ánh sáng [34].

Năm 2007, Applied Biosystems (ABI) giới thiệu hệ thống giải trình tựSOLiD dựa trên công nghệ nối các đoạn oligonucleotide Dựa trên nguyên lý ghépnối, toàn bộ genome được cắt thành các đoạn DNA ngắn, sau đó từng đoạn đượcgắn với các adapter rồi cố định vào các hạt từ Quá trình giải trình tự được thực hiệnthông qua các oligonucleotide được đánh dấu huỳnh quang Độ dài đọc của SOLiDban đầu là 35 bp lần đọc và dữ liệu đầu ra là 3G sau mỗi lần chạy SOLiD có thể đạt

độ chính xác cao 99.85% sau khi lọc Năm 2010, hệ thống đã cải thiện được độ dàiđoạn đọc là 85 bp và độ chính xác là 99.99%, dữ liệu đầu ra vẫn là 30 Gb mỗi lầnchạy [34]

Cũng trong năm 2007, Illumina cho ra mắt hệ thống giải trình tự Solexa Hệthống này đơn giản hóa phương pháp xây dựng thư viện và đảo đầu bằng phươngpháp huỳnh quang dẫn dến việc tạo ra các đoạn đọc có độ dài 35 bp Công nghệ giảitrình tự bằng tổng hợp SBS sử dụng 4 nucleotide đánh dấu huỳnh quang để giảitrình tự hàng chục triệu cluster đồng thời trên bề mặt flow-thalassemiacell Trong mỗi chu trìnhgiải trình tự, một deoxynucloside triphosphate đánh dấu (dNTP) được thêm vàochuỗi acid nucleic Tín hiệu huỳnh quang của nucleotide đóng vai trò như một khóadừng phản ứng polymer hóa, do đó sau khi mỗi dNTP được tích hợp, dye huỳnhquang được ghi lại để xác định nucleotide và sau đó bị cắt bỏ để tổng hợpnucleotide tiếp theo Vì cả 4 loại dNTP gắn khóa dừng tổng hợp thuận nghịch cómặt đồng thời dưới dạng đơn phân tử, sự cạnh tranh ngẫu nhiên giúp giảm thiểuviệc tổng hợp mất cân đối [34]

Năm 2010, một hệ thống giải trình tự nhanh hơn, chi phí thấp hơn dựa trêncông nghệ bán dẫn Ion Torrent được giới thiệu Đây là hệ thống duy nhất xác địnhtrình tự không dựa vào tín hiệu huỳnh quang mà dựa vào việc đo sự thay đổi pH doviệc giải phóng ra ion H+ khi gắn nucleotide bằng công nghệ bán dẫn [9], [34]

Công nghệ giải trình tự thế hệ mới có hiệu suất cao, giảm chi phí đã pháttriển nhanh chóng trong những năm gần đây và trở thành một công cụ phân tích

quan trọng cho nhiều nhà di truyền học Hàng triệu hoặc hàng tỉ phân tử DNA cóthể được giải trình tự đồng thời Do đó, làm tăng đáng kể hiệu suất của quá trìnhgiải trình tự và giảm thiểu việc phải tách dòng trình tự đích giống như phương phápSanger trước đó [34].

1.3 Hệ thống giải trình tự thế hệ mới của Illumina - MiSeq

1.3.1 Lịch sử phát triển

Vào năm 1998, Solexa, tiền thân của hệ thống giải trình tự của Illumina,được thành lập bởi Shankar Balasubramanian và David Klenerman Trải qua nhiềugiai đoạn nghiên cứu và phát triển, năm 2006, hệ thống máy giải trình tự Solexa đầutiên, the Genome Analyzer, được ra mắt và có khả năng giải trình tự 1Gb dữ liệucho một lần chạy Đến năm 2007, Illumia tiến hành mua lại Solexa và tiếp tục pháttriển để đạt được những thành quả như ngày nay [34]

1.3.2 Nguyên tắc hoạt động

Hệ thống máy giải trình tự của Illumina sử dụng công nghệ giải trình tự theophương pháp tổng hợp (Sequencing by Synthesis, SBS), kết hợp với việc sử dụngcác nucleotide có gắn tín hiệu huỳnh quang và khóa dừng thuận nghịch để đọc vànhận biết trình tự một cách trực tiếp Trong mỗi chu trình, tại nucleotide có sự kếthợp sẽ được phát hiện bằng các bức xạ huỳnh quang Công nghệ giải trình tự bằngphương pháp tổng hợp (SBS) sẽ đưa ra kết quả có sự chính xác cao, tăng tỉ lệ đọcđược của các đoạn DNA [34]

1.3.2.1 Quy trình thực hiện

Quy trình giải trình tự thế hệ mới gồm có 4 bước (hình 6) [29]:

Hình 6: Quy trình giải trình tự thế hệ mới của Illumina

a Chuẩn bị thư viện (Library Preparation) [28], [29].

Các đoạn DNA cần giải trình tự sẽ được cắt thành những đoạn DNA nhỏ(khoảng 200-thalassemia 600bp), các đoạn này được gắn các trình tự vào đầu 5’ và 3’ Các trình

tự được thêm vào vào gồm phần trình tự để nhận biết các mẫu riêng biệt phần trình

tự để gắn lên flowcell và mang tín hiệu giải trình tự Sau khi các đoạn DNA

được gắn hoàn thiện sẽ được khuếch đại sử dụng phản ứng PCR và tinh sạch sản phẩm trước khi đưa vào giải trình tự

Các mẫu được đưa về cùng một nồng độ như nhau bằng phương phápNormalization theo kit của hãng Illumina Sau đó, tất cả các mẫu được trộnchunglại trong 1 ống nghiệm để biến tính bằng NaOH và đưa vào máy giải trình tự.

Thư viện sau khi biến tính thành các mạch đơn và được máy đưa tự động lênflow cell – nơi có các giếng phủ đầy các mồi bổ sung với P5 và P7, đã cố định đầu5’ trên mặt giếng Mỗi đoạn sẽ khuếch đại riêng biệt và tách thành từng nhómcluster thông qua việc tạo cầu (hình 6) Cắt và rửa trôi loại bỏ mạch bổ sung và giữlại mạch chính để toàn bộ các trình tự trên cluster là 1 chiều sẵn sàng cho việc giảitrình tự chiều thứ nhất

Sau khi giải trình tự lần thứ nhất (read 1), các đoạn mạch này tiếp tục tạo cầuvới mồi P5, P7 bên bên cạnh để tạo thành mạch mới và thực hiện bước giải trình tựthứ 2 (read 2) tương tự như read 1

c Giải trình tự

-thalassemia Thả DNA polymerase và mồi Read1 Seq primer vào cùng với 4 loạinucleotide gắn huỳnh quang mang gốc khóa ở nhóm 3’-thalassemiaOH Khi nucleotide này được gắnvào cũng là lúc phản ứng ngừng lại Tia Laser chiếu vào để kích thích phát huỳnh quang

và một camera ghi lại tín hiệu huỳnh quang đó (hình 6) Gốc khóa được cắt ra, tín hiệuhuỳnh quang cũng bị loại bỏ và rửa trôi cùng các nucleotide không gắn Chu trình nàyđược lặp lại đến hết một nửa độ dài trình tự thứ nhất Sản phẩm đọc chiểu 1 được rửa đi.-thalassemia Tiếp tục bổ sung Index1 primer và các thành phần PCR, cơ chế giải trình tựtương tự như trên đến khi hết phần Index, sản phầm đọc được rửa đi

-thalassemia Tạo cụm và giữ lại trình tự bổ sung Thả DNA polymerase và mồi Read2Seq primer vào với 4 loại nucleotide gắn huỳnh quang Quy trình giải trình tự được tiếptục tương tự như lần đọc thứ nhất.

d Phân tích kết quả

Sử dụng phần mềm Sequencing Analysis Viewer (hình 7) để biết thông tin

mẻ chạy và chất lượng mẻ chạy Một số thông số cần quan tâm để có một mẻ chạyđạt yêu cầu:

-thalassemia Mật độ cụm: Cluster density nằm trong khoảng 800 – 1200 K/mm2

-thalassemia Tỷ lệ cụm đạt chuẩn: Cluster passing filter: ≥ 90%

-thalassemia Độ tin cậy: Qscore (Q30) ≥ 90%

-thalassemia Tỉ lệ số sợi DNA có hiện tượng 1 nucleotide giải trình tự chậm hơn 1 chu kì: phasing < 0,25%

-thalassemia Tỉ lệ số sợi DNA có hiện tượng 1 nucleotide giải trình tự nhanh hơn 1 chu kì: pre-thalassemiaphasing < 0,25%

Hình 7: Thông tin lần chạy trên phần mềm Sequencing Analysis Viewer

-thalassemia Miseq Reporter cho biết chất lượng của xét nghiệm giải trình tự và phân tích dữ liệu NGS ở mức cơ bản (hình 8).

Hình 8: Kết quả phân tích đột biến trên Miseq Reporter

-thalassemia IGV (Integrative Genomics Viewer) là công cụ tin sinh học mạnh mẽ cho phépkhai thác thông tin sâu hơn như loại bỏ các đoạn đọc ngắn, không đảm bảo chất lượng,loại bỏ các adapter dư thừa, các biến đổi (variant) có độ tin cậy thấp… (hình 9)

Hình 9: Kết quả phân tích đột biến trên phần mềm IGV

1.4 Các nghiên cứu về các đột biến gây bệnh β-thalassemia ở Việt Nam

1.4.1 Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật multiplex ARMS-thalassemia PCR

Tại Việt Nam, theo nghiên cứu của Svasti cho thấy có 9 đột biến thường gặp,chiếm khoảng 95% các trường hợp β-thalassemiathalassemia bao gồm: -thalassemia28 (A→G), codon 17

(AAG→TAG), c odon 26 (GAG→AAG), IVS1-thalassemia1 (G→T), IVS1-thalassemia5 (G→C), codon41/42(-thalassemiaTCTT), codon 71/72 (+A), codon 95 (+A), IVS2-thalassemia654 (C→T) [43].

Năm 2008, Nguyễn Khắc Hân Hoan và cs đã xây dựng kỹ thuật multiplexARMS-thalassemiaPCR ứng dụng vào chẩn đoán trước sinh đột biến gây bệnh β-thalassemiathalassemiacho các cặp vợ chồng có con mắc β-thalassemiathalassemia khám thai tại Bệnh viện Từ Dũ Kếtquả cho thấy, kỹ thuật ARMS-thalassemiaPCR có chi phí thấp, thời gian chẩn đoán nhanh và

độ chính xác 100% [1]

Năm 2014, Trần Vân Khánh và cs đã áp dụng multiplex ARMS-thalassemia PCR để xác

định đồng thời 9 đột biến phổ biến trên gen HBB ở bệnh nhân β-thalassemiathalassemia cho kết

quả 39/52 trường hợp mang đột biến chiếm tỷ lệ 75% [6]

Với ưu điểm thời gian thực hiện nhanh, chi phí thấp, kỹ thuật này đang đượcứng dụng nhiều trong các phòng xét nghiệm sinh học phân tử để chẩn đoán bệnh β-thalassemiathalassemia Tuy nhiên, kỹ thuật này chỉ có thể phát hiện được các đột biến và đahình đã biết Do đó, muốn phát hiện một đột biến hoặc đa hình chưa biết cần kếthợp với các phương pháp chẩn đoán phân tử khác như giải trình tự

1.4.2 Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật lai phân tử

Với ưu điểm nổi bật cho phép phát hiện được nhiều đột biến trong cùng mộtlần thực hiện, phương pháp lai điểm ngược đã được sử dụng trong nhiều nghiên cứu

để phát hiện đột biến β-thalassemiathalassemia Cho tới nay, lai điểm ngược là kỹ thuật duynhất được các hãng phát triển thành các kit thương mại để chẩn đoán đột biến β-thalassemiathalassemia Bộ kit StripAssay của ViennaLab cho phép phát hiện đồng thời 21 độtbiến α-thalassemiathalassaemia và 22 đột biến β-thalassemiathalassaemia Kit Strip Asay (ViennaLab, Áo)

có bộ kít α-thalassemiaglobin Strip Assay cho phép sàng lọc được 21 đột biến α-thalassemiathalassemia và

bộ kít β-thalassemiaglobin Strip Assay cho phép sàng lọc được 22 đột biến β-thalassemiathalasemia phổbiến trong khu vực Đông Nam Á Những bộ kít này đạt tiêu chuẩn chứng nhận IVD(In Vitro Diagnostics) cho chẩn đoán bệnh, được phép lưu hành tại Châu Âu và đãđược sử dụng ở nhiều nước trên thế giới như Malaysia, Iran, Iraq, Thổ Nhĩ Kỳ, AiCập [4], [38]

Trong nghiên cứu của Nguyễn Thị Thu Hà (2017) sử dụng bộ kít β-thalassemiaglobinStrip assaycủa ViennaLab trong tổng số 63 alen đột biến được xác định gồm có 9kiểu đột biến gồm codon 26 (33,3%), codon 17 (17,5%), codon 41/42 (15,9%),IVS1-thalassemia1 (11,1%), -thalassemia28 (7,9%), IVS2-thalassemia654 (6,4%), codon 71/72 (4,8%), codon 95(1,6%) và codon 8/9 (1,6%) [4].

Tuy nhiên, kit thương mại này vẫn chỉ cho phép xác định được những độtbiến đã biết được xây dựng trong bộ kit

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Đối tượng, hóa chất và thiết bị

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng bảy mươi năm mẫu máu của ngườinghi ngờ mang đột biến gen HBB cung cấp bởi Viện Huyết học -thalassemia Truyền máuTrung ương Hầu hết các đối tượng nghiên cứu được sàng lọc dựa trên phân tíchcông thức máu ngoại vi, phân tích thành phần huyết sắc tố và sử dụng kỹ thuậtMultiplex ARMS-thalassemiaPCR phát hiện 9 đột biến gây bệnh β-thalassemiathalassemia thường gặp ởViệt Nam bao gồm: -thalassemia28 (A→G), codon 17 (AAG→TAG), codon26 (GAG→AAG),IVS-thalassemiaI-thalassemia1 (G→T), IVS-thalassemiaI-thalassemia5 (G→C), codon 41/42 (-thalassemiaTCTT), codon 71/72 (+A), codon

95 (+A), IVS-thalassemiaII-thalassemia654 (C→T) Trong đó mười một mẫu có xuất hiện HbE trong kếtquả điện di huyết sắc tố và sáu mươi tư mẫu âm tính với 9 đột biến gây bệnh β-thalassemiathalassemia nói trên

2.1.2 Hóa chất

- Hóa chất tách chiết và PCR: E.Z.N.A.® Blood DNA Mini Kit (Omega); KAPA

HiFi HotStart ReadyMix; DMSO (Dimethyl sulfoxide);

-thalassemia Hóa chất điện di: Agarose LE Biotechnology Grade; RedSafeTM Nucleic Acid

Staining Solution; ExactMark 1kb DNA Ladder (250-thalassemia10,000bp); Zymoclean Gel DNArecovery kit (Zymo research); TBE Buffer;

-thalassemia Hóa chất kiểm tra nồng độ DNA: Quibit dsDNA HS assay kit (Life

technologies); Agencourt Apure XP (Beckman coulter);

- Hóa chất giải trình tự trên hệ thống Miseq: MiSeq Reagent Nano Kit v2-thalassemia 300

Cycles; Nextera XT library prep kit 24 samples (box 1, box 2) (Illumina); Miseq reagentkit v2-thalassemia300 cycles PE (box 1, box 2) (Illumina); Nextera XT index kit 24 indices – 96samples (Illumina); Tween 20; NaOH 1N

Và các hóa chất cần thiết khác đạt đủ chất lượng sử dụng trong sinh học phântử

Máy PCR Gradient 2 chiều (Eppendoft); Máy giải trình tự thế hệ mới Miseq

Illumina; Máy giải trình tự Sanger 3500 Genetic Analyzers (Thermo Fisher

Scientific) Máy ly tâm 5427R (Eppendoft); máy vortex (Dlab); máy spin (Dlab);

máy đo nồng độ DNA/RNA Qubit 3.0 Fluorometer (Invitrogen) Tủ an toàn sinh

học cấp II; bộ micropipet (Eppendoft) và các thiết bị sinh học phân tử đạt chuẩn sử

dụng khác Các máy móc, thiết bị trên thuộc khoa Di truyền và Sinh học phân tử -thalassemia

Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Chúng tôi thực hiện nghiên cứu theo sơ đồ minh họa ở hình 10 với các bước

như sau: tách DNA từ mẫu máu của đối tượng nghiên cứu; kiểm tra chất lượng và

nồng độ DNA bằng phương pháp đo mật độ quang học; tối ưu hóa phản ứng khuếch

đại gen HBB ở những mẫu đạt tiêu chuẩn sử dụng cặp mồi HBB-thalassemiaF1/R1; kiểm tra

sản phẩm PCR bằng điện di sau đó tinh sạch sản phẩm; tạo thư viện và chạy giải

trình tự NGS; phân tích kết quả NGS; kiểm chứng một vài mẫu bằng phương pháp

giải trình tự Sanger