Nghiên cứu thành phần hóa học và khảo sát hoạt tính sinh học loài san hô mềm sinularia erecta

Trong số các loài sinh vật biển, san hô mềm đang được rất nhiều nhà khoa học trên thế giới tìm hiểu và nghiên cứu bởi sự dồi dào về nguyên liệu, tính đa dạng về thành phần hoá học và hoạ

Trang 1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Trang 2

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

1 TS NGUYỄN HOÀI NAM

2 PGS.TS TRẦN MẠNH TRÍ

Hà Nội – 2020

Trang 3

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan : Luận văn này là công trình nghiên cứu của riêng em, được thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS Nguyễn Hoài Nam và TS Trần Mạnh Trí Các

số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được cá nhân hoặc nhóm tác giả công bố trong bất kỳ công trình nào khác Em xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về các nghiên cứu của mình

HỌC VIÊN CAO HỌC

Nguyễn Thị Hường

Trang 4

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, em xin gửi lời cám ơn chân thành sâu sắc tới các thầy cô giáo trong Khoa Hóa Học - Trường Đại học Khoa học tự nhiên, đã tận tình giảng dạy, truyền đạt cho em những kiến thức, kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian học tập

Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn thầy TS Nguyễn Hoài Nam và TS Trần Mạnh Trí đã tận tình hướng dẫn, hết lòng chỉ bảo, tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong suốt thời gian làm luận văn

Đồng thời, em xin gửi lời cảm ơn đến tập thể cán bộ phòng Dược liệu biển, Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình giúp

đỡ, trực tiếp chỉ bảo, hướng dẫn em trong suốt quá trình làm luận văn tốt nghiệp Trong thời gian làm việc, em không ngừng tiếp thu thêm nhiều kiến thức chuyên môn

bổ ích mà còn học tập được tinh thần làm việc, thái độ nghiên cứu khoa học nghiêm túc, hiệu quả, đây là những điều rất cần thiết cho em trong quá trình học tập và công tác sau này

Luận văn được giúp đỡ về mặt kinh phí và thực hiện trong khuôn khổ nội dung bởi Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam và VAST-FEB RAS trong chuyến thám hiểm Akademik Oparin thứ 5 [VAST.HTQT.NGA.15–04/16–17]

Em xin chân thành cảm ơn !

HỌC VIÊN CAO HỌC

Nguyễn Thị Hường

Trang 5

MỤC LỤC

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC CÁC HÌNH viii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Giới thiệu về san hô mềm 3

1.1.1 Khái quát chung về san hô mềm 3

1.1.2 Giới thiệu về san hô mềm Sinularia 5

1.1.3 Giới thiệu về san hô mềm Sinularia erecta 7

1.2 Tình hình nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học một số loài san hô mềm điển hình thuộc giống Sinularia 7

1.2.1 Tình hình nghiên cứu về hóa học và hoạt tính sinh học một số loài san hô mềm điển hình thuộc giống Sinularia trên thế giới 7

1.2.2 Tình hình nghiên cứu về hóa học và hoạt tính sinh học một số loài san hô mềm điển hình thuộc giống Sinularia ở Việt Nam 15

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, MỤC TIÊU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Đối tượng nghiên cứu 18

2.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 18

2.2.1 Mục tiêu của luận văn 18

2.2.2 Các nội dung nghiên cứu 18

2.3 Phương pháp nghiên cứu 19

2.3.1 Phương pháp xử lý mẫu, tạo dịch chiết, phân lập các hợp chất 19

2.3.2 Xác định cấu trúc các hợp chất sử dụng phổ cộng hưởng từ hạt nhân 21

2.3.3 Phương pháp nghiên cứu thử nghiệm hoạt tính diệt tế bào ung thư 22

2.3.4 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm 23

3.1 Phân lập các hợp chất từ san hô mềm Sinularia erecta 25

3.1.1 Phân lập các hợp chất 25

3.1.2 Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập được 27

3.2 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư các hợp chất phân lập được 28

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

4.1 Kết quả xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được 29

4.1.1 Hợp chất 1: 3β,5α-dihydroxyeudesma-4(15), 11-diene (chất mới) 29

4.1.2 Hợp chất 2: 4(15)-Eudesmene-1β,6α-diol 35

Trang 6

4.1.3 Hợp chất 3 : 6-Hydroxy-eudesm-4(15)-ene-1-one 40

4.1.4 Hợp chất 4: 4β,15-Epoxyeudesmane-1β,6α-diol 45

4.1.5 Hợp chất 5: Aromadendrane-4,10-diol 49

4.1.6 Hợp chất 6: Aromadendrane-4,10-diol 54

4.1.7 Hợp chất 7: Aromadendrane-4,10-diol 58

IV.1.8 Hợp chất 8: Alloaromadendrane-4,10-diol 63

4.2 Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư các hợp chất phân lập được 69

KẾT LUẬN 72

PHỤ LỤC 79

1 Phụ lục phổ 79

2 Công trình đã công bố 96

Trang 7

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

13

Resonance Spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13

50%

Spectra

Phổ khối ion hóa phun điện tử

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Ionization Mass Spectra

Phổ khối ion hóa phun điện tử phân giải cao

Trang 8

PANC-1 Epithelioid carcinoma cancer Ung thư biểu mô tuyến tụy

effect correlation spectroscopy

Trang 9

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Các loài san hô mềm thuộc chi Sinularia 06

Bảng 4.1 Số liệu phổ NMR của hợp chất 1 31

Bảng 4.9 Kết quả thử sàng lọc độc tế bào của các mẫu 69

Bảng 4.10 Kết quả thử sàng lọc hoạt tính ức chế sản sinh NO của các mẫu…… 70

Trang 10

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Sơ đồ phả hệ của giống Sinularia 04

Hình 2.1 San hô mềm Sinularia erecta Tixier-Durivault, 1945 18

Hình 3.1 Sơ đồ chiết tách các hợp chất từ mẫu Sinularia erecta 24

Hình 3.2 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn n-Hexan (H) 25

Hình 4.1.1a Phổ HR-ESI-MS của hợp chất 1 28

Hình 4.1.1b Phổ 1H-NMR của hợp chất 1 28

Hình 4.1.1c Phổ 13 C-NMR của hợp chất 1 29

Hình 4.1.1d Phổ HSQC của hợp chất 1 30

Hình 4.1.1e Phổ HMBC của hợp chất 1 31

Hình 4.1.1f Phổ NOESY của hợp chất 1 32

Hình 4.1.1g Các tương tác HMBC chính và cấu trúc hóa học của hợp chất 1 33

Hình 4.1.2a Phổ 1H-NMR của hợp chất 2 34

Hình 4.1.2b Phổ 13 C-NMR của hợp chất 2 34

Hình 4.1.2c Phổ HSQC của hợp chất 2 35

Hình 4.1.2d Phổ HMBC của hợp chất 2 36

Hình 4.1.2e Các tương tác HMBC chính và cấu trúc hóa học của hợp chất 2 37

Hình 4.1.4b Phổ 13C-NMR của hợp chất 4 42

Hình 4.1.5a Phổ 1 H-NMR của hợp chất 5 46

Trang 11

Hình 4.1.7.c Phổ HSQC của hợp chất 7 54

Trang 12

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trái đất là hành tinh của các đại dương với hơn 70% diện tích bề mặt trái đất được bao phủ bởi nước mặn, đồng thời đại dương cũng là nơi chiếm đến trên 90% thể tích khu vực sinh sống của trái đất và hầu hết các hoạt động của sự sống đều có liên quan đến cuộc sống dưới biển Vì vậy không có gì đáng ngạc nhiên khi nói rằng môi trường biển chính là nơi ẩn chứa sự đa dạng sinh học loài lớn nhất

Đặc biệt, điều kiện sống khắc nghiệt trong môi trường biển dẫn tới sự cạnh tranh gay gắt về môi trường sống, nhiều sinh vật nhỏ bé phải tự sản sinh ra các chất

để bảo vệ, tạo điều kiện thuận lợi cho các sinh vật biển tổng hợp các hợp chất hữu

cơ có cấu trúc khác biệt so với các hợp chất có nguồn gốc thực vật Nghiên cứu về nguồn hợp chất thiên nhiên từ biển đã được bắt đầu từ những năm 50 của thế kỷ

trước và đang ngày càng nhận được sự quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới

Trong số các loài sinh vật biển, san hô mềm đang được rất nhiều nhà khoa học trên thế giới tìm hiểu và nghiên cứu bởi sự dồi dào về nguyên liệu, tính đa dạng về thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của chúng Các rạn san hô là một trong những hệ sinh thái lâu đời nhất, đa dạng nhất về mặt sinh học và phong phú về các loài trên trái đất

San hô mềm là nhóm sinh vật biển thuộc ngành Cnidaria, lớp Anthozoa, theo đánh giá của các nhà khoa học ở Việt Nam có rất nhiều loài san hô mềm có chứa các hoạt tính sinh học đã được công bố, điểm rất đáng lưu ý là các nghiên cứu khởi đầu của Việt Nam về san hô mềm trong các đề tài nghiên cứu được thực hiện ở Việt Nam theo hướng này đều phân lập, tìm kiếm và phát hiện được các lớp chất thuộc lớp chất sesquiterpen, terpenoid và steroid Ngoài ra, các hoạt tính sinh học chính của các loài san hô mềm là hoạt tính diệt tế bào ung thư, hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định, và hoạt tính kháng viêm Có thể thấy hướng nghiên cứu tìm kiếm các chất từ nguồn san hô mềm theo hướng hoạt tính diệt tế bào ung thư và hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định rất có ý nghĩa và cần thiết

Mặc dù trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về san hô mềm và đạt được những thành tựu có ý nghĩa phục vụ cho công tác nghiên cứu, tuy nhiên ở Việt

Trang 13

Nam mới chỉ có rất ít các công trình nghiên cứu về đối tượng này Chính vì vậy, việc nghiên về các chất hóa học từ san hô mềm là một hướng nghiên cứu mới, có nhiều triển vọng ở nước ta

Do đó, học viên đã lựa chọn đề tài luận văn: “Nghiên cứu thành phần hóa

học và khảo sát hoạt tính sinh học loài san hô mềm Sinularia erecta” với mục

đích góp phần khai thác, sử dụng hiệu quả nguồn tài nguyên thiên nhiên phong phú

để tạo ra các sản phẩm có giá trị phục vụ cuộc sống, luận văn đã được thực hiện nội dung chính với các mục tiêu chính như sau:

 Nghiên cứu phân lập các hợp chất từ loài san hô mềm Sinularia

erecta ở Việt Nam

 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập được

 Đánh giá hoạt tính sinh học các hợp chất phân lập được nhằm định hướng cho các nghiên cứu ứng dụng tiếp theo

Trang 14

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về san hô mềm

1.1.1 Khái quát chung về san hô mềm

San hô là loài sinh vật biển thuộc lớp San hô (Anthozoa), tồn tại dưới dạng các thể polip nhỏ giống hải quỳ, thường sống thành các quần thể gồm nhiều cá thể giống hệt nhau Các cá thể này tiết ra calcium carbonate để tạo bộ xương cứng, xây nên các rạn san hô tại các vùng biển nhiệt đới

San hô lớp Anthozoa được chia thành hai phân lớp tùy thuộc theo số xúc tu (tua cảm), hoặc các đường đối xứng và một loạt các bộ phận tương ứng với kiểu xương ngoài và bao gồm phân lớp san hô có tám xúc tu được gọi là san hô tám ngăn

(Octocorallia), và phân lớp san hô có số xúc tu lớn hơn tám và là bội số của sáu được gọi là san hô sáu ngăn (Hexacorallia) Các san hô mềm (Alcyonacea), san hô sừng (Gorgonacea) và san hô bút biển (Pennatulacea) thuộc phân lớp san hô (Octocorallia) (Hình 1.1a), san hô cứng nằm trong phân lớp (Hexacorallia)[28]

Theo thống kê trên thế giới, phân lớp Octocorallia có khoảng 2000 loài chia làm

310 giống và 45 họ

San hô là những sinh vật rất đơn giản, tồn tại ở khắp các vùng biển, nông cũng như sâu và là những cá thể hình trụ rất nhỏ có hàng xúc tu ở đỉnh, được sử dụng để bắt mồi trong môi trường nước Mặc dù san hô nhìn giống như cây nhưng chúng là động vật và có cấu tạo như sứa và hải quỳ, chúng thuộc vào nhóm động vật biển có các trâm gây ngứa Có đến hàng trăm kiểu san hô khác nhau nhưng tất

cả đều do các cá thể nhỏ bé, còn gọi là polip tạo nên Các cá thể này tiết ra canxium carebonate để tạo bộ xương cứng, xây nên các rạn san hô tại các vùng biển nhiệt đới Trên thế giới, rạn san hô ngầm ước tính bao phủ trên 284.300 km2

, chủ yếu ở vùng biển Ấn Độ - Thái Bình Dương (91,9%)

Các loài san hô mềm có vai trò quan trọng trong hệ sinh thái rạn san hô, chúng tạo ra nguồn vật chất hữu cơ, tham gia tạo rạn Cuộc sống cộng sinh của san

hô mềm với các loài tảo biển đã tạo nên đặc điểm sinh học vô cùng thú vị của san

hô mềm Nhiều loài có chất hoạt tính sinh học có giá trị làm thuốc chữa bệnh Nhiều

Trang 15

loài có màu sắc đẹp thường được dùng để chế tác đồ mỹ nghệ Rất nhiều các hợp chất thứ cấp như các ditecpennoid dạng cembranoid từ san hô mềm có thể được tạọ

ra từ những mối tương tác với môi trường sinh thái như vậy [19]

Hình 1.1 Sơ đồ phả hệ của giống Sinularia

Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã tiến hành một nghiên cứu về san hô mềm ở

Trang 16

vùng biển ven bờ vịnh Bắc Bộ Tiến hành khảo sát, thu thập mẫu san hô mềm trên các rạn san hô ở vùng biển Hạ Long, quần đảo Long Châu (Quảng Ninh), đảo Cồn

Cỏ (Quảng Trị), bán đảo Sơn Trà (Đà Nẵng) và vùng bờ biển Hải Vân (Thừa Thiên Huế) trong nhiều năm Kết quả phân tích những mẫu vật thu thập được tại 4 khu vực này, bước đầu đã phát hiện có 46 loài san hô mềm, thuộc 10 họ, 24 chi Trong

đó, nhiều nhất là họ san hô Alcyoniidae (có 13 loài, chiếm 28,2) ; tiếp đến là hai họ san hô Paramuriceidae và Ellellidae, mỗi họ có 9 loài (19,5%); ba họ Melithaeidae, Goroniidae, Plexauridae mỗi họ có 3 loài, các loài san hô mềm này phân bố khá rộng rãi Tại bốn khu vực điều tra (kể trên), nơi được phát hiện nhiều nhất là vùng quần đảo Long Châu (có 32 loài), tiếp đến là vùng ven biển Hải Vân và bán đảo Sơn Trà (25 loài), vịnh Hạ Long (23 loài), ít nhất là vùng Cồn Cỏ (chỉ có 10 loài) Tuy nhiên, xét về mật độ thì Cồn Cỏ là nơi có độ phủ san hô mềm cao nhất, hai chi

Lobophytum và Sinularia phát triển mạnh, tạo thành từng đám lớn [2]

Theo báo cáo kết quả đánh giá độ đa dạng sinh học của Khu bảo tồn biển vịnh Nha trang do Viện Hải dương học thực hiện năm 2005 cho thấy mức độ giàu

có, phong phú và duy trì ổn định của san hô ở khu vực này Điển hình, ở khu đông Hòn Tre có khoảng 150 loài, ở tây nam Hòn Mun có khoảng 120 loài, trong đó có

chi Sinularia, Lobophytum [3]

1.1.2 Giới thiệu về san hô mềm Sinularia

Chi Sinularia là một trong những san hô mềm được phân bố rộng rãi nhất

Chúng tạo thành một phần chi phối của sinh khối trong môi trường rạn san hô nhiệt

đới San hô mềm thuộc chi Sinularia phát triển rất mạnh mẽ, chúng phân bố rộng

rãi từ Đông Phi đến Tây Thái Bình Dương, sống ở các rạn san hô hay trên đá ở vùng nước nông, nhưng hiếm khi hình thành những quần thể lớn, với khoảng 100 loài đã được phát hiện, trong đó có khoảng 40 loài đã được khảo sát hoá học [4]

Chi Sinularia đã cho thấy nó là một nguồn cung cấp phong phú các hợp chất thứ

cấp, bao gồm: sesquiterpene, diterpene, steroid và các hợp chất polyamine Các hợp chất thứ cấp gần đây đã chứng tỏ các hoạt tính sinh học của chúng như: kháng sinh,

Trang 17

chống viêm, chuyển hoá glucose trong tế bào mỡ chuột, ức chế sự phát sinh histamine và các hoạt tính gây độc tế bào

Bảng 1.1 Các loài san hô mềm thuộc chi Sinularia

1 S abhishiktae 19 S foveolata 37 S macrodactyla

2 S abrubta 20 S fungoides 38 S manaarensis

3 S acuta 21 S gardineri 39 S maxima

4 S babeldaobensis 22 S gaveshaniae 40 S minima

5 S bisulca 23 S gaweli 41 S notanda

6 S brassica 24 S gibberosa 42 S pavida

7 S capillosa 25 S gibberosa 43 S peculiaris

8 S compressa 26 S grandilobata 44 S polydactyla

9 S corpulentissima 27 S gravis 45 S querciformis

10 S crebra 28 S heterospiculata 46 S siaesensis

11 S cruciata 29 S hirta 47 S sobolifera

12 S densa 30 S humilis 48 S sublimis

13 S digitata 31 S inexplicita 49 S terspilli

14 S erecta 32 S lamellata 50 S tumulosa

15 S finitima 33 S laminilobata 51 S ultima

16 S flaccida 34 S leptoclados 52 S uniformis

17 S flexibilis 35 S loyai 53 S verruca

18 S foliata 36 S luxuriosa 54 S yamazatoi

Trang 18

1.1.3 Giới thiệu về san hô mềm Sinularia erecta

San hô mềm Sinularia erecta Tixier-Durivault, 1945 thuộc ngành Cnidaria, lớp Anthoazoa, phân lớp Octocorallia, bộ Alcyonacea, họ Alcyoniidae, chi Sinularia

Sinularia erecta Tixier-Durivault là một loài san hô mềm sinh sống ở vùng nước

biển mặn, tập trung nhiều và đa dạng ở độ sâu 15-20m, quanh các rạn san hô của các đảo hay các bãi đá ngầm Loài san hô này được phân bố rải rác dọc bờ biển Việt Nam như Côn Đảo (Bà Rịa – Vũng Tàu), quần đảo Trường Sa, vịnh Vân Phong (Khánh Hòa), đảo Lý Sơn (Quảng Ngãi), Cù Lao Chàm, Cù Lao Xanh (Bình Định), bán đảo Sơn Trà, quần đảo Hoàng Sa (Đà Nẵng), đảo Cát Bà, đảo Cô Tô

1.2 Tình hình nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học một số loài san hô mềm

điển hình thuộc giống Sinularia

1.2.1 Tình hình nghiên cứu về hóa học và hoạt tính sinh học một số loài san hô mềm điển hình thuộc giống Sinularia trên thế giới

Những nghiên cứu về các chất có hoạt tính sinh học từ san hô mềm thuộc

giống Sinularia thực sự khởi phát từ những nghiên cứu khảo sát tác dụng chữa ung

thư vòm họng các dịch chiết của các loài san hô mềm như Sinularia grandilobata,

S parva, S.triangula, S.scabra, S nanolobata và S.gibberosa đã được tiến hành với

mô hình sử dụng dòng tế bào SCC25 và dòng tế bào HaCaT, kết quả nghiên cứu trên mô hình trên cho thấy dịch chiết của các loài nêu trên có tác dụng gây chết các

tế bào SCC25 và HaCaT theo chương trình, các kết quả này cũng mở ra một hướng nghiên cứu tìm kiếm các hoạt chất có khả năng điều trị bệnh ung thư vòm họng từ

loài san hô mềm Sinularia [32]

Trên thế giới, rất nhiều công trình nghiên cứu về san hô mềm đã được công

bố Hàng nghìn hợp chất đã được phát hiện và phân lập từ san hô mềm, chúng thường hiện diện ở các lớp chất steroid, sesquiterpene, terpenoit, acid amine, các hợp chất phenol, hợp chất thơm, các acid béo, và vô số các dạng khác từ những loài

thuộc các chi Cespitularia, Clavularia, Gersemia, Lobophytum, Nephthea,

Sarcophyton, và Sinularia rất nhiều trong số này thể hiện các đặc đểm dược học

độc đáo , duy nhất Tuy nhiên, trong khuôn khổ tổng quan luận văn chỉ tập trung

Trang 19

trình bày những nghiên cứu về 2 lớp chất sesquiterpene, diterpene và steroid là

những lớp chất tiêu biểu từ loài san hô mềm Sinularia hoạt tính sinh học điển hình của một số loài san hô mềm thuộc giống Sinularia, những loài này được nghiên cứu

nhiều và có những kết quả hoạt tính rất đáng quan tâm

1.2.1.1 Các hợp chất sesquiterpene

Năm 2013, Dawei Chen cùng công sự đã phân lập được 14 hợp chất mới sesquiterpene dạng astericane được thu thập mẫu tại Biển Đông từ loài san hô mềm

Sinularia capillosa, cụ thể là capillosananes A - N (1-14) cùng với 4 hợp chất

khung seco-asteriscanes mới, capillosananes O - R (15-18) Đây là nghiên cứu đầu

tiên về sesquiterpene khung asteriscane, đặc biệt hai hợp chất capillosananes Q và R

(17 - 18) đại diện cho khung seco-asteriscane mới Về hoạt tính sinh học, hợp chất

1 có hoạt tính chống độc mạnh với giá trị IC50 là 9,70µM, đồng thời hai hợp chất

capillosananes B (2) và I (9) thể hiện hoạt tinh kháng viêm TNF-α bằng phương

pháp in vitro [10]

Trang 20

Năm 2015, Wun-Jie Lin và các cộng sự đã phân lập được hai eudesmane

sesquiterpenoids từ loài san hô mềm Sinularia gaweli, là hợp chất verticillatol (19) and 5α-acetoxy-4(14)-eudesmene-1β-ol (20) là một hợp chất mới, được phân lập đầu tiên từ loài san hô mềm Sinularia gaweli Hai hợp chất (19) và (20) có thể hiên

hoạt tính kháng viêm, ảnh hưởng của hai hợp chất này trên protein iNOS và COX-2 gây viêm thể hiện trên dòng tế bào đại thực bào được kích thích LPS RAW264.7 [20]

San hô mềm Sinularia mayi, thu thập ở các vùng ven biển khác nhau, đã

được nghiên cứu thành phần hóa học một số lần Năm 1978, Bennchan và cộng sự

tiếp tục phân lập được hai hợp chất sesquiterpene aromandendrane mới (21) và (22)

[18]

Sesquiterpene cyclopropan, Δ9(15) africanene (23), đã được công bố lần đầu

tiên từ loài san hô mềm Sinularia polydactyla và sau đó cũng được phân lập từ

Sinulara erecta vào năm 1980 được phân lập bởi tác giả Brackman Như là một

phần của công trình nghiên cứu dược phẩm, africanene (23) đã được thử nghiệm

Trang 21

hoạt tính gây độc tế bào in vitro trên các tế bào u cổ trướng Ehrlich (EAC) và các tế

bào khối u cổ trướng lymphoma Dalton (DLAT) tại nồng độ 10µg/mL, với kết quả gây chết các tế bào EAC và DLAT tương ứng là 100% và 92% Trong thí nghiệm

gây độc tế bào in vitro, việc xác định sự ức chế các khối u cổ trướng Ehrlich đã

được tiến hành với chuột, africanene (23) được dùng ở chuột theo đường tiêm trong

màng bụng và đã quan sát thấy rằng tuổi thọ của chuột tăng 22,68 % và 53,32 % tương ứng ở nồng độ 10 và 20 mg/kg trọng lượng cơ thể Năm 1999, Ramesh đã

phân lập thêm hai dẫn xuất của africanene, 10(S)-hydroxy-9(15) africanene (24), 9(S), và africanene 15-dihydroxy (25) được phân lập từ loài san hô mềm S.dissecta

từ miền Nam Ấn Độ [18]

Năm 2013, Bin Yang và cộng sự đã phân lập được 4 hợp chất sesquiterpen

mới sinularianin C - F (28 -31), cùng 2 hợp chất đã biết sinularianin A và B (26-27)

từ loài san hô mềm Sinularia sp từ khu vực biển phía Nam của Trung Quốc Tất cả

các hợp chất này đều được đánh giá khả năng ức chế hoạt hóa NF-κB, nổi bật trong

số này có hai hợp chất (26) và (29) thể hiện hoạt tính khá tốt với tỷ lệ ức chế là

41,3% và 43,0% ở nồng độ 10 µg / mL [34]

Trang 22

Năm 2018, Qin GF và cộng sự đã phân lập được 3 hợp chất sesquiterpen mới

bao gồm sinuketal (32), sinulin A và B (33 và 34) từ loài san hô mềm Sinularia sp

Hợp chất (32) thể hiện hoạt tính chống sốt rét tương đối yếu so với Plasmodium

falciparum 3D7, hoạt tính gây độc tế bào yếu đối với các dòng tế bào thử nghiệm Jurkat, MDMB-231 và U2OS, ức chế tác dụng chống lại virus cúm A H1N1 và PR8 Các hợp chất khác được đánh giá về khả năng gây độc tế bào đối với các dòng tế bào ung thư thử nghiệm HeLa, HCT-116, và A549 [24]

1.2.1.2 Các hợp chất diterpene

Năm 2015, Chen WF và cộng sự phân lập được hợp chất diterpene (35) và

một hợp chất tương tự mới 4α-hydroxy-5-episinuleptolide (36) từ loài Sinularia

numerosa Hợp chất episinuleptolide acetate (35) có kết quả gây độc tế bào đối với

một số dòng tế bào gây u, theo các đánh giá về hoạt tính trên in vitro cho thấy đây

Trang 23

là một hợp chất tiềm năng trong việc bảo vệ tế bào gây u và gây chết tế bào này [11]

Năm 2012, Huei-Jyun Shih và cộng sự đã tìm ra 7 hợp chất diterpene

metabolite mới (37-43) và 7 cembranoid diterpene cũ (44-50) bao gồm: flexibilisolides C-G (37-41), flexibilisin C (42), 11,12-secoflexibillin (43), 11- dehydrosinulariolide (44), flexilarin D (45), 14-deoxycrassin (12), 11-epi- sinulariolide acetate (47), 3,4:8,11-bisepoxy-7-acetoxycembra-15(17)-en-1,12-olide

(48), sinulariolide (49) và 11-epi-sinulariolide (50) từ san hô mềm Sinularia

flexibilis Hợp chất mới flexibilisin C ( 42) và 11,12-secoflexibillin (43) có kết quả

gây độc tế bào trên hai dòng tế bào HeLa và B16 Ngoài ra flexibilisin C (42) còn

được coi là hoạt chất có tác dụng gây độc tế bào tiềm năng trên hai dòng tế bào Hep1 và B16 [26]

Trang 24

SK-Năm 2012, Shen.S và cộng sự còn phân lập được 5 hợp chất diterpene thuộc

khung cembrane mới từ loài san hô mềm Sinularia pavida, các hợp chất này lần

lượt được đặt tên là pavidolides A-E (51-55) cùng với sarcophytin (56) và chatantin (57) Các nghiên cứu về cấu trúc kết hợp cùng với nghiên cứu về hoạt tính gây độc

tế bào cho thấy pavidolines B-C (52-53) thể hiện khả năng ức chế mạnh dòng tế bào

ung thư máu người HL-60 [25]

Năm 2015, Wun-Jie Lin và cộng sự đã phân lập được hai cembranoid

diterpene từ loài san hô mềm Sinularia gaweli, đó là (–)-leptodiol acetate (58) và

hợp chất mới sinulacembranolide A (59) Qua nghiên cứu, các nhà khoa học đã ghi nhận được sinulacembranolide A (59) có khả năng ức chế mạnh sự sản sinh NO trên

dòng tế bào đại thực bào chuột ( tế bào RAW264.7) bị kích hoạt bởi LPS [20]

Trang 25

Năm 2018, Chuan Zhao và các cộng sự đã phân lập được 5 hợp chất

diterpenoid dạng cembrane đã biết từ loài san hô mềm Sinularia flexibils thuộc

vùng biển phía nam Trung Quốc Các hợp chất phân lập được kiểm tra về khả năng

ức chế sự sản xuất LPS induced NO và TNF-α trong các tế bào RAW264.7 giống

như đại thực bào, hoạt tính chống viêm trong ống nghiệm của các hợp chất (60-64)

là đo bằng cách kiểm tra hiệu ứng ức chế của sản xuất NO và mức độ TNF-α trong

phần nổi phía trên của lipopolysaccharide (LPS) –induced tế bào RAW264.7, sử dụng phương pháp Griess và ELISA [14]

1.2.1.3 Các hợp chất steroid

Năm 2013, Huang CY và cộng sự đã phân lập được 7 hợp chất steroid mới

cũng từ san hô mềm Sinularia brassica, đáng chú ý khi đây là 7 steroid dạng

withanolide, dạng rất hiếm gặp khi nghiên cứu các sinh vật trong môi trường biển

Các hợp chất đó là sinubrasolides A−G (63-69), các hợp chất (63-69) được thử

nghiệm ở nồng độ IC50 trên các dòng tế bào ung thư người P388, MOLT 4, K-562, HT-29 và cho thấy hoạt tính của chúng có khả năng gây độc tế bào mạnh [13]

Trang 26

palmitoyl-palmitoyl-phần của loài san hô mềm Sinularia còn có nhiều hợp chất khác [1]

1.2.2 Tình hình nghiên cứu về hóa học và hoạt tính sinh học một số loài san hô mềm điển hình thuộc giống Sinularia ở Việt Nam

Trong một vài năm trở lại đây, ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu

về san hô mềm, phần lớn tập trung ở giống Sinularia Năm 2013, Thao N P và cộng sự đã nghiên cứu loài san hô mềm Sinularia maxima và phân lập được thêm 7

hợp chất norditecpene là: scabrolide A (70), 12-hydroxy-scabrolide A (71), yonarolide (72), ineleganolide (73), 5-epinorcembrene (74), 13-epi-scabrolide C (75) và norcembrene 5 (76), trong đó hợp chất (71) và (75) là hai hợp chất mới Qua các khảo sát hoạt tính sinh học cho thấy hợp chất (70) thể hiện hoạt tính ức chế ở

Trang 27

mức độ trung bình sự tạo thành IL-12 và IL-6 với giá trị IC50 tương ứng là 23,52 và

69,85 µm, hợp chất (70) ức chế mạnh sự tạo thành IL-12 và IL-6 trong tế bào

BMDCs được kích thích bởi LPS với giá trị IC50 tương ứng là 5,30 và 13,12 µm [29][ 30]

Năm 2017, Ngoc NT và các cộng sự đã phân lập được 4 hợp chất sesquiterpenes

(77-80) bao gồm hai hợp chất mới, nanolobatols A và B (77 và 78), được phân lập

từ san hô mềm Sinularia nanolobata thu thập tại Việt Nam Cấu trúc của chúng

được xác định trên cơ sở dữ liệu quang phổ (1H và 13C NMR, HSQC, HMBC, 1H – 1H COZY, NOESY và FT-ICR-MS) Các hợp chất trên đều thể hiện hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất bị cô lập chống lại 8 tế bào ung thư ở người [23]

San hô mềm nguồn dược liệu dồi dào, đa dạng và đáng quý bởi chúng chứa rất nhiều hợp chất thể hiện hoạt tính sinh học thú vị như tác dụng gây độc tế bào, hoạt tính chống ung thư và kháng viêm v.v Tuy nhiên, việc nghiên cứu thành phần

Trang 28

hoá học và hoạt tính sinh học của các loài trong chi Sinularia này vẫn còn hạn chế,

mới chỉ thấy tập trung vào một số loài Hơn nữa, mặc dù Việt Nam được coi là có vùng biển giàu tài nguyên và sự đa dạng về san hô do điều kiện khí hậu nhiệt đới là một trong những nơi có số lượng san hô mềm rất phong phú, song các công trình nghiên cứu về san hô mới chỉ có rất ít Do đó, việc nghiên cứu hoá học và hoạt tính

sinh học của loài san hô mềm không chỉ làm sáng tỏ thêm thành phần hoá học của

các loài này, mà còn tìm ra những chất có hoạt tính sinh học đáng quý, có khả năng ứng dụng cao

Trang 29

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, MỤC TIÊU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Nguyên liệu: Mẫu san hô mềm Sinularia erecta Tixier-Durivault, 1945 thuộc

họ san hô mềm Alcyoniidae Loài san hô này phân bố tại khu vực Vịnh Bắc Bộ và khu vực đảo Cù Lao Chàm, Quảng Nam

Mẫu nghiên cứu được thu vào năm 2016, tại Cù Lao Chàm, Quảng Nam trong chuyến khảo sát bằng tàu "Viện sỹ Oparine" vào khảo sát tại Việt nam lần thứ

5, mẫu tiêu bản (mã số: 20161123) được PGS.TS Đỗ Công Thung, Viện Tài nguyên và Môi trường Biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam giám định và được lưu giữ tại Viện Hoá sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Mẫu sinh vật biển sau khi thu thập được rửa sạch nhiều lần bằng nước cất để loại muối và tạp bẩn, sau đó để ráo nước và được lưu giữ trong điều kiện lạnh âm sâu (20oC) cho tới khi sử dụng để nghiên cứu

Hình 2.1 San hô mềm Sinularia erecta Tixier-Durivault, 1945

2.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu

2.2.1 Mục tiêu của luận văn

Nghiên cứu thành phần hóa học và khảo sát hoạt tính sinh học loài san hô

mềm Sinularia erecta

2.2.2 Các nội dung nghiên cứu

- Phân lập một số hợp chất hóa học từ san hô mềm Sinularia erecta

- Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất bằng các phương pháp hóa lý

Trang 30

- Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào các hợp chất phân lập được

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp xử lý mẫu, tạo dịch chiết, phân lập các hợp chất

2.3.1.1 Phương pháp xử lý mẫu

Việc xử lý các mẫu sinh vật biển được thực hiện theo quy trình thống nhất đã được xây dựng qua các nhiệm vụ khoa học của Viện Hóa sinh biển:

Bước 1: Mẫu san hô mềm sau khi lấy ra khỏi tủ lạnh âm sâu được tiến hành

rã đông bằng cách để trên bệ rửa thí nghiệm, cho nước sạch chảy đều trên bề mặt của mẫu nghiên cứu, các lớp đá bao quanh mẫu san hô mềm được tan từ từ để lộ phần thân của mẫu san hô mềm Mẫu được ngâm trong nước lạnh trong thời gian từ 2-3 giờ nhằm loại bỏ từ từ hàm lượng muối vô cơ

Bước 2: Sau khi mẫu san hô mềm đã được rã đông, loại bỏ các phần túi

nylon và các thành phần vi sinh vật biển khác bám trên bề mặt của mẫu san hô mềm Lưu lại tiêu bản mẫu, để mẫu sinh vật biển lên mặt bàn thí nghiệm và chụp ảnh để lưu phần mẫu trước khi xử lý

Bước 3: Sau khi mẫu san hô mềm đã được loại bỏ các thành phần nylon và

các thành phần khác, mẫu được để trên túi lưới ở nhiệt độ phòng cho đến khi khô hết bề mặt của phần thân mẫu san hô mềm Mẫu được cân để thu được khối lượng thực tế trước khi tiến hành xử lý

Bước 4: Mẫu được cắt nhỏ thành từng phiến, chiều rộng và dài của phiến tùy

theo độ cứng của mẫu san hô mềm Các phiến càng mỏng thì khả năng làm khô mẫu

và xay mẫu càng thuận lợi

Bước 5: Sấy và làm khô các mẫu san hô mềm Các mẫu san hô mềm sau khi

đã được cắt thành các phiến nhỏ được chuyển vào túi lưới và tiến hành làm khô sơ

bộ bằng phương pháp sấy khô trên thiết bị tủ sấy chân không hoặc phơi dưới điều kiện ánh sáng mặt trời (có tránh tia tử ngoại) Trong quá trình sấy mẫu này, khối lượng mẫu san hô mềm giảm xuống rất nhanh

Bước 6: Làm khô mẫu trên thiết bị đông khô

Bước 7: Nghiền mẫu thành bột mịn bằng thiết bị nghiền mẫu

Trang 31

2.3.1.2 Phương pháp nghiên cứu tạo dịch chiết phân đoạn

Bước 1: Chuẩn bị mẫu thử: Các mẫu san hô mềm được lấy lượng 5 mg mẫu

khô, cho vào bình định mức 10 ml

Bước 2: Đánh số thứ tự và ký hiệu các bình chiết mẫu Thêm dung môi theo

thứ tự tăng dần độ phân cực, dung môi được thêm đến vạch định mức

Bước 3: Toàn bộ các bình chiết được cho lên máy lắc ngang, lắc đều cho

dung môi thấm đều trên bột san hô mềm Để lắng trong khoảng 1-2 giờ

Bước 4: Lọc mẫu, phần dịch lọc được cất loại dung môi trên thiết bị cất

quay, dịch thô thu được cho vào lọ nhỏ phục vụ cho việc kiểm tra lượng vết chất và khả năng hòa tan mẫu nghiên cứu

Bước 5: Sử dụng sắc ký bản mỏng TLC và hệ dung môi CH2Cl2 : MeOH với

tỷ lệ thích hợp để đánh giá các mẫu thô thu được

2.3.1.3 Phương pháp phân lập chất

- Sắc ký lớp mỏng: Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành

khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt hỗn hợp các chất cần tách Pha tĩnh là chất hấp phụ được chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích Pha động

là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ quy định trong từng chuyên luận Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử được di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với

những tốc độ khác nhau Kết quả, ta thu được một sắc ký đồ trên lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254(Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck) Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điện từ đến khi hiện màu

- Sắc ký cột: Nguyên lí tách của sắc kí cột cũng như của các loại sắc ký khác: một

mẫu thử được nạp lên một cột chứa chất hấp phụ (thường là silica gel, nhôm oxide).Cột chứa chất hấp phụ này đóng vai trò là một pha tĩnh Một dung môi khai triển (pha động) di chuyển dọc theo cột sẽ làm di chuyển các cấu tử của mẫu thử, do các cấu tử này có độ phân cực khác nhau nên ái lực của chúng với pha tĩnh cũng

Trang 32

khác nhau Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel pha thường và pha đảo Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh) Silica

gel pha đảo ODS hoặc YMC (30-50 μm, FuJisilisa Chemical Ltd.)

- Hệ thống sắc ký lỏng trung áp (MPLC): Hệ thống bao gồm Detector UV-vis bước

sóng từ 200-900 nm, bộ lấy mẫu tự động (fraction collector) kèm theo với các dãy ống nghiệm kích thước thay đổi tùy theo lượng mẫu, hệ thống bơm với khả năng điều chỉnh áp từ 1 đến 10 bar, tốc độ dòng từ 1ml/phút đến 200 ml/phút Cột tách SNAP loại C8, C18 với dung lượng từ 100g đến 450g mẫu đầu vào

- Hệ thống lấy mẫu tự động (Fraction collector): Mẫu được đưa qua cột sắc ký bằng

thủy tinh với pha tĩnh là silica gel pha thường hoặc pha đảo Cơ chế phân tách dựa trên sự tương tác giữa chất và pha tĩnh, dung môi với tỷ lệ phù hợp Mẫu được thu thập thông qua máy lấy mẫu tự động

Các thiết bị sử dụng nêu trên thuộc Viện Hoá sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.3.2 Xác định cấu trúc các hợp chất sử dụng phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR - Nuclear Magnetic Resonance) là một phương pháp vật lý hiện đại nghiên cứu cấu tạo của các hợp chất hữu cơ, nó có

ý nghĩa quan trọng để xác định cấu tạo các phân tử phức tạp như các hợp chất thiên nhiên

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân, một chiều và hai chiều được đo trên máy Bruker Avance AM500 FT-NMR Spectrometer, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Chất nội chuẩn được sử dụng là TMS (tetramethyl silane)

Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân sử dụng:

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều: 1H-NMR, 13C-NMR

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều: 1H-1H COSY, ROESY, HSQC, HMBC

Dung môi được sử dụng bao gồm các dung môi CD3OD, CDCl3

Trang 33

2.3.3 Phương pháp nghiên cứu thử nghiệm hoạt tính diệt tế bào ung thư

Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ

(National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung

thư ở điều kiện in vitro

Phương pháp MTT được sử dụng để nghiên cứu thử nghiệm hoạt tính diệt tế bào ung thư Nguyên tắc của phương pháp này là đánh giá hoạt động trao đổi chất

của tế bào sống thông qua hoạt động của enzyme oxidoreductase phụ thuộc

NADPH Enzyme này sẽ khử thuốc nhuộm 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)- 2,5 diphenyltetrazolium bromide (MTT) thành sản phẩm formazan có màu tím và không tan Giá trị mật độ quang học (OD – Optical Density) đo được của formazan sau khi hòa tan trong dung môi thích hợp sẽ phản ánh mức độ hoạt động của

enzyme, tương ứng với độ sống của tế bào [7][ 22] Phép thử được thực hiện trong

điều kiện cụ thể như sau:

- Tế bào được nuôi trong đĩa 96 giếng với mật độ 2.0 x 104 tế bào/ml, ủ ở nhiệt độ 37oC, 5% CO2 trong 24 giờ

- Tế bào được xử lý với các hợp chất ở những nồng độ khác nhau (0.3, 1, 3,

10, 30, và 100 l trong DMSO), ủ ở nhiệt độ 37oC, 5% CO2 trong 48 giờ

- Sau đó, dung dịch MTT 0.5 mg/ml lần lượt được thêm vào và tiếp tục ủ ở nhiệt độ 37oC, 5% CO2 trong 4 giờ

- Hàm lượng formazan tạo thành được đánh giá bằng phương pháp đo mật độ quang OD ở bước sóng 570 nm, sẽ phản ánh số lượng tế bào sống trong dịch nuôi cấy

Khả năng sống sót của tế bào khi có mặt chất thử sẽ được xác định thông qua công thức sau:

% sống sót = [OD(chất thử) - OD(môi trường trắng)] x 100%

OD(đối chứng âm) - OD(môi trường trắng)

% ức chế = 100%  % sống sót

% ức chế ˃ 50% sẽ được chọn ra để thử nghiệm tiếp trên giá trị IC50 (nồng

độ ức chế 50% sự phát triển)

Trang 34

- Các phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác Etoposide và camptothecin được sử dụng như là chất đối chứng dương

- DMSO 10% luôn được sử dụng như đối chứng âm Giá trị IC50 sẽ được xác định nhờ vào phần mềm TableCurve Trong khuôn khổ luận văn này, chất thử nào

có IC50 < 100 μg/ml (với chất chiết thô hoặc phân đoạn hóa học) hoặc IC50  100

M (với hoạt chất tinh khiết) sẽ được xem là có biểu hiện hoạt tính gây độc tế bào

và có khả năng ức chế sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư

Phương pháp nghiên cứu thử nghiệm hoạt tính diệt tế bào ung thư được thử nghiệm tại phòng Hoạt chất sinh học, Viện Hoá sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học

và Công nghệ Việt Nam

2.3.4 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm

 Nguyên lý

Gốc tự do nitric oxide (•NO) được sản sinh ở nhiều loại tế bào khác nhau Dạng •NO xuất tiết có mặt ở các tế bào như đại thực bào, nguyên bào sợi hay tế bào gan thường được sản sinh với lượng lớn khi xuất hiện các đáp ứng viêm [40]

Một phương pháp được sử dụng để xác định gián tiếp •NO là đo màu các thành phần sản phẩm của nó (nitrate và nitrite) Phản ứng này đòi hỏi rằng nitrate (NO3) đầu tiên được giảm thành nitrite (NO2), do tác động của nitrate reductase

NO3- Nitrate reductase NO2- Nitrate Nitrite

Nitrite được phát hiện và phân tích bằng cách hình thành một màu hồng đỏ khi mẫu thử có chứa NO2- với thuốc thử Griess

Khi thêm axit sulphanilic, nitrite tạo thành muối diazonium, sau đó các thuốc nhuộm azo (N-alpha-naphthyl-ethylenediamine) được thêm vào để tạo thành màu hồng

Trang 35

Phương pháp MTT (3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) là một phương pháp so màu, đo độ suy giảm màu để đánh giá khả năng sống sót của tế bào Ở các tế bào sống, hệ enzyme oxidoreductase hoạt động mạnh, những enzyme này có khả năng phân giải MTT thành dạng formazan không hoà tan, màu tím đậm Do vậy, tỉ lệ tế bào sống sót được suy ra từ lượng formazan tạo thành từ MTT Lượng formazan tạo thành được hoà tan bởi dung môi hữu cơ (DMSO, propanol) và đo độ hấp thụ ở bước sóng 570 mm Khả năng gây độc tế bào của các mẫu thử nghiệm được suy ra từ việc đánh giá khả năng sống sót của tế bào

 Các bước tiến hành:

5% CO2 với 10% FBS, penicillin và streptomycin sulphate Sau đó chúng được nuôi cấy trong giếng phiến 96 với mật độ 2,5 x 105

tế bào/giếng Tế bào được kích thích với LPS trong 24 giờ với sự có mặt của các hợp chất thử ở nhiều nồng độ khác nhau, được pha sẵn trong DMSO Dịch nổi của tế bào phản ứng với thuốc thử Griess NaNO2 ở các nồng độ khác nhau được sử dụng để xây dựng đường chuẩn

Độ hấp thụ được đo ở 570 nm Cardamonin được sử dụng làm mẫu đối chứng [41]

Phần tế bào còn lại sau khi đã sử dụng để đánh giá các hoạt tính invitro được

bổ sung dung dịch MTT (5mg/mL), ủ 4h ở 37oC và 5% CO2 Sau đó hút bỏ hết môi trường trên bề mặt, kết tủa formazan được hòa tan trong isopropanol Độ hấp thụ

được đo ở 570 nm

Trang 36

CHƯƠNG 3- THỰC NGHIỆM

3.1 Phân lập các hợp chất từ san hô mềm Sinularia erecta

3.1.1 Phân lập các hợp chất

Mẫu san hô mềm Sinularia erecta tươi (1,5 kg) sau khi được xử lý theo

phương pháp xử lý mẫu sinh vật biển, được cắt thành từng miếng nhỏ và ngâm chiết MeOH sử dụng sóng siêu âm 3 lần (mỗi lần 2h) ở nhiệt độ phòng thu được cặn chiết MeOH tổng (150 g, M) Cặn MeOH được hòa vào nước (1.0 lít) và chiết phân lớp với n-hexane Cô quay loại bỏ dung môi dưới áp suất giảm thu được cặn chiết n-hexane (48g, H) Sau đó phần dịch nước được bổ sung dichloromethane tỉ lệ 1 : 1 thu được căn chiết dichloromethane (2g , D)

Hình 3.1 Sơ đồ chiết các phân đoạn từ mẫu Sinularia erecta

Cặn chiết H và D được tiến hành phân tách thô bằng hệ thống sắc ký lỏng trung áp với cột nhồi silica gel pha thường Rửa giải gradient bằng hệ dung môi dichloromethane : methanol (từ 100:1 đến 1:1) thu được 9 phân đoạn (H1→H9) Phân đoạn H3 (2g) tiếp tục được phân tách bằng hệ thống sắc ký lỏng trung áp với

Trang 37

cột pha đảo YMC RP-18, sử dụng pha động là methanol: nước (2:1) thu được 2 phân đoạn ký hiệu H3A và H3B Phân đoạn H3A (120 mg) được phân tách tiếp bằng sắc ký cột silica gel pha thường, rửa giải bằng hệ dung môi dichloromethane: acetone (20/1) kết hợp với sắc ký cột silica gel pha thường rửa giải bằng hệ dung

môi n-hexane : etyl acetate 5/1 thu được hợp chất 4 (1,8 mg) Phân đoạn H3B (900

mg) được phân tách tiếp bằng sắc ký cột silica gel pha thường, rửa giải bằng hệ dung môi n-hexane : acetone (10/1) kết hợp với sắc ký cột silica gel pha thường rửa

giải bằng hệ dung môi dichloromethane: etyl acetate 5/1 thu được hợp chất 5 (2,8

mg)

Hình 3.2 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn n-Hexan (H)

Phân đoạn H4 + H5 (10g) được phân tách bằng hệ thống sắc ký lỏng trung áp với cột pha đảo YMC RP-18, sử dụng pha động là methanol: H2O (1/1 →10/1) thu

Trang 38

được 7 phân đoạn ký hiệu H5A →H5G Phân đoạn H5B (120 mg) được phân tách tiếp bằng sắc ký cột silica gel pha thường, rửa giải bằng hệ dung môi dichloromethane: acetone (10/1) kết hợp với sắc ký cột silica gel pha thường rửa

giải bằng hệ dung môi n-hexane : acetone 7/1 thu được 3 hợp chất: 1 (1,5 mg), 2 (3mg), 3 (3,5mg) Phân đoạn H5C (190 mg) được phân tách tiếp bằng sắc ký cột

silica gel pha thường, rửa giải bằng hệ dung môi dichloromethane: acetone (15/1) thu được 4 phân đoạn H5C1- H5C4 Phân đoạn H5C3(16mg) được phân tách trên sắc ký cột silica gel pha thường rửa giải bằng hệ dung môi n-hexane : acetone 5/1

thu được hợp chất 6 (5 mg) Phân đoạn H5E (55mg ) được phân tách tiếp bằng sắc

ký cột silica gel pha thường, rửa giải bằng hệ dung môi dichloromethane: acetone (10/1) kết hợp với sắc ký cột silica gel pha thường rửa giải bằng hệ dung môi n-

hexane: acetone 5/1 thu được hợp chất 7 (1,6 mg) và hợp chất 8 (4,7mg)

3.1.2 Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập được

- Hợp chất 1: 3β,5α-dihydroxyeudesma-4(15),11-diene (chất mới)

Chất không màu, dạng dầu; [α]D + 10 ( c = 0,05; CHCl3); Phổ khối phân giải cao

HR-ESI-MS m/z 237,18549 [M + H]+ , M =236 Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) và 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) được trình bày trên bảng 4.1

C-NMR (125 MHz, CDCl3) được trình bày trên bảng 4.5

Trang 39

- Hợp chất 6 : Aromadendrane-4α, 10α-diol

Chất bột màu trắng; [α]D - 42 ( c = 0,05; CHCl3); Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) và 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) được trình bày trên bảng 4.6

- Hợp chất 7: Aromadendrane-4β, 10β-diol

Chất bột màu trắng; [α]D - 13 ( c = 0,05, CHCl3); Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) và 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) được trình bày trên bảng 4.7

- Hợp chất 8: Alloaromadendrane-4β, 10α-diol

Chất bột màu trắng; [α]D + 8 ( c = 0,05; CHCl3); Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) và 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) được trình bày trên bảng 4.8

3.2 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư các hợp chất phân lập được

Hoạt tính diệt tế bào ung thư thử nghiệm được tiến hành tại Viện Hoá sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Tất cả các hợp chất phân lập được được kiểm tra hoạt tính gây độc tế bào ung thư đối với 3 dòng tế bào ung thư người bao gồm: ung thư phổi (A-549), ung thư cổ tử cung (Hela), và ung thư biểu mô tuyến tụy (PANC-1) Các dòng tế bào này được đánh giá bằng các xét nghiệm đo màu dựa trên phương pháp MTT Kết quả được trình bày trong bảng 4.9

và bảng 4.10

Trang 40

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được

4.1.1 Hợp chất 1: 3β,5α-dihydroxyeudesma-4(15), 11-diene (chất mới)

Hợp chất 1 được phân lập dưới dạng dầu, không màu Trên phổ HR-ESI-MS

(Hình 4.1.1a) xuất hiện pic giả ion phân tử tại m/z 237,18549 [M+H]+, cùng với dữ liệu phổ 13C-NMR cho phép xác định công thức phân tử C15H24O2 (tính toán lý thuyết C15H24O2+ 237,18491), số liên kết đôi tương đương là 4

Hình 4.1.1a Phổ HR-ESI-MS của hợp chất 1

Trên phổ 1H-NMR (hình 4.1.1b) xuất hiện các tín hiệu của 2 nhóm methyl bậc 3 [ 1,67 (s, H-13) và 1,06 (s, H-14)], 01nhóm methine gắn trực tiếp với oxy [

4,49 (br d, J=10 Hz, H-3)] , 01 nhóm exomethylen điển hình cho liên kết đôi ngoại

vòng [ 5,15 (br s, H-15a) và 5,42 (br d,J=1,5 Hz, H-15b]

Định dạng
Số trang	116
Dung lượng	6,7 MB

Nghiên cứu thành phần hóa học và khảo sát hoạt tính sinh học loài san hô mềm sinularia erecta​

Nghiên cứu thành phần hóa học và khảo sát hoạt tính sinh học loài san hô mềm sinularia erecta