Kết quả nghiên cứu sàng lọc cho thấy triển vọng của cây An điền nón trong quá trình tìm kiếm các thành phần có hoạt tính kháng khuẩn.. Nghiên cứu đặc điểm thực vật bằng phương.[r]
Trang 1Analogues with Various Substituents at the Sulfinyl Sulfur:
Asymmetric Synthesis and Biological Activities J Org
Chem., 2009, 74,6002-6009.
*2 2 H L Holiand; F M Brown; B G Larsen; M Zabic
Biotransformation of organic sulfides Part 7 Formation of
chiral isothiocyanato sulfoxides and related compounds
by microbial biotransformation Tetrahedron Asymmetry,
1995, ổ(7), 1569-1574
23 E L Eliei; R 0 Hutchins; R Mebane; R L
Wilier Endocyciic vs Exocyclic Attack in Nucleophiiic
Displacement Reactions on Five- and Six-Membered
Cyclic Onium Salts J Ory Chem., 1976, 41(6), 1052-
1057
24 T J Wenzei; J Zaia Organic-Soiuble Lanthanide Nuciear Magnetic Resonance Shift Reagents for
Sulfonium and isothiouronium Salts Anal, Chem., 1987,
59,562-567
25 H Golchoubian; F Hosseinpour Effective Oxidation of Sulfides to Sulfoxides with Hydrogen Peroxide under Transition-Metal-Free Conditions
ivioiecuies, 2007, 12, 304-311.
26 M H Benn and Vinod K Singh A simple, biogeneticaily modeled synthesis of 4-(methy1thio)butyỉ thiocyanate: the reaction of thiocyanaie anion with S-
methy!-(1,n)-epithionium ions Can J Chem., 1986, 64,
940-942
THẸO ĐỊNH HƯỚNG 'h o ạ t tín h k h á n g KHUẢN CỦA LOÀI AN ĐIÈN NÓN ( H e d y o t i s p i l u l i f e r a (Pit.) T.N.Ninh)
ThS Võ Quốc Hùng, ThS Nguyễn Đình Quỳnh Phú, T S Hồ Việt Đức, T S Nguyên Thị Hoài
(Khoa Dược, Đại học Y Dược Huế)
TÓM TẤT
Đặt vấn đề và mục tiêu: Tình trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn đã đặt ra yêu cẩu cấp thiết cho việc phàt triển thuốc khàng sinh mới Kết quả nghiên cứu sàng lọc cho thấy triển vọng của cây An điền nón trong quá trình tìm kiếm các thành phần có hoạt tính kháng khuẩn Vì vậy, để tài được thực hiện nhằm khảo sâỉ đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và hoạt tính kháng khuẩn của cốc hợp chất được phân lập từ An điên nón - vốn chưa
được nghiên cứu cụ thể ờ Việt Nam cũng như trên thế giới.
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Phần trên mặt đất của cây An điền nón (Hedyotis pilulifera (Pit)
T.N.Ninh) được thu h ái tại Vĩnh Linh, Quảng Trị vào tháng 08/2014 Nghiên cứu đặc điểm thực vật bằng phương
kết hợp Xốc định cẩu trúc qua các dữ liệu phổ, thông số vật lý, kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo Xảc định hoạt tính kháng sinh bằng phương phàp pha loằng trên khay 96 giếng.
Kết quả - Kết luận: Đă xác định được đặc điếm vi học của thân và lâ cây An điền nón Đã phân lập được 01
hợp chất irìdoid mới ià 10-0-acetylborreríagenin (1), cùng 05 hợp chất irídoid (2-6) và 05 hợp chất tríterpene đã biểt (7-11) Hợp chất 7,8, 10 và 11 thể hiẹn hoạt tính ức chế 6 cốc mức độ khàc nhau đổi với 3 chủng vi khuẩn
S aureus, B subtilis và M smegmatis Trong đó, hợp chất 10 cố hoạt tính mạnh trên cả 3 chủng vi khuẩn (MIC lần lượt la 2,5; 2,5 và 1,25 ụg/mL).
T ừ k h ó a : Hedyotis pilulifera, 10-0-acetylborrerìagenin, irídoid, trìterpene, hoạt tính kháng khuẩn
SUMMARY
Hedyotis pilulifera (Pit.) T.N.Ninh: BOTANICAL P R O PER TIES AND ANTIBACTERIAL CO NSTITU ENTS
Authors: Vo Quoc Hung, Nguyen Dinh Quynh Phu, Ho Viet Due, Nguyen Thi H oai
(Faculty o f Pharmacy, Hue University o f Medicine and Pharmacy)
Background: Drug resistance has become a serious problem encouraging scientists to deveplop new antibiotics The screening o f antibacterial effect ofHedyotis pilulifera (Pit.) T.N.Ninh showed the potential o f this
plan to discover antibacterial constituents Therefore, this study was conducted to investigate botanical properties,
phytochemicals, and antibacterial activity o f H pilulifera which has not been studied y e t
province in August 2014 Botanical properties were studied using microscopic methods Pure compounds were isolated by using the combination o f various chromatographic methods, structure o f isolated compounds were identified by analyzing their spectral data, physical properties, and by comparing with those in literature
Antibacterial activity o f isolated compounds was evaluated by microdilution assay.
Results & Conclusion: M icroscopic botanical properties o f H pilulifera were described One new iridoid, 10-0-
acetylborreriagenin (1), together with five known iridoid compounds (2-6), and five known triterpenes (7-11) were
isolated The result o f antibacterial activity test o f these 11 compounds show ed that compounds 7, 8, 10, and 11
possessed inhibitory activity toward s aureus, B subtilis, and M smegmatis with different strengths Among those, compound 10 possessed strong inhibitory effect toward all three tested bacteria (MIC 2.5, 2.5, 1.25 ụg/mL, respectively).
activity.
-
Trang 2732-Đ ẬT VẮN 732-ĐỀ V À MỤC TIÊU
Trong vài thập kỷ trờ lại đây, việc đề kháng các loại
thuốc kháng vi sinh vật đã írở íhành một nguy cơ đáng
báo động, làm giảm hiệu quả điều trị, gia ỉăncỊ chỉ phí
và tỉ ỉệ tử vong Do đó, việc nghiên cứu nham phát
hiện các kháng sinh mới có hiệu quả điều trị cao đang
là một yêu cầu cấp bách [24], Trong quá trình tỉm kiếm
này, thiên nhiên đã, đang và sẽ tiếp tục là một đối
tượng đầy triển vọng với nguồn hợp chấỉ có hoạt tính
sinh học vô cùng phong phu [11 ]
Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa
nên có nguồn ỉàí nguyên thực vật đa dạng Trong đó,
Hedyotis L gồm hơn 500 loài là một trong những chi
thực vật có số lượng loài lớn nhất trong họ Cà phê
(Rubiaceae), hiện được biết có 66 loài, 7 thứ tại Việt
Nam [3, 6], Các nghiên cứu đã cho thấy nhiều loài
trong chi Hedyotis L có phổ hoạt tính sinh học tương
đối rộng như là hoạt tính chống oxy hóa, kháng viêm,
bảo vệ gan, tác dụng gây độc đối với một số dòng tế
bào ung thư ỉhử nghiệm [10, 12], Đáng chú ý là hoạt
tính khang khuẩn với hiệu quả ức chế trên vỉ khuẩn
Gram (-) và Gram (+) [10,16]
Trong quá ỉrình nghiên cứu sàng lọc hoạt tính
kháng sĩnh của các loài thuộc chi Hedyotis L , dịch
chiết methanol ỉừ cây An điền nổn (Hedyotis pilulifera
(Pit.) T.N.Nính) đã thể hiện tác dụng đáng lưu ý Tuy
nhiên cho đến nay, chưa thấy cỏ công bố nào về đặc
điểm vi học, thành phần hóa học, cũng như tác dụng
sinh học của loài này tại Việt Nam cũng như trên thể
giới Với những iý do nêu trên, đề tài “N ghiên cứ u đặc
điểm th ự c v ậ t và th àn h phần hóa h ọ c th e o định
hư ớ ng hoạt tín h kháng kh uẩ n c ủ a loà i A n điề n nón
(Hedyotis pilu life ra (Pit.) T.N.NỈnh)" được thực hiện
nhằm góp phần phục vụ cho công tac bảo tồi% chuẩn
hóa nguyên liệu cũng như iàm sáng tỏ thành phần hóa
học và tác dụng kháng khuẩn của dược liệu này
ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIỀN c ư u
1 Đôi tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là phần trên mặt đất của cây
An điền nón, mẫu được thu thập tại huyện Vĩnh Linh,
tỉnh Quảng Trị vào tháng 8 năm 2014 Tên khoa học
được xác định ià Hedyotis pilulifera (Pit.)
T.N.Ninh.íhuộc họ Cà phê (Rubiaceae) Tiêu bản mẫu
cây (kí hiệu VL-01) hiện được lưu giữ tại phòrig tiêu
bản của Viện Sinh ỉháỉ và Tài nguyên Sinh vật - Viện
Hàn lâm Khọa học và Công nghệ Việt Nam và tại
Khoa Dược - Trương Đại học Y Dược HŨế
2 PhiPơng pháp nphiên cửu
2.1 Nghiên cứ u v ế th ự c vật
Quan sát, chụp ảnh và mô tả đặc điểm hình thái
thực vật của cây íại thực địa T hu hái, làm tiêu bản
mẫu cây và lưu giữ tiêu bản Giám định tên khoa học
cùa cây trên cơ sở phân tích đặc điểm hình thái, so
sánh với tiêu bản !ưu trữ và tài liệu phân loại thực vật
[4] cùng với sự hỗ trợ cùa chuyên gia phân loại thực
vật Nghiên cứu cấu tẹo giải phẫu bằng kính hiển vi sừ
dụng phương pháp cắt nhuộm kép V! phẫu bằng xanh
methylene và đỏ carmin, và phương pháp soi bột [7]
2.2, Nghiên cứu về thành phần hóa học
Tạo dịch chiết toàn phần bang phương pháp ngâm
với dung môi hữu cơ ở nhiệt độ phòng Chiết xuất các
phân đoạn sử đụng phương pháp chiết phân bố [2], Phân lập các chẩỉ tình khiết bằng sẳc ký cột silica gel pha thường (Silica gei 60 0,040-0,063mm (230-400 mesh ASTM), Merck); silica gel pha đảo YMC (30-50
ụm, F u ji Siiysia Chemical Ltd.); Diaion HP-20 vá Sẹphadex LH-20 (Merck) Theo dõi các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM) tráng sẵn pha thường (Merck, Kielselgeí 60 F254, 250 |jm ) và pha đảo (Merck,
RP C-18 F 2 5 4 ) Phát hiện vếí chẩt bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 366 nm hoặc dùng thuốc thừ là dung dịch H2SO4 10% Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được dựa trên các phương pháp pho bao gồm: phổ cộng hường từ hạt nhân (NMR) mộì
chiều (1H NMR, 13c NMR, DEPT) và' hai chiều (HMBC,
HSQC, COSY, NOESY); phổ khối iượng phân giải cao HR-ESI-MS; cùng các thông số vật lý như nhiệt độ nóng chảy, độ quay cực, quang phổ tư ngoại và phổ hồng ngoại
2.3 Nghiên cứu về hoat tính kháng khuẩn
Hoạt tính kháng khuần được đánh giá bằng phương pháp pha loãng trên 6 chủng vi khuẩn
(NBRC 13167), Klebsiella pneum oniae (NBRC 14940),
aeruginosa (NBRC 106052) Các chủng vi khuẩn có
nguồn gốc từ ngân hàng vi khuẩn của Trung tâm Tài nguyên Sinh vậí NITE, N hậỉ Bản Vi khuẩn được cấy ỉrên thạch YP [chứa 1% polypeptone (Nihon Pharmaceutical, Nhật Bản), 0,2% yeast extract (Difco, Mỹ), 0,1% M g S 04.7H20 , và 2% agar (Nacalai Tesque, Nhạt Bản)] sau đó được ủ ở 30 ° c tròng 12 giờ Dung địch gốc của mẫu thừ được pha trong dimethyl sulfoxide ở nồng độ 10 mg/mL đối với dịch chiết, hoặc
1 mg/mL đối với hợp chất tinh khiết, sau đó được pha ioãng thành các nồng độ khác nhau khi cho vào khay
96 giếng đâ chứa sẵn các chùng vi khuẩn được U trong moi trường YP Sau khi ủ qua đêm ở 37 °c,
dung dịch 3-(4,5-dimethyiihiazol-2-yl)-2,5- dimethyltetrazolium bromide (Sigma Aldrich, Mỹ) pha trong isopropyl-HCI {0,5 mg/mL) được thêm vào mỗi giếng và ủ tiếp trong 1 giờ Giá trị nống độ ửc chế tối thiểu (MIC) đữợc xac đĩnh bời nồng đọ tháp nhất có tác dụng ức chế sự sinh trưởng cua vi khuẩn kiểm định Kanamycin và ampicillin (Nacalai Tesque, Nhật Bản) được sư dụng !àm chất đối chứng tương ứng với đối VỚI vi khuẩn Gram (-) và Gram (+) [20]
KÉT QUẢ
1 Kết quả nghiên cứu về thực vật
1.1 Nghiên cứu vi phẫu
Tiến hành phơi sấy khô íhân và lá dược liệu, c ắ t
và nhuộm kép vi phẫu thân và lá, quan sát các đặc điểm, mô tả và chụp ảnh tiêu bạn dưới kính hiển vi Đặc điềm vi phẫu thân.A): Mặt cắt hình tròn, từ ngoài vào trong có: Biểu bì (2) là một hàng tế bào xếp đều đặn mang lông che chở đa bào (1) Mô dày (3) có 2-3 IỚỊP tế bào hình đa giác thành dày xếp sát bieú bi Mô mem vò (4) gồm 4-5 lớp tế bào thành mỏng, hình trứng, xếp lộn xộn Libe (5) gồm 6-8 lớp tế bao nhỏ xếp sát nhau thành vòng ìibe sát phía ngoài vòng gỗ, trong iibe có tinh thể canxi oxalat hình cau gai rai rác
Trang 3hay tập trung thành từng đám Tầng phát sinh lìbe-gỗ
(6) gốm 1-3 hàng tế bào nhỏ tạo thành vòng liên tục
Mô gỗ (7) xếp sat nhau tạo thành vòng liên tục, các
mạch go xếp thành dãy Mô mềm ruột (8) là những tể
bào hình tròn hoặc đa giác, thành mỏng, phần trung
tâm có các tế bào với kích thước lớn hơn Tinh thế
canxi oxaiaí hình cầu gai (9) tập trung nhiều ở mô
mềm vỏ, rải rác ở libe và mô mềm ruột Trong mô
mềm ruột còn xuất hiện tinh thề canxi oxalat hình kim
(10) Đ ặc điểm vi phấu lá: Phần gân lá.B1): gân trên
hơi lồi, gân dưới loi nhiều Biểu bĩ (2) trên và dưới là
một hang tế bào hỉnh írứng xếp liên tục đều đặn mang
lông che chở đa bào (1) Long che chở đa bào cấu tạo
bời 2-7 tế bào, các tế bào càng gần đầu íông càng ciài
và nhỏ đần x ế p sát dưới biểu bì là mô dày (3) có 3-4
hàng tế bào, là những tế bào hỉnh tròn hoặc đa giác,
có thành dày ở góc, kích thước không đều Mô mềm
(4) là những tế bào hình đa giác hoặc hơi tròn, thành
mong, kích thước không đèu nhau Phản gân chinh có
một cung libe gỗ, libe ở dưới, gỗ ở trên Libe (5) gồm
các té bào nhỏ, xếp sát nhaụ tạo thành cung lỉbe bao
bó gô cầu tạo bởi các mạch gô tương đối nhỏ, xếp thành hàng Phần phiến lá (.B2): Tế bào biểu bi trên có klch thưởc lớn hơn tế bào biểu bì dưới, đều gồm một hàng tế bào hình trứng hoặc đa giác, xếp đều đặn mang iông che chở đa bào íữơng tự phần gân lá Biểu
bì dưới mang lông tiết (10), lỗ khí (11) Mô giậu (7) nằm dưới lớp biểu bì trên, cau tạo bởi một hàng tế bao hình chữ nhật, xếp sít nhau và thẳng góc với biểu bì írên, chiếm khoảng 1/4 bề dày phiến lá Mô khuyết (8) được cấu tạo bởi những tế bào thành mỏng, kfch thước khổng đều, kéo dai theo chiều ngang đề hở những khuyet nho Tinh thể canxi oxalat (9) hình cầu
gai tập trung nhiều ờ phiến lá, mật độ nhiều ở mô giậu,
rải rác trong mô khuyềt
Hình 1 Vi phẫu thân (hình A) và vi phẫu lá (phần gân lá - Hình B1 và phần phiến iá - Hình B2) cây An điền nón.
1.2 Nghiên cứ u b ộ t thân và iá
Tách riêng phần thân và lá, nghiền thành bột mịn, soi và chụp ảnh dưới kính hiển vi các đặc điểm của bột Bột thân (Hình 2.A) màu nâu, không mùi, không vị Quan sát dưới kính hiển vi nhận thấy: mảnh biểu bi (1), lông che chở đa bào (2), mảnh mô mềm là các tế bào thành mỏng hlrth trứng (3a) hoậc đa giác (3b), mảnh mô mang íinh thể canxi oxalat hình cầu gai (4), bó sợi (5), mảnh mạch xoắn (6), mảnh mạch điểm (7), tinh thể canxi oxalat hình cầu gai (8) có kích thước 0,02-0,03 mm, tinh thể canxi oxalat hình kim (9) có kích thước 0,06-0,07 mm Bột lá (Hlnh 2.B) màu xanh, không mùi, không vị Soi dưới kính hiền vi nhận thầy: mảnh biểu bì mang lông che chở đa bào (1), bó sợi (2), mảnh mạch xoắn (3), lông che chở đa bào (4a) và nhiều đoạn lông đứt gãy (4b), mảnh biểu bì mang lo khí (5), mảnh mô mềm gồm các tế bào gần tròn thành mong (6), tinh thể canxi oxalat hình cầu gai (7) có kích thước 0,02-0,03 mm
Hình 2 M ột số đặc điềm bột thân (hình A) và bột lá (hình B) cây An điền nón.
7 3 4
Trang 4-2 Kết quả nghiên cứu thành phần hóa học
2.1 Chiết xuất và phân lập
Mâu nguyên liệu được rửa sạch, ỉhái nhỏ, phơi, sấy khô ờ 5 0-60 ° c , sau đó xay thành bột ỉhô và bảo quản ở nơi khô ỉhọáng Bột khô (1,4 kg) được ngâm chiết ở nhiệt độ phòng với methanol (MeOH) (5 Ưlần/7 ngày X 3 lần), gộp các dịch chiết, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, nhiệt độ 5 0 -6 0 ° c thu được cao chiết MeOH (38 g) Phân tán cao chiết trong 2 L nước rồi chiếi phân bố lan iượt với chloroform (CHCi3) (2 L X 3 lan) và ethyl acetate (EA) (2 L X 3 lần), cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được các cao chiết tương ứng là HC (13 g), HE (11 g) và phân đoạn nước còn lại HW (14 g)
Cao HC (13 g) được tiến hành chiết pha rắn sử dụng silica ge! pha thường và rửa giải bằng gradient nồng độ của hỗn hợp dung môi n-hexane (He) và acetone (Ac)7 với tỉ ĩệ lẩn lượt là 100:0, 95:5, 90:10, 50 10 1 0 1 0 vả
0:100 jv /v , 1 L mỗi hệ), thu được 6 phân đoạn từ HC1 đến HC6 Phân 'đoạn HC3 (1,9 g) được tiến hành sac kỵ trên cộỉ silica gel pha thường với dung môi khai triển là He-EA (6:1) Theo dõi quá trình rưa gỉải bằng SKLM, gộp
các phân đoạn tương tự, thu được 5 phận đoạn (H C3A-HC3E) Phân đoạn HC3B (210 mg), H C3C (180 mg) va
H C3E (2,1 g) được tiếp tục phân tách bằng các cột pha thưởng, thu được các hợp chất lan lượt là 8 (11,0 mg),
11 (8,0 mg) và 9 (2,6 mg) Phân đoạn HC6 (1,5 g) sau khỉ được triển khai lần lượt qua cột pha thường và pha
đảo thỉ thu được hợp Chat 7 (8,1 mg) và 10 (4,5 mg)
Cao HW (14 g) được phân tán ỉrong lượng nước tối thiểu và đưa lên cột Diaion HP-20, sau đó rửa giải bằng
gradient nồng độ với hệ dung môi MeOH-nươc (0:100, 25:75, 50:50, 75:25, 100:0, v/v, 1 L mỗi hệ), thu được 5
phân đoạn (HW 1-HW 5) Phân đoạn HW3 (2,5 g) được triển khai trên cột pha thường, hệ rửa giải là EA:MeOH cho 6 phân đoạn (HW3A-HW 3F) Phân đoạn HW3B (470 mg) tiếp tục được phân lập trên cột R P-C18, rửa giải
bằng hỗn hợp MeOH-nước (1:2) cho 4 phân đoạn (HW3B1-HW3B4).' Sau khi tinh chế bằng cột Sephadex LH-20
sử dụng dung môi MeOH, từ phân đoạn HW3B1 đã thu được hợp chất 2 (5,0 mg) Phân đoạn HW3B2 và HW3B4 được tiến hành sắc ký trên các cột RP-C18 cho hợp chất sạch theo thư tự là 3 (6,0 mg), 4 (8,0 mg) và 1 (15,0 mg) Sau cùng từ phân đoạn HW3D (350 mg) đã thu được hợp chất 5 (4,5 mg) va 6 (5,0 mg) sau khi triền khai sắc kỷ trên cột RP-C18 với hệ MeOH-nước (1:1)
2.2 Xác định cấu trúc càc họp chất phân lập được
Dựa trên dữ liệu thực nghiệm kết hợp đối chiếu với tồi ỉiệu đã công bố, cấu írúc hóa học của 11 hợp chất tinh
khiết phân lập từ phân đoạn CH CỈ3 và phân đoạn nước của An điền nón được" khẳng định la 10 -0 -
acetylborreriagenin (1), asperuioside (2) [13], paederosỉde (3) [22], asperulosidic acid (4), daphylloside (5) £13], paederosidic acid methyl ester (6) [21], oleanic acid (7) [17], betuiinic acid (8) [15], 3-O-acetyl pomolic acid (9)
[19], rotungenic acid (10) [18] và rotundic acid (11) [14] (hinh 8) Trong đó, kết qua tra cứu íàỉiíẹu gần nhất cho thấy hợp chất 1 là chất mới, lần đầu tiên được biết đến trong tự nhiên.
Hợp chất 1 được tách ra từ phân đoạn nước dưới dạng bột màu không màu Phổ H R-ESI-M S của hợp chất
này cho peak ion giả phân tử tại m /z 279,0830 [M + N a f (tỉnh toán lý thuyết cho công thức C12H16Ó6Na là
279,0845) cho phép thiết lập công thức phân íừ C 12H160 6 Phổ IR chỉ ra các dải hấp thụ mạnh đạc trưng cho
nhóm OH (3356 cm '1), ester (1659 cm '1) và nối đôi (2942, 2835, 1452, 1415 cm '1) Phổ u v (MeOH) cũng g ự ĩý s ự
có mặt của nhóm ester (Xmax 208 nm) trong cấu trúc của chất 1
Phổ 1H NMR chỉ ra các tín hiệu đặc trưng của 1 proton olefin tại ậ ị 5,88 (m) và proton nhóm methyl tại ỏH 2,09
(3H, s) Phân tích phổ 13c NMR và HMQC chỉ ra sự hiện diện của 12 íín hiệu carbon gồm 2 carbon carbonyl (Sc
172,47; 180,96), 2 carbon olefin (ỏc 12 7 ,11; 148,47), 1 carbon methine gắn oxy (<5c 88,23), 3 carbon methylene gắn oxy (Sc 60,65; 62,70; 62,96), 3 carbon methine (Sc 43,95; 46,12; 50,27) và 1 carbon acetyl methyl 20,81) Dựa vào việc phân tích chi tiếì phổ HMQC, HMBC và CO SY, số liệu phổ H và 13c NMR của 1 được gán hoàn toàn và được chỉ ra ờ Bảng 1 Tương tác 1H -1H C O SY giữa H-5 ( 4 3,33) và H-6 (ỏH 5,40), giữa H-6 va H-7 (ỏH
5,88), giữa H-5 và H-9 {4, 3 ,11) và tương tác HMBC íừ H-7 đến C -5 (ỏc 43,95)/C-6 (<5b 88,23)/C-8 (ổc
148,47)/C-9 (ỏc 50,27) đề nghị sự có mặt của hợp phần cyclopentene Hơn nữa, tương tác HMBC từ H-5/H-6 đến C -1 1 (ổc
180,96) và tương tác C O S Y giữa H-4 (ẶJ 2,96) và H-5 chỉ ra vòng cycíopentene ngưng tụ với vòng ỵ-lacíone tại
C -5 và C-6 Mặt khác, tương tác HMBC ỉừ H-1 (4n 3,74; 3,77) đến C-5/C-8/C-9, từ H-3 ( 4 3,83; 3,91) ứển C-4 (ỗc
4 6 ,12)/C-5/C -11, và từ H -10 (4i 4,71,4 ,75) đến C-7/C-8/C-9 xác nhận ba nhóm oxymeỉhyiene lần iượt tại C-9, c~
4, C-8 Sự hiện diện của nhóm acetoxy tại C -10 được thể hiện qua tương tác HMBC từ H -10 đến C -1 2 ĩỏc
172,47) Tiếp đó, hóa lập thể của 1 được làm rõ bằng phổ NOESY C ác tương tác N O ESY quan trọng giữa H-5
vậ H-6, H-5 và H-9 đề nghị những proton này ở cùng phía so với mặi phẳng vòng ((3-face) [21] Đáng chú ý, H-4
có tương tốc N O ESY với H-1 nhưng không tương íác với H-5 chứng tỏ H-4 (Snh hướng a Nhỉn chung, dư kiện
phổ NMR và hóa học lập ìhể cùa 1 tương tự với các giá trị tương ứng của hợp chất borreriagenin [23] ngoại trừ
sự thêm vào của một nhóm acetyi tại C -10 Do vậy, hợp chất 1 được két luận ià 10-0-acetylborreriagenin.
Trang 5Hình 3 Cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ phân đoạn chloroform và phân đoạn nước của phần trên mặt đất cây An điền nón
3 Kết quả nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn
11 hợp chất đã phân iập được đánh giá hoạt tính
kháng khuẩn trên 6 chủng vi khuẩn, kết quả cho thấy
có 4 hợp chất triterpen là 7, 8, 10 và 11 thể hiện hoạt
tính ức chế sự phát triển ờ các mửc độ khác nhau đối
với 3 chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus, Bacillus
subtilis và Mycobacterium smegmatis (Bảng 2Ị Trong
số đó, cả bốn hợp chất đều có hoạt tính đối với V!
khuan s aureus I MIC lần iượt là 10; 20; 2,5 và 10
ụg/mL) Hợp chát 8, 10 và 11 có tác dụng ức chế đối
với B subtiìis (MIC lần lượt là 20; 2,5 và 5 fjg/mL) Đặc
biệt, chỉ cỗ 2 hợp chất là 7 và 10 thể hiện hoạt tính
mạnh đối với vi khuẩn M sm egmatis với giá trị MIC lần
lượt là 2,5 và 1,25 Ịjg/mỉ_
Bảng 1 Dữ kiện phổ 1H (500 MHz)và 13c (125
Vị trí & <5ÌH(muỉt, J in Hz)
3,77 (dd, 11,5; 4,5)
3,91 (dd, 11,0; 4,5)
10 62,70 4,71 (dd, 15,0; 2,0)
4,75 (dd, 15,0; 1,5)
Hình 4 Các tương tác HMBC (hình A), COSY (hình B), và NOESY (hình C) chủ yếu của hợp chất 1
BÀN LUẬN
Dù số lượng rất phong phú, nhưng số ioài trong chi
Hedyotis L được nghiên cứu đặc điểm vi học còn khá hạn chế, có thể kể đển là cây Dạ cẩm (H capitellata Wall ex G Don [1, 5]), c ỏ lưỡi rắn (H corymbosa (Ị.) Lamk.) và Bạch hoa xà thiệt thảo (H diffusa Willd.) [8]
Đ ặc điểm vi học của cây An điền nón có thể được sử dụng để phân biệt với 3 cây trên khi kếí hợp các đặc điểm của cẩu tạo phiến lá gồm tế bào biểu bì trên lớn, mang lông che chở đa bào, mô giậu gồm 1 iớp tế bào
có tinh the canxi oxalat hình cầu gai, cùng đặc điểm bột thân và iá cây với ỉông che chờ đa bào và tỉnh thể canxi oxaỉat hình cầu gai
Thống kê của W H O cho biết, vào năm 2014 thế giới có khoảng 9,6 triệu người mắc bệnh lao do vi
khuẩn Mycobacterium tuberculosis, làm 1,5 triệu bệnh
Bảng 2 Giá trị MIC của các hợp chất có tác dụng
S aureus B subtilis M smeợmatis
thuốc, chiếm 3,6% so ca mới nhiễm và 20,2% số ca đã được điều trị [24, 25] Tụ cầu vàng s aureus cũng là
một trong những ioại vi khuẩn nguy hiểm bờỉ khả năng gây nhiễm khuân dưới nhiều hỉnh thức, tính dễ thích ứng với các điều kiện môi trường khác nhau và độc lực cao của nó Đây là tác nhân hàng đầu írong vấn đề nhiễm khuẩn bệnh viện và có thể gây ra hội chứng sốc nhiễm độc cũng như ngộ độc thực phẩm [24] Các hợp chất đã phân lập từ An điền nón thuộc về hai nhóm chẩt là iridoid (1 -6 ) và triterpene (7—11) Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn cho thấy các hợp chất triterpene 7, 8, 10 và 11 thể hiện khả năng ức che ờ các mức độ khác nhau đổi với các chủng vi khuẩn
7 3 6
Trang 6-kiểm định, c ầ n chú ý rằng, giá trị MIC trong khoảng
100-1000 pg/mL đã được xem là có tác dụng ỉrong
test kháng khuẩn in vitro [9] Theo ổó, hợp chất 10
(rotungenic acid) cho thấy hoạt tính mạnh trên cả 3
chủng S aureus, B subtilis và M smegmatis với giá trị
MIC lần lượt ià 2,5; 2,5 và 1,25 Ịjg/mL Đáng chú ý là
hiện nay chưa thấy công bố nào về hoạt tính kháng
khuẩn của hợp chất này Hợp chất 7 cũng cho tác
dụng ức chế mạnh đối với M sm egm atis (MIC 2,5
ụg/mL) và hoạt tỉnh đáng kể đối với s aureus (MIC 10
Mg/mL) Hợp chất 11 thể hiện tác dụng đáng kể đố! với
S aureus và B subtilis (MIC lần lượt là 10 và 5
ụ g lm l), còn hợp chất 8 thẻ hiện hoạt tính trung binh
írên 2 chủng vi khuẩn này (MIC 20 Mg/mL mỗi chủng)
Các kết qua này rất có y nghĩa khi mà tinh trạng đe
kháng khang sinh đang ngày một ian rộng về cả quy
mô và mức độ trong điều trị nhiễm khuẩn
Tác dụng kháng khuẩn đáng lưu ý của các hợp
chất này cho thấy sự phù hợp với kếí quả sàng íọc
hoạt tính trước đó của cây An điền nón Đỉều này cũng
mở ra triển vọnc) trong các nghiên cứu sâu hơn nhằm
xác định cơ che tác dụng của các hợp chất đã phân
iập, đặc biệt là đối với hợp chất 7 và 10 Đ ồng'thời,
việc nghiên cứu các thành phần khác từ cây An điền
nón và các loài thuộc chi Hedyotis L cần được tiếp tục
trong thời gian iới nhằm tlm kiếm các hợp chất có hoạt
tính kháng sinh phục vụ trong điều trị
KẾT LUẬN
Từ phần trên mặỉ đất của An điền nón (Hedyotis
pilulifera (Pit.) T.N.NỈnh), lần đầu tiên các đặc điểm vị
phâu íhân và !á, cùng đặc điểm bột thân và lá được
công bố Bằng các phương pháp sắc ký kết hợp
phương pháp phổ, đã phân lạp và xác định cấu trúc 11
hợp chất, gồm 01 iridoid mới íà 10-0-
acetylborreriagenỉn (1), cùng 05 iridoid (2 -6 ) và 05
íriterpene (7-11) đã biết Ket quả khảo sát hoại tính
kháng sinh của các hợp chất đã phân lập ( 1 - 1 Ĩ) cho
thấy nhóm triterpene có hoạt tính ức chế với các mức
độ khác nhau, trong đó hợp chất 10 thề hiện hoạt tính
mạnh trên ca 3 chủng s aureus, B subtilis và M
smegmatis Đây cũng ĩà íần đầu tiên các thành phần
iridoỉd và triterpene cũng như hoạt tính kháng khuẩn
của cây An điền nón được công bố
TÀI LIỆU THAM KHẦO
1 Bộ môn Dược liệu (2007), Bài Giảng Dược Liệu, tập
1,2, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội
2 Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương
pháp nghiên cứu hóa học cấy thuốc, NXB Y học, Hồ Chí
Minh
3 Đỗ Văn Hài, Vũ Xuân Phương, Trần Thế Bách và
cộng sự (2013), Bồ sung một loài thuộc chi An điền -
Hedyotis L họ Cà phê (Rubiaceae) ở Việt Nam, Hội nghị
khoa học toàn quốc về sinh thái và tài nguyên sinh vật lần
thứ 5, 68-70.
4 Phạm Hoàng Hộ (2003), Cây cỏ Việt Nam, tập 3,
NXB Trẻ
5 Lại Quang Long (2001), Nghiên cún về thực vật,
thành phần hóa học va m ột số tác dụng sinh học của cây
Dạ cầm (Hedyotis capitellata Wall Ex G Don), Luận án
Tiến sĩ Dược học, Thư viện Đại học Quốc gia Víẹt Nam
6 Trần Ngọc Ninh (2005), Danh lục các loài thực vật
Việt Nam, tập 3, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
7 Thân Nguyễn Viết Thân (2003), Kiểm nghiệm dược liệu bằng phương pháp hiển VI, tậ p 1, N X B K h o a h ọ c k ỹ
thuật, Hà Nội
8 Trần Đinh Nhã Thi, Nguyễn Thị Thu Ngân, Trương
Thị Đẹp (2015), Đặc điểm vi học của chi Hedyotis họ Cà phê (Rubiaceae Juss.), Hội nghị Khoa học Kỹ thuậỉ iần
32, Đại học Y dược Ho Chí Minh
9 Abreu A C-, McBain A J., Simoes M (2012), Plants as sources o f new antimicrobials and resistance-
modifying agents, Natural Product Reports, 29 (9), 1007-
21.
10 Ahmad R., Ali A M., Israf D A., et al (2005),
Antioxidant, radicai-scavenging, anti-inflammatory, cytotoxic and antibacterial activities of meỉhanoiic extracts
of some Hedyotis species, Life Sc/., 76 (17), 1953-64.
11 Bérdy J (2005), Bioacỉíve microbỉai metabolites: A
personal view, J Antibiot., 58,1-26.
12 Gupta R K-, Singh R K„ Swain s R., et al (2012), Antihepatotoxic potential of Hedyotis corymbosa
against D-ga!actosamine hepatopathy in experimental
rodents, Asian Pac J Trop Med., 5,1542-47.
13 Gurbuz F., Demirezer L o , Guvenalp z., e t al
(2006), iridoids, flavonoids and monoterpene glycosides
from Galium verum subsp verum, Turk J Chem., 30, 525-
34
14 He Y F-, Nan M L , Sun J, M „ et al (2012),
Synthesis, characterization and cytotoxicity of new rotundic acid derivatives, Molecules, 1 7,1 278-91.
15 Hess S c , Monache F D (1999), Divergioic acid,
a triỉerpene from Vochysia divergens, J Braz Chem Soc.,
10(2), 104-06
16 Hussain A z., Kumaresan s (2013), Phytochemical and antimicrobial evaluation of
Oldenlandia corymbosa, Asian J Plant Sci Res., 3 (4),
155-58
17 Mahato s B „ Kundu A p (1994), 13c NMR spectra o f pentacylic triterpenoids A compilation and
some salient features, Phytochemistry, 37 (6), 1517-75.
18 Nakatani M., Miyazaki Y., iwashita T., etal (1989), Triterpenes from Ilex rotunda fruits, Phytochemistry, 28
(5), 1479-82
19 Neto c c , Vaisberg A, J., Zhou B N.( e t al
(2000), Cytotoxic triterpene acids from the Peruvian
medicinal plant Polylepis racemosa, Planta Med., 66 (5),
483-84
20 Nisa Khoirun, Ito Takuya, Subehan, et al (2016),
New acylphioroglucinol derivatives from the leaves of
Baeckea frutescens, Phytochemistry Letters, 15, 42-45.
21 Quang D N., Hashimoto T., Tanaka M., e t al
(2002), Iridoid glucosides from roots of Vietnamese
Paederia scandens, Phytochemistry, 60 (5), 505-14.
22 Suzuki S., Hisamichi K „ Endo K (1993), NMR studies and structural assignment of paederoside,
Heterocycles, 35 (2), 895-900.
23 Vieira I J c , Mathias L., Braz-Filho R., et al (1999), Iridoids from Borreria verticillata, Organic Letters,
1 (8), 1169-71
24 World Health Organization (2014), Antimicrobial resistance: global report on surveillance, France.
25 World Health Organization (2015), Global Tuberculosis Report.