Khảo sát thành phần hóa học cao ethyl acetate lá cây me rừng phyllanthus emblica

Thế nhưng bệnh tật không vì thế mà giảm đi, tỷ lệ mắc bệnh tăng lên từng ngày xuất phát từ nhiều nguyên nhân do ô nhiễm môi trường, do hóa chất trong thực phẩm, hay cũng có thể do di tru

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

L ỜI MỞ ĐẦU

Ngày nay cùng với sự phát triển kinh tế xã hội, chất lượng cuộc sống ngày càng cao, con người càng quan tâm hơn đến việc chăm sóc sức khoẻ Thế nhưng bệnh tật không vì thế mà giảm đi, tỷ lệ mắc bệnh tăng lên từng ngày xuất phát từ nhiều nguyên nhân do ô nhiễm môi trường, do hóa chất trong thực phẩm, hay cũng có thể do di truyền

và nhiều nguyên nhân khác…

Trước tình trạng đó, nhiều quốc gia trên thế giới đã tiến hành tìm kiếm các loại thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên với hi vọng những tìm ra những hợp chất mới có thể trị bệnh một cách an toàn, thân thiện với sức khỏe con người

Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới nên được thừa hưởng nguồn thiên nhiên vô cùng phong phú với nhiều loài dược liệu quí Các hợp chất thiên nhiên thể hiện hoạt tính sinh học rất đa dạng nên là một trong những định hướng để nghiên cứu, chiết xuất và tìm ra các loại thuốc mới bằng con đường tổng hợp

Nhằm đóng góp một phần hiểu biết thêm về thành phần hóa học của cây thuốc dân gian, chúng tôi thực hiện đề tài “Khảo sát thành phần hóa học cao ethyl acetate lá cây me rừng”

Me rừng là một loài cây mà hầu hết các bộ phận rễ, thân, lá, hoa, quả, hạt đều có thể dùng làm thuốc trị bệnh Rễ me rừng trị viêm ruột, đau bụng đi ngoài, cao huyết áp, hạt được sử dụng để trị hen hay viêm khí quản, lá dùng làm thuốc trị phù thũng, viêm da mẩn ngứa, eczema hay dùng nấu nước tắm rửa phòng trị bệnh ngoài da, quả me cũng được chế thành thuốc long đờm, hạ nhiệt, lợi niệu, trị tiêu chảy, chống bệnh thiếu vitaminC… Hi vọng với đề tài này có thể đóng góp một phần nhỏ những chứng cứ khoa học có giá trị vào kho dược liệu của Y học dân tộc Việt Nam

Chương I

1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT

Me rừng còn gọi là chùm ruột núi hay du cam tử, ngưu cam tử, dư cam tử

Tên khoa học: Phyllanthus emblica Linn

Thuộc họ thầu dầu Euphorbiaceae [1]

Cây me rừng phân bố chủ yếu ở những khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới của Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia và Malaysia Ở nước ta, cây me rừng mọc phổ biến trên các đồi trọc, các bãi hoang, trong các rừng thưa [1]

Me rừng là cây ưa ánh sáng, chịu được khô hạn, cây nhỡ cao 3m, phân nhiều cành nhỏ mềm, có lông, dài 20cm Hoa nhỏ, cụm hoa thành xim co mọc ở nách lá phía dước của cành, gồm rất nhiều hoa đực và vài hoa cái Hoa mọc từ tháng 3 đến tháng 11 Lá xếp thành hai dãy trên các cành nhỏ trông giống một lá kép lông chim, cuống lá rất ngắn Lá kèm rất nhỏ hình ba cạnh Quả hình cầu trước mọng, sau khô thành quả nang, hạt hình ba cạnh, màu hồng nhạt[1]

1.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC TÍNH

1.2.1 Dược tính theo y học cổ truyền

Ở Việt Nam:

Quả có vị chua, ngọt, đắng, tính mát, có tác dụng nhuận phế, hóa đờm, sinh tân, chữa cảm, phát sốt ho, đau cổ họng [1]

Rễ có tác dụng trị viêm ruột, đau bụng đi ngoài, cao huyết áp: ngày dùng 15-20g

rễ sắc uống [1]

Lá có tác dụng trị lở loét, mẩn ngứa [1]

Ở Ấn Độ:

Cây me rừng là một trong những loài thảo dược được sử dụng phổ biến ở Ấn Độ

và được coi như một nguồn cung cấp vitamin C Quả tươi là một vị thuốc mát, lợi tiểu, nhuận tràng , quả khô dùng chữa lỵ, ỉa chảy

Cây có tác dụng hạ men gan, tăng hấp thụ thức ăn, cân bằng lượng acid trong dạ dày, tăng cường phổi và hệ miễn dịch, kích thích nhuận tràng, hỗ trợ hệ tiết niệu, tốt cho

da, mắt và tóc.[3]

1.2.2 M ột số nghiên cứu về dược tính

+ Hoạt tính kháng herpes simplex virus (HSV) loại 1 và loại 2

Năm 2011, Yangfei Xiang và các cộng sự [16] đã thử nghiệm khả năng kháng viêm nhiễm HSV-1 và HSV-2 của hợp chất 1,2,4,6-tetra-O-galloyl-β-D-glucose

(1246TGG) (62) được cô lập từ cây me rừng Kết quả cho thấy 1246TGG ở nồng độ 31,70 µM có khả năng ức chế sự phát triển của virus Herpes và có thể được dùng trong điều trị HSV

+ Tác d ụng gây độc tế bào ung thư

Năm 2011, Xiaoli Liu cùng với các cộng sự [15] đã tiến hành nghiên cứu khả năng điều hòa miễn dịch và gây độc tế bào ung thư của một số hợp chất phenol được cô lập từ quả me rừng Kết quả cho thấy hai hợp chất isocorilagin (49) và geraniin (50) có khả năng gây độc tế bào ung thư vú (MCF-7) ở người với IC50 lần lượt là 13,2 và 80,9 µg/ml

Ngoài ra, isocorilagin (49) còn có tác dụng gây độc tế bào ung thư phổi (HELF) ở người

với IC50 51,4 µg/ml

+ Tác dụng phục hồi tổn thương tinh hoàn do tác dụng phụ của thuốc động kinh

tác dụng phụ ảnh hưởng đến khả năng sinh sản của nam giới Theo nghiên cứu vào năm

2015 của Sitthichai Iamsaard và các cộng sự [9], dịch chiết từ cành me rừng có tác dụng cải thiện nồng độ tinh dịch của chuột đực đã được tiêm valproic acid

+ Hoạt tính kháng khuẩn, kháng oxi hóa

Theo các nghiên cứu vào năm 2007 của Xiaoli Liu cùng các cộng sự [14] và nghiên cứu vào năm 2010 của Wei Luo cùng các cộng sự [11], một số hợp chất phenol

như 3-O-galloyl mucic acid 1,4-lactone (29), kaempferol 3-β-D-glucopyranoside (46), kaempferol (47), quercetin (48), isocorilagin (49), geraniin (50) isomallotusinin (59), chebulagic acid (60), chebulanin (61) được cô lập chủ yếu từ vỏ và quả me rừng có các

tác dụng kháng khuẩn, kháng oxi hóa hiệu quả

+ Tác dụng phục hồi chức năng gan và hạ men gan

Theo nghiên cứu do Sharma Bhawna và các cộng sự thực hiện vào năm 2010 [8], dịch chiết ethanol của cây me rừng có tác dụng hạ men gan, phục hồi chức năng của tế bào gan với liều lượng 75mg/kg/ngày khi thử nghiệm trên chuột

1.3 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HOÁ HỌC

Các nghiên cứu từ năm 1998 trở về trước cho thấy trong cây me rừng có các hợp chất: zeatin (1), zeatin nucleotide (2), zeatin riboside (3), chebulic acid (4), chebulinic

acid (5), corilagin (6), 3,6-di-O-galloyl glucose (7), gallic acid (8), ethyl gallate (9),

gluco-gallin (10), ellagic acid (11), gibberellin (A1, A3, A4, A7, A9) (12-16), leucodelphinidin (17), rutin (18), β-sitosterol (19) [4]

NH

N N

(1)

NH N N N N

O OHOH

(2)

O P

O HO OH OH

OH

N H N N

O OH

HO OH

(3)

(4)

OR O

OR

O

O O HO

O HOOC

OH OH

R=Galloyl (5)

RO

R=Galloyl (6)

(8) R=H (9) R=C 2 H 5

O OR OH

OH

HO HO

R=Galloyl (10)

OH O

(12) R 1 =R 2 =OH (14) R 1 =H, R 2 =OH (16) R 1 =R 2 =H

H

R O

OH O

(13) R=OH (15) R=H

OH

R=Rha-glu (18)

Từ 1999-2001, Ying-Jun Zhang và các cộng sự đã nghiên cứu thành phần từ các

bộ phận khác nhau của cây me rừng Kết quả cho thấy nhóm tác giả đã cô lập và nhận

danh các hợp chất sau: phyllaemblic acid (20), các phyllaemblicin A-C (21-23), sáu hợp

chất phenolic mới là 2-O-galloyl L-malic acid(24), 2-O-galloyl mucic acid (25) và ba dẫn

xuất methyl ester (26-28), 2-O-galloyl mucic acid 1,4-lactone (29) cùng dẫn xuất methyl

ester (30), 5-O-galloyl mucic acid 1,4-lactone (31) cùng dẫn xuất methyl ester (32),

3-O-phyllaemblic acid B (35) và 3-O-phyllaemblic C (36), 3-O-phyllaemblicin D (37), cùng với hai

hợp chất mới, 2-carboxylmethylphenol 1-O-β-D-glucopyranoside (38) và

2,6-dimethoxy-4-(2-hydroxyethyl)phenol 1-O- β-D-glucopyranoside (39), các phyllanemblinin A-F

(40-45) [10, 17, 18, 20, 21]

O O O

O

HO

OH

O O O OH

OH

HO HO

(21)

O O O O

O

HO

OH

O O O OH

H OH

H H OH

R=Galloyl

(24)

R=Galloyl (25) R 1 =R 2 =H (26) R 1 =R 2 =CH 3 (27) R 1 =H, R 2 =CH 3 (28) R 1 =CH 3, R 2 =H

H

RO H

R1O O

R=Galloyl (31) R 1 =H (32) R 1 =CH 3

O O O O

O

HO

OH

O O O OH

O

HO HO O HO

HO

O

HO

O OH

OH HO

(23)

O O

OR HO

R=Glu (39)

R=Galloyl (41)

OG

OH HO

HO

OH

O O

O

HOOC HO

(51) cũng đã được cô lập cùng với các hợp chất đã biết: daucosterol (52), stearic acid

(53), lauric acid (54), cinnamic acid (55) [2]

O

O HO

OH

O OH HO

OH

(47) R=H (48) R=OH

R OH

R=Galloyl (49)

HO HO

O O HO

HO HO

O OR O

HO O OH

O O

O

OH

OH O

O

O

OH O O

HO HO

HO OH

(55)

(53) R=n-C 17 H 35 (54) R=n-C 11 H 23

Năm 2008, S K EL-DESOUKY và cộng sự đã cô lập được hợp chất mới là

acylated apigenin glucoside (apigenin-7-O-(6”-butyryl- β-glucopyranoside)) (56) và các

hợp chất khác như 1,2,3,4,6-penta-O-galloyglucose (57) Xiaoli Liu và các cộng sự đã cô

lập thêm quercetin-3-O-β-D-glucopyranoside (58) [7, 13]

OH

O OH

O O

OR

RO RO

OH

HO

O O HO

OH HO OH

(58)

Từ vỏ quả me rừng, năm 2011, Wei Lou và các cộng sự đã cô lập được

isomallotusinin (59), chebulagic acid (60), chebulanin (61) [10]

Hợp chất 1,2,4,6-tetra-O- galloyl-β-D-glucose (62) đã được cô lập từ lá và cành của

cây me rừng bởi Yangfei Xiang và các cộng sự vào năm 2011 [16]

O

OH

OH HO

HO

R=Galloyl

(59)

OH HO

HO

OH

O O

O HOOC

OH OH

R=Galloyl

R=Galloyl (61)

OH O

OR

O

O O HO

O HOOC

OH OH HO

O

OR

OR HO

Năm 2012, Wei-Yan Qi và cộng sự đã cô lập được β-sitosterol (19), daucosterol

(52), cùng 12 hợp chất sterol khác (63-74), trong đó có 2 hợp chất sterol mới là

5α,6β,7α-trihydroxysitosterol (64) và 7α-acetoxysitosterol (65) từ cành và lá của cây me rừng [12]

R OH

OH

HO

(63) R=H (64) R=OH

H

R2HO

(65) R 1 =H, R 2 =CH 3 COO (66) R 1 =H, R 2 =OH (67) R 1 =CH 3 CH 2 O, R 2 =H (68) R 1 =R 2 =O

Chú thích:

HO

OH

OH O

H O

neoche

O

Ac=Acetyl

O OH

O

Rha-Glu=α-L-rhamnopyranosyl (1→6) -O-β-D-glucopyranosyl

 Đèn soi UV: bước sóng 254 nm

 Cân điện tử Sartorius Mass 620g

2.1.3 Phương pháp tiến hành

2.1.3.1 Phương pháp phân lập các hợp chất

Sắc kí cột silica gel pha thường và sắc kí lớp mỏng

Hiện hình sắc ký lớp mỏng bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 20%

2.1.3.2 Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1

H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz) và NMR được ghi trên máy Bruker Avance tại Phòng thí nghiêm phân tích trung tâm, Đại học Khoa Học Tự Nhiên, 227 Nguyễn Văn Cừ, Q5, Tp.HCM

2D-2.2 NGUYÊN LI ỆU

2.2.1 Thu hái nguyên li ệu

Mẫu được dùng trong nghiên cứu khoá luận là lá cây me rừng được thu hái tại Bình Thuận vào tháng 5/2014

Mẫu cây đã được TS Phạm Văn Ngọt nhận danh tên khoa học là Phyllanthus

emblica Linn, họ thầu dầu ( Euphorbiaceae)

2.2.2 X ử lý mẫu nguyên liệu

Mẫu nguyên liệu được rửa sạch, loại bỏ phần sâu bệnh, phơi khô trong bóng râm, rồi xay thành bột mịn Sau đó tiến hành ngâm chiết và phân lập các hợp chất

2.3 ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO

Lá me rừng được phơi khô, chặt nhỏ và nghiền thành bột mịn, sấy khô đến khối lượng không đổi (m =7,2 kg) Nguyên liệu bột mịn được tận trích với ethanol 960 bằng phương pháp ngâm dầm, lọc và cô quay loại dung môi dưới áp suất thấp thu được cao ethanol thô (285,5 g)

Cao ethanol thô được chiết lỏng – lỏng lần lượt với hexane, ethyl acetate thu được cao hexane (22,1 g), cao ethyl acetate (143,1 g) và phần cao còn lại (77,1 g) Quá trình thực hiện được tóm tắt theo sơ đồ 2.1

đoạn (EA1-EA5) Quá trình thực hiện được trình bày trong bảng 2.1

Sơ đồ 2.1 Qui trình điều chế các loại cao

B ột lá me rừng ( 7,2 Kg)

- Ngâm trong ethanol 96o

- Lọc

- Cô quay thu hồi dung môi

Ethanol thu hồi Cao ethanol

(285,5 g)

- Chiết lỏng – lỏng với hexane, ethyl acetate

- Cô quay thu hồi dung môi

B ảng 2.1 Sắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate lá me (143,1g)

STT Phân đoạn Dung môi gi ải ly

Tr ọng lượng (g)

S ắc kí lớp

m ỏng Ghi chú

kéo vệt Đã khảo sát

Ghi chú: H (hexane), EA (ethyl acetate), Me (methanol)

2.4.1 SẮC KÍ CỘT SILICA GEL TRÊN PHÂN ĐOẠN EA1 (16,50 g)

Tiến hành sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA1 (16,50 g) bằng hệ dung môi C:Me (0% đến 20% Me), sau đó chuyển sang hệ dung môi EA:Me (5% đến 100% Me) thu

được 10 phân đoạn, kí hiệu từ EA1.1 đến EA1.10

Trong phân đoạn EA1.9 cho kết quả sắc kí lớp mỏng có sự tách vết màu vàng rõ ràng Tiếp tục sắc kí cột pha thường trên phân đoạn EA1.9 nhiều lần, thu được hợp chất ở dạng bột màu vàng, kí hiệu là PAL3 Hợp chất PAL3 có khối lượng 25mg (hệ dung môi H: Ac: AcOH 6:4:0,2 màu vàng khi hiện hình bằng thuốc thử H2SO4 20%) Kết quả được trình bày trong bảng 2.2, 2.3

Bảng 2.2 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA1 (16,50 g) của bảng 2.1

STT Phân đoạn Dung môi gi ải ly

Tr ọng lượng (g)

Sắc kí lớp

7 EA1.7 C : Me 85:15 0,24 Vệt dài Chưa khảo sát

8 EA1.8 C : Me 85:15 0,31 Vệt dài Chưa khảo sát

9 EA1.9 C : Me 8:2 9,73 V ết rõ ràng Kh ảo sát

10 EA1.10 C : Me 8:2 0,83 Nhiều vết Chưa khảo sát

Ghi chú: C (chloroform)

STT Phân đoạn Dung môi gi ải ly

Trọng lượng (g)

S ắc kí lớp mỏng Ghi chú

2 EA1.9.2 DCM:Me 95:5 0,65 Nhiều vết Đã khảo sát

3 EA1.9.3 DCM:Me 95:5 0,54 Nhiều vết Đã khảo sát

4 EA1.9.4 DCM:Me 9:1 1,57 Nhiều vết Chưa khảo sát

5 EA1.9.5 DCM:Me 9:1 1,51 Vết rõ ràng Chưa khảo sát

6 EA1.9.6 DCM:Me 9:1 0,40 V ết rõ ràng Kh được PAL3 ảo sát thu

7 EA1.9.7 DCM:Me 9:1 1,62 Nhiều vết Chưa khảo sát

Ghi chú: DCM (dichloromethane)

2.4.2 S ẮC KÍ CỘT SILICAGEL TRÊN PHÂN ĐOẠN EA4 (33,40 g)

Tiến hành sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4 (33,40 g) bằng hệ dung môi H:EA (75% đến 100% EA) sau đó chuyển sang hệ dung môi EA:Me (5% đến 40% Me)

thu được 8 phân đoạn, kí hiệu từ EA4.1 đến EA4.8

Trong phân đoạn EA4.7 cho kết quả sắc kí lớp mỏng có sự tách vết màu vàng rõ

ràng Tiếp tục sắc kí cột pha thường trên phân đoạn EA4.7 nhiều lần, thu được hợp chất không màu, kí hiệu là PAL4 Hợp chất PAL4 có khối lượng 7mg (hệ dung môi H: Ac: AcOH 6:4:0,2 màu vàng khi hiện hình bằng thuốc thử H2SO4 20%) Kết quả được trình bày trong bảng 2.4, 2.5

Bảng 2.4 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4 (33,40 g) của bảng 2.1

STT Phân đoạn Dung môi gi ải ly

Tr ọng lượng (g)

S ắc kí lớp

m ỏng Ghi chú

kéo vệt Chưa khảo sát

kéo vệt Chưa khảo sát

tách rõ Kh ảo sát

B ảng 2.5 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4.7 (3,40 g) của bảng 2.4

STT Phân đoạn Dung môi gi ải ly

Trọng lượng (g)

S ắc kí lớp

2 EA4.7.2 H:Ac 4:1 0,24 Nhiều vết Chưa khảo sát

3 EA4.7.3 H:Ac 3:2 0,8 Nhi ều vết Khảo sát thu được PAL4

CHƯƠNG III

3.1 KH ẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT PAL3 (25 mg)

Hợp chất PAL3 thu được sau quá trình sắc kí cột nhiều lần phân đoạn EA1.9.6 của bảng 2.3 có những đặc điểm quan trọng sau:

• Hợp chất ở dạng bột màu vàng

• Kết quả sắc kí lớp mỏng giải ly với hệ môi hexane : acetone : acetic acid 6: 4: 0,2; hiện hình bằng thuốc thử H2SO4 20%, đun nóng bảng mỏng thu được 1 vết tròn màu vàng nhạt

của proton bị tách meta, ở δH 7,69 (J=8,5 Hz) xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của proton

bị tách ortho và meta Ngoài ra trên phổ còn xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của hai proton khác bị tách meta ở δH 7,82 (J=2,0 Hz) và 7,69 (J=2,5 Hz)

Phổ 13C-NMR của PAL3 thể hiện tín hiệu cộng hưởng của 15 C trong vùng δC

176,4 -94,3, cho phép dự đoán PAL3 là hợp chất flavon Trong đó có carbon >C=O cộng hưởng ở δC 176,4 ppm Như vậy có thể dự đoán PAL3 là một flavonol

Từ những dữ liệu trên kết hợp so sánh với dữ liệu phổ của quercetin cho thấy sự

tương đồng, nên hợp chất PAL3 được đề nghị là quercetin

OH O OH

OH

OH

1 2 3 4 10 5 6 7

8

2' 3' 4'

5' 6'

Quercetin (PAL3)

Bảng 3.1 Dữ liệu phổ của hợp chất PAL3

3.2 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT PAL4 (7 mg)

Hợp chất PAL4 thu được sau quá trình sắc kí cột nhiều lần phân đoạn EA4.7.3 của bảng 2.5 có những đặc điểm quan trọng sau:

• Hợp chất ở dạng vô định hình, không màu

• Kết quả sắc kí lớp mỏng giải ly với hệ môi hexane : acetone : acetic acid 6: 4: 0,2; hiện hình bằng thuốc thử H2SO4 20%, đun nóng bảng mỏng thu được 1 vết tròn màu vàng nhạt

Phổ 1H-NMR của PAL4 xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của proton anomer ở δH

4,55 (1H, d, J=1,5 Hz) và tín hiệu cộng hưởng của các proton gắn trên carbon mang

oxygen >CH-O trong vùng δH 3,78-3,34 Ngoài ra phổ 1H-NMR còn xuất hiện tín hiệu