Đề tài được thực hiện với mục tiêu: Nghiên cứu thành phần hóa học của Mán đ a theo định hướng tác dụng sinh học, thử tác dụng chống oxy hóa in vitro các chất phân lập được[r]
Trang 1TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN VÀ THÀNH PHÀN HÓA HỌC CỦA PHẦN TRÊN
MẶT ĐẮT CÂY MÁN ĐỈA ( A R C H I D E N D R O N C L Y P E A R I A )
ThS Nguyễn Khánh Thùy U n h í1}, Th.s Hồ Việt Đức{1>, PGS TS Nguyễn Thị Hoài(1), TS Đ ỗ Thị Thảo(2)
(1>: Khoa Dược, trường Đ ại học Y Dược Huế (2): Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam.
TÓM TĂT
Đặt van đề và mục tiêu: Mán đ a được đồng bào Pako, Vân Kiều ở Quảng Trị dùng chữa các bệnh có liên quan đến tác dụng chống oxy hoá như viêm gan, xơ gan Sàng lọc hoạt tính chống oxy hoả in vitro cho thấy Mán đ a có hoạt tính mạnh Đề tài được thực hiện với mục tiêu: Nghiên cứu thành phần hóa học của Mán đ a theo định hướng tác dụng sinh học, thử tác dụng chống oxy hóa in vitro các chất phân lập được và thử hoạt tính bào vệ gan in vivo của cao chiết dược liệu.
Đối tượng nghiên cứu: phần trên mặt đất của cây Mán đỉa thu hâi tại huyện Dakrong, tỉnh Quảng Trị.
, Phương pháp nghiên cứu: Chiết xuất bằng phuvng pháp chiết lỏng - lỏng rắn ~ lỏng Phân lập chầỉ tinh khiết
bằng các phương pháp sắc ký Xác định cấu trúc bằng phương pháp phổ Thử tác dụng chống oxy hóa in vitro trên gan chuột phân lập Thử tắc dụng bảo vệ gan in vivo trên chuột gây viêm gan bằng paracetamol.
Kết quả: Đã phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất tính khiết là: Daucosterol (1), Methyl gallat (2), Quercetin 3-O-a-L-rhamnopyranosid (3), 7-0-galloyltrícetiflavan (4), i-octacosanol (5) và acid docosenoic (6) Các hợp chất (2), (3), (4) có tác dụng chống oxy hóa in vitro với ED50 lần lượt là 7,31 ụg/ml, 30,64 ụg/mí và 1,02 ụg/ml Cao chiết ethyl acetat ở liều 500 và 1000 mg/kg/ngày thề hiện rõ tác dụng bảo vệ gan và ờ liều 2000 mg/kg/ngày có tâc dụng bảo vệ gan tương đương với Silymann.
Kết luận: Đã phân lập được 06 hợp chất: Daucosteroi (1), Methyl gallat (2), Quercetin 3-O-ơ-L- rhamnopyranosid (3), 7-0-galloyltricetifỉavan (4), 1-octacosanol (5) và acid docosenoic (6) Trong đó các hợp chắt (2), (3), (4) có tác dụng chống oxy hóa in vitro Cao chiết ethyl acetat của dược liệu thể hiện tác dụng bảo vệ gan
in vivo.
Từ khóa: Mán đa
SUMMARY
LIVER-PROTECTING EFFECTS AND THE CHEMICAL CONSTITUENTS OF THE AERIAL PARTS
OF ARCHIDENDRON CLYPEARIA
Nguyen Khanh Thuy Linh(1), Ho Viet Duc(1>, Nguyen Thi Hoafv, Do Thi Thao(2i
Faculty o f Pharmacy, Hue college o f Medicine and Pharmacy
m: Institute o f Biotechnology, Academy o f Science and Technology o f Vietnam
Backgrounds: Archidendron clypearia has shown in vitro antioxidant activity in our previous screening test This paper aims to clarify the chemical composition and antioxidant activity ofArchidendron clypearia.
Puqjoses: To study the chemical composition oriented biological effects; Determination antioxidant activity of isolated compounds.
Materials: The whole aerial part o f A clypearia were collected in Dakrong, Quang Trí province, Vietnam Methods: Extraction methods: soaking extraction, liquid-liquid extraction, solid-liquid extraction Isolated by column chromatography and thin-layer chromatography Determining structure by spectroscopic methods Determination antioxidant activity in in vitro test Determination liver-protecting effect in vivo test.
Results: 6 compounds were isolated from Archidendron clypearia including Daucosterol, Methyl gallat, Quercetin 3-Ọ-a-L-rhamnopyranosid, 7-O-galloyltncetiflavan, 1- octacosanol and acid docosenoid In in vitro tests
on isolated liver cells of rats, there are 3 out o f 6 substances which have shown antioxidant activity, in which the best one is 7-O-galloyltricetiflavan, followed by Methyl gallate and Quercetin 3-O-a-L-rhamnopyranosid with ED50 values o f 1.02, 7.31 and 30.64 fjg/m l respectively In in vivo test, ethyl acetate extracts shown a protective effect on liver at doses 500mg/kg/day.
Conclusion: 6 compounds were isolated from Archidendron clypearia 7-O-galloyltricetiflavan, Methyl gallat and Quercetin 3-0~a-L-rhamnopyranosid have shown antioxidant effects In in vivo test, ethyl acetate extracts shown a protective effect on liver.
K eyw ords: Archidendron clypearia
ĐẶT VẤN ĐÈ VÀ MỤC TIẾU chiết methanol của Mán đỉa trẽn tế báó cjan chuột đã Tri thức bản địa, đặc biệt là trí thức sử dụng cây phân iập trong thử nghiệm in vitro [1], cho thấy dược
thuốc có vai trò quan trọng trong đời sống cùa người liệu này có hoạt tính chống oxy hoá mạnh Cho đển dân Qua nghiên cứu ban đầu, Mán đỉa là dược liệu nay, có rất ít nghiên cứu cùa Việt Nam cũng như ờ được đồng bào Pako, Vân Kiều ờ Quảng Trị dùng trên thế giới về thành phần hoá học và tác dụng sinh chữa các bệnh có liên quan đến tác dụng chống oxy học cùa ioài này Với mong muốn làm sáng to Kỉnh hoá như viêm gan, xơ gan, bệnh gan mật, tiêu hóa nghiệm của đồng bào Pako, Vân Kiều về việc sử dụng kém Kết quả sàng lọc hoạt tính chổng oxy hoá cao dược liệu Mán đỉa, chúng tôi tiến hành đe tài: “Tác
Trang 2dụng bảo vệ gan và thành phần hóa học của phần trên
mặt đất cây Mán đĩa Archidendron clypearía (Jack.) I
Niels Mimosaceae” với ba mục tiêu chính:
- Nghiên cứu thành phần hóa học theo định hướng
tác dụng sinh học
- Thu’ íác dụng chống oxy hóa in vitro của các chẳt
phân lập được
- Thử tác dụng bảo vệ gan in vivo cùa cao chiết
dược liệu
ĐÓI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứ u
1 Đối tượng nghiên cứu
Phần trên mặt đấí của cây Mán đỉa thu hái tạí
huyện Dakrong, tỉnh Quảng Trị Mâu dược liệu nghiên
cứu được TS Nguyễn Thế Cường - Viện Sinh thái và
Tài nguyên sinh vật - Viện Hàn iâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam xác định íên khoa học là Archidendron
clypearía (Jack) I Niels, Mimosaceae.
2 Phương pháp nghiên cứu
2.1 X ử lý mẫu, ch iế t x u ấ t cao toàn phần và cao
các phân đoạn.
Dược liệú được phơi sấy khô, xay nhỏ thành bột
mịn, sau đó chiết với methanol tuyệt đối bằng pháp
ngâm lạnh (48 giờ/lần X 3 lần) Gộp dịch chiet
methanol và cắt íhu hồi hết dung môi dưới áp suất
giảm cho đển cắn thu được cao cắn toàn phần
Lấy cao cắn toàn phần phân tán vào nước rồi chiểt
xuất phân đoạn bằng các phương pháp chiết lỏng-lỏng
với các dung môi rt-hexan, chloroform, ethylacetat,
butanol, thu được dịch chiết các phân đoạn và phần
nước còn lại
2.2 P hương pháp p h â n lập tế bào gan chuột.
Chuột BALB/c khóẻ mạnh được sử dụng đề tach tế
bào gan Gây chết chuột bằng ethanol 800, tách lấy
gan Gan chuột sau khỉ tách được rửa bằng PBS có
10% kháng sinh PSF (Penicillin-Streptomicin-
Fungizone) (Invitrogen) sau đó dùng panh, kéo, kim
đáng tin cậy với sai số p < 0,05
% tế bào gan sống sót “
ỈOD(chấíthử)
OD(H?Q?)1 X 100
NH4CI để phá vỡ hồng cầu Sau khi li tâm cắn tế bào
thu được hoà lại vào mồi trường MEME có 10% FBS
2.3 Phương pháp thử tác dụng chống oxy hóa
in vitro [3], [4], [5], [6].
Tế bào gan từ gan chuột sau khi phân lập được
nuôi ổn định 1-2 ngay, sau đó đưa vào đĩa thí nghiệm
96 giếng với mật đọ 1 X 104 tb/giếng để nuôi qua đểm
trong íủ ẳm 5% C 0 2, ờ 37°c Thêm chất nghiên cứu
hoặc Cucurmin (đối chứng dương) ờ các nồng độ
khác nhau,^ ù trong 2h Thêm 100 fiM H20 2 vào mỗi
giếng và để ỉác động trong 2h Để xác định số tế bào
gan sống sót sau tác động của H20 2 cũng như tác
động bảo vệ cùa hoạt chất nghiên cửu, MTT nồng độ
1mg/ml (50 nl/giếng) sẽ được đưa vào các giếng và ủ
tiếp trong 4h ở 37°c Loại bò toàn bộ dịch nổi va đưa
vào mỗi giếng 100 ^il/giếng DMSO 100% Đo mật độ
quang học (giá trị OD - Optical Density) của chất
formazanI tạo thành bằng máy Microplate Reader ở
492 nm Tấí cả thí nghiệm được lặp lại 3 lần để tránh
sai sổ Các số liệu được xử lí bắng phần mềm
TabieCurve 2D phiên bản số 4 và EXEL để tính giá trị
Standard Deviation Độ chính xác của số liệu được
tỉnh bằng R2 Nếu R2 à 0,95 thì kết quả ổược xem ìà
OD(Tế bào) - 0D(H20 2) Trong đó: OD(chất thử), 0D (H 20 2), OD(Te bào) lần lượt là giá trị mật độ quang học đo ờ giếng có chất cần
kiểm tra hoạt tính, ờ aiếnơ đối chứng êm ('chỉ gây chếí
tể bào bằng H20 2) va ở giếng mà tế bào hoàn toàn khỏe mạnh, không bị gây chết bằng H20 2
2.4 Phương pháp thử tác dụng chống oxy hóa
in vivo Ị7Ị.
Gây ton thương gan bằng paracetamol (PAR) với liều 400 mg/kg, paracetamol được pha với nồng độ 50 mg/ml 36 chuột BALB/c có khối lượng 26 g ± 2 g được chĩa iàm 6 ỉô (6 con/lô): Lô 1: uống DMSO 10%: o’,2 mi/con/ngày (chuột khỏe mạnh bình thường), lô 2: uống DMSO 10%: + Paracetamoỉ (bệnh lý), lô 3, 4, 5: uống cao chiết ethyl acetat liều lần lượt là 500 mg/kg/ngày,
1000 mg/kg/ngày, 2000 mg/kg/ngày, lô 6: uống Sịlymarin 50 mg/kg/ngày (chứng dương) Gây ổộc gan bằng cách cho uổng paracetamol (chỉ cho các lô 2, 3,4, 5) với liều paracetamol 400 mg/kg/1 lần duy nhất
Chuột ở các íô thử/ lô ổối chiếu được uống cao chiết/ thuốc đối chứng liên tục 7 ngày, mỗi ngày cho uống 1 lần vào buổi sáng, trước khi gây độc gan bằng paracetamol Ngày thứ 7 chuột được uong paraceíamoi 1lần duy nhất liều 400 mg/kg sau uống mâu 1 giờ, nhịn đói 14-16 giờ ỉrước đó, Sau 48 giờ uống paracetamol, láy máu định lượng aminotransferase (AST, ALT), cân khổi lượng gan, quan sát đại thể gan và xác định hàm lượng MDA trong gan
❖ Định lượng aminotransferase (AST, ALT) trong, huyết thanh chuột bằng phương pháp so màu, thực hiện írên máy định iượng sinh hoá bán tự động AU680 cùa hãng Beckman Coulter
❖ Kiềm íra trực quan gan: Sau toàn bộ íhí nghiệm
và sau khi lấy máu xét nghiệm, chuột được mổ đề kiểm tra trực quan
❖ Xác định hàm lượng MDA trong gan
❖ Phương pháp xử lí số liệu Các sổ liệu được sử !í írên Excei, thuật toán ỉhống
kê student t’test, F’test và phương pháp phân tích phương sai một nhân tố ngẫu nhiên (one way ANOVA)
vả sử dụng hệ số LSD (ieast-significant difference) đế kiểm tra sự sai khác có ý nghĩa so với đối chứng âm,
sai khác là không có ý nghĩa thống kê
2.5 Phương pháp thử độc tính cấp [2]
Theo phương pháp Litchfield-Wilcoxon, chuột nhắc trắng cả 2 giống được chia làm các lô, mỗi íô 8 con Chuột nhịn ăn 12h, được uống thuốc íhử (cao chiết ethyl acetat Mán đỉa) liều íăng dần Theo đõỉ liên íục trong 72 giờ đầu đế xác ổịnh số chuột chết và tình trạng chung của chuột suối 7 ngày trong từng lô, tính giá trị LD50
2.6 Phương pháp nghiên cứu về hoả học.
Phân lập các chất tinh khiết bằng sắc ký cột silica gel pha thường (Silica gel 60 0,040-0,063mm (230-400 mesh ASTM), Merck); silica gel pha đảo YMC (30-50
6 1 6
Trang 3-pha đảo (TLC-Silicagel 60 F254 Merck) Phát hiện vết
chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và
366 nm hoặc đùng thuốc íhử là dung dịch H2SO410%
phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ đến
khi hiện màu
Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được dựa
trên các phương pháp phổ bao gồm: phổ cộng hường
íừ hạt nhân một chiều (1IH-NMR, 13C-NMR, DEPT) va
hai chiều (HMBC, HSQC) đo tren máy Bruker Avance
AM500 FT-NMR, phổ khối lượng phun mù điện tử đo
trên máy AGILENT 1100 LC-MSD Trap tại Viện Hoá
học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việỉ Nam
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
1 Tác dụng chống òxy hóa in v itro của cao
chiêt toàn phần và cao các phân đoạn
Cao chiet toàn phần methanol (M),'õ phân đoạn: n-
hexan (H), chloroform (C), ethyl acetat (E), n-buỉanol
(B) và nước (W) của Mán đỉa được thử tác dụng
chống oxy hóa in vitro và kểt quả ở bang 1
Bang 1 Giá trị ED50 của cao chiết 5 phân đoạn của
Mán đỉa
Nồng
độ
(pg/ml)
% íê bào sốnq sót
H c E B w Curcumi
n
N đô M
100 71,1
4
68,5
7
70,2 9
71,4 3
64,43 67,43 20 113,8
0
20 56,8
6
53,7 67,7 57,7 28,57 64,57 4 64,73
4 37,4
3
37,7 65,1
4
39,4
? 10,14 47,71 0,8 27,3
0,8 17,4
3
27,1
4
53,1
4 15,1 4 1,43 12,57 0,16 -7,55
ED 50 9,30 14,9 0,63 9,10 >50
(59,43)
4,43 ed5 2,18
cao chiết nước không the hiện hoạt tính, còn cả 4
phân đoạn còn lại đều có tác dụng ờ các mửc độ khác
nhau Trong đó, phân đoạn ethyl acetat thể hiện hoạt
tính mạnh nhất với giá trị ED50 thấp nhất và thấp hơn
cả chất đối chửng dương là Curcuniin
Điều này rất có ý nghĩa trong quá trình nghiên cứu
ỉhuốc từ dược liệu Vì như chúng ta biếỉ, khó khăn trong
việc pháỉ ỉriển thuốc dân tộc cổ truyền lâu nay là chúng
ta thường dùng dịch chiết tổng (dịch chiết toàn phần)
mà không tìm ra, không chứng minh được phân đoạn
nào có tác dụng Cao chiết toàn phần với khối lượng
lớn rất khó khăn đưa vào các dạng bào chế phân liều
hiện đại Việc chứng minh được thành phần, phân đoạn
có tác^dụng sẽ định hướng cho các nghiên cứu tiếp
dụng manh nhất là dịch chiết f?hân đoạn ethyl acetaí
2 Kết quả nghiên cứu về hóa học
5,0 kg dược liệu đã xay thành bột được ngâm chiết
trong meíhanol (10 lít X 3), dịch chiết sau đó được cô
khô ở áp suấỉ thấp, thu được cao cắn cắ n methanol
được phân bố vào nước rồi lần lượt chiết với n-hexan,
chloroform, ethyl axetat, n-butanol cho các phân đoạn
chiết n-hexan (H), chloroform (C), ethyl axetat (E), n-
butanol (B) và dịch nước còn lại Dịch nước được tách
phân đoạn bằng cột Dianion HP-20 (W)
Phân đoạn ethyl actetat'(E) được tách trên cột silica gel, rửa giải lần lượt bằng n-hexan/aceton 100 - 40/1-20/1-10/1-5/1 -1/1 -0/100 và methanol 100% thu được 8 phân đoạn (E1-8) Phân đoạn E4 được tách trên cột silica gei pha thường, rửa giải bằng hỗn hợp chlorofom/aceton 10/1, thu được 5 phân đoạn (E4A- E) Phân đoạn E4B được tiến hành sắc ký với cộí silica gel pha đảo, rửa giải bằng hệ dung mổi aceton/nước 3/2 íhu được 4 phân đoạn (E4B1-4) Phân đoạn E4B3 tiếp tục tiến hành sắc ký cột pha thường với hệ dung môi chloroform/ethyl acetaư methanol 15/1/0,1 íhu đưực 5 phân đoạn (E4B3A-E) E4B3D được phân lập bang sac ký cột siìicagei pha đảo với hệ methanol/nước 3/1 thu được 3 phẩn đoạn (E4B3D1-3) E4B3D2 được tinh chế qua cột Sephadex, rửa giải bằng methanol 100% ỉhu được Chat sạch số 1 (ACE9) 25mg E4D được tách bằng cộỉ Sephađex, rửa giàí bằng meỉhanol 100%, thu được 4 phan đoạn (E4D1-4) E4D2 tiếp tục íỉnh chế qua sắc
ký cộỉ silicagel pha đảo với hệ methanol/nước 8/1 thu được 4 phân đoạn (E4D2A-D) E4D2B tiến hành sắc
ký lớp mỏng điều chế với hệ chloroform/methanol/acid formic íhu được chất sạch sồ 2 (ACE7) 12mg
Phân đoạn E6 được tách bằng cột silĩcagel pha thường, rửa giải bằng hệ chioroform/aceton 1/1 thu được 5 phân đoạn (E6A-E) Tinh chế phân đoạn E6B bằng cộỉ silica gel pha đảo, r!>a giải bằng methanol/nước 2/1, thu được 5 phân đoạn (E6B1-5) Phân đoạn E6B2 được tách bằng cột Sephàdex, rửa giải bằng methanol 80%, thu được 4 phân đoạn (E6B2A-D) E6B2A tiến hành sắc ký pha thường, rửa giải bằng hệ dung môi chioroform/methanol/acid formic 6/1/0,1, thu đựợc 3 phân đoạn E6B2A1-3 E6B2A3 tinh chế bằng sắc ký pha đảo với hệ meíhanol/nước/acid formic 1/1/0,05 thu được chất sạch số 3 (AEC4) 105mg E6B2C được tách bằng sắc
ký pha thừờng, rưa giải bằng hệ chioroform/methanol 3/2 thu được 3 phân đoạn (E6B2C1-3) E6B2C2 xuất hiện tinh thể trắng khi được cô đặc; tiến hành lọc, rửa ỉinh thể thu được chất sạch số 4 (ẦÓE8) 86mg
Phân đoạn E3 tiến hanh sắc ký cột pha thường với
hệ dung môi chloroform : methanol ( 5 : 1 ) íhu được 5 phân đoạn E3A-E Phân đoạn E3D tiếp tục qua cột Sephadex, rửa giải bằng methanol : nước ( 4 : 1 ) thu ỔIPỢC 4 phân đoan E3D1-4 Phân đoạn E3D2 qua cột sắc kỷ pha đảo với hệ dung môi aceion : nước : acid
giải băng methanol thu đươc 3 phân đọạn E3D2A1-3 Phân đoạn E3D2A2 được tinh chế bằng sắc ký cộí pha thường với hệ dung môi chloroform : meỉhanoi : nước ( 3 : 1 : 0,1) thu được chất sạch số 5 (ACC1) 92mg Phân đoạn E3Đ2D tinh chế bằng sắc ký cột Sephadex rửa giải bằng methanol thu được chất sạch
số 6 (ACC3) 88mg
Thông qua viẹc phân tích dữ kiện phổ 1D, 2D - NMR, MS cấu true của các chất sạch 1-6 được xác định là Daucosíerol (1), Methyl galiaíe (2), Quercetin 3- O-a-L-rhamnopyranosid (3), 7-0-Galloyỉiríceíiflavan (4), 1-octacosanoi (5) vồ acid docosenoic
Trang 4Hình 1 Cấu trúc của các chất phân lập được từ Mán đỉa
3 Tác dụng chống oxy hóa của các chất phân lập được
Tỷ lê (%) tê bào sốnq sỏt Nồng độ
(MQ/ml) ACC1 ACC3 ACE4 ACE7 ACE8 ACE9 Nồng độ (ug/mí)Cucurmín
160 24,38 1,94 63,25 65,90 66,95 27,92 80 67,42
32 19,26 5,30 50,53 62,19 66,25 6,01 16 59,11 6,4 14,84 13,07 24,73 46,11 55,30 3,00 3,2 41,73 1,28 8,83 9,72 8,13 38,34 51,41 -7,42 0,64 16,89
ED50 (ụg/ml) >160 > 160 30,64 7,31 1,02 >160 6,31 tác dụng mạnh nhẳt với ED50 íà 1,02 ụg/ml, mạnh gểp 6 Ỉần so với Curcumin Kế tiếp là ACE7 với ED5Q là 7,31 ụg/ml (gần tương đương so với Curcumin) và ACE4 là 30,64 Ịjg/ml ACC1, ACC3 và ACE9 không thể hiện tác dụng chống oxy hóa
bệnh suy giồm hệ thần kinh và tăng tốc độ quá trinh lão hỏa cơ thể con người
4 Tác dụng bào vệ gan in vivo của cao chiết dược liệu.
4.1 Hiệủ quà bào v ệ gan
Sau 9 ngày thí nghiệm chuột ở íất cả các lô được láy máu đề kiểm tra hàm lượng AST, ALT írong huyết thanh Kết quả nghiên cứu hiệu quả bảo vệ gan của cao chiết ethyl acetat được trinh bày ở bảng 3
Lô Thuôc và liều lượng AST (Ul/L) ALT (Ul/L) % giảm AST % giảm
ALT DMSO 10% 60,50 ±9,19 35,50 ± 6,36 -
-2 DMSO 10% + PRA400
mg/kg
92,67 ± 9,45 p<0,05 so với(1)
141,00 ±29,50 p<0,05 so với (1)
3 Cao ethyi acetat 500
mg/Rg/ngày + PRA 400
mg/kq
94,50 ± 16,77 p>0,05 so với (2) p>0,05 so với (5)
96,25 ±16,29 p<0,05 so với (2) p<0,05 so vởi (6)
-1,98 31,73
4 Cao eíhyl acetat 1000
mg/kg/ngày + PRA 400
mg/kg
93,00 ±12,63 p>0,05 so với (2) p>0,05 so với (5)
91,00 ±9,90 p<0,05 so với (2) p<0,05 so với (6)
-0,36 35,46
5 Cao ethyl acetat 2000
mg/kg/ngày + PRA 400
mg/kg
95,50 ±23,23 p>0,05 so với (2) p>0,05 so với (5)
71,50 ±11,92 p<0,05 so với (2) p>0,05 so với (6)
-3,06 49,50
6 Silymarin
50 mg/kg+PRA 400 mg/kg
88,50 ±2,13 p<0,05 so với (1) p>0,05 so với (2)
67,00 ± 8,38 p<0,05 so vớỉ(1) p<0,05 so với (2)
4,50 52,48
6 1 8
Trang 5-BảngI 3 cho thấy khi chuột được uống cao chiết ethyl acetat và Siiymarin (lô 3, 4, 5, 6) có chỉ số ALT thấp hơn
so với đối chứng (lô 2) và có sự sai khác, trong khi đo chỉ số AST vẫn cao và khong có sư sai khác so vơi đối chứng
Khỉ gan bị viêm hay bị íổn thương, men gan sẽ “rò ri” vào đòng máu làm chỉ số men tăng lên Paracetamol lam ton thương gan chuộí nên nồng độ ALT và AST tăng lên có ý nghĩa thống kê so với mau chứng trắng (lô chuôỉ khôna sử duna Daracetam oiV K ấ t n u à n n h iê n n V n rhn t hấ\t n À n n rtA A I T * a / l i i m -3-1 7-50/7 L4-, c k « « «
chiết ethyl acetat Mán đỉa ở liều 500 mg/kg/ngày Và khỉ sử dụng cao chiết ở liều 2000 mg/kg/ngay thi nồng đọ ALT đã giảm đến 49,50% so với lô chứng Điều này chứng tỏ cao chiết ethyl acetat đã có tác dụng bảo vệ gan % giảm ALT khi cho chuột uống cao ethyl acetaí Man đỉa iĩều 2000 mg/kg/ngày gần tương đương với Silymarin điều này có nghĩa khả năng bảo vệ gan của Mán đìa khi dùng liều 2000 mg/kg/ngày gần tương đương với Silymarin trong thí nghiệm này
4.2 Khối lượng gan và trực quan tổn thương gan
D Ẳ r ì n Á h D A jnrt •x «A4 At n Ắ n (A IL*Í
Lô Thuốc và lieu lượng Khôi lượng gan
(g/1 Og cơ thể) p Quan sát hinh thái trực quan gan
1 DMSO 10% 0,381 ±0,009 Gan bình ỉhường, bê mật gan đồng
nhất khônq có tổn thươnq
2 DM SO 10% +PRA
400mg/kg 0,504 ± 0,088 p<0,05 so với (1) Gan to vá cỏ 1/6 con bê mặt gan bị tôn thươnq qan rấỉ rõ rêĩ
3 E-BM87 500 mg/kg/ngày
+ PRA 400mq/kq'" 0,394 ± 0,057 p>0,05 so với (2) p>0,05 so với (6) vẫn có con gan to, bè mặt không có tốn thươnq
4 E-BM87 1000
mg/kg/ngày + PRA
400mq/kq
0,390 ±0,022 p<0,05 so với (2)
5 E-BM87 2000
mg/kg/ngày + PRA
400mg/kg
0,401 ±0,058 p>Õ,05 so với (2)
6 Silymarin
50 mg/kg+PRA 400mq/kq 0,370 ±0,016 p<0,05 so với (2) p>0,05 so với (1) Gan bình thường, bề mặỉ không có tốn thươnq
Lô Thuốc và lièuĩươnq MDA (mM/ml) MDA tăng so với lô 1 (lần) p
2 DMSO 10% +PRA 400 mq/kq 9,824 2,75 p<0,05 so với (1)
3 Cao eỉhyl acetat 500 mg/kg/ngày + PRA 400
rng/kg 7,968 2,23
p>0,05so với (2) p>0,05so với (6)
4 Cao ethyl acetat 1000 mg/kg/ngày + PRA
400mq/kq 6,721 1,88 p>0,05so với (2) p>0,05 so với (6)
5 Cao ethyl acetat 2000 mg/kg/ngày + PRA
400mq/kq 5,528 1,55 p<0,05 so với (2) p>0,05so với (6)
6 Silymarỉn
50 mg/kq + PRA 400 mq/kq 5,205 1,45 p<0,05 so với (2) p>0,05sovới(1ì
MDA (malonyl dialdehyd) là sản phẩm cuối cùng
của quá trình peroxy hóa íipid màng tế bào, thường
được chọn là chỉ số để đánh giá mức độ tổn thương te
bào do stress oxy hóa Khi cho chuột uống cao ethyl
acetat liều 500 mg/kg/ngày và 1000 mg/kg/ngày, hàm
lượng MDA trong gan đều được cải thiện so với lô
chứng không có hoạt chất bảo vệ, mặc dù các số liệu
choI thấy sự sai khác không có ý nghĩa thống ke Tuy
nhiên, khi dùng cao ethyl acetat Mán đỉa liều 2000
mg/kg/ngày, MDA írong gan đã giảm đáng kể so với lô
chứng, hiệu quả gần tương đương Silymarin và sự sai
khác này có ý nghĩa thống kê
Những kếí quả đã đạt được là bằng chứng khoa
học góp phần giải ìhích kinh nghiệm sử dụng dược
liệu Man đỉa cõa đồng bào dân tộc Pako, Vân Kiều
trong chữa bệnh Nó cũng mờ ra triển vọng cây thuốc
nàỵ cần được nghiên cứu sâu và đầy đủ hơn ve thành
phan hóa học, tác dụng sinh học để có cơ sở định hướng cho việc sử dụng và phát triển cây này trong thời gian tới
57 Độc tính cấp cùa cao chiết ethyl acetat Mán đỉa
LD50 được xác định ià 9500 mg/kgP có nghĩa ià liều gây chết 50% chuột thí nghiệm là 9500mg/kgP tương đương với 190g dược iiệu/kg chuột, cao gẩp khoảng 132 lan so với liều dùng theo kinh nghiệm của người dân địa phươna Mặc dù cao eíhyl acetat của Mán đỉa có độc tính cấp nhưng độc tính này xuất hiện
ồ liều rất cao, gấp 380 lần liều thường dùng theo kinh
nghiệm của người dân Như vậy, liều có íác dụng điều
Trang 6trị thấp hơn rất nhiều so với liều độc nên dược liệu
được xem là khá an toàn trong các nghiên cứu tiểp
íheo và trong triển vọng phát triền thành thuốc
KẾT LUẠN
Cao chiết các phân đoạn cửa cây Mán đỉa
(Archidendron clypearía, họ Mimosaceae) đã được
cao chiết phân đoạn ethyi acetat thể hiện hoạt tính
mạnh nhất với các giá trị ED50 là 0,63 Mg/ml Từ phân
đoạn ethyl aceíat đa chiết xuat phân lập, xác định cấu
trúc ổược 6 hợp chất tinh khiết bao gồm Daucosterol,
Methyl galiate, Quercetin-3-O-a-rhamnopyranosid, 7-
O-Gailoytricetiflavan, 1-octacosanol và acid
docosenoic Methyl galỉate, Quercetin-3-O-a-
rhamnopyranosid, 7-0-Galloyíricetiflavan có íác dụng
chống oxy hóa trên thử nghiệm in vitro, trong đó 7-0-
Galloytricetiflavan thể hiện tác dụng mạnh nhất với
ED50- 1,02 pg/ml Cao chiết eíhyl aceíat ơ liều 500 và
1000 mg/kg/ngày íhề hiện rõ tác dụng bảo vệ gan và ở
íiều 2000 mg/kg/ngày có tác dụng bảo vệ gan tương
đương với Silymarin
TAI LIỆU THAM KHẢO
1 Nguỳễn Thị Hoài (2012-2013), Nghiên cứu cấc
cây thuốc của đồng bào Pako Vân Kiều ở Miền Trung
theo hướng tác dụng chống oxy hóa, diệt tế bào ung
thư, Đề tài cấp Bộ GD&ĐT.
2 Viện đừợc iiệu (2006), Phương phấp nghiên cứu
tâc dụng dược lý của thuốc từ thảo dược, NXB Khoa
học va kỹ thuật, ír 171 -183, tr 279-292
3 Burdon R H, (1993,), Carcinogenesis and Free
medicine, molecular and cs!! biology updates, Basel,
pp.187-193
4 Collins A R (2005), “Assays for oxidatives stress an antioxidant status: application research into
the biological effectiveness of polyphenol”, Am J Clin
5 Gupta R Sbarma M., Lakshmy R., Prabhaharan D., Reddy K s (2009), Improved method of total
antioxidant assay”, Indian J Biochem Biophys., 46,
pp.126-129
6 Haimin c., Xiaojun Y., Peng Z-, Jing L (2006),
"Antioxidant activity and hepatoprotective potential of
agaro-oiigosaccharides invitro and invivo", Nutrition
Journal, 5(31).
7 Zacurazi Facurazi s., Hairuszah I., Nanthini u (2008), "Moringa oleifera Lam prevents acetaminophen induced liver through restoration of glutathione level”, Food Chem Toxicol, 46(8), pp.2611-2615
NGHIÊN c ứ u LÊN MEN LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS
ĐẺ SẢN XUÁT MAGNESI LACTAT
Ths Nguyễn Minh Ngọc (Trường Cao đẳng Dược Hải Dương)
Ts Nguyễn Thị Hường (Trường Cao đẳng Dược Hải Dương)
Ts Đàm Thanh Xuân (Trường Đại học Dược Hà Nội)
ĐẶT VẮN ĐỀ
Magnesi là một nguyên tố đa lượng vai trò thiết yếu
trong cơ thể, thiếu Magnesi có thể dẫn đến những thay
đổi sinh hóa và triệu chứng nghiêm trọng, liên quan
đến các bệnh như bệnh tim mạch, loãng xương và
bệnh hen suyễn Các dạng Magnesi vồ cơ có sinh khả
dụng thấp hơn các đạng muối Magnesi hữu cơ trong
đó có Magnesi íactai Magnesi íactat còn được sư
dụng làm nguyên liệu sản xuất Caici lacỉat, axit lactic,
nhựa sinh học polylactic Sản xuất Magnesi lactat
bằng cách lền men các vi khuẩn lactic íừ nguồn
nguyên liệu hỵdratcarbon và bổ sung M gC03vào môi
trường nuôi cay đang íà hướng nghiên cứu được quan
tâm [1J Nghiên cứu này được tiến hành nhắm mục
đích lựa chọnpH thích hợp và phương thức bổ sung
M gC03 trong quá trình niioi cấy vi khuân Lactobacillus
acidophillus đề điều chế Magnesi lactat, đồng thời
kiểm tra tiêu chuẩn, định tínhT định iuợng sản phẩm
Magnesì lactat tạo thành
ĐÓI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứ u
1 Đối tứợng nghiên cứu
Chùng Lactobacillus acidophillus ATCC 4356
Môi trường MRS có bổ sung sữa bột, MgC03,
Magnesi lactat nguyên liệu và một số hóa chat đạt tiêu
chùẳn phân tích
Thiềt bị đo phổ hồng ngoại, phổ cộng hường từ hạt
nhân1H-NMR Bruker AV500 (Phòng NMR Viện Hóa
học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam), máy đo phổ khối lượng (MS) LCMS - 2010EV (Shimadzu) tại phòng Thí nghiệm Hoá vậí liệu - Khoa Hoá học - Trường ĐHKHTN - ĐHQGHN ‘
2 Phương pháp nuôi cấy vi sinh vậ t thu Magnesi lactat
Nuôi cấy Lactobacillus acidophillusở 37°c trong
đều kiện vi hiếu khí trong 100ml môi trường MRS có
bồ sung sữa bộí[6], MgC03 Sau 96h, đun cách thủy dịch lên men írong 20 phút Ly tâm 4.000 vòng/phút trong vòng 15 phút, lọc nóng, ỉhu dịch Cô cách íhủy còn 30% thể tích Để kết tỉnh lạnh 4 - 10°c, 12h trong
tủ iạnh Thu tinh thể, rửa 2 lần bằng nước cất đã đe lạnh Dịch rửa được cô tiếp đến còn 30% thể tích, để
kết tinh lạnh qua đêm ở 5 c sấy tinh thể thu được ở
nhiệt độ 40°c trong 24h thu được sản phẩm thô Hàm lượng Magnesi lactat trong sản phẩm thô (q) được xác định theophương pháp complexon [2].TÍnh hiệii suất tạo sản phẩm Magnesi lactat theo công íhức:
m q.n00-h).i80.lQ 0%
(a-b).238,45
Trong đó:
H: hiệu suất (%), m: số gam Magnesi lactat thô tronglOO ml dịch !ên men
q: hàm lượng Magnesi lactat (%)