Khảo sát thành phần hóa học của cao hexane của rễ cây chùm ruột (phyllanthus acidus) thu hái ở tỉnh bình thuận​

CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY CHÙM RUỘT PHYLLANTHUS ACIDUS .... Các nguồn tài liệu cho thấy cây chùm ruột là một loài cây được phân bố khá phổ biến ở các nước nhiệt đới gi

(PHYLLANTHUS ACIDUS) THU HÁI

Ở TỈNH BÌNH THUẬN

GVHD: Th.S Dương Thúc Huy SVTH: Trần Thị Huệ

MSSV: K38.201.040

L ỜI CẢM ƠN i

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1

1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY CHÙM RUỘT PHYLLANTHUS ACIDUS 1

1.1.1 Tên gọi 1

1.1.2 Phân bố 1

1.1.3 Mô tả thực vật 1

1.1.4 Công dụng của cây chùm ruột trong y học cổ truyền 2

1.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY CHÙM RUỘT PHYLLANTHUS ACIDUS 2

1.3 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY CHÙM RUỘT PHYLLANTHUS ACIDUS 3

1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ CÂY CHÙM RUỘT PHYLLANTHUS ACIDUS TRONG NƯỚC 4

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM 7

2.1 HÓA CHẤT, THIẾT BỊ 7

2.1.1 Hóa chất 7

2.1.2 Thiết bị 7

2.2 LY TRÍCH VÀ CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT 7

2.2.1 Nguyên liệu 7

2.2.2 Điều chế các loại cao 8

2.2.3 Cô lập các hợp chất hữu cơ trong cao hexane 8

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 10

3.1 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC HỢP CHẤT T1A 10

3.2 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC HỢP CHẤT CRT3A 13

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN - ĐỀ XUẤT 15

4.1 KẾT LUẬN 15

4.2 ĐỀ XUẤT 15

PH Ụ LỤC

Bằng tất cả sự trân trọng và biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến với:

 Thầy Dương Thúc Huy – người Thầy đầy tâm huyết và nhiệt tình Thầy không

những chỉ dạy cho em kiến thức chuyên môn cùng với những kinh nghiệm nghiên cứu quý báu mà còn giúp em có niềm say mê nghiên cứu khoa học trong suốt thời gian được Thầy hướng dẫn

 Tất cả quý Thầy Cô khoa Hóa, trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình truyền đạt những kiến thức quý báu trong suốt thời gian em theo học và hoàn thành khóa luận

 Các bạn trong nhóm làm khóa luận K38, cùng các bạn sinh viên khóa K39 trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình cộng tác, giúp

đỡ em trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận này

 Và cuối cùng con xin cảm ơn gia đình – chỗ dựa vững chắc về tinh thần trong

suốt thời gian con theo học và thực hiện đề tài ở trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh

-i-

Việt Nam là quốc gia nằm trong khu vực có khí hậu nhiệt đới gió mùa, được thiên nhiên ưu đãi cho các loài thực vật rất đa dạng Từ xưa, người Việt Nam đã biết tận dụng nguồn tài nguyên này vào việc làm thuốc chữa bệnh (gọi là thảo dược) Nhưng có thể do ngẫu nhiên hoặc phải mất rất nhiều thời gian thì người ta mới nhận

biết được một loại cây có thể dùng làm thuốc Ngày nay với sự phát triển nhanh chóng của khoa học kĩ thuật, ngành tổng hợp hóa dược rất phát triển Tuy vậy, không

phải hợp chất nào cũng dễ dàng được tổng hợp Để đáp ứng yêu cầu đó, đồng thời cũng tận dụng những ưu đãi của thiên nhiên, ngành hóa học các hợp chất thiên nhiên

đã ra đời và phát triển rất mạnh mẽ Rất nhiều các hợp chất tự nhiên được phân lập từ cây cỏ đã được ứng dụng rộng rãi để sản xuất các loại thuốc chữa bệnh bảo vệ sức khỏe con người Hơn nữa, việc sử dụng thuốc Nam hầu như không gây tác dụng phụ

và phù hợp với sức khỏe con người

Các nguồn tài liệu cho thấy cây chùm ruột là một loài cây được phân bố khá phổ biến ở các nước nhiệt đới gió mùa như Thái Lan, Việt Nam, Ấn Độ, Malaysia,…Các hợp chất được phân lập từ lá và vỏ thân cây chùm ruột đều có hoạt tính sinh học rất cao như chống lại những tổn thương ở gan, làm giảm huyết áp, có tính chất kháng viêm, giảm đau, chống oxi hóa Tuy nhiên cho đến nay, rễ cây chùm

ruột vẫn chưa được nghiên cứu kĩ và sâu rộng Từ những điều trên, chúng tôi thấy

cần thiết phải nghiên cứu và khảo sát tiếp tục thành phần hóa học của rễ cây chùm ruột Phyllanthus acidus ở Việt Nam để tìm ra những hợp chất mới có hoạt tính mới

và tương tự như lá và vỏ thân cây chùm ruột Xuất phát từ những ứng dụng y học quý giá và kế thừa những nghiên cứu đã có nên chúng tôi quyết định chọn nghiên

cứu đề tài: “Khảo sát thành phần hóa học của cao hexane của rễ cây chùm ruột

H-13C qua 2, 3 nối

H-13C qua 1 nối 1

 HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Cây chùm ruột .1

Hình 1.2 Một số hợp chất cô lập từ cây Phyllanthus acidus 5,6

Hình 3.1 C ấu dạng và tương quan HMBC của hợp chất T1A 11 Hình 3.2 C ấu dạng của hợp chất CRT3A 13 Hình 4.1 Hai hợp chất cô lập được từ cao hexane của rễ cây chùm ruột 15

12 Bảng 3.2 Dữ liệu phổ 1

H-NMR, 13C-NMR của chất CRT3A (CDCl3) và 13

C-NMR (CDCl3) của hợp chất 𝛼𝛼 – lupene[10,20]

14

-v-

CHƯƠNG 1

1.1.1 Tên g ọi

Tên thông thường: cây chùm ruột

Tên gọi khác: cây tầm ruột hay cây tầm giuộc

Thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae)

Tên khoa học: Phyllanthus acidus

Hình 1.1 Cây chùm ruột

1.1.2 Phân bố

Cây chùm ruột có nguồn gốc từ Madagasca, sau đó di nhập vào nhiều nước vùng châu

Á, châu Phi

Phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới

Ở Việt Nam, cây chùm ruột được trồng phổ biến ở miền Nam

1.1.3 Mô tả thực vật

Theo Phạm Hoàng Hộ, Đỗ Tất Lợi, Đỗ Huy Bích và cộng sự, cây chùm ruột là loại cây

nhỏ, cao 3–5 m, thân nhẵn, cành có vỏ màu xám nhạt, cành non màu lục nhạt, nhẵn; cành già màu xám có nhiều vết sẹo do lá rụng để lại Lá chùm ruột thuộc loại lá kép, mọc so le,

cuống dài, lá chét mỏng, mềm, dài 4–5 cm, rộng 18–20 mm Gốc lá bầu, tròn, phần đầu phiến lá nhọn, mặt dưới màu xám nhạt, gân lá rõ ở cả hai mặt Cụm hoa mọc ở kẽ những lá

đã rụng thành xim, dài 6–15 cm, cuống mảnh có cạnh; hoa nhỏ màu đỏ, hoa cái và hoa đực

ở cùng một cây; hoa đực có đài 4 răng, 4 nhị, rời; hoa cái có 4 lá đài, bầu 4 ô và hoa mọc thành cụm từ 4–7 hoa ở mỗi mấu tròn Quả chùm ruột mọng, có khía, 4 mảnh, đường kính khoảng 5 mm và cuống quả dài khoảng 7 mm Khi quả chín có màu vàng nhạt, vị chua, hơi

ngọt và ăn được.[21 -23]

1.1.4 Công d ụng của cây chùm ruột trong y học cổ truyền

Theo Đỗ Tất Lợi, Đỗ Huy Bích và cộng sự, trong y học cổ truyền các nước, những bộ phận khác nhau của cây chùm ruột được dùng làm thuốc chữa các bệnh ngoài da, như lá được dùng nấu nước tắm chữa lở ngứa và mề đay Vỏ thân cây chùm ruột được dùng để tiêu hạch độc, ung nhọt, tiêu đờm trừ tích ở phổi, dùng bôi ngoài, chữa ghẻ, loét, vết thương sứt da chảy máu; ngậm chữa đau răng và đau họng Bột vỏ thân ngâm giấm, uống chữa bệnh trĩ Rễ và vỏ cây chùm ruột có độc, người Malaysia dùng đun sôi, xông hít chữa

ho và nhức đầu; hay được người dân đảo Giava dùng chữa hen suyễn (dùng lượng rất nhỏ)

Vỏ rễ sắc đặc hoặc ngâm rượu, bôi chữa vảy nến (psoriasis) Tuy nhiên, không được dùng

sớm và chỉ công bố sự cô lập của các triterpene và phytosterol (Dekker, 1908; Ultee, 1933; Sengupta và Mukhopadhyay, 1966; Pettit và cộng sự, 1982).[2,18,16,14]

Các hợp chất

triterpene đã được cô lập thuộc khung oleane như β-amyrin (22), khung lupane như lupeol (23) và khung cyclopropyl- hexacyclic triterpenoid như phyllanthol (24) Trong khi đó, các

hợp chất sterol chủ yếu có khung sitosterol và các glycoside của chúng

Những nghiên cứu trong khoảng 15 năm gần đây trên cây chùm ruột Phyllanthus acidus

đã công bố sự cô lập của một nhóm các hợp chất norbisabolane sesquiterpenoid, với hoạt tính sinh học của chúng khá đa dạng (Lv J.-J và cộng sự, 2014; Vongvanich và cộng sự, 2000).[8,19]Năm 2000, hai hợp chất phyllanthusol A (2) và B (3) đã được cô lập, có khung

sườn serquiterpenoid loại norbisabolane gắn các phân tử đường glucosyl và N-acetate (Vongvanich và cộng sự, 2000).[19]Tuy nhiên, đến năm 2014, cùng với sự cô lập

mannosamine-19 hợp chất cũng thuộc khung sườn norbisabolane, các hợp chất phyllanthusol A và B được xác nhận cấu trúc, trong đó hai đơn vị đường là glucopyranosyl và glucosamine-N-acetate Như vậy, cho đến nay, 21 hợp chất norbisabolane đã được cô lập, với tên gọi tương

ứng là phyllanthacidoid A-T (1-21) Trong đó, hai hợp chất phyllantacidoid S (20) và T (21) chứa khung sườn rất lạ so với các hợp chất được cô lập trước đây, với hợp phần tricyclo[3.1.1.1] có trong cấu trúc của chúng Ngoài ra, các hợp chất phyllanthacidoid cũng được xác định là thành phần chính có trong rễ cây chùm ruột, với hàm lượng khoảng 1 mg/g, tính trên khối lượng rễ chưa khô (Vongvanich và cộng sự, 2000).[19]

RUỘT PHYLLANTHUS ACIDUS

Những nghiên cứu về hoạt tính sinh học trên cao chiết các bộ phận của cây chùm ruột

2006),[11] kháng nấm (Satish và cộng sự, 2009),[15] kháng ký sinh trùng giun đũa trên thực

Ngoài ra, các hợp chất thuộc khung sườn norbisabolane đã được thử nghiệm độc tính tế bào và hoạt tính kháng virus viêm gan siêu vi B (HBV), với giá trị IC50 trong khoảng 0.8-36.0 µM (Lv và cộng sự, 2014; Vongvanich và cộng sự, 2000).[8,19] Các hợp chất được cô lập từ cao n-butanol của lá cây chùm ruột Phyllanthus

cộng sự, 2010).[7]

1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ CÂY CHÙM RUỘT PHYLLANTHUS

Năm 2014, Nguyễn Thái Thế đã cô lập được các hợp chất phenylbutanoid và diphenylheptanoid, trong đó có một hợp chất diphenylpentanoid mới (Nguyen T T và

cộng sự, 2014).[13] Cho đến nay, các hợp chất có khung sườn phenylbutanoid và

phenylheptanoid chưa được công bố trong chi Phyllanthus Các hợp chất cô lập gồm

glochodinone (25), 4-[4’-(O-β-D-glucopyranosyl)phenyl-2-butanone (26),

1-[4’-(O-β-D-glucopyranosyl)phenyl]-5-[4”-(O-β-D-glucopyranosyl)phenyl]-3-pentanone (27)

Năm 2015, trong tóm tắt kết quả nghiên cứu đề tài luận văn Thạc sĩ của Võ Thị Như

Thảo, với đề tài : “Nghiên cứu tách chiết và xác định thành phần hóa học của vỏ thân cây chùm ruột Tam Kỳ, tỉnh Quảng Nam trong một số dịch chiết”, tác giả công bố đã thu được một số kết quả như: xác định độ ẩm của nguyên liệu bột khô là 8.87%; hàm lượng tro trung

bình là 5.00%; định tính được dịch chiết n-hexane có 15 cấu tử hữu cơ thuộc các nhóm hợp

chất acid hữu cơ, ester, vitamin, sterol; dịch chiết chloroform có 9 cấu tử hữu cơ thuộc nhóm sterol, acid hữu cơ, ester của acid béo; dịch chiết etyl acetat có 14 cấu tử hữu cơ thuộc nhóm acid béo, sterol, sesquiterpen Ngoài ra, tóm tắt luận án cũng công bố thông tin về thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của bột vỏ cây chùm ruột trên hai dòng chủng vi khuẩn là Bacillus subtilis và Klebsiella Tuy nhiên, công bố của tác giả không cho thấy bất

kỳ sự xác định cấu trúc của hợp chất nào cô lập được từ vỏ thân cây chùm ruột ở Tam Kỳ, tỉnh Quảng Nam và cho đến nay, các kết quả này vẫn chưa được tìm thấy trong các báo cáo khoa học tại Việt Nam

O O O O

O HO

O HO

O HO

O HO

O

O O O HO

HO

HO

OH Glc N-Ac-GlcN

O

O O O

O

OHOH

H OH

HO HO

OR 1

HO

O O

O

H OH

H OH

HO HO

OR 1

HO

O O

R 2

R 1 R 2

12.N-Ac-GlcN H 13.N-Ac-GlcN OH 14.Glc OH

O

OR

HO HO HO

OHOH

OH HO

O HO

O

OHOH

H HO

HO

OR

HO

O O HO

Hình 1.2 Một số hợp chất cô lập từ cây Phyllanthus acidus

O

1 2 3

4 5 6

7 8 9 10

11

12 13 14

15 16

17 18 19

20

21 22

23 24

25 26

27

28

29 30

O HO

HO

OH

O OH

2 3 4

1' 2' 3' 4' 5' 6'

1''

2'' 3''

4'' 5'' 6''

26

O

1' 2' 3' 4' 6'

6""

O

OH OH HO

31

OH HO

Hình 1.2 Một số hợp chất cô lập từ cây Phyllanthus acidus (tiếp)

CHƯƠNG 2

THỰC NGHIỆM

2.1.1 Hoá ch ất

 Silica gel: silica gel 60, 0.04-0.06 mm, Merck dùng cho cột sắc kí

 Sắc kí bản mỏng loại 25DC - Aflufolein 20×20, Kiesel gel 60F

phổ HMBC và phổ HSQC ghi trên máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker

 Tất cả phổ NMR được ghi tại phòng Phân tích Trung tâm trường Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh, số 227, Nguyễn Văn Cừ, Quận 5, thành

2.2.2 Điều chế các loại cao

Sau khi xử lý mẫu nguyên liệu thu được 20.0 kg nguyên liệu dạng bột Nguyên liệu bột được đun hồi lưu trong ethanol ở 80oC trong 30 phút đối với mỗi bình cầu dung tích 1000

ml Tiến hành lọc bỏ phần bã rắn, cô quay phần dịch dưới áp suất thấp thu được cao ethanol thô (1.0 kg) Một nửa cao ethanol thô tiếp tục được hòa tan bằng methanol nóng thu được phần dịch methanol (300.0 g) Tiến hành sắc ký cột pha thuận nhiều lần bằng hệ

dung môi n-hexane: ethyl acetate : methanol với độ phân cực tăng dần thu được các phân

2.2.3 Cô lập các hợp chất hữu cơ trong cao hexane

Trên phân đoạn H1 (2.0 g) thực hiện sắc kí cột (SKC) silica gel và giải ly bằng hệ dung

môi n-hexane: ethyl acetate (9:1) thu được 4 phân đoạn H1.1 (125.0 mg), H1.2 (250.0 mg), H1.3 (152.0 mg) và H1.4 (150.0 mg) Từ phân đoạn H1.2 tiếp tục SKC silica gel và giải ly

bằng hệ dung môi n-hexane: methanol (100:0.2) thu được 3 phân đoạn H1.2.1 (60.0 mg),

H1.2.2 (55.0 mg) và H1.2.3 (75.0 mg) Trên phân đoạn H1.2.1 thực hiện SKC và giải ly bằng hệ dung môi n-hexane: methanol (100:0.2) thu được hợp chất T1A (Sơ đồ 2.1)

Trên phân đoạn H1.2.3 thực hiện SKC silica gel và giải ly bằng hệ dung môi n-hexane:

Hòa tan một nửa cao tổng bằng methanol nóng

Sắc kí cột Giải li bằng các dung môi khác nhau

CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ - THẢO LUẬN

3.1 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC HỢP CHẤT T1A

Hợp chất T1A cô lập được từ phân đoạn H1.2.1 Hợp chất T1A là chất bột màu trắng,

tan trong dung môi chloroform

 Biện luận cấu trúc T1A

Phổ 1H-NMR của hợp chất T1A cho thấy sự hiện diện của bảy nhóm methyl đặc trưng cho hợp chất triterpene khung sườn ursane tại 𝛿𝛿R H 0.96 (3H, s), 𝛿𝛿R H 0.77 (3H, s), 𝛿𝛿R H 0.86

(3H, s), 𝛿𝛿R H 1.14 (3H, s), 𝛿𝛿R H 0.90 (3H, s), 𝛿𝛿R H 0.94 (3H, d, J = 6.0 Hz) và 𝛿𝛿R H 0.87 (3H, d, J =

6.0 Hz) lần lượt là H3-23, H3-24, H3-25, H3-26, H3-28, H 3-29 và H3-30 Ngoài ra, trong

phổ 1

H-NMR còn xuất hiện tín hiệu proton của nhóm methine liên kết với oxygen (H-3) tại

nhóm methylene ở vùng từ trường rất cao ghép cặp với nhau (H2-27) tại 𝛿𝛿R H 0.01 (1H, d, J

= 5.5 Hz) và 𝛿𝛿R H 0.66 (1H, d, J = 5.5 Hz)

Phổ 13

C-NMR cho thấy hợp chất T1A có ba mươi tín hiệu carbon của khung sườn

ursane, trong đó có bảy tín hiệu của nhóm methyl tại 𝛿𝛿R C 15.3, 16.0, 18.0, 18.1, 20.7, 27.3

và 28.2; ba tín hiệu của nhóm methine tại 𝛿𝛿R C 50.1, 54.0 và 55.7 lần lượt là 9, 18 và 5; một nhóm methine của C-3 liên kết với oxygen tại 𝛿𝛿R C 79.1; một nhóm methylene của C-

C-27 tại 𝛿𝛿R C 13.3 và các tín hiệu của carbon khác

Phổ 1

H-NMR cho thấy tín hiệu của proton H-3 tại 𝛿𝛿R H 3.19 có dạng mũi dd với hằng số

ghép lần lượt là J1 = 11.0 Hz và J2 = 5.0 Hz chứng tỏ proton này phải ghép cặp với hai proton (H-2𝛼𝛼 và H-2𝛽𝛽) lần lượt với Jaa = 11.0 Hz và Jae = 5.0 Hz, do đó proton H-3 phải ở

vị trí trục hay nhóm –OH ở vị trí xích đạo

Phổ HMBC cho thấy proton H3-23 (𝛿𝛿R H 0.96, s) và proton H3-24 (𝛿𝛿R H 0.77, s) cùng

tương quan với những carbon C-3 (𝛿𝛿R C 79.1), C-4 (𝛿𝛿R C 38.8) và C-5 (𝛿𝛿R C 55.7) từ đó giúp xác định vị trí của nhóm –OH gắn với C-3 Ngoài ra, phổ HMBC còn cho thấy proton H3-25 (𝛿𝛿R H 0.86, s) tương quan với C-5 (𝛿𝛿R C 55.7), C-9 (𝛿𝛿R C 50.1) và C-10 (𝛿𝛿R C 37.3); proton H3-26 (𝛿𝛿R H 1.14, s) tương quan với C-8 (𝛿𝛿R C 37.0), C-9 (𝛿𝛿R C 50.1) và C-14 (𝛿𝛿R C 32.2); proton H-28 (𝛿𝛿R H 0.90, s) tương quan với C-16 (𝛿𝛿R C 27.9), C-17 (𝛿𝛿R C 31.1), C-18 (𝛿𝛿R C 54.0) và C-22 (𝛿𝛿R C42.0); proton H-29 (𝛿𝛿R H 0.94, d, J = 6 Hz) tương quan với C-18 (𝛿𝛿R C 54.0) Từ đó giúp xác định vị trí của các nhóm methyl

Trên 1H-NMR xuất hiện hai tín hiệu proton của nhóm methylene không tương đương H2-27, mũi d với hằng số ghép J = 5.5 Hz tại 𝛿𝛿R H 0.01 và 0.66 Chứng tỏ nhóm methylene này phải liên kết với carbon tứ cấp Trên phổ HSQC cho thấy hai proton này cùng gắn trên

một carbon C-27 tại 𝛿𝛿R C 13.3 Trên phổ HMBC, hai proton này cùng tương quan với những carbon kế cận tương tự nhau C-12 (𝛿𝛿R C 35.2), C-13 (𝛿𝛿R C 26.6), C-14 (𝛿𝛿R C 32.2), C-15 (𝛿𝛿R C21.3) và C-18 (𝛿𝛿R C 54.0) giúp khẳng định vị trí của nhóm methylene này

Từ những dữ liệu phổ và tài liệu tham khảo,[12]

suy ra hợp chất T1A là phyllanthol

9 10

11

12 13

14

15 1617 18 19

20 21 22

23

24

29 30

28

27