Tối ưu quy trình phân tích gen NPHS2 trên mẫu máu bệnh nhân nhi mắc hội chứng thận hư tiên phát

Những nghiên cứu áp dụng tiến bộ của di truyền học phân tử trong vài năm qua đã chứng minh có nhiều gen liên quan đến HCTHTP kháng corticosteroid, trong đó các đột biến của gen NPHS2 mã

Trang 1

NGUYỄN THỊ THÙY LINH

TỐI ƯU QUY TRÌNH PHÂN TÍCH GEN

NPHS2 TRÊN MẪU MÁU BỆNH NHÂN NHI

MẮC HỘI CHỨNG THẬN HƯ TIÊN PHÁT

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH Y ĐA KHOA

Trang 2

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

NGUYỄN THỊ THÙY LINH

TỐI ƯU QUY TRÌNH PHÂN TÍCH GEN

NPHS2 TRÊN MẪU MÁU BỆNH NHÂN NHI

MẮC HỘI CHỨNG THẬN HƯ TIÊN PHÁT

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH Y ĐA KHOA

Khóa: QH 2012.Y Người hướng dẫn: 1 ThS Phạm Thị Hồng Nhung

2 ThS BS Vũ Vân Nga

HÀ NỘI - 2018

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

Trang 3

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới ThS Phạm Thị Hồng Nhung – Giảng viên Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, ThS Vũ Vân Nga - Giảng viên Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, những người thầy đã luôn hướng dẫn chỉ bảo tận tình, cho tôi nhiều ý kiến nhận xét quý báu cũng như truyền đạt cho tôi tinh thần học hỏi, làm việc nghiêm túc trong quá trình tôi thực hiện khóa luận này

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Vũ Thị Thơm – Giảng viên khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, người thầy luôn tận tâm giúp đỡ tôi trong quá trình học tập nghiên cứu, tạo điều kiện thuận lợi cũng như luôn sẵn sàng giải đáp mọi thắc mắc để tôi có thể hoàn thành khóa luận này

Để thực hiện tốt khóa luận này, tôi trân trọng cảm ơn sự tài trợ của Đại học Quốc gia Hà Nội cho đề tài mã số QG.16.23 Trong quá trình học tập, làm việc và thực hiện khóa luận, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của các thầy

cô và các bạn sinh viên làm việc tại thực tập tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Y dược học cơ sở – Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội Tôi xin chân thành cảm ơn

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban chủ nhiệm khoa, cùng toàn thể các thầy

cô giáo trong Khoa Y dược- Đại học Quốc gia Hà Nội đã cho tôi những kiến thức quý báu trong quá trình học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã luôn bên cạnh, động viên, khích lệ tôi trong lúc khó khăn cũng như trong quá trình thực hiện khóa luận này

Hà Nội, ngày 29 tháng 05 năm 2018

Nguyễn Thị Thùy Linh

Trang 4

DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

bp Base pair (Cặp bazơ nitơ)

ADN Deoxyribo Nucleic Acid (Axit Deoxynucleic)

dNTP Deoxynucleotide triphosphate

DHPLC Denaturing high performance liquid chromatography (Sắc kí

lỏng cao áp biến tính) EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic acid (Axit ethylene diamine

tetraacetic) HCTH Hội chứng thận hư

HCTHTP

Kb

Hội chứng thận hư tiên phát kilobase (= 1000 bp)

NCBI National Center for Biotechnology Information (Trung tâm

Thông tin Công nghệ Sinh học Quốc gia – Mỹ)

NPHS2 Gen mã hóa cho protein podocin

NHLBI National Heart, Lung and Blood Instiute (Viện tim, phổi và

máu quốc gia)

OD Optical density (Mật độ quang học)

PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase)

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (Đa hình độ dài

đoạn cắt giới hạn) SNP Single nucleotide polymorphism (Đa hình đơn nucleotit)

SSCP Single strand conformation poly morphism (Phân tích đa hình

cấu hình sợi đơn) STR Short Tandem Repeat (Các đoạn lặp ngắn)

TAE Đệm Tris base/axit acetic/ EDTA

UTR Untranslated region (Vùng không dịch mã)

Trang 5

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Trang

Bảng 1 Trình tự mồi nhân dòng gen NPHS2 20

Bảng 2 Thành phần và điều kiện phản ứng PCR của gen NPHS2 30

Bảng 3 Tổng hợp các SNP thuộc gen NPHS2 của 149 bệnh nhân 32

Bảng 4 Các đột biến sai nghĩa thuộc gen NPHS2 trong nghiên cứu 33

Bảng 5 Các đột biến vô nghĩa thuộc gen NPHS2 trong nghiên cứu 33

Bảng 6 Tần số kiểu gen và tần số alen của 6 SNP xuất hiện alen đột biến 34

Trang 6

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Trang Hình 1.1 Tỉ lệ mắc hội chứng thận hư ở một số nước 4 Hình 1.2 Cơ chế bệnh học HCTH 5

Hình 1.3 Gen NPHS2 và protein podocin 8

Hình 1.4 Tế bào biểu mô có chân trên màng đáy cầu thận và tương tác giữa

các protein cấu tạo nên tế bào 9

Hình 1.5 Các đột biến trên protein podocin được mã hóa bởi gen NPHS2 10

Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm nghiên cứu 23 Hình 3.1 Kết quả điện di ADN tổng số trên gel agarose 0,7% 25 Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR tối ưu nhiệt độ gắn mồi trên 6 exon

Trang 7

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1. TỔNG QUAN VỀ HỘI CHỨNG THẬN HƯ TIÊN PHÁT 3

1.1.1 Khái niệm và đặc điểm dịch tễ học 3

1.1.2 Cơ chế sinh bệnh học 4

1.1.3 Biến chứng của liệu pháp corticosteroid trong điều trị HCTHTP 5

1.1.4 Tổng quan về gen liên quan đến hội chứng thận hư tiên phát 6

1.2. TỔNG QUAN VỀ GEN NPHS2 8

1.2.1 Vị trí, cấu trúc, vai trò của gen NHPS2 8

1.2.2 Đa hình di truyền gen NPHS2 9

1.3. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ĐA HÌNH DI TRUYỀN GEN NPHS2 Ở BỆNH NHÂN MẮC HCTHTP 11

1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐA HÌNH DI TRUYỀN ĐƠN NUCLEOTIT 13

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 18

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18

2.1.2 Hóa chất 18

2.1.3 Thiết bị 19

2.1.4 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 19

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.2.1 Thu thập và bảo quản mẫu sinh phẩm 20

2.2.2 Tách chiết và kiểm tra chất lượng ADN tổng số 20 Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

Trang 8

2.2.3 Nhân dòng 6 exon của gen NPHS2 bằng PCR 21

2.2.4 Xác định kiểu gen 6 exon của gen NPHS2 bằng giải trình tự 23

2.2.5 Xác định tần số của các SNP thuộc gen NPHS2 23

2.3. ĐẠO ĐỨC NGHIÊN CỨU 24

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ 26

3.1. TÁCH CHIẾT ADN TỔNG SỐ 26

3.2. NHÂN DÒNG 6 EXON CỦA GEN NPHS2 BẰNG PCR 26

3.3. XÁC ĐỊNH KIỂU GEN 6 EXON CỦA GEN NPHS2 BẰNG GIẢI TRÌNH TỰ 30

3.4. TẦN SỐ ALEN CỦA CÁC ĐA HÌNH XUẤT HIỆN TRONG NGHIÊN CỨU 33

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 34

4.1 VỀ TỐI ƯU HÓA QUY TRÌNH PHÂN TÍCH 6 EXON ĐẦU CỦA GEN NPHS2 34

4.2 VỀ PHÂN TÍCH KẾT QUẢ SNP XÁC ĐỊNH ĐƯỢC TRÊN 6 EXON …36

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40

4.1 KẾT LUẬN 40

4.2 KIẾN NGHỊ 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Trang 9

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hội chứng thận hư tiên phát (HCTHTP) là bệnh cầu thận mạn tính thường gặp nhất ở trẻ em và là yếu tố nguy cơ chính dẫn đến suy giảm chức năng thận [14, 65] Cho đến nay, các phương pháp điều trị bệnh chủ yếu là liệu pháp corticosteroid, thuốc ức chế miễn dịch và ghép thận Theo tiêu chuẩn lâm sàng, HCTH được phân loại dựa vào đáp ứng của bệnh nhân với liệu pháp corticosteroid gồm hai nhóm: nhạy cảm và kháng corticosteroid [14, 38] Phần lớn bệnh nhân mắc HCTHTP thường rất cảm thụ với liệu pháp này, tuy nhiên việc điều trị kéo dài bằng corticosteroid gây ra nhiều tác dụng phụ như hội chứng Cushing, tăng huyết áp, đục thủy tinh thể, glaucoma, loãng xương, chậm phát triển thể chất [12] Bên cạnh đó, một tỉ lệ không nhỏ (10 – 20% trường hợp) bệnh nhân mắc HCTHTP kháng corticosteroid có nguy cơ cao tiến triển thành bệnh thận giai đoạn cuối [58] Nhiều trường hợp kháng corticosetorid được chứng minh là do đột biến gen gây ảnh hưởng tới chức năng và sự biệt hóa của tế bào podocyte (tế bào biểu mô có chân trên màng đáy cầu thận) Bệnh có tỷ lệ tái phát cao, diễn biến điều trị lâu dài tạo ra sự lo lắng, chán nản và tiêu tốn nhiều tiền của cho bệnh nhân và gia đình người bệnh [6]

Trên thế giới, nhiều công trình nghiên cứu về HCTHTP đã được thực hiện để xác định nguyên nhân, cơ chế biểu hiện bệnh cũng như tính di truyền của bệnh Những nghiên cứu áp dụng tiến bộ của di truyền học phân tử trong vài năm qua đã chứng minh có nhiều gen liên quan đến HCTHTP kháng

corticosteroid, trong đó các đột biến của gen NPHS2 mã hóa cho protein

podocin đóng vai trò quan trọng [49, 60]

Các nhà khoa học đã xác định được tổng cộng 89 đột biến điểm trên 8

exon của gen NPHS2, trong đó 56 đột biến tập trung từ exon 1 đến exon 6

được chứng minh có liên quan chặt chẽ tới HCTHTP [41] Vì vậy, việc xác

định các đột biến của gen NPHS2 nhằm tìm hiểu mối liên quan giữa di truyền

với đáp ứng thuốc có thể hỗ trợ các bác sĩ lâm sàng quyết định phác đồ điều trị thích hợp cho từng bệnh nhân, hạn chế nhiều biến chứng do thuốc và giảm

Trang 10

chi phí điều trị [43] Đây chính là xu hướng tối ưu hóa điều trị theo từng cá thể, tích hợp xét nghiệm di truyền học trong phác đồ điều trị bệnh nhân

Tại Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về các đa hình thái của gen

NPHS2 cũng như quy trình phân tích gen này Từ nhu cầu lâm sàng và tính

cấp thiết của nghiên cứu xây dựng các phương pháp mới trong chẩn đoán,

điều trị bệnh nhân mắc HCTHTP, chúng tôi tiến hành đề tài “Phân tích gen NPHS2 trên mẫu máu bệnh nhân nhi mắc hội chứng thận hư tiên phát”

1 Mục tiêu nghiên cứu:

- Xây dựng quy trình phân tích các đa hình di truyền nằm trong exon 1

đến exon 6 thuộc gen NPHS2 ở bệnh nhân nhi mắc HCTHTP ở Việt Nam

- Xác định tần số các đa hình gen NPHS2 trên 149

bệnh nhân nhi mắc HCTHTP ở Việt Nam

2 Nội dung nghiên cứu:

- Tối ưu hóa phản ứng PCR nhân dòng exon 1 đến exon 6 thuộc gen

NPHS2

- Giải trình tự và xác định các đa hình gen NPHS2

- Áp dụng quy trình phân tích gen để khảo sát tần số kiểu gen và tần số alen trên 149 bệnh nhân nhi mắc HCTHTP ở Việt Nam

Trang 11

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ HỘI CHỨNG THẬN HƯ TIÊN PHÁT

1.1.1 Khái niệm và đặc điểm dịch tễ học

Hội chứng thận hư là biểu hiện thường gặp của bệnh cầu thận nguyên phát, diễn biến kéo dài nhiều năm với các đợt bột phát, xen lẫn những thời kỳ thuyên giảm Đây là một hội chứng lâm sàng và sinh hóa xuất hiện ở nhiều bệnh do tổn thương ở cầu thận đặc trưng bởi phù, protein niệu cao, protein máu giảm, rối loạn lipid máu và có thể đái ra mỡ [6]

Hội chứng thận hư tiên phát là HCTH không có nguyên nhân rõ ràng, khởi phát sớm nhất trên 3 tháng tuổi, với 3 hình thái bệnh lí tổn thương cầu thận: tổn thương tối thiểu, xơ cứng hoặc hyalin hoá cục bộ hoặc một phần và tăng sinh gian mạch lan toả Bệnh hay gặp ở tuổi tiền học đường hoặc học đường (5 – 10 tuổi) [8]

Hội chứng thận hư kháng steroid (Steroid-resistant nephrotic syndrome

- SRNS) được định nghĩa là một tình trạng bệnh nhân mắc hội chứng thận hư không đạt được sự thuyên giảm sau điều trị đầy đủ theo liệu pháp corticosteroid tiêu chuẩn Hội chứng thận hư kháng corticosteroid chiếm khoảng 10% - 15% hội chứng thận hư ở trẻ em và có xu hướng tiến triển đến giai đoạn cuối của bệnh thận trong vòng 10 năm [44] Khi đó bệnh nhân cần được điều trị bằng lọc máu và ghép thận với chi phí cao

Tỷ lệ mắc HCTHTP thay đổi theo tuổi, giới, chủng tộc, địa dư và cơ địa Tuổi mắc bệnh trung bình ở trẻ em Việt Nam là 8,7 ± 3,5 (tuổi đi học) trong khi đó một số nghiên cứu trên thế giới cho thấy tuổi mắc bệnh thấp hơn thường gặp ở trẻ em trước tuổi đi học Trẻ nam gặp nhiều hơn trẻ nữ (tỷ lệ 2:1) Về chủng tộc, trẻ em Châu Á bị bệnh nhiều hơn Châu Âu (với tỷ lệ 6:1); trẻ em Châu Phi ít mắc HCTHTP, nhưng nếu trẻ em da đen mắc HCTHTP thì thường bị kháng corticosteroid [52]

Ở Mỹ, tỉ lệ mắc mới hàng năm ước tính 2,0 – 2,7/100.000 ca, tỉ lệ hiện mắc là 16/100.000 người Tại Anh, hàng năm tỉ lệ mới mắc của trẻ em gốc Á

(Đông Nam Á, Nhật, Ấn Độ) cao gấp 6 lần trẻ em châu Âu (Hình 1.1 thể hiện

tỉ lệ mắc HCTH ở một số nước trên thế giới) Ở nước ta, tại các khoa Nhi Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

Trang 12

bệnh viện đa khoa tỉnh, số trẻ em mắc hội chứng thận hư (HCTH) chiếm khoảng 0.5 – 1% tổng số bệnh nhi điều trị nội trú và chiếm 10 – 30% tổng số bệnh nhi bị các bệnh thận Tại Bệnh viện Nhi Trung Ương số bệnh nhân bị thận hư chiếm gần 2% tổng số bệnh nhân và chiếm 40% tổng số bệnh nhân của khoa thận [1, 10]

Hình 1.1 Tỉ lệ mắc hội chứng thận hư ở một số nước trên thế giới [27]

1.1.2 Cơ chế sinh bệnh học

Cơ chế sinh bệnh học của HCTHTP đến nay vẫn chưa được biết đầy

đủ Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu cho thấy có sự rối loạn chức năng của tế bào lympho T dẫn đến sự rối loạn đáp ứng miễn dịch Các protein đặc biệt là các Albumin xuất hiện trong nước tiểu là do biến đổi cấu trúc màng lọc, mở rộng

lỗ lọc và mất điện tích âm màng đáy Một số bệnh nhân mang điện tích dương trong huyết tương và các phân tử protein này có thể trung hòa điện tích âm trên thành mao mạch cầu thận Ngoài ra một số nghiên cứu còn cho thấy có vai trò của yếu tố di truyền trong cơ chế sinh bệnh học HCTHTP Gần đây người ta thấy rằng sự thay đổi của các phân tử creatin bộc lộ trên chân lồi của các tế bào biểu mô có chân, đặc biệt là nephrin, podocin và α-actin cũng có

vai trò gây xuất hiện protein niệu [4] Hình 1.2 mô tả cơ chế gây mất albumin

từ máu ra nước tiểu trong HCTH

Trang 13

Hình 1.2 Cơ chế bệnh học HCTH [53]

Hầu hết các bệnh nhân bị HCTH kháng corticosteroid không rõ nguyên nhân Tuy nhiên 1/4 đến 1/3 trường hợp HCTH kháng corticosteroid ở trẻ em hoặc HCTH bẩm sinh được chứng minh trong các nghiên cứu có nguyên nhân

do gen làm ảnh hưởng tới sự biệt hóa và chức năng của tế bào podocyte [33]

1.1.3 Biến chứng của liệu pháp corticosteroid trong điều trị HCTHTP

Những bằng chứng về rối loạn miễn dịch là cơ sở để sử dụng corticosteroid và các thuốc ức chế miễn dịch khác trong điều trị HCTHTP Khi chưa có corticosteroid, một tỉ lệ lớn bệnh nhân bị HCTH chết hoặc tiến triển đến bệnh thận giai đoạn cuối nhanh chóng Từ năm 1950, corticosteroid

đã được sử dụng trong điều trị HCTH giúp giảm tỉ lệ tử vong trẻ em bị HCTH xuống còn khoảng 3% Corticosteroid có tác dụng giảm viêm ở cầu thận trong điều trị HCTHTP, từ đó các triệu chứng bệnh sẽ giảm hoặc mất hoàn toàn Với những trẻ bị HCTH giai đoạn đầu, 90% trẻ đáp ứng với liệu pháp corticosteroid [45] Tuy nhiên, bệnh có khả năng tái phát cao, vì vậy cần theo dõi lâu dài và tuân thủ phác đồ một cách chính xác Mặt khác, điều trị bằng corticosteroid trong thời gian dài cũng gây ra nhiều biến chứng nghiêm trọng như [12, 45]:

- Thần kinh, tâm thần: rối loạn tâm thần, trầm cảm

- Tim mạch: tăng huyết áp, suy tim mất bù

- Tiêu hóa: bệnh lý dạ dày – tá tràng (loét, chảy máu, thủng), viêm tụy

- Nội tiết: hội chứng Cushing, chậm phát triển ở trẻ em

- Chuyển hóa: tăng glucose máu, đái tháo đường, mất kali

Trang 14

- Cơ xương khớp: loãng xương, hoại tử vô khuẩn chỏm xương đùi, yếu

cơ, nhược cơ

- Mắt: Glaucoma, đục thủy tinh thể dưới bao

- Da: trứng cá, teo da, ban, tụ máu, đỏ mặt, chậm liền sẹo

- Nhiễm khuẩn

- Tai biến do ngừng thuốc đột ngột: suy thượng thận cấp

Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu về HCTHTP đã được thực hiên cho thấy tỉ lệ bệnh nhân HCTH kháng thuốc là 10 – 20% và có xu hướng ngày càng tăng [11, 31] Theo kết quả nghiên cứu của Lê Nam Trà và cộng sự trên

42 trẻ bị HCTHTP kháng corticosteroid được điều trị bằng methylprenisolon liều cao truyền tĩnh mạch, tỉ lệ thuyên giảm hoàn toàn là 33,3%, thuyên giảm một phần là 30,9% và không đáp ứng là 35,7% [8] Những nghiên cứu mới về phân tích đột biến gen mã hóa tổng hợp các protein tham gia cấu trúc màng lọc cầu thận đã phần nào chứng minh giả thiết nguyên nhân gây kháng thuốc

do gen Bằng chứng là sự di truyền khả năng đáp ứng và không đáp ứng với corticosteroid ở các bệnh nhân mắc hội chứng thận hư đang ngày càng được công nhận [30] Vấn đề cơ chế nào dẫn đến việc những bệnh nhân này ban đầu đáp ứng với corticosteroid nhưng sau đó lại kháng với corticosteroid (hiện tượng kháng corticosteroid muộn) cũng được đặt ra Vì vậy, xét nghiệm gen

di truyền đang ngày càng trở thành một công cụ có giá trị trong việc xác định các đột biến gen có liên quan đến hội chứng thận hư và sự di truyền tính kháng steroid, từ đó có được hướng điều trị hiệu quả và trong tương lai có thể tránh những trường hợp sinh thiết thận không phù hợp [13]

1.1.4 Tổng quan về gen liên quan đến hội chứng thận hư tiên phát

Hơn hai thập kỉ qua, cơ sở phân tử của HCTH kháng corticosteroid đã được nghiên cứu trên cả trường hợp mắc HCTH kháng corticosteroid có tính chất gia đình và những trường hợp ngẫu nhiên Các đột biến trên gen mã hóa cho các protein ở tế bào biểu mô có chân (podocyte) được mô tả như là nguyên nhân của HCTH kháng corticosteroid di truyền Đến nay, các đột biến

ở 10 gen (NPHS1, NPHS2, PLCE1, CD2AP, ACTN4, TRPC6, INF2, MYO1E, PTPRO và ARHGDIA) liên quan đến các dạng khác nhau của HCTH kháng

corticosteroid đã được mô tả và 11 gen khác cũng được xác định là có liên Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

Trang 15

quan (WT1, LMX1B, LAMB2, ITGB4, SCARB2, COQ2, PDSS2, MTTL1, SMARCA, MYH9 và NXF5) [23] Kết quả của các nghiên cứu đã thực hiện

trên thế giới chỉ ra các gen sau đây là nguyên nhân phổ biến nhất trong HCTH kháng corticosteroid:

- Đột biến gen NPHS1 mã hóa nephrin của tế bào podocyte, thường gặp

ở lứa tuổi nhỏ, đặc biệt trong HCTH bẩm sinh thể Phần Lan [31, 36]

- Đột biến gen NPHS2 mã hóa protein podocin của tế bào podocyte,

thường gặp ở lứa tuổi lớn và HCTH kháng thuốc có tính chất gia đình Đột

biến gen NPHS2 gặp khoảng từ 10 – 30 % trẻ bị HCTH kháng thuốc ở Châu

Âu và Trung Đông, ngược lại tỉ lệ này lại ít ở trẻ em Mỹ gốc Phi [37, 54, 60, 69]

- WT1 mã hóa cho sự di truyền ức chế protein của khối u liên quan đến

phát triển thận và hệ sinh dục Đột biến gen WT1-Wilm’tumor có thể gặp ở tất cả các trường hợp bị HCTH tiên phát kháng corticosteroid [36, 59]

- Gen ít gặp hơn là LAMB2 mã hóa lamin beta 2, PLCE1 mã hóa phospholipase C epsilon và TRP6 mã hóa cho kênh dẫn truyền canxi nằm trên

màng lipid tạo thành một phức hệ với podocin quy định cơ chế cảm nhận của màng lọc cầu thận [36]

- Đột biến gen NPHS3 và đột biến ở gen epsilon phospholipase C (PLCE1 hay NPHS3) thường kết hợp với HCTH bẩm sinh và xơ hóa gian

Trên cơ sở các nghiên cứu này, các đột biến của gen NPHS2 được mô

tả là một trong các nguyên nhân quan trọng trong cơ chế kháng thuốc ở bệnh nhân mắc HCTHTP và được tìm thấy ở các quần thể khác nhau với tần số và mức độ biểu hiện khác nhau [20, 25] Vì vậy, nghiên cứu của chúng tôi lựa

chọn phân tích gen NPHS2 là bước đầu cho những nghiên cứu tiếp theo về

mối liên quan giữa các đột biến tìm thấy với đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng, đáp ứng điều trị và tiên lượng ở bệnh nhân người Việt Nam mắc HCTHTP

Trang 16

1.2 TỔNG QUAN VỀ GEN NPHS2

1.2.1 Vị trí, cấu trúc, vai trò của gen NHPS2

Gen NPHS2 ở người được xác định vị trí vào năm 2000, có độ dài

khoảng 25 kb trên vai dài nhiễm sắc thể số 1 (1q25-q31) và bao gồm 8 exon

dịch mã C Cấu trúc protein podocin (Nguồn: Genetics in Medicine)

NPHS2 mã hóa cho protein podocin, hầu như chỉ biểu hiện ở tế bào

podocyte trên cầu thận Podocyte là tế bào biểu mô biệt hóa bao quanh mặt

ngoài của màng lọc cầu thận (Hình 1.4) Những tế bào này phân ngón thành

những chân bám vào mặt ngoài màng đáy, khe giữa các chân giả tạo ra những

lỗ lọc đường kính khoảng n Å cho dịch lọc đi qua Podocin là một protein màng, cấu tạo từ 383 axit amin và trọng lượng 42 kD, thuộc họ stomatin có cấu trúc giống như kẹp tóc, cả hai đầu của phân tử protein podocin đều nằm trong tế bào chất Podocin tồn tại dưới dạng oligo trên màng lipid kép và tập trung nhiều ở các khe của màng lọc cầu thận, nơi nó tương tác với các protein khác như CD2AP hay nephrin [20]

Trang 17

Hình 1.4 Tế bào biểu mô có chân trên màng đáy cầu thận và tương tác giữa các protein cấu tạo nên tế bào (Nguồn: Diagnostic Pathology: Kidney

diseases E-Book by Robert B Colvin, Anthony Chang)

1.2.2 Đa hình di truyền gen NPHS2

Kruglyak và Nickerson (2001) ước tính rằng hai hệ gen người bình thường trung bình giống nhau về trình tự các nucleotit tới 99,9% Trong phần khác biệt di truyền còn lại thì đến 90% là các đa hình đơn nucleotit (single nucleotit polymorphism, viết tắt là SNP) [46] SNP là đột biến thay thế một nucleotit trong trình tự ADN với tần số lớn hơn 1% trong quần thể Nhiều nghiên cứu đến nay cho thấy hầu hết các SNP phổ biến chỉ có hai alen và khoảng 2/3 các SNP trong hệ gen người có nguồn gốc là các đột biến đồng hoán SNP có ý nghĩa rất quan trọng vì nó là loại biến dị di truyền phổ biến và

ổn định, hơn 99,9% trình tự hệ gen là giống nhau và sự biến đổi của phần còn lại được coi là có ảnh hưởng rất lớn đến việc bằng cách nào đó mà con người

có sự phản ứng khác nhau với bệnh tật, với các nhân tố môi trường như vi khuẩn, vi rút, các độc tố và hóa chất, các thuốc và các liệu pháp điều trị khác Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

Trang 18

nhau Các SNP nằm trong vùng mã hóa của gen làm thay đổi cấu trúc và chức năng của protein được dịch mã là một trong những mục tiêu thường được phân tích nhằm chẩn đoán bệnh và lý giải cho việc tại sao mỗi người lại đáp ứng khác nhau với một loại thuốc trong cùng một điều kiện môi trường Các điểm đa hình nucleotit này cho thấy tiềm năng không giới hạn trong việc nghiên cứu tác động của chúng đến con đường sinh bệnh học [61, 64] Mặc

dù tác động của từng SNP riêng rẽ đến sự hình thành bệnh là tương đối yếu nhưng sự tổ hợp của chúng có thể làm tăng đáng kể nguy cơ gây bệnh Cùng với đó là sự liên quan đến khả năng đáp ứng thuốc, khả năng hấp thụ, chuyển hóa thuốc cũng như các phân tử khác [66] Vì vậy, việc nghiên cứu mối liên

hệ giữa các SNP này với sự hình thành bệnh là rất cần thiết nhằm tìm ra các chỉ thị di truyền đặc trưng cho từng quần thể

Do có cấu trúc đơn giản, chỉ thay đổi một nucleotit nên các kĩ thuật sinh học phân tử có thể phân tích nhanh chóng và hiệu quả kiểu gen của hàng trăm hay hàng ngàn cá nhân cho hàng trăm hay hàng ngàn SNP [47] Các nhà

di truyền học hy vọng rằng trong tương lai có thể hoàn thiện bản đồ các SNP

có liên quan đến các bệnh lý, tiến đến việc giải mã chức năng của các gen ở mỗi cá thể giúp tiên lượng các nguy cơ mắc bệnh, từ đó có lời khuyên thích hợp trong vấn đề phòng bệnh đối với từng cá thể

Nhiều dạng đa hình gen NPHS2 đã được xác định, trong đó chủ yếu là

các SNP (Hình 1.5)

Hình 1.5 Các đột biến trên podocin

(Nguồn: Weber et al: Podocin gene mutation screening)

Trang 19

Các nhà khoa học đã xác định được 89 đột biến điểm trên 8 exon của

gen NPHS2, trong đó 56 đột biến tập trung từ exon 1 đến exon 6 được chứng

minh có liên quan chặt chẽ tới HCTHTP; còn 33 đột biến tập trung ở exon 7

và 8 chưa tìm được mối liên quan chặt chẽ nào với HCTHTP [41, 42] Bên cạnh các nghiên cứu trên các exon, cũng có một số ít nghiên cứu về các đột

biến trên intron của NPHS2, tuy nhiên chưa có mối liên hệ rõ ràng nào giữa

các đột biến trên intron của gen này với HCTHTP kháng thuốc [34, 41]

Sáu mươi bảy biến thể đa hình của NPHS2 đã được công bố gồm 22

SNP thuộc vùng mã hóa, trong đó có 8 SNP làm thay đổi axit amin và 14 SNP không làm thay đổi axit amin 45 đột biến còn lại nằm ở vùng không mã hóa gồm 13 thay đổi ở intron, 26 thay đổi ở vùng promoter và 6 thay đổi ở vùng 3 UTR Đột biến p.R229Q (c.686G>A) thay thế nucleotit G thành A ở

vị trí 686 trong exon 5 dẫn đến sự thay đổi axit amin arginine thành glutamine [21] Vì vậy, các đặc điểm sinh học của chuỗi peptit được mã hóa đã thay đổi Nghiên cứu invitro cho thấy podocin đã giảm đáng kể liên kết với nephrin [63] Tỷ lệ xuất hiện alen p.R229Q (c.686G> A) phụ thuộc vào dân tộc: 0,03-0,13 ở châu Âu [25, 42, 63], và 0,005-0,025 ở các cá nhân từ gốc Phi Châu [29, 55, 63] Các biến thể p.A61V (c.182C> T) và p.A242V (c.725C> T) là những SNP làm thay đổi protein mã hóa chủ yếu ở các cá nhân người Mỹ gốc Phi, với tần suất tương đối lần lượt là 0,015 và 0,076 (NHLBI Exome Sequencing Project) Năm 2011, Ren Q và Yu Sy trong nghiên cứu ở 35 bệnh nhân nhi và 30 người đối chứng khỏe mạnh đã phát hiện 3 SNP: 288C>T thể

dị hợp ở exon 2, 945T>C thể đồng hợp và 1038A>G thể dị hợp ở exon 8 [56]

1.3 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ĐA HÌNH DI TRUYỀN GEN NPHS2 Ở

BỆNH NHÂN MẮC HCTHTP

Trên thế giới, các nhà nghiên cứu đã tiến hành phân tích đa hình di

truyền gen NPHS2 trên những nhóm bệnh nhân mắc hội chứng thận hư khác nhau Năm 2000, Boute và cộng sự lần đầu phân tích đột biến gen NPHS2 đã

phát hiện ra đột biến gen lặn trên nhiễm sắc thể thường ở các bệnh nhân người

Mỹ với HCTH kháng thuốc [21] Các nghiên cứu trước đây về tần số đột biến

gen NPHS2 trong các quần thể khác nhau cho thấy chủng tộc đóng một vai trò quan trọng Các đa hình di truyền gen NPHS2 đã được công bố có ảnh hưởng

Trang 20

khác nhau đến các đặc điểm lâm sàng như protein niệu xuất hiện sớm, tiến triển nhanh đến bệnh thận giai đoạn cuối và sự khác biệt về thể mô bệnh học [19, 44, 65] Tuy nhiên, không có sự đồng thuận về exon nào ảnh hưởng đến HCTH hơn hay đột biến trên exon nào có hại nhất [32] Năm 2007, Berdeli

nghiên cứu đột biến gen NPHS2 trên 295 trẻ em ở Thổ Nhĩ Kì mắc HCTHTP

kháng thuốc thấy: 41 bệnh nhân (chiếm tỉ lệ 13,8%) có tiền sử gia đình và 254 bệnh nhân (chiếm 86,2%) là trường hợp ngẫu nhiên Phân tích trên 8 exon của

gen NPHS2 bằng phương pháp giải trình tự thấy có 53 đột biến, trong đó 37

đột biến mới Tỷ lệ phát hiện đột biến là 24,7% trên tất cả các bệnh nhân, 29,2% ở nhóm có tiền sử gia đình và 24% ở nhóm ngẫu nhiên [18] Trong nghiên cứu của Basiratnia và cộng sự năm 2013 trên 99 trẻ em mắc hội chứng thận hư ở Tây Nam Iran, sau khi phân tích kết quả trên hai nhóm là nhóm kháng corticosteroid (49 bệnh nhân) và nhóm nhạy cảm với corticosteroid (50 bệnh nhân), đã đề xuất phác đồ điều trị mới cho nhóm trẻ em mắc HCTH

kháng thuốc dựa trên xác định các đột biến gen NPHS2 [51] Joshi và cộng sự

năm 2013 đã chỉ ra trong nghiên cứu của mình sự biểu hiện đa dạng về đột

biến gen NPHS2 ở các chủng người và các quốc gia khác nhau Từ đó đề xuất

sự tiếp cận có hệ thống để kiểm tra di truyền cho từng bệnh nhân mắc HCTH kháng thuốc nhằm hỗ trợ các bác sĩ trong việc lựa chọn điều trị thích hợp [40]

Mặc dù vậy, cũng có một số nghiên cứu phân tích các exon khác nhau

của gen NPHS2 trên đối tượng bệnh nhân mắc HCTH lại không tìm thấy đột

biến gen nào Nghiên cứu của Dedi Rachmadi và cộng sự năm 2015 trên đối tượng bệnh nhân nhi mắc hội chứng thận hư kháng steroid ở Indonesia đã phân tích các đa hình di truyền trên các exon 1, 2 và 8 bằng phương pháp giải trình tự gen và mối liên quan với các biểu hiện lâm sàng Kết quả cho thấy

không có mối tương quan giữa 6 đa hình di truyền gen NPHS2 đã xác định

được với các biểu hiện lâm sàng của bệnh nhân (p>0,05) và không tìm thấy đột biến mới Tuy nhiên, tác giả cũng đưa ra kết luận trong nghiên cứu này chỉ có 28 trên 59 mẫu giải trình tự thành công do hạn chế về thời gian và tài chính [28] Vì vậy có thể các exon khác của gen mã hóa cho protein podocin đóng vai trò trong cơ chế sinh bệnh học của hội chứng thận hư kháng

Trang 21

corticosteroid chưa được chứng minh trong nghiên cứu này và cần thực hiện các nghiên cứu tiếp theo

Tại Việt Nam, những nghiên cứu trên đối tượng bệnh nhân mắc HCTHTP được tiến hành trước đây tập trung chủ yếu về đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và đánh giá đáp ứng điều trị Đến nay chưa có nghiên cứu nào

về đa hình di truyền gen NPHS2 trên đối tượng bệnh nhân này được công bố

Vì vậy, nghiên cứu của chúng tôi được tiến hành với mục đích tìm ra phương

pháp phân tích gen NPHS2, phục vụ cho chẩn đoán và điều trị HCTH cho

từng cá thể Đây là xu hướng điều trị hứa hẹn mang lại kết quả tối ưu hơn trong tương lai

1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐA HÌNH DI TRUYỀN ĐƠN NUCLEOTIT

Gần 300 gen đã được phân tích chi tiết về SNP theo các phương pháp

và trên nhiều nhóm người khác nhau Năm 1980, SNP được phát hiện do sử dụng enzyme giới hạn để xác định sự có mặt của vị trí cắt và số điểm cắt bằng cách quan sát sự thay đổi độ dài của các đoạn cắt trên ADN Đến năm 1990, SNPs đã phần lớn thay thế STR (short tandem repeat) trong việc sử dụng như một dấu chuẩn lựa chọn cho các nghiên cứu liên kết STR là các đoạn ADN

có cấu trúc lặp lại từ 2 – 6 bp, có tính bảo thủ cao, được di truyền qua các thế

hệ và mang tính đặc trưng cá thể [24] Phân tích STR lý tưởng với các nghiên cứu liên kết mà quá trình phân tích phả hệ được sử dụng để xác định một gen chịu trách nhiệm cho một rối loạn đơn gen [2] Tuy nhiên, các nghiên cứu về sau đã có sự chuyển đổi từ các rối loạn đơn gen sang phân tích các bệnh đa yếu tố như loãng xương, tiểu đường, tim mạch, rối loạn tâm thần và phần lớn ung thư, là các bệnh xảy ra với tần số cao hơn các bệnh đơn gen Bên cạnh đó, quan điểm điều trị mới quan tâm nhiều hơn ảnh hưởng của di truyền trong đáp ứng thuốc Các bệnh đa yếu tố di truyền này bao gồm nhiều biến đổi ở gen mà mỗi biến đổi đóng góp một phần tác động nhỏ Các nghiên cứu với kích thước mẫu lớn so sánh được các trường hợp bệnh với các đối chứng tương ứng từ cùng một quần thể và khả năng phát hiện các biến đổi nhỏ trong gen cao hơn SNP được lựa chọn như dấu chuẩn do nó phong phú hơn và được cho là ổn định hơn STR Nhiều SNP là các trình tự chức năng nếu chúng xảy ra trong Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

Trang 22

vùng mang trình tự mã hóa hoặc trình tự quy định trong gen, do đó có thể kiểm tra trực tiếp sự liên kết giữa kiểu hình và sự thay đổi chức năng gen [2, 24]

Nghiên cứu về mối liên quan giữa SNP với bệnh lý có thể thực hiện bằng 2 cách: trực tiếp phân tích một SNP trong một trình tự mang chức năng kết hợp với một đặc trưng của bệnh hoặc sử dụng một SNP như một dấu chuẩn cho mất cân bằng liên kết (linkage disequilibrium -LD) Dựa trên cơ sở

lý thuyết, phương pháp sử dụng máy tính để mô phỏng đã dự đoán rằng LD không có khả năng mở rộng ra hơn 3 kb trong quần thể người, tức là chỉ khoảng 500000 SNP được sử dụng cho một lần phân tích Tuy nhiên, những hiểu biết về mức độ và mô hình biến động của tần số tái tổ hợp của genome

đã được công nhận cho phép chúng ta phân loại dấu chuẩn cho một lần phân tích genome, rút ngắn hơn thời gian và kích thước mẫu cần thiết Một hệ quả của việc sử dụng quá nhiều dấu chuẩn đồng thời (nhiều cuộc kiểm tra độc lập)

là lượng mẫu yêu cầu để phát hiện các ảnh hưởng di truyền nhỏ có ý nghĩa thống kê là khá lớn Do đó, nghiên cứu yêu cầu lượng lớn các bệnh nhân và các nhóm đối chứng Hiện nay, quy mô thí nghiệm lớn như vậy là không khả thi về mặt kinh tế, vì vậy cách tiếp cận phân tích gen ứng cử viên – gen được lựa chọn trên cơ sở chức năng sinh học và nghiên cứu, kết hợp với các kiểu hình của bệnh đang được áp dụng phổ biến [2]

Việc xác định và mô tả lượng lớn SNP rất cần thiết trước khi chúng ta

có thể sử dụng chúng rộng rãi như một công cụ di truyền Khoảng vài trăm ngàn SNP sẽ được yêu cầu như một nguồn tài nguyên để xây dựng các bộ dấu chuẩn tối ưu cho các nghiên cứu Hiện nay có rất nhiều các phương pháp xác định các đa hình di truyền trên ADN như kĩ thuật đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn (Restriction fragment length polymorphism, viết tắt là RFLP), kĩ thuật sử dụng đầu dò ADN (ADN- probe), kỹ thuật đa hình cấu tạo sợi đơn (single strand conformational polymorphism, viết tắt là SSCP), giải trình tự, sắc kí lỏng cao áp biến tính (Denaturing high performance liquid chromatography, viết tắt là DHPLC), chip ADN (SNP microarray) [64]

Trang 23

Đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn (Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Length Polymorphism, viết tắt là RFLP)

RFLP được định nghĩa là tính đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn, biểu hiện sự khác nhau về kích thước các phân đoạn được tạo ra khi cắt ADN bằng ezyme cắt giới hạn Nguyên lí cơ bản của phương pháp này là dựa vào tính chất của enzym giới hạn, có thể nhận biết một trình tự ADN đặc hiệu để cắt đoạn ADN thành các mảnh nhỏ có chiều dài khác nhau Các mảnh giới hạn này sau đó được phân tách theo chiều dài của chúng bằng phương pháp điện

di trên gel agarose/polyacrylamide và được chuyển qua màng bằng phương pháp lai Southern blot Trên màng có những đầu dò ADN để xác định những đoạn ADN giới hạn có thể bắt cặp bổ sung với Đầu dò RFLP xảy ra khi chiều dài của các đoạn giới hạn khác nhau ở những mẫu khác nhau Mỗi đoạn giới hạn đó được gọi là một alen và có thể dùng để phân tích di truyền [22] Phân tích RFLP thường được hỗ trợ bằng kĩ thuật PCR để khuếch đại đoạn gen cần phân tích, bỏ qua bước lai với mẫu dò ADN đánh dấu phóng xạ như trong phương pháp RFLP thông thường nên giá thành rẻ hơn và ít ảnh hưởng đến sức khỏe hơn cho người nghiên cứu Chính vì thế, kĩ thuật này thường được gọi là PCR-RFLP Tùy theo mục đích và dựa vào đặc điểm của gen cần nghiên cứu, người ta có thể thực hiện phương pháp PCR-RFLP theo các cách khác nhau, có thể đơn giản hóa hoặc tiến hành cùng một số phương pháp khác

Phương pháp phân tích đa hình cấu hình sợi đơn (Single strand conformation polymorphism, viết tắt là SSCP)

Một phương pháp đơn giản khác được sử dụng trong nghiên cứu đột biến điểm là phân tích đa hình cấu hình sợi đơn (SSCP) của phân tử ADN Cấu trúc không gian 3 chiều của phân tử ADN sợi đơn được xác định bởi trình tự và môi trường chứa chúng Do đó, trong trường hợp điều kiện môi trường không thay đổi, cấu trúc của chúng chỉ phụ thuộc vào trình tự nucleotit

và bất cứ thay đổi nào trong đó cũng làm thay đổi cấu hình sợi đơn Khi điện

di trên gel polyacrylamide không biến tính, các cấu hình khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau và phân tách ra Những yếu tố khác ảnh hưởng đến cấu hình sợi đơn như nhiệt độ, pH, đệm chạy có thể được sử dụng để tăng Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

Trang 24

khả năng phân tách Nhìn chung, nhiệt độ và pH thấp giúp duy trì cấu hình và

dễ dàng phân biệt được các phân tử ADN có trình tự khác nhau

Phương pháp phân tích ADN dị sợi kép (Denaturing high performance liquid chromatography, viết tắt là DHPLC)

Đây là phương pháp thay vì sử dụng gel và phân tách ADN bằng điện

di, ADN được phân tách bằng sắc ký HPLC Các mạch ADN được phân tách

ở nhiệt độ cao, sau khi hạ nhiệt độ xuống, chúng liên kết với nhau và hình thành ADN dị sợi kép chứa các cặp ghép đôi không chính xác Các phân tử dị sợi kép này có thời gian di chuyển khác biệt so với sợi kép bình thường DHPLC là một kĩ thuật mạnh, đơn giản và mẫu được đưa vào tự động Với những tiến bộ gần đây trong việc phát triển phần mềm dự đoán đường cong biến tính, phương pháp này có độ nhạy cao và khả năng tái sử dụng tốt

Công nghệ VDA cũng có nhiều ưu điểm và tỷ lệ phát hiện cao, cho phép phát hiện các SNP bằng quá trình lai sản phẩm PCR với mảng array sử dụng đầu dò oligonucleotit trên một chip thuỷ tinh và đo sự khác biệt trong liên kết lai giữa oligonucleotit phù hợp và không phù hợp

Phương pháp giải trình tự

Phần lớn các phương pháp nói trên được sử dụng để sàng lọc bước đầu đột biến điểm/SNP Để khẳng định chính xác đột biến hay biến đổi người ta phải giải trình tự trực tiếp Nguyên tắc của hầu hết các phương pháp giải trình

tự hiện nay đều dựa trên phương pháp được Sanger và cộng sự công bố năm

1977, được gọi là phương pháp dideoxyribonuleotide (gọi tắt là phương pháp dideoxy) [3] Theo phương pháp này, một trình tự Sanger giới hạn được bắt đầu tại một vị trí cụ thể trên chuỗi ADN bằng cách sử dụng một oligonucleotit ngắn, có trình tự bổ sung với trình tự của mẫu tại vị trí đó Các mồi oligonucleotit được kéo dài nhờ tác dụng của enzyme ADN polymerase Trong hỗn hợp phản ứng có sẵn các loại deoxynucleotit A, T, G, C trong đó

có một loại là di-deoxynucleotit để ngắt phản ứng kéo dài chuỗi Các đoạn ngắn ADN mới được tổng hợp sau đó được điện di trên gel polyacrylamide, hình ảnh thu được sẽ được dùng để phân tích trình tự ADN [5]

Trang 25

Ngày nay, phương pháp giải trình tự tự động được áp dụng rộng rãi ở các phòng thí nghiệm trên thế giới nhưng cơ bản vẫn áp dụng nguyên lý như trên Với sự phát triển của các enzyme ADN polymerase và các hợp chất hóa học, phương pháp này cho phép sàng lọc SNPs hiệu quả rất cao khi so sánh với các kỹ thuật đã miêu tả trên Cho đến nay, nó đã được cải tiến thành giải trình tự tự động và sử dụng chất huỳnh quang, cho phép xác định chính xác các điểm đột biến trên cả một hệ gen với độ nhạy rất cao [7] Ưu điểm của giải trình tự là cung cấp đầy đủ thông tin về điểm đột biến như: loại đột biến,

vị trí, hậu quả Phương pháp này có hạn chế là đòi hỏi sản phẩm khuếch đại ADN phải có độ tinh sạch rất cao và các hóa chất, thiết bị đắt tiền Tuy nhiên, giải trình tự vẫn là phương pháp tốt nhất để xác định chính xác cùng lúc tất cả các đa hình trên phân đoạn cần phân tích, phù hợp cho các nghiên cứu chưa xác định được đa hình liên quan đến bệnh lý quan tâm Bên cạnh đó, giải trình

tự xác định được sự xuất hiện của đột biến, cung cấp dữ liệu kiểu gen đầy đủ của đối tượng tham gia nghiên cứu

Ngoài việc chọn lựa phương pháp cho phát hiện SNP, quần thể sử dụng

để phát hiện SNP cũng cần được chọn lựa Tần số alen SNP khác nhau đáng

kể giữa các dân tộc và các quần thể khác nhau Các công ty phân tích SNP đã lựa chọn sử dụng các nhóm người đa sắc tộc để tối đa hóa cơ hội phát hiện SNP Một số nghiên cứu khác lại sử dụng các nhóm người mang bệnh để tìm

ra các SNP, theo logic là các biến thể góp phần vào giai đoạn bệnh sẽ xuất

hiện ở tần số cao ở nhóm người này

Trang 26

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu máu toàn phần chống đông EDTA của 149 bệnh nhân nhi người Việt Nam mắc HCTHTP được lấy từ Bệnh viện Nhi Trung Ương

Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân:

Các bệnh nhân được chẩn đoán HCTHTP theo tiêu chuẩn của KDIGO năm 2012: Protein niệu ≥ 50 mg/kg/24 giờ hoặc Protein niệu/Creatinin niệu ≥

200 mg/mmol, Albumin máu ≤ 25 g/lít, Protid máu ≤ 56 g/lít [48]

Không mắc các bệnh hệ thống và các bệnh về cầu thận khác; Tự nguyện tham gia nghiên cứu

Tiêu chuẩn loại trừ bệnh nhân:

HCTH thứ phát: tìm thấy nguyên nhân (Ví dụ: lupus ban đỏ hệ thống, ban xuất huyết dị ứng, ngộ độc…)

Bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu

2.1.2 Hóa chất

Hóa chất dùng cho tách ADN tổng số

E.Z.N.A blood ADN Mini kit (hãng Omega-Biotek)

Hóa chất dùng cho điện di

Ultra Pure Agarose (hãng Invitrogen); TAE 1X; Ethylene diamine tetra acetic Acid, (EDTA) Disodium Salt, Dihydrate (hãng Affymetrix); 6X ADN loading dye (hãng ThermoScientific); GeneRuler 100 bpPlus ADN Ladder (code: SM0321, hãng ThermoScientific); Lambda ADN/HindIII Marker (code: SM0103, hãng ThermoScientific); Tris base (hãng Bio basic); Acid acetic

(hãng Merck)

Hóa chất dùng cho PCR

Cặp mồi được đặt tổng hợp từ hãng IDT, Mỹ; Pfu ADN polymerase (hãng Thermo Scientific); dNTPMix 2 mM (hãng Thermo Scientific); Nước khử ion (hãng Omega Biotek)

Trang 27

2.1.3 Thiết bị

Các pipet Eppendorf dải 0,5 µl - 10 µl, 10 µl - 100 µl, 100 µl - 1000 µl, hãng: Thermo; Đầu típ 10 µl, 200 µl, 1000 µl, hãng: Thermo; Ống Eppendorf 1,7 ml, hãng: Thermo; Ống PCR 0,2 ml, hãng: Thermo; Hệ thống điện di Cole-Parmer (Mỹ) ; Máy PCR Prime Thermal Cycler (Anh); Tủ lạnh -300C Panasonic (Nhật Bản); Máy li tâm EBA 21 Hettich Zentrifugen (Đức); Máy lắc VELP Scientifica (Châu Âu); Máy soi gel Cole-Parmer (Mỹ) ; Máy quang phổ NP80 Nanophotometer (Đức)

2.1.4 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian nghiên cứu: bắt đầu từ tháng 9/2015 đến 3/2017

Địa điểm tiến hành phân tích gen: Phòng thí nghiệm Bộ môn Y dược học cơ sở, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Cỡ mẫu nghiên cứu: Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp chọn mẫu thuận tiện Đối tượng nghiên cứu được lựa chọn liên tiếp thỏa mãn tiêu chuẩn tại Bệnh viện Nhi Trung ương, đồng ý tham gia nghiên cứu cho đến khi quy trình đạt ổn định

Đề tài áp dụng phương pháp giải trình tự dựa trên nguyên lý của Sanger Tiến hành tối ưu hóa quy trình PCR với các điều kiện: nhiệt độ gắn mồi, nồng độ mồi và nồng độ ADN khuôn Mức độ đánh giá tối ưu dựa trên kết quả điện di trên gel agarose Dựa trên kết quả giải trình tự sẽ tính được tần

số kiểu gen và tần số alen của các SNP Tần số alen thu được trong nghiên cứu được so sánh với tần số lý thuyết khi quần thể cân bằng theo định luật Hardy-Weinberg

Phân tích kết quả và xử lý số liệu với kiểm định Khi bình phương bằng phần mềm Excel Phép thử Khi bình phương được dùng để đánh giá tần số alen thu được trong nghiên cứu có khác biệt có ý nghĩa thống kê so với tần số alen lý thuyết theo định luật Hardy-Weinberg hay không

Trang 28

2.2.1 Thu thập và bảo quản mẫu sinh phẩm

Mẫu máu toàn phần (2 ml máu/ mẫu) lấy từ tĩnh mạch của bệnh nhân nhi mắc HCTHTP tại Bệnh viện Nhi Trung Ương được đưa vào ống chuyên dụng chứa EDTA, bảo quản lạnh ở -20oC đến khi sử dụng

Kí hiệu mẫu: ống chứa máu phải có đầy đủ thông tin về mã bệnh nhân, tên, tuổi, ngày lấy mẫu Tất cả thông tin về mẫu máu của bệnh nhân phải được lưu trong sổ bàn giao mẫu và nhật kí thí nghiệm tách ADN tổng số

2.2.2 Tách chiết và kiểm tra chất lượng ADN tổng số

Tách chiết ADN tổng số

Sử dụng E.Z.N.A blood DNA Mini Kit theo quy trình khuyến cáo của

hãng Quy trình tách chiết ADN được trình bày ở Phụ lục 1

Kiểm tra và định lượng ADN tách chiết

Sự có mặt của ADN được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,7%, đệm TAE 1X 5 µl ADN được trộn với 1 µl đệm tra mẫu chứa ethidium bromide (50 µg/ml) Điện di được thực hiện với hiệu điện thế 90 volt trong 1 giờ, các băng ADN được phát hiện dưới ánh sáng UV

Nồng độ và độ tinh sạch của ADN tách chiết được định lượng bằng cách đo mật độ hấp thụ quang ở bước sóng 260 nm (OD260) và 280 nm (OD280) ADN được cho là có độ tinh sạch cao khi giá trị OD 260/ OD 280 nằm trong khoảng 1,8 – 2,0

Quy trình kiểm tra chất lượng ADN bằng điện di được trình bày ở Phụ

lục 2 Thiết kế mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR

Sử dụng phần mềm PerlPrimer version 1.1.1, chúng tôi tự thiết kế các mồi nhân dòng exon 2, 3 và 4, đặt tổng hợp hóa học tại hãng IDT (Mỹ) Các cặp mồi dùng cho nhân dòng exon 1, 5 và 6 sử dụng trình tự công bố bởi

Basiratnia năm 2013 [17] Trình tự mồi được trình bày trong Bảng 1

Trang 29

Bảng 1 Trình tự mồi nhân dòng gen NPHS2

Exon Trình tự mồi (5’ – 3’) Độ dài sản phẩm dự

kiến

TCC ACC TTA TCT GAC GCC CC

CCC ATT CCC TAG ATT GCC

5 AAA GGA GCC CAA GAA TCA AG 292 bp

AAA TAT TTC AGC ATA TTG GCC

GATATGGCTATAGTA CTC AGT G

2.2.3 Nhân dòng 6 exon của gen NPHS2 bằng PCR

Nguyên tắc của PCR là tạo lượng lớn các đoạn ADN cần phân tích từ ADN khuôn dựa trên cơ sở hoạt động của enzyme ADN polymerase để tổng hợp sợi mới bổ sung Các yếu tố cơ bản để thực hiện phản ứng PCR bao gồm:

- Sợi khuôn ADN, tổng hợp chuỗi mới theo nguyên tắc bổ sung

- Hai đoạn mồi xác định vị trí bắt đầu và kết thúc của đoạn ADN cần khuếch đại

- Các loại nucleotide dATP, dTTP, dGTP, dCTP

- Môi trường đệm cung cấp ion Mg2+ giúp enzyme hoạt động tối ưu

- Enzyme tổng hợp chuỗi mới

Để có quy trình nhân dòng đặc hiệu và ổn định, chúng tôi tiến hành các thí nghiệm tối ưu nhiệt độ gắn mồi, nồng độ mồi và nồng độ ADN khuôn Sản phẩm PCR được đánh giá chất lượng bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%

Định dạng
Số trang	58
Dung lượng	1,39 MB

Tối ưu quy trình phân tích gen NPHS2 trên mẫu máu bệnh nhân nhi mắc hội chứng thận hư tiên phát​

Tối ưu quy trình phân tích gen NPHS2 trên mẫu máu bệnh nhân nhi mắc hội chứng thận hư tiên phát