Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích các hoạt chất chính trong cây hương thảo (rosmarinus officinalis l ) bằng phương pháp HPLC​

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN LÊ THỊ OANH NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH CÁC HOẠT CHẤT CHÍNH TRONG CÂY HƯƠNG PHƯƠNG PHÁP HPLC Chuyên ngành: Hóa p

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LÊ THỊ OANH

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH

CÁC HOẠT CHẤT CHÍNH TRONG CÂY HƯƠNG

PHƯƠNG PHÁP HPLC

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 8440112.03

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

1 PGS TS Tạ Thị Thảo

2 TS Lê Thị Huyền

Hà Nội - 2020

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc, sự cảm phục và kính trọng nhất tới PGS TS Tạ Thị Thảo và TS Lê Thị Huyền - những người Thầy đã tận tâm hướng dẫn khoa học, động viên, khích lệ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn

Tôi xin trân trọng cảm ơn tất cả các thầy cô trong bộ môn hoá phân tích và các cán bộ phòng đào tạo sau đại học của trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội đã quan tâm, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị phòng Nghiên cứu cấu trúc - Viện Hóa Sinh biển đã quan tâm giúp đỡ, với những lời khuyên bổ ích và những góp ý quý báu trong việc thực hiện và hoàn thiện luận văn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới toàn thể gia đình, bạn bè và những người thân đã luôn luôn quan tâm, khích lệ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, tháng 10 năm 2020

Học viên

Lê Thị Oanh

i

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

MỤC LỤC i

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Giới thiệu về họ Hoa môi (Lamiaceae) 2 1.2 Chi Rosmarinus 2 1.3 Loài Hương thảo (R officinalis L.) 3 1.3.1 Đặc điểm thực vật 3

1.3.2 Nguồn gốc phân bố 4

1.3.3 Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học 4

1.3.4 Công dụng và hoạt tính sinh học loài R officinalis 9

1.4 Tổng quan về các phương pháp phân tích thành phần hóa học của loài R officinalis 11 1.4.1 Các phương pháp phân tích thành phần hóa học của dược liệu 11

1.4.2 Các nghiên cứu về xác định thành phần hóa học trong loài R officinalis ……….12

1.4.3 Các phương pháp chiết tách chất phân tích ra khỏi mẫu dược liệu 14

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM 16

2.1 Đối tượng nghiên cứu 16 2.2 Hoá chất, dụng cụ và thiết bị 16 2.2.1 Chất chuẩn 16

2.2.2 Các hoá chất khác 17

2.2.3 Dụng cụ, thiết bị 18

2.3 Phương pháp nghiên cứu 18 2.3.1 Phương pháp phân tách các dịch chiết và phân lập các hợp chất 18

2.3.2 Phương pháp xác định cấu trúc các chất 21

2.3.3 Tối ưu hóa điều kiện hệ thống sắc ký 21

2.3.4 Phương pháp xử lý mẫu 22

2.4 Đánh giá phương pháp phân tích 25 2.4.1 Tính thích hợp của hệ thống sắc ký 25

ii

2.4.2 Tính chọn lọc, tính đặc hiệu 25

2.4.3 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn 26

2.4.4 Độ lặp lại của phương pháp 26

2.4.5 Độ đúng (đánh giá qua độ thu hồi) 27

2.5 Phân tích mẫu thực tế 28 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Thông số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất đã phân lập được 29 3.2 Nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện đo của hệ thống sắc ký 33 3.2.1 Khảo sát lựa chọn điều kiện tách trên hệ sắc ký HPLC 33

3.2.2 Xây dựng các phương trình đường chuẩn 37

3.3 Nghiên cứu phương pháp xử lý mẫu dược liệu R officinalis 42 3.3.1 Khảo sát tỷ lệ dung môi chiết 42

3.3.2 Khảo sát phương pháp chiết 43

3.4 Đánh giá phương pháp phân tích 46 3.4.1 Đánh giá tính phù hợp của hệ thống sắc ký 46

3.4.2 Độ đặc hiệu 47

3.4.3 Độ lặp lại của phương pháp 48

3.4.4 Độ đúng của phương pháp 49

3.5 Định lượng bốn hoạt chất chính trên mẫu thực 51 KẾT LUẬN 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

PHỤ LỤC

H-NMR Proton nuclear magnetic

resonance spectroscopy Phổ cộng hưởng t hạt nhân proton

CDL Limit of detection of calibration Giới hạn phát hiện của đường chuẩn CDQ Limit of quantitation of

calibration

Giới hạn định lượng của đường chuẩn

DAD Diod Array Detector Detector mảng diod

HPLC High Performance Liquid

Chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao

R2 Correlation coefficient Hệ số tương quan

RO7

11,12,20-trihydroxy-abieta-8,11,13-triene

triene

RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối

iv

DANH MỤC BẢNG

Trang Bảng 2 1 Các mẫu R officinalis dùng trong nghiên cứu 16

Bảng 3 1 Số liệu phổ NMR của hợp chất RO1 và hợp chất tham khảo 30

Bảng 3 2 Các hợp chất RO1-RO5 phân lập t loài R officinalis 31

Bảng 3 3 Các hợp chất RO6-RO10 phân lập t loài R officinalis 32

Bảng 3 4 Hệ gradient với pha động MeOH/H2O và ACN/ H2O 35

Bảng 3 5 Thông số đánh giá pic các chất định phân trong các điều kiện rửa giải 35

Bảng 3 6 Ảnh hưởng của thể tích mẫu tiêm vào cột đến thông số pic các chất 36

Bảng 3 7 Hệ gradient chạy HPLC 37

Bảng 3 8 Khoảng tuyến tính RO1, RO3, RO9, RO10 38

Bảng 3 9 Giá trị hệ số b’ 40

Bảng 3 10 Các đại lượng thống kê 40

Bảng 3 11 Phương trình đường chuẩn của các chất 41

Bảng 3 12 CDL và CDQ của RO1, RO3, RO9 và RO10 bằng HPLC-DAD 41

Bảng 3 13 Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống 46

Bảng 3 14 Thời gian lưu mẫu đối chiếu và mẫu thử 48

Bảng 3 15 Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp bằng mẫu RO1 49

Bảng 3 16 Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp bằng mẫu thực 49

Bảng 3 17 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp 50

Bảng 3 18 Kết quả định lượng bốn hoạt chất trong một số mẫu lá và thân R officinalis 52

v

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1 1 Cây Bạc hà (Mentha arvensis) 2

Hình 1 2 Cây Hoàng cầm (Scutellaria baicalensis) 2

Hình 1 3 Loài Hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) 3

Hình 1 4 Cấu trúc của một số terpene phân lập t loài R officinalis 6

Hình 1 5 Cấu trúc của một số flavonoid phân lập t loài R officinalis 8

Hình 1 6 Cấu trúc của một số phenolic phân lập t loài R officinalis 8

Hình 2 1 Sơ đồ phân lập các hợp chất t loài R officinalis 20

Hình 3 1 Công thức cấu tạo chất RO1 ……… 29

Hình 3 2 Khảo sát bước sóng phát hiện tối ưu của các chất 33

Hình 3 3 Sắc ký đồ ứng với điều kiện sắc ký lựa chọn được 37

Hình 3 4 Đường chuẩn các chất RO1, RO3 38

Hình 3 5 Đường chuẩn các chất RO9, RO10 39

Hình 3 6 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của dung môi chiết đến hàm lượng RO1, RO3, RO9 và RO10 42

Hình 3 7 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ chiết siêu âm đến hiệu suất chiết RO1, RO3, RO9, RO10 43

Hình 3 8 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của thời gian chiết siêu âm đến hiệu suất chiết RO1, RO3, RO9, RO10 44

Hình 3 9 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ thể tích dung môi chiết/khối lượng dược liệu đến hiệu suất chiết RO1, RO3, RO9, RO10 45

Hình 3 10 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của thời gian chiết hồi lưu đến hiệu suất chiết RO1, RO3, RO9, RO10 46

Hình 3 11 SKĐ của chất đối chiếu RO1, RO3, RO9, RO10 47

Hình 3 12 SKĐ của mẫu thử 48

1

MỞ ĐẦU

Việt Nam là một nước nằm trong vùng nhiệt đới ẩm gió mùa nên có nguồn dược liệu rất phong phú và đa dạng Nhân dân ta t lâu đã biết dùng cây cỏ để chữa bệnh và phòng bệnh, nhưng chủ yếu theo kinh nghiệm dân gian tùy theo t ng địa phương Phần lớn các cây thuốc Việt Nam chưa được nghiên cứu một cách đầy đủ, nhất là về thành phần hóa học, tác dụng sinh học và hàm lượng các hoạt chất do đó chưa có được các cơ sở khoa học để tạo được các sản phẩm ứng dụng mới trong các lĩnh vực dược phẩm, thực phẩm và nông nghiệp Trong số đó có cây Hương thảo

(Rosmarinus officinalis L.) là một loại cây có nhiều ứng dụng trong cuộc sống

Nhiều nghiên cứu trên thế giới chỉ ra rằng nó có các khả năng như chống oxi hóa, kháng viêm và chống ung thư, ức chế mạnh sự tăng trưởng tế bào trong tất cả các dòng tế bào ung thư thử nghiệm, có tác dụng hạ đường huyết, kích thích hệ thần kinh Với mong muốn tìm hiểu về chất lượng cây Hương thảo, chúng tôi lựa chọn

đề tài: ―Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích các hoạt chất chính trong cây

Hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) bằng phương pháp HPLC‖

Mục tiêu nghiên cứu:

- Phân lập được một số hoạt chất chính trong cây Hương thảo dùng làm chất đối chiếu trong việc định tính, định lượng các hoạt chất đó

- Xây dựng được quy trình định lượng các hoạt chất chính trong cây Hương thảo bằng phương pháp HPLC

- Ứng dụng xác định, đánh giá hàm lượng các hoạt chất chính trong một số mẫu Hương thảo ở các vùng khác nhau

2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về họ Hoa môi (Lamiaceae)

Họ Hoa môi (Lamiaceae) còn được gọi bằng nhiều tên khác như họ Húng, họ Bạc hà…là một họ thực vật có hoa [32] Chúng phân bố rộng khắp trên toàn cầu nhưng tập trung chủ yếu ở Địa Trung Hải Một số loài là cây bụi hay cây gỗ, hiếm gặp hơn là các dạng dây leo Chúng có lá đối xứng và xếp chồng chéo hình chữ thập hay mọc vòng, thân cây thường hình vuông, có nhiều lông tuyến, nơi giải phóng những hợp chất thơm mà ta ngửi thấy

Các loài thực vật trong họ này nói chung có hương thơm trong mọi phần của cây và nhiều loại cây thân thảo được sử dụng rộng rãi trong ẩm thực và dùng làm thuốc như: Húng quế, Bạc hà (hình 1.1), Hoàng cầm (hình 1.2) Hương thảo (hình 1.3), Xô thơm, Tía tô Bên cạnh những loài lấy lá để ăn, làm gia vị còn một số loài được trồng làm cảnh như húng chanh Một số loài khác được trồng vì mục đích lấy hạt (chứ không phải lá) làm thực phẩm như hạt cây chia [32]

Trên thế giới, Lamiaceae có khoảng 245 chi và 7886 loài khác nhau Ở Việt

Nam có trên 40 chi và khoảng 145 loài Chi Rosmarinus có khoảng 40 loài, chi

Thymus có khoảng 350 loài và hầu hết chúng sống ở Châu Á Có khoảng 150 loài

điển hình của chi Ocimum được biết đến sinh sống ở Ấn Độ, còn ở Châu Âu có

15-20 loài, Có hơn 100 loài thuộc chi Phlonis, 40-50 loài thuộc chi Lamuim, [30, 31]

Hình 1 1 Cây Bạc hà

(Mentha arvensis)

Hình 1 2 Cây Hoàng cầm

(Scutellaria baicalensis) 1.2 Chi Rosmarinus

Rosmarinus là một chi trong họ hoa môi Lamiaceae, nhóm thực vật có hoa

Là loại cây bụi sống lâu năm có bộ lá thơm và hoa màu xanh tím

3

Chi Rosmarinus được tìm thấy ở vùng Địa Trung Hải, một phần ở phía nam

bờ biển Châu Âu, Bắc Mĩ và phía đơng Ai Cập, cũng như Cilicia Chúng được biết đến với mục đích dùng làm thuốc, nấu nướng, mỹ phẩm và trang trí Chúng được sử

dụng t rất sớm bởi người La Mã, Hy Lạp và Ai Cập Rosmarinus được xem là một

trong những lồi thực vật cĩ ích nhất vùng Địa Trung Hải

Cĩ khoảng 40 lồi trong chi Rosmarinus, tuy nhiên chỉ cĩ 6 lồi được chấp nhận tên: R officinalis L., R eriocalyx Jord & Fourr., R eriocalyx var pallescens

(Maire) Upson & Jury, R x lavandulaceus Noë, R x mendizaballii Sagredo ex Rosua, R tomentosus Hub -Mor & Maire. Mỗi lồi cĩ đặc điểm khác nhau nhưng

quan trọng nhất, nhiều lợi ích nhất là R officinalis L [16, 31]

1.3 Lồi Hương thảo (R officinalis L.)

1.3.1 Đặc điểm thực vật

a) Cây Hương thảo b) Lá Hương thảo khơ c) Thân Hương thảo khơ

Hình 1 3 Lồi Hương thảo (Rosmarinus officinalis L.)

Tên khoa học: Rosmarinus officinalis L

Tên thường gọi: Cây Hương thảo, cây Dương chổi

Mơ tả về thực vật: Cây nhỏ cao 1- 2 m, phân nhánh và mọc thành bụi Lá R

officinalis nhiều, hẹp, hình dải, dai, cĩ mép gập xuống, khơng cuống, màu xanh sẫm

và nhẵn ở trên, phủ lơng rải rác màu trắng ở mặt dưới Hoa xếp 2 - 10 ở các vịng lá, dài cỡ 1 cm, màu lam nhạt hơi cĩ màu hoa cà với những chấm tím ở phía trong các

4

thùy Toàn cây có mùi rất thơm Mùa nở hoa vào khoảng t tháng 3 đến tháng 5 [10]

1.3.2 Nguồn gốc phân bố

R officinalis là loài cỏ thơm ở vùng Địa Trung Hải, được trồng nhiều ở Nam

Âu, Tây Á và Bắc Phi trước đây Nó mọc hoang dại dọc theo phía bắc và phía nam

bờ biển Địa Trung Hải và cũng trong khu vực tiểu vùng Himalaya Nó được trồng

t những ngày xa xưa ở nước Anh, Đức, Pháp, Trung Mỹ, Venezuela

Tại Việt Nam, cây được nhập trồng ở một số tỉnh miền núi trung du phía Bắc, miền Trung và miền Nam.Thường trồng bằng cách giâm cành hay gieo hạt Cây thích hợp với khí hậu khô ráo, nhiều nắng nhưng không quá nóng Đất trồng phải thoát nước tốt

1.3.3 Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học

Qua nghiên cứu, các nhà khoa học thấy rằng trong loài R officinalis chứa

chủ yếu các thành phần là terpene, flavonoid, tinh dầu và các phenolic acid Ngoài

ra cây còn chứa các acid hữu cơ (citric, glyconic, )

Các hợp chất terpene là nhóm hợp chất tự nhiên mà phân tử của nó được

cấu tạo bởi một hoặc nhiều đơn vị isoprene (C5H8) và có chung 1 gốc sinh tổng hợp Có thể chia thành terpenoid mạch vòng và terpenoid mạch th ng Ngoài ra dựa vào số đơn vị isoprene, người ta chia thành monoterpene (C10), sesquiterpene (C15), diterpene (C20), triterpene (C30), tetraterpene (C40)

Cấu trúc của một số loại terpene như diterpene, triterpene, phenolic

diterpene,… trong loài R officinalis đã được xác định như: 7-methoxyrosmanol (1),

betulin (2) [9]; oleanolic acid (3), ursolic acid (4) [27]; carnosic acid (5), carnosol

(6), O-methylcarnosic acid (7) [21]; methoxy-trans-carnosic acid (8), methoxy-cis-carnosic acid (9) [45]; seco-hinokiol (10) [17]; 7β-methoxy-abieta- 8,13-diene-11,12-dione-(20,6β)-olide (11), 7α-methoxyabieta-8,13-diene-11, 12- dione-(20,6β)-olide (12), royleanolic acid (13), rosmanol (14), betulinic acid (15),

12-23-hydroxybetulinic acid (16), rofficerone (17) [39]; epirosmanol (18), methyl carnosate (19) [59]; rosmariquinone (20) [29]; rosmadial (21) [43]; isorosmanol

(22), 11,12-di-O-methoxy isorosmanol (23) [42] Cấu trúc của các chất này xem

trong hình 1.4

5

Các flavonoid đã được phân lập t loài R officinalis như: genkwanin (24),

isocutellarein 7-O-glucoside (25), (E)-feruloylhomoplantaginin (26), (E)-feruloylnepitrin (27), 6''-O-(E)-p-coumaroylnepitrin (28), 6-methoxyluteolin-7-

6''-O-7

glucopyranoside (29), luteolin 3'-O-β-D-glucuronide (30), luteolin

3'-O-(3''-O-acetyl)-β-D-glucuronide (31), kaempferol (32), luteolin (33), ladanein (34),

hispiduline (35), diosmethine (36), diosmine (37), sinensetine (38), homoplantaginin (39), eriocitrin (40), gallocatechin (41), hesperidin (42), acacetin (43), cirsimaritin (44) [11, 13, 15, 21, 22, 36, 44] Cấu trúc của các chất này xem

trong hình 1.5

8

Hình 1 5 Cấu trúc của một số flavonoid phân lập t loài R officinalis

Các hợp chất phenolic

Bên cạnh các hợp chất terpene và flavonoid đã được phân lập, các phenolic

cũng được tìm thấy trong loài R officinalis như: rosmanic acid (45), rosmarinic acid (46), caffeic acid (47), 1-O-(4-hydroxybenzoyl)-β- D -glucopyranose (48), 1-O-

feruloyl-β- D- glucopyranose (49) [11, 21, 28]

Hình 1 6 Cấu trúc của một số phenolic phân lập t loài R officinalis

9

Nhƣ vậy: Tổng hợp các kết quả nghiên cứu đã công bố cho thấy, thành phần

hoá học trong loài R officinalis rất đa dạng và phong phú, góp phần tạo cơ sở khoa

học lý giải cho việc sử dụng cây này để chữa bệnh trong y học cổ truyền

1.3.4 Công dụng và hoạt tính sinh học loài R officinalis

Loài R officinalis có vị chát, mùi thơm nồng, tính ấm nóng Người ta thường dùng R officinalis trong các trường hợp như: cơ thể suy nhược, choáng do huyết áp

thấp, người mệt yếu do tuần hoàn kém, mau quên, ăn uống không tiêu, đau nhức cơ, thấp khớp, viêm họng, nhức đầu, căng th ng thần kinh, chống rụng tóc, mau mọc tóc Được dùng dưới các dạng: ngâm rượu (cồn thuốc), nước hãm hoặc chiết tinh dầu để xoa bóp ngoài da

Qua nghiên cứu, các nhà khoa học đã cho thấy rằng các hợp chất trong loài

R officinalis có nhiều hoạt tính sinh học như:

 Hoạt tính chống oxi hóa

Năm 2013, Xiaoqiang Chen cùng các cộng sự tiến hành thử nghiệm song

song hoạt tính chống oxi hóa của tinh dầu R officinalis trong dầu hướng dương

được lưu giữ ở 60°C và việc sử dụng chất chống oxi hóa tổng hợp là butylat hydroxyanisol (BHA), butylat hydroxytoluene (BHT) và tert-butylhroquinon

(TBHQ) Kết quả thu được là tinh dầu R officinalis có tính oxi hóa rất mạnh, gần

bằng chất chống oxi hóa tổng hợp (BHA và BHT) [18]

Các hợp chất phenolic diterpene như carnosol (6), rosmanol (14), carnosic acid (5), và phenolic acid như rosmarinic (46), caffeic acid (47) được phân lập t

R officinalis, trong đó carnosic acid (5) và carnosol (6) được công nhận là có hoạt

tính chống oxy hóa cao nhất, chống lại các gốc tự do [54, 55]

 Hoạt tính chống viêm

Năm 2013, các nghiên cứu của Salvan da Rosa đã sử dụng các mô hình thí nghiệm và các thử nghiệm in vitro trên chuột Kết quả cho thấy trong thành phần

hóa học phân lập của R officinalis thì carnosol (6) và axit rosmarinic (46) có hoạt

tính kháng viêm rất mạnh trong mô mỡ do carrageenan gây ra Bằng cách ức chế bạch cầu, bạch cầu trung tính và giảm tiết dịch dẫn đến giảm giải phóng nitricoxide (chất trung gian gây viêm tiền liệt) Hai hợp chất này có khả năng chống viêm bằng cách ức chế phản ứng miễn dịch bẩm sinh, ngăn ng a các bệnh lý viêm và tự miễn dịch [20]

10

 Khả năng kháng khuẩn

Pinene, verbenone, bornyl acetate là thành phần tinh dầu trong R officinalis cho thấy hoạt động kháng khuẩn, chống lại cả vi khuẩn Gram (+) (Staphylococcus

aureus, S epidermidis) và Gram (-) (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa) [8]

Theo nghiên cứu của S Tavassoli, trong dịch chiết MeOH t lá R officinalis chứa các thành phần chống vi khuẩn Chống lại các chủng vi khuẩn Leuconostoc

mesenteroides, Lactobacillus delbruekii, Saccharomyces cerevisia và Candida krusei (Issatchenikia orientalis) [51]

Rosmarinic acid (46) và carnosic acid (5) theo nghiên cứu của Zampini

chống lại 37 chủng vi khuẩn Carnosic acid (5) ngăn cản Staphylococcus aureus

methicillin-resistant và Enterococcus faecalis gentamicin cũng như các dòng vi

khuẩn Escherichia coli, Proteus mirabilis, Enterobacter cloacae, Pseudomonas

aeruginosa, Morganella morganii and Providencia stuartii [58]

 Khả năng chống ung thư

Năm 2014, Margarita Gonzalez và các cộng sự nghiên cứu hoạt tính chống

lại ưng thư vú ở người của các hợp chất được phân lập t dịch chiết của R

officinalis Kết quả cho thấy sau khi sử dụng dịch chiết R officinalis (SFRE), thể

hiện sự chống lại các tế bào ung thư vú t các phân nhóm khối u khác nhau và sự điều hòa của các thụ thể ER- và HER2 Hơn nữa, SFRE làm tăng đáng kể hiệu quả của hóa trị liệu ung thư vú (tamoxifen, trastuzumab và aclitaxed) [25]

Chiết xuất t lá R officinalis đã được chứng minh có tác dụng chống lại các

tế bào ung thư biểu mô, hạn chế sự tăng sinh tế bào ung thư gan ở người Một số

chất có tác dụng như: carnosol (6), carnosic acid (5) và rosemanic acid (45) đã được

phân lập t loài R officinalis [54]

Jóseph Tai nghiên cứu, đánh giá hoạt tính chống sự phân bào của tế bào ung

thư buồng trứng Kết quả cho thấy carnosic acid (5) và rosmarinic acid (46) có trong

R officinalis có hoạt tính chống tăng sinh trên 2 dòng tế bào ung thư buồng trứng

người A2780 và ARL80CP70 vớ IC50 ước tính lần lượt là 1/1000 và 1/400 [50]

Ngoài ra carnosic acid (5) còn có khả năng ức chế 3 dòng tế bào Caco-2,

HT29 và LoVo của ung thư trực tràng với giá trị IC50 nằm trong khoảng t

24-96 [12]

 Cải thiện chức năng thận, giải độc gan, hạ đường huyết

11

Theo Zheng Tu và các cộng sự, sự rối loạn chuyển hóa như béo phì và tiểu

đường đang gia tăng Chiết xuất R officinalis giúp giảm lượng đường và cholesterol

trong máu bằng cách tăng cường tiêu thụ glucose trong tế bào HepG2 đồng thời phosphoryl hóa của AMP được hoạt hóa nhờ enzym AMP-activated protein kinase (AMPK) và chất nền acetyl-coA carboxylase (ACC) làm tăng glycolysis gan và oxy hóa acid béo [53]

Nghiên cứu cho thấy các hợp chất phenolic trong R officinalis giúp cải thiện

khả năng phòng, chống oxy hóa ở các mô khác nhau và giảm lượng cholesterol trong máu [4]

 Ảnh hưởng lên hệ thần kinh trung ương, hệ hô hấp

Theo nghiên cứu của Machado, ursolic acid (4), carnosol (6) và betulinic acid (15) thông qua sự kích hoạt các thụ thể dopamin D1 và D2 tương tác với hệ

thống dopaminegic có tác dụng chống trầm cảm [37, 38]

Luteolin (33), carnosic acid (5) và rosmarinic acid (46) phân lập t R

officinalis có tác dụng giảm đau, điều tiết monoaminergic và cholinergic Chúng tác

động đến thần kinh và cải thiện cholinergic ở tế bào PC12, các chất dẫn truyền thần kinh: dopamine, norepinephrine, serotonin và acetylcholine được thử nghiệm ở chuột [46]

Như vậy: Với nhiều công dụng và hoạt tính sinh học, nhu cầu sử dụng loài

R officinalis của người tiêu dùng ngày càng lớn và các sản phẩm t R officinalis

ngày càng xuất hiện nhiều Nhằm kiểm soát chất lượng của loài R officinalis, các sản phẩm t loài R officinalis để đảm bảo sức khỏe, lợi ích cho người tiêu dùng thì

việc kiểm tra chất lượng là vô cùng quan trọng

1.4 Tổng quan về các phương pháp phân tích thành phần hóa học của loài R officinalis

1.4.1 Các phương pháp phân tích thành phần hóa học của dược liệu

Dược liệu là đối tượng phân tích có thành phần nền phức tạp Trong dược liệu có một hỗn hợp các chất có tính chất giống nhau (terpene, flavonoid, anthraquinon ) Các chất trong cùng một nhóm chất thì giống nhau khung cơ bản, khác nhau ở một vài nhóm thế hoặc các thành phần khác, tức là khác nhau không nhiều về tính chất vật lý, tính chất hóa học Vì vậy, việc sử dụng các phương pháp quang phổ (UV-VIS, IR, huỳnh quang) để phân tích định lượng các hoạt chất trong dược liệu sẽ gặp nhiều khó khăn và hầu như là không thể thực hiện được

12

Hiện nay, trong phân tích hiện đại thì sắc ký là một trong những phương pháp xác định hàm lượng các chất thông dụng nhất Người ta có thể định lượng một chất hay định lượng đồng thời nhiều chất trong một lần định lượng nếu chọn được điều kiện thích hợp Các phương pháp sắc ký thường dùng là: sắc ký khí (GC), sắc

ký điện di, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Trong đó HPLC là phương pháp có nhiều ứng dụng trong nghiên cứu các hợp chất tự nhiên nói chung và nghiên cứu dược liệu nói riêng Ưu điểm lớn nhất của phương pháp này là có thể phân tích nhiều loại hợp chất khác nhau, nên khả năng phân tích rộng hơn nhiều so với sắc ký khí (thường dùng với các đối tượng dễ bay hơi) Có thể dùng HPLC để phân tích các chất t phân cực tới không phân cực, t các chất bay hơi tới các chất không bay hơi, t các chất trung tính tới các chất điện ly,… Với pha tĩnh ngày càng được hoàn thiện và đổi mới để nâng cao hiệu năng tách, detector ngày càng nhạy, HPLC ngày nay có thể dễ dàng phân tích các chất trong hỗn hợp ở mức ppm tới ppb, thậm chí ppt [2] Với mục tiêu đặt ra là xây dựng một phương pháp phân tích định lượng

nhanh, chính xác các hoạt chất chính trong loài R officinalis L chúng tôi lựa chọn

phương pháp nghiên cứu là sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

1.4.2 Các nghiên cứu về xác định thành phần hóa học trong loài R officinalis

Trên thế giới đã có các nghiên cứu về phân lập, định lượng các chất trong

loài R officinalis sử dụng các phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao như sau:

1.4.2.1 HPLC-UV

Rất nhiều nghiên cứu trên thế giới đã áp dụng kỹ thuật HPLC-UV trong xây

dựng phương pháp định tính, định lượng và đánh giá chất lượng loài R officinalis

Năm 2013, Hcini và các cộng sự đã tiến hành định tính và định lượng

rosmarinic acid (46), carnosol (6), carnosic acid (5), là các hoạt chất chính trong R

officinalis bằng HPLC Các điều kiện phân tích: sử dụng cột pha đảo ZORBAX

SB-C18 (4,6 mm 125 mm; 5 μm), pha động được dùng là acetonitril (A) và nước đã được acid hóa chứa 5% acid formic (B) Hệ gradient là 0 phút: 5%A; 10 phút: 15%A; 30 phút: 25%A; 35 phút: 30%A; 50 phút: 55%A; 55 phút: 90%A; 57 phút: 100%A; tốc độ dòng chảy: 1,0 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 20 μl, detector tử ngoại khả kiến UV-Vis loại DAD, bước sóng được phát hiện tại 280 và 330 nm [28]

Năm 2018, Tawfeeq cùng với các cộng sự đã phân tích định tính và định

lượng rosmarinic acid (46) trong lá R officinalis bằng HPLC Với điều kiện: cột pha

đảo ODS-C18 (250 mm 4,6 mm), pha động: 80% methanol và 20% nước (chứa

13

0,1% acid acetic); tốc độ dòng chảy 1 ml/phút Detector UV, phát hiện bước sóng tại 320 nm [52]

Năm 2020, Beateix Sik và các cộng sự cũng đã phân tích rosmarinic acid

(46), là một phenolic trong R officinalis bằng HPLC Sử dụng cột pha đảo

ODS-C18 (250 mm 4,6 mm), nhiệt độ cột 25oC, tốc độ dòng chảy 1 ml/phút Pha động là

hộ hợp ACN (A)và nước chứa 2,5% CH3COOH (B) với hệ gradient: 0-10 phút: 20% A; 10-30 phút: 20-30% A; 30-35 phút: 30-50% A; 35-50 phút: 50-60% A; 50-

10-55 phút: 60-90% A; 10-55-67 phút: 90-100% A; 67-68 phút: 100-10% A Detector DAD, phát hiện ở bước sóng 280 nm [47, 48]

1.4.2.2 LC-MS/MS

LC-MS/MS là phương pháp phân tích có độ chính xác cao Bên cạnh ý nghĩa trong phân tích định lượng, LC-MS/MS còn cung cấp các thông tin về dữ liệu phổ khối của các tín hiệu chất phân tích, t tín hiệu này có thể đánh giá về độ tinh khiết pic, có thể dự đoán được cấu trúc hóa học của một tín hiệu chất phân tích Có nhiều nghiên cứu áp dụng LC-MS/MS hoặc LC-MS về phân tích thành phần hóa học đối

với đối tượng loài R officinalis

Axit Rosmarinic là hợp chất polyphenolic tự nhiên được tìm thấy chủ yếu trong các loại thảo mộc thuộc họ Lamiaceae như hương thảo Nó thể hiện các hoạt tính sinh học khác nhau như chống oxy hóa, kháng vi-rút, kháng khuẩn và chống viêm LC-MS / MS có một vai trò quan trọng trong nghiên cứu xác định và mô tả đặc tính của các hợp chất tự nhiên, chuyển hóa thuốc, phát hiện ra các ứng cử viên thuốc mới vì tính nhạy cảm và tính đặc hiệu của nó Baser KHC cùng các cộng sự

đã tiến hành định lượng axit rosmarinic trong chiết xuất methanol của lá

Rosmarinus officinalis thu được t İzmir bằng cách sử dụng phương pháp

LC-MS/MS Các phân mảnh 358,9/160,9 và 358,9/197,0 của axit rosmarinic được sử dụng để định lượng Kết quả là 0,31g axit rosmarinic đo được trong 100g chiết xuất methanol của lá Hương thảo[14]

Borrásn Linares và cộng sự đã định tính và định lượng các hoạt chất của 20

mẫu R officinalis ở các nơi khác nhau bằng electrospray quadrupole-time of flight

mass spectrometry (HPLC–ESI-QTOF-MS) Sử dụng cột Zorbax Eclipse Plus C18 (4.6 mm ×150 mm, 1.8 μm) Tốc độ dòng chảy 0,8 ml/phút, thể tích tiêm 5 μl, nhiệt

độ của buồng lấy mẫu tự động 4oC Pha động là acetonitrile (B) và nước chứa 0,1% acid formic (A) với hệ gradient: 0 phút: 5% B; 12 phút: 50% B; 17 phút: 75% B; 22

14

phút: 95% B; 25 phút: 5% B Hệ thống HPLC được ghép nối với máy quang phổ khối micro TOF-Q II (Bruker Daltoniks, Bremen, Germany) thông qua ESI (Bruker Daltoniks, Bremen, Germany) [15]

1.4.3 Các phương pháp chiết tách chất phân tích ra khỏi mẫu dược liệu

Một trong những yếu tố quyết định đến hiệu quả của phương pháp định lượng đó là phương pháp xử lý mẫu Thông thường, đối với các mẫu thực vật, sử dụng dung môi hữu cơ hoặc nước để lấy các chất tan ra khỏi mô thực vật, quá trình

đó gọi là chiết xuất Sản phẩm thu được của quá trình này là một dung dịch các chất tan hoà tan trong dung môi, gọi là dịch chiết Có nhiều cách chiết, phổ biến nhất là chiết bằng nước đun sôi, tuy nhiên, trong thực vật có rất nhiều chất không tan trong nước, khi đó ta phải dùng thay thế bằng các dung môi hữu cơ như: EtOH, MeOH, Acetone,dichloromethane… Hiệu quả của quá trình chiết xuất phụ thuộc vào bản chất của chất tan, dung môi, nhiệt độ, áp suất, cấu tạo vách tế bào,…[2]

Có rất nhiều kỹ thuật chiết khác nhau Trong phòng thí nghiệm, một số các phương pháp chiết xuất cổ điển thường được sử dụng ở quy mô phân tích như: chiết soxhlet, chiết hồi lưu, chiết siêu âm,…Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học công nghệ, có nhiều phương pháp chiết khác được sử dụng với mục đích giảm lượng dung môi, hoá chất sử dụng để tránh độc hại và không gây ô nhiễm môi trường như: chiết pha rắn, chiết bằng chất lỏng quá tới hạn,… tuy nhiên, các kỹ thuật này đều tương đối phức tạp và kinh phí tốn kém, vì vậy khó có thể áp dụng rộng rãi ở mọi đơn vị kiểm nghiệm

Chiết siêu âm là quá trình chiết với sự hỗ trợ của sóng siêu âm, thường sử dụng trong chuẩn bị mẫu phân tích Khi đó, nhúng bình chiết vào một bể siêu âm có chứa nước, sóng siêu âm phát ra t các đầu phát sẽ truyền qua môi trường nước và

đi vào hỗn hợp chiết Ưu điểm của phương pháp là nhanh, đơn giản, dễ sử dụng Nhược điểm là trong dịch chiết xuất hiện nhiều tạp

Chiết hồi lưu là một trong những phương pháp ngâm chiết truyền thống, được thực hiện trong một hệ thống ngưng tụ Ưu điểm của phương pháp là hiệu suất chiết cao Nhưng có nhược điểm là phức tạp hơn chiết siêu âm

Với mục đích chiết tách và phân lập chất, các tác giả [19] đã chiết tách và

tinh chế được 8 hợp chất t R officinalis MeOH là dung môi được sử dụng để chiết

các chất này ra khỏi dược liệu, cao MeOH được hòa tan trong nước và chiết lỏng

lỏng với lần lượt các dung môi n-hexane, CHCl3 Phân đoạn CHCl3 được xác định

15

là chứa các hợp chất định tách Phân đoạn này được tách sơ bộ bằng cột pha thường, cột RP-18 trước khi sử dụng phương pháp sắc ký lỏng điều chế với cột tách sử dụng

là cột pha đảo Hệ dung môi rửa giải là 40-45% MeOH/H2O

Với mục đích phân tích định lượng [34], Jacotet Navarro và các cộng sự đã tiến hành so sánh phương pháp chiết xuất siêu âm và chiết bằng lò vi sóng các hợp

chất rosmarinic acid (46), carnosic acid (5) và ursolic acid (4) t lá R officinalis

EtOH 90% là dung môi được sử dụng để chiết các chất này ra khỏi dược liệu Sau khi khảo sát các ảnh hưởng về thời gian chiết, dung môi chiết và tỷ lệ chiết dung môi/dược liệu thì cho thấy chiết siêu âm cho hàm lượng carnosic acid và ursolic acid nhiều nhất và chiết bằng lò vi sóng cho hàm lượng rosmarinic acid cao nhất Hơn nữa, nghiên cứu này cho thấy rằng chiết xuất bằng siêu âm và lò vi sóng những lựa chọn thay thế tốt cho các quy trình thông thường liên quan đến tiêu thụ năng lượng và khí thải carbon ở quy mô phòng thí nghiệm Điều kiện chiết siêu âm tốt nhất là tại 40oC, thời gian siêu âm 30 phút và tỷ lệ dung môi chiết/dược liệu là 20 ml/1 g

Ngoài ra, có một số công trình nghiên cứu khác [6, 40, 41] đã sử dụng EtOH, EtOH/H2O hoặc MeOH/H2O làm dung môi chiết trong quá trình xử lý mẫu R

officinalis Nhận xét thấy, sử dụng EtOH làm dung môi chiết có nhiều ưu điểm hơn

MeOH, đặc biệt EtOH ít gây độc hại và thân thiện với môi trường hơn, vì vậy có thể

áp dụng rộng rãi ở các đơn vị kiểm nghiệm, phòng thí nghiệm và trong công nghiệp

Nhƣ vậy: Với mục tiêu góp phần tìm hiểu về loài R officinalis trên thị

trường Việt Nam chúng tôi tiến hành đề tài ―Nghiên cứu xây dựng quy trình phân

tích các hoạt chất chính trong cây Hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) bằng

phương pháp HPLC‖ Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành phân lập một

số hoạt chất trong loài R officinalis và xây dựng phương pháp định lượng các hoạt

chất đó bằng phương pháp HPLC

16

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Các mẫu cây Hương thảo (R officinalis L.) sử dụng trong nghiên cứu được

thu hái t các khu vực khác nhau của Việt Nam bao gồm: Hà Nội, Hưng Yên, Đà Lạt được trình bày ở bảng 2.1 Sau đó phơi và sấy ở 50 cho đến khô Mỗi mẫu được lấy khoảng 150g nghiền thành bột mịn, đủ dùng cho việc nghiên cứu

Bảng 2 1 Các mẫu R officinalis dùng trong nghiên cứu

Kí hiệu mẫu

Nơi thu hái

1 R officinalis Hà Đông A Vạn Phúc - Hà Đông - Hà Nội

2 R officinalis Thanh Trì B Kim Giang - Thanh Trì - Hà Nội

3 R officinalis Long Biên C Cổ Linh - Long Biên - Hà Nội

4 R officinalis Hưng Yên D Văn Giang – Hưng Yên

2.2 Hoá chất, dụng cụ và thiết bị

2.2.1 Chất chuẩn

2.2.1.1 Chất đối chiếu 7α-Methoxyrosmanol

Chất đối chiếu 7α-Methoxyrosmanol (viết tắt RO1) là sản phẩm phân lập được t dược liệu R officinalis độ tinh khiết đạt 95,0% (kiểm tra bằng HPLC, tính

theo phần trăm diện tích pic); CTPT: C21H28O5, KLPT: 360,44 ĐvC

Cách pha dung dịch chất đối chiếu RO1 (nồng độ 20 mg/ml): cân chính xác 105,26 mg chất đối chiếu RO1, chuyển vào bình định mức 5 ml, thêm khoảng 3 ml MeOH, siêu âm cho tan hết Bổ sung đến vạch mức bằng MeOH, lắc đều, thu được dung dịch RO1 có nồng độ chính xác 20 mg/ml T dung dịch chuẩn này, tiến hành pha loãng bằng MeOH theo các tỷ lệ khác nhau để thu được các dung dịch RO1 chuẩn có nồng độ nhỏ hơn dùng cho nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích

17

2.2.1.2 Chất đối chiếu 7β-methoxyrosmanol

Chất đối chiếu 7β-methoxyrosmanol (viết tắt RO9) là sản phẩm phân lập được t dược liệu R officinalis độ tinh khiết đạt 95,0% (kiểm tra bằng HPLC, tính

theo phần trăm diện tích pic); CTPT: C21H28O5, KLPT: 360,44 ĐvC

Cách pha dung dịch chất đối chiếu RO9: tương tự dung dịch chất đối chiếu RO1

2.2.1.3 Chất đối chiếu demethyl salvicanol

Chất đối chiếu Demethyl salvicanol (viết tắt RO3) là sản phẩm phân lập

được t dược liệu R officinalis độ tinh khiết đạt 95,0% (kiểm tra bằng HPLC, tính

theo phần trăm diện tích pic); CTPT: C20H30O3, KLPT: 318,45 ĐvC

Cách pha dung dịch chất đối chiếu RO3: tương tự dung dịch chất đối chiếu RO1

2.2.1.4 Chất đối chiếu 7α-ethoxyrosmanol

Chất đối chiếu 7α-Ethoxyrosmanol (viết tắt RO10) là sản phẩm phân lập được t dược liệu R officinalis độ tinh khiết đạt 95,0% (kiểm tra bằng HPLC, tính

theo phần trăm diện tích pic); CTPT: C22H30O5, KLPT: 374,47 ĐvC

Cách pha dung dịch chất đối chiếu RO10: tương tự dung dịch chất đối chiếu RO1

2.2.2 Các hoá chất khác

- Các hoá chất sử dụng trong quá trình chiết tách và xử lý mẫu như: ethanol

(EtOH 96%), n-hexane, ethyl acetate (EtOAc), axetone (A), dichloromethane (D),

acid sulfuric…) dùng cho sắc ký đạt tiêu chuẩn phân tích (P.A), Trung Quốc Dung môi dùng trong chiết xuất đạt tiêu chuẩn công nghiệp được chưng cất lại trước khi dùng

- Nước cất hai lần

- Silica gel 60 (0,04-0,063 mm) Merck

- Silica gel pha đảo ODS hoặc YMC (30-50 Pm, FuJisilisa Chemical Ltd.)

- Bản mỏng tráng sẵn pha thường DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715)

- Bản mỏng tráng sẵn pha ngược RP-18 F254s (Merck)

18

- Dung môi hoà tan chuẩn bị mẫu phân tích và dung môi pha động chạy sắc

ký (methanol, acetonitrile) thuộc loại dùng cho HPLC (Merck, Đức)

2.2.3 Dụng cụ, thiết bị

Dụng cụ

- Micropipet các cỡ: 100, 200, 1000 l (Eppendorf, Đức)

- Bình cầu đáy bằng, đáy tròn các cỡ (Isolab, Đức)

- Phễu lọc thuỷ tinh

- Sinh hàn hồi lưu

- Nhiệt kế

- Cốc thuỷ tinh 50 ml, 100 ml

- Bình tia, vial

- Cột sắc ký pha thường và pha đảo các loại đường kính

- Sinh hàn hồi lưu

Tất cả các dụng cụ thủy tinh đều phải được rửa sạch, tráng bằng nước cất,

sau đó tráng bằng MeOH và để khô, tráng n-hexane 3 lần sau đó sấy ở 105 trong

vòng 1 giờ, lấy ra để nguội trước khi sử dụng

Thiết bị

- Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Agilent 1100HP với detector DAD (Mỹ)

- Cột pha đảo C18 YMC (150 mm x 4,6 mm; 5 ) (Nhật Bản)

- Máy siêu âm Elmasonic S300H (Đức)

- Cân phân tích 4 số AL204 Mettler Toledo

- Tủ sấy

- Tủ hút

- Máy cất quay chân không Eyela N-1200A (Nhật Bản)

- Đèn tử ngoại hai bước sóng 254 và 368 nm UVGL-58 (Mỹ)

- Bếp điện

- Các dụng cụ khác

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp phân tách các dịch chiết và phân lập các hợp chất

Thân và lá R officinalis (Đà Lạt) sau khi sấy khô, nghiền thành bột mịn (1

kg), sau đó chiết với methanol (3 lần x 10L) bằng thiết bị siêu âm (ở 50oC, mỗi lần

19

1 giờ) Các dịch chiết được gom lại, lọc qua giấy lọc và cất thu hồi dung môi dưới

áp suất giảm thu được 156 g cặn chiết methanol Cặn chiết này được hòa tan vào 2

lít nước cất và tiến hành chiết phân bố lần lượt với n-hexane và EtOAc thu được cặn

n-hexane (ROH, 36,0 g), cặn EtOAc (ROE, 85,0 g) và lớp nước (ROW, 35,0 g) sau

khi cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm

Phân đoạn ROH được phân bố đều trong MeOH, tẩm với silica gel, quay khô loại bỏ dung môi, nghiền mịn đưa lên cột sắc ký silica gel với hệ dung môi rửa giải

gradient n-hexane:EtOAc (100:0 → 0:1, v/v) thu được năm phân đoạn chính,

RO1A-RO1E Phân đoạn RO1B được phân tách trên cột sắc ký silica gel với hệ

dung môi rửa giải n-hexane-EtOAc (8:1, v/v) thu được năm phân đoạn,

acetone:nước (3:1, v/v) thu được hợp chất RO4 (3,3 mg) và RO5 (3,0 mg) Phân

đoạn RO6D được phân tách trên cột sắc ký RP-18 với hệ dung môi rửa giải

acetone:nước (3:1, v/v) thu được hợp chất RO6 (10,0 mg) và RO7 (17,6 mg)

Phân đoạn RO3E được phân tách trên cột sắc ký RP-18 với hệ dung môi rửa giải acetone:nước (2,5:1, v/v) thu được bốn phân đoạn, RO7A-RO6D RO6A tiếp tục được phân tách trên cột sắc ký RP-18 với hệ dung môi rửa giải acetone:nước

(3:1, v/v) thu được hợp chất RO8 (45,6 mg) Phân đoạn RO7B được phân tách trên

cột sắc ký RP-18 với hệ dung môi rửa giải acetone:nước (3:1, v/v) thu được hợp

chất RO9 (29,0 mg) Phân đoạn RO7C được phân tách trên cột sắc ký RP-18 với hệ dung môi rửa giải acetone:nước (4:1, v/v) thu được hợp chất RO10 (27,2 mg)

Quy trình phân lập các hợp chất được tóm tắt qua hình 2.1

1

20

Hình 2 1 Sơ đồ phân lập các hợp chất t loài R officinalis

21

2.3.2 Phương pháp xác định cấu trúc các chất

Xác định cấu trúc chất phân lập thông qua việc phân tích các phổ cộng hưởng t hạt nhân (1H-NMR và 13C-NMR), phổ HSQC và so sánh với dữ liệu trong các tài liệu tham khảo [3]

Phổ 1 H-NMR: Trong phổ 1H-NMR, độ chuyển dịch hoá học ( ) của các proton được xác định trong thang t 0-14 ppm tuỳ thuộc vào mức độ lai hoá của nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của t ng phân tử Mỗi loại proton cộng hưởng

ở một t trường khác nhau vì vậy chúng được biểu diễn bằng một độ dịch chuyển khác nhau Dựa vào những đặc trưng của độ dịch chuyển hoá học cũng như tương tác spin giữa các hạt nhân t với nhau mà người ta có thể xác định được cấu trúc hoá học của hợp chất

Phổ 13 C-NMR: phổ này cho tín hiệu vạch phổ của cacbon, mỗi nguyên tử

cacbon sẽ cộng hưởng ở một t trường khác nhau và cho một tín hiệu phổ khác nhau Thang đo phổ 13C-NMR cũng được tính bằng ppm và với dải thang đo rộng hơn so với phổ proton (t 0-240 ppm)

Phổ 2D-NMR: Đây là các kỹ thuật phổ hai chiều, cho phép xác định các

tương tác của các hạt nhân t của phân tử trong không gian hai chiều Một số kỹ thuật thường dùng:

Phổ HMQC – heteronuclear multiple quantum coherence: Các tương tác

trực tiếp C-H được xác định nhờ vào các pic giao nhau trên phổ HMQC Trên phổ này, một trục là phổ 1H-NMR còn trục kia là 13C-NMR

Phổ HMBC – heternuclear multiple bond connectivity: là phổ biểu diễn

các tương tác xa của C và H trong phân tử

Phổ cộng hưởng t hạt nhân NMR (1D, 2D-NMR) được ghi trên máy Bruker Avance 500 MHz cho 1H-NMR với TMS làm chất nội chuẩn và 125 MHz cho 13C- NMR với tín hiệu dung môi làm chất chuẩn nội Thiết bị đo được đặt tại Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.3.3 Tối ưu hóa điều kiện hệ thống sắc ký

Phép phân tích định lượng các hoạt chất chính trong R officinalis được thực

hiện trên hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC, kết hợp với hệ bơm gồm 4 kênh, bộ điều khiển, bộ trộn dung môi và detector DAD

22

Detector là một bộ phận có vai trò theo dõi, phát hiện các chất tan trong pha động t cột sắc ký rửa giải ra một cách liên tục, nó là một bộ phận thu nhận và phát hiện các hợp chất dựa theo một tính chất nào đó của chất phân tích Trên thực tế, hầu hết các chất nghiên cứu đều hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại UV – VIS, vì vậy detector UV – VIS thường được sử dụng nhiều nhất trong các nghiên cứu Hiện nay mảng diot – array (DAD) phát triển, chúng có vai trò như một detector UV –

VIS Vì vậy, detector DAD được dùng để định lượng các hoạt chất chính trong R

officinalis

Cột tách có vai trò rất quan trọng trong một phép tách sắc ký, nó quyết định hiệu quả tách của quá trình Để chọn được một pha tĩnh hay một cột tách phù hợp nhất, ta phải dựa trên những đặc điểm như: độ phân cực của chất phân tích, chất phân tích được pha trong môi trường như thế nào, có pH ra sao thì mới quyết định chọn pha tĩnh phù hợp Do các chất phân tích kém phân cực nên phải sử dụng pha tĩnh có bản chất kém phân cực giống như chất phân tích Vì vậy, cột pha đảo RP-HPLC là lựa chọn tối ưu nhất Trong điều kiện phòng thí nghiệm, chúng tôi đã sử dụng cột tách pha đảo C18 YMC (250 mm x 4,6 mm; 5 ) để tách các hợp chất và định lượng chúng

Các điều kiện phân tích trên hệ thống HPLC được tóm tắt như sau:

- Nhiệt độ cột: 40oC

- Detector diod array DAD

- Thể tích tiêm mẫu: t 1 μl đến 10 μl

- Tốc độ dòng: 1 ml/phút

- Hệ thống dung môi: khảo sát các hệ MeOH/H2O và ACN/H2O

- Rửa giải theo chương trình gradient

2.3.4 Phương pháp xử lý mẫu

Theo tính chất đã biết của các nhóm chất terpen, flavonoid là tan tốt trong các dung môi hữu cơ như EtOH, MeOH…Theo các tài liệu tham khảo [6, 40, 41], chúng tôi lựa chọn hỗn hợp dung môi chiết là EtOH/H2O bởi EtOH ít gây độc hại

và thân thiện với môi trường hơn MeOH

Đối với các mẫu thử R officinalis, chúng tôi đã khảo sát và đưa ra phương

pháp xử lý mẫu như sau:

Chiết siêu âm: Cân chính xác các mẫu dược liệu (thân và lá R officinalis)

cho vào bình nón, chiết siêu âm với EtOH 70 ba lần, mỗi lần 50 ml và trong 30

23

phút Ép bã dược liệu thu được các dịch chiết Các dịch chiết này được hòa tan vào nước cất và tiến hành chiết 2-3 lần với dichloromethane để loại tạp chất thu được các dịch chiết dichlometane, để lắng 24h, gạn và lọc thu được dịch lọc Cô loại dung môi các dịch lọc dưới áp suất thu được các cao đặc Hòa tan cao đặc trong một lượng chính xác MeOH, tiến hành sắc ký HPLC

Chiết hồi lưu: Cân chính xác các mẫu dược liệu (thân và lá R officinalis)

cho vào bình cầu, chiết nóng bằng đun sôi hồi lưu với EtOH 70 (khoảng 200 ml), đun sôi nhẹ trong 3h (chiết 3 lần) Thu các dịch chiết và ép bã dược liệu Dịch chiết EtOH được hòa tan vào nước cất và tiến hành chiết 2-3 lần với dichlometane thu được các dịch chiết dichloromethane, để lắng, gạn và lọc thu được dịch lọc Cô loại dung môi dịch lọc dưới áp suất thu được cao đặc Hòa tan cao đặc trong một lượng chính xác MeOH, tiến hành sắc ký HPLC

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến kỹ thuật chiết gồm có:

+ Dung môi chiết xuất

+ Phương pháp chiết xuất

+ Thời gian chiết và số lần chiết

+ Tỷ lệ thể tích dung môi chiết/dược liệu

2.3.4.1 Khảo sát tỷ lệ dung môi chiết

Tiến hành khảo sát chiết với cả hai loại hỗn hợp dung môi hữu cơ MeOH/H2O, EtOH/H2O theo các tỷ lệ biến đổi t 100% - 20% Các dịch chiết thu được ứng với t ng khảo sát được tiến hành phân tích định lượng RO1, RO3, RO9

và RO10 theo phương pháp HPLC-DAD Hàm lượng các hoạt chất này trong dịch chiết là tiêu chí đánh giá hiệu quả chiết, t đó chọn ra được điều kiện chiết tối ưu Mỗi khảo sát được tiến hành thí nghiệm 3 lần và lấy giá trị trung bình

2.3.4.2 Phương pháp chiết xuất

Trong phạm vi phòng thí nghiệm, hai phương pháp chiết được lựa chọn để khảo sát là: chiết siêu âm và chiết hồi lưu

Chiết siêu âm: Sóng siêu âm gây ra sự phá vỡ cấu trúc vật lý một cách mãnh liệt – gây ra sự khuếch tán vào trong dung môi của các chất cần chiết xuất Ưu điểm của phương pháp này là nhanh, đơn giản, dễ sử dụng Tuy nhiên, phương pháp có nhược điểm là dịch chiết nhiều tạp

24

Chiết nóng: Sử dụng dung môi để chiết nóng các hoạt chất t dược liệu đã nghiền nhỏ trong bình cầu bằng phương pháp đun hồi lưu Ưu điểm là hiệu suất chiết cao, dịch chiết thu được ít tạp chất hơn so với phương pháp chiết siêu âm, tuy nhiên hệ thống chiết phức tạp hơn

2.3.4.3 Khảo sát nhiệt độ chiết

Nhiệt độ là yếu tố ảnh hưởng đến độ tan của một chất, vì vậy nhiệt độ chiết ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình hòa tan chất định phân trong dung môi chiết Đối với chiết hồi lưu, nhiệt độ chiết thường được chọn là nhiệt độ sôi của dung môi dùng để chiết xuất Đối với chiết siêu âm, các bể chiết siêu âm hiện nay thường có khoảng nhiệt độ làm việc t 300C đến 500C, vì vậy, lựa chọn khoảng 300C-500C để tiến hành khảo sát trong điều kiện cố định như sau:

+ Hệ dung môi chiết: EtOH/H2O (70/30)

+ Thời gian chiết: 30 phút

+ Khối lượng dược liệu: 1 g

+ Thể tích dung môi: 50 ml

Mỗi khảo sát được làm lặp lại 3 lần

2.3.4.4 Tỷ lệ thể tích dung môi chiết / khối lượng dược liệu

Tỷ lệ thể tích dung môi chiết/khối lượng dược liệu là yếu tố ảnh hưởng lớn đến quá trình chiết xuất hoạt chất ra khỏi nền mẫu dược liệu Nếu sử dụng lượng thể tích dung môi chiết ít, một phần lớn dung môi bị ngấm vào dược liệu, dịch chiết thu được ít dẫn đến hiệu suất chiết thấp Ngược lại, nếu sử dụng lượng thể tích dung môi chiết lớn, có thể chiết kiệt lượng chất định phân có trong mẫu thử, nhưng cũng

có thể dẫn tới xuất hiện nhiều tạp chất gây cản trở quá trình phân tích và phát hiện chất Hơn nữa, việc sử dụng thể tích dung môi chiết lớn gây tốn kém về mặt kinh tế Chính vì vậy, việc khảo sát lựa chọn tỷ lệ thể tích dung môi chiết/dược liệu tối ưu là cần thiết Các tỉ lệ dung môi (ml) – dược liệu (g) được lựa chọn khảo sát trong phương pháp chiết bao gồm: 30:1, 50:1, 70:1 và 90:1

25

2.3.4.5 Khảo sát thời gian chiết

Thời gian chiết cũng có ảnh hưởng đến hiệu suất chiết Nếu thời gian chiết dài gây tốn kém về mặt kinh tế, đồng thời có thể dẫn tới việc xuất hiện các tín hiệu tạp chất Thời gian chiết được khảo sát như sau:

+ Hệ dung môi chiết: EtOH/H2O (70/30)

+ Khối lượng dược liệu: 1 g

+ Thể tích dung môi: 50 ml

+ Nhiệt độ chiết 70oC

+ Khảo sát thời gian chiết trong 1h, 2h, 3h, 4h và 5h

2.4 Đánh giá phương pháp phân tích

2.4.1 Tính thích hợp của hệ thống sắc ký

Đánh giá sự phù hợp của thiết bị đối với việc thực hiện phương pháp HPLC

đã cho để đạt độ đúng và độ tin cậy chấp nhận được

Cách khảo sát: tiến hành tiêm lặp lại 6 lần mẫu đối chiếu RO1 có nồng độ 1 mg/ml vào hệ thống sắc ký theo chương trình đã chọn Ghi lại thời gian lưu và diện tích pic của các lần sắc ký

Yêu cầu: số đĩa lý thuyết 2000, giá trị RSD của thời gian lưu 1% và của diện tích pic phải 2% (với phép thử định lượng) Trường hợp RSD 2% phải có

sự giải thích phù hợp Độ phân giải giữa pic chính và pic phụ phải lớn hơn 1,5 (RS 1,5)

2.4.2 Tính chọn lọc, tính đặc hiệu

Là khả năng phát hiện được chất phân tích khi có mặt các tạp chất khác như các tiền chất, các chất chuyển hoá, tạp chất… Trong phép phân tích định lượng, là khả năng xác định chính xác chất phân tích trong mẫu khi bị ảnh hưởng của tất cả các yếu tố khác, nhằm hướng đến kết quả chính xác

Cách khảo sát: Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã tìm được trên mẫu thử lá

R officinalis ở Hưng yên và mẫu đối chiếu RO1, RO3, RO9, RO10 có nồng độ 1

mg/ml Ghi lại sắc ký đồ (SKĐ)

Yêu cầu: Trên SKĐ của mẫu thử phải cho pic với thời gian lưu tương ứng như pic của chất đó trên mẫu chuẩn

26

2.4.3 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn

Pha một dãy các dung dịch chuẩn có nồng độ chính xác, tiến hành sắc ký theo điều kiện đã nêu, lấy kết quả về diện tích pic và dựng đường chuẩn để thu được

phương trình hồi quy Yêu cầu phương trình hồi quy có R> 0,99

Đánh giá phương trình hồi quy: xây dựng các phương trình đường chuẩn trên phần mềm minitab 19 Đánh giá sai số hệ thống của các hệ số trong phương trình hồi quy sử dụng các chuẩn Student và Fisher

T phương trình đường chuẩn xây dựng được, với độ lệch chuẩn SD thu được trên bảng phân tích ANOVA, tính toán được giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của đường chuẩn (CDL và CQL) theo các công thức tính như sau:

CDL = 3.S D /b → CDQ = 3,3 x CDL Trong đó: S D là độ lệch chuẩn của phương trình đường chuẩn; b là độ dốc của đường chuẩn

2.4.4 Độ lặp lại của phương pháp

Diễn tả sự trùng hợp (hay mức độ phân tán) của các kết quả đo được t nhiều lần lấy mẫu trên cùng một mẫu thử đồng nhất dưới những điều kiện mô tả

Khảo sát độ lặp lại của hệ thiết bị HPLC sau khi chọn các điều kiện tối ưu, đánh giá độ lặp của hệ thiết bị dựa trên độ lặp diện tích và thời gian lưu của các cấu

tử trong dung dịch khảo sát Dung dịch khảo sát là một mẫu có nồng độ xác định nằm trong giới hạn tuyến tính của đường chuẩn đã xây dựng, được bơm vào hệ 6 lần sau đó lấy diện tích pic và thời gian lưu trung bình của các lần và tính được giá trị % RSD Giá trị này đánh giá độ lặp cần khảo sát

Khi phân tích mẫu thực thì độ lặp lại của quá trình xử lý mẫu cũng được khảo sát và đánh giá Để đánh giá độ lặp lại, cùng một mẫu được cân khối lượng gần giống nhau, xử lý cùng một điều kiện Mỗi mẫu sau xử lý được bơm 3 lần để thu được kết quả trung bình Các giá trị trung bình đó được sử dụng để đánh giá độ lặp của phương pháp xử lý mẫu Giá trị % RSD cũng được dùng làm giá trị đánh giá

độ lặp của phương pháp xử lý mẫu

Yêu cầu: Với phép thử định lượng: giá trị RSD 2,0% Các trường hợp giá trị RSD > 2%, cần phải có sự giải thích phù hợp

27

2.4.5 Độ đúng (đánh giá qua độ thu hồi)

Độ đúng có thể được đánh giá qua sự phù hợp của kết quả thực nghiệm so với giá trị thực hoặc được chấp nhận thực Đánh giá độ đúng thông qua độ thu hồi

Cách khảo sát: Tiến hành thêm 1 lượng xác định chất RO1 vào mẫu thử (lá

R officinalis Hưng Yên) sao cho nồng độ chất RO1 đó vẫn nằm trong khoảng tuyến

tính Tiến hành đo các dung dịch sau:

- Dung dịch chuẩn

- Dung dịch mẫu thử

- Dung dịch mẫu thử thêm chuẩn: thêm một lượng chính xác chất chuẩn ở các mức khác nhau vào trong mẫu thực và tiến hành chiết tách như với mẫu thực Tính độthu hồi theo công thức:

R% = 100%

Trong đó:

R%: độ thu hồi

Cc: nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết)

Ct+c: nồng độ chất phân tích trong mẫu thêm chuẩn

Ct: nồng độ chất phân tích trong mẫu thử Yêu cầu: Theo AOAC, mẫu phân tích có hàm lượng chất phân tích 1% độ thu hồi yêu cầu nằm trong khoảng 97-103%

 Một số đặc trưng thống kê để xử lý và đánh giá kết quả

Tính toán dựa trên các phương pháp xử lý thống kê trong phân tích với các đại lượng đặc trưng với sự hỗ trợ tính toán của phần mềm Minitab 17

28

2.5 Phân tích mẫu thực tế

Mẫu thử sau khi được xử lý thu được dung dịch chạy sắc ký HPLC Mỗi mẫu được phân tích lặp lại 3 lần và lấy kết quả trung bình Hàm lượng (%) của các hoạt chất chính tính theo dược liệu khô tuyệt đối được tính theo công thức (1):

Hz) Bên cạnh đó còn xuất hiện một tín hiệu proton gắn vòng thơm tại δH 6,81 (1H, s) Hai tín hiệu doublet tại δH 4,26 và 4,71 (J = 3,0 Hz Ngoài ra, phổ 1H-NMR còn

có một tín hiệu singlet ở δH 3,66 cho thấy hợp chất là một dẫn xuất methoxy của rosmanol

Trên phổ 13C-NMR của RO1 xuất hiện tín hiệu của 21 nguyên tử carbon,

trong đó có năm carbon methyl tại C 22,2; 22,4; 22,0; 31,5; 58,2 (C nhóm methoxy); ba carbon methylene tại C 27,1; 19,0; 38,0; năm carbon methine tại C

51,0; 74,9; 77,4; 27,3; 121,1 (carbon ở trong vòng thơm) và tám nguyên tử carbon không liên kết trực tiếp với nguyên tử hydro tại C 31,4; 126,0; 125,0; 47,1; 143,6; 141,3; 134,9; một nhóm carbonyl ở vị trí 179,6

Phân tích phổ NMR của hợp chất RO1 cho thấy số liệu phổ của hợp chất này

tương tự với số liệu phổ đã công bố của 7α-methoxy rosmanol

Do đó, hợp chất RO1 được xác định là 7α-methoxy rosmanol [5]

T các dữ liệu giải phổ 1H-NMR, 13C-NMR, HSQC, HMBC và các số liệu được trình bày ở bảng 3.1 đã kh ng định chắc chắn công thức phân tử của hợp chất

này Công thức cấu tạo của chất RO1 được trình bày ở hình 3.1

Hình 3 1 Công thức cấu tạo chất RO1

30

Bảng 3 1 Số liệu phổ NMR của hợp chất RO1 và hợp chất tham khảo

Vị trí δ C [5] δ C a,b δ H a,c (độ bội, J = Hz)

Tương tự, dựa trên các dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, HSQC, HMBC và

các tài liệu tham khảo, 10 chất đã được phân lập gồm có 7α-methoxyrosmanol

(RO1); carnosol (RO2); demethylsalvicanol (RO3); sageone (RO5); deoxocarnosol (RO6); 11,12,20-trihydroxy-abieta-8,11,13-triene (RO7); rosmanol (RO8); 7 -methoxyrosmanol (RO9); 7α-ethoxyrosmanol (RO10); rosmarinoside A (RO4) Trong đó RO4 là một hợp chất mới và RO3, RO6, RO7 lần đầu tiên được

20-phân lập t chi Rosmarinus 10 hợp chất tách được t loài R officinalis đã được xác

định như ở bảng 3.2và 3.3

Demethylsalvicanol (RO3) [24]

Rosmarinoside A (new)

RO4 [56]

Sageone (RO5) [49]

Chất bột vô định hình,

màu trắng

Chất rắn kết tinh màu trắng

Chất bột vô định hình, màu trắng

Chất dạng dầu, màu vàng Chất dạng dầu, màu

trắng

C21H28O5, M = 360,4 C20H26O4, M = 330,4 C20H30O3, M = 318,4 C20H26O4, M = 330,4 C19H24O3 M = 300,4

11,12,20-trihydroxy-Rosmanol (RO8) [23, 33]