Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các hợp chất có trong cây Côm Tầng

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới dự án Pháp – Việt, đặc biệt là Viện Hóa học các Hợp chất Tự nhiên tại Gif-sur-Yvette Cộng hòa Pháp đã đo mẫu và thử hoạt tính gây độc tế bào các cặn chiết và c

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-O0O -

TRẦN THU TRANG

NGHIÊN CỨU CÁC THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH

GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA CÂY CÔM (ELAEOCARPUS GRIFFITHI)

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội, Năm 2013

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, trước tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TSKH Phạm Văn Cường người đã tận tình hướng dẫn tôi hoàn thành bản luận văn này

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn toàn thể cán bộ tại phòng Tổng hợp Hữu

cơ -Viện Hóa sinh biển và ban lãnh đạo Viện Hóa sinh biển đã động viên và giúp

đỡ tôi rất nhiều trong việc hoàn thành bản luận văn này

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới dự án Pháp – Việt, đặc biệt là Viện Hóa học các Hợp chất Tự nhiên tại Gif-sur-Yvette (Cộng hòa Pháp) đã đo mẫu và thử hoạt tính gây độc tế bào các cặn chiết và các chất phân lập được để tôi có thể hoàn thành bản luận văn này

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học và các thầy cô giáo Khoa Sinh học-Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên-ĐHQG Hà Nội

đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn đến gia đình và bạn bè luôn động viên và ở bên cạnh giúp đỡ tôi những lúc khó khăn trong cuộc sống để tôi có thể làm việc tốt và hoàn thành tốt luận văn này

Hà Nội, ngày 10 tháng 12 năm 2013

Trần Thu Trang

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

AMEM Advanced Minimum Essential Medium

ATCC Bảo tàng giống chuẩn Hoa kỳ

CC Column Chromatography (Sắc ký cột)

13C-NMR Carbon Magnetic Resonance Spectroscopy

(Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon)

dt Dublet của triplet

DEPT Distortionless Enhancement By Polarization Transfer (Phổ DEPT)

ED50 Liều tác dụng tối đa trên 50% đối tượng thử

ESI-MS Electron Spray Impact Mas Spectroscopy

(Phổ khối va chạm phun mù điện tử) HSQC Heteronuclear Spectroscopy Quantum Coherence

(Phổ tương tác dị hạt nhân) HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation (Phổ tương tác liên kết dị hạt

nhân)

1

H-NMR Proton Magnetic Resonance Spectroscopy

(Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton)

1H-1H-COSY 1H-1H Correlated Spectroscopy (Phổ tương tác proton-proton)

IR Infrared Spectroscopy (Phổ hồng ngoại)

IC50 Nồng độ ức chế 50% sự phát triển của cá thể nghiên cứu

MCF-7 Tế bào ung thư vú

MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) NMR Thin Layer Chromatography (sắc ký lớp mỏng)

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1: Cây Côm (Elaeocarpus griffithi) thuộc họ Côm (Elaeocarpaceae) 3

Hình 2 Một số hợp chất alkaloid từ loài Elaeocarpus grandis 4

Hình 3 Một số hợp chất alkaloid từ loài Elaeocarpus fuscoides 5

Hình 4 Một số hợp chất phân lập từ loài E parvifolius và E mastersi 6

Hình 5: Một số hợp chất từ loài Elaeocarpus habbemensis 6

Hình 6: Chu kỳ tế bào 8

Hình 7: Các tác nhân alkylants 9

Hình 8: Những tác nhân chống lại quá trình trao đổi chất 10

Hình 9: Ức chế tổng hợp protein 11

Hình 10: Các chất đan xen chuỗi ADN 11

Hình11: Ức chế enzyme topoisonmerase I và II 12

Hình 12: Cấu trúc hóa học của hợp chất F1 13

Hình 13: Cấu trúc hóa học của chất F2 26

Hình 14: Cấu trúc hóa học của chất F3 27

Hình 15: Cấu trúc hóa học của chất F4 29

Hình 16: Khảo sát hoạt tính độc tế bào ung thư vú của chất F2 30

Hình 17: Minh họa ảnh hưởng của chất F2 trên dòng tế bào ung thư biểu mô KB 32

Hình 18: Minh họa ảnh hưởng của chất F2 trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7 32

Bảng 3.3: Số liệu phổ 1

H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) của chất F3 trong DMSO

Bảng 3.4Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) của chất F4 trong DMSO

tự nhiên.[9,15,20]

Nước ta có thảm thực vật vô cùng phong phú và đa dạng Theo các số liệu thống kê của Tổ chức Bảo tồn Thiên nhiên Thế giới (IUCN), thì thảm thực vật Việt Nam có trên 12.000 loài, trong đó có khoảng 3.200 loài được sử dụng trong dân gian làm thuốc mới có hoạt tính cao, đã được sử dụng rộng rãi trong việc điều trị bệnh [34]

Ví dụ nổi bật là việc phát hiện ra hai loại hoạt chất tự nhiên Vinblastine và Vincristine

từ cây Dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don), họ Trúc đào (Apocynaceae) [19]

và Taxol từ cây thông đỏ (Taxus brevifolia), họ Thông (Pinaceae) [31], cùng với các

dẫn xuất bán tổng hợp như Taxotere từ 10-deacetyl bacatin III hay gần đây hoạt chất Vinflunine từ Vinorelbine cũng đã chính thức được sử dụng để điều trị cho bệnh nhân ung thư Tuy nhiên, còn phần lớn các cây thuốc dân gian vẫn chưa được nghiên cứu một cách hệ thống Việc nghiên cứu thành phần hóa học và khảo sát hoạt tính sinh học không những giúp sử dụng các cây thuốc một cách hiệu quả mà trên cơ sở đó còn phân lập được các hoạt chất để từ đó tiến hành tổng hợp hoặc bán tổng hợp ra các hoạt chất mới có hoạt tính cao hơn và ít tác dụng phụ hơn trong điều trị

Mô hình nghiên cứu “Sinh học dẫn đường” nhằm tìm kiếm những chất có hoạt

tính sinh học là mô hình nghiên cứu tiên tiến, có định hướng cao, nhằm làm sáng tỏ bản chất khoa học của nguồn tài nguyên thiên nhiên, góp phần đưa nhanh các kết quả nghiên cứu vào áp dụng thực tiễn Việc nghiên cứu kế thừa và phát huy vốn quí của dân tộc đặt ra trong lúc này vừa là vận hội và cũng là thách thức đối với những nhà

khoa học nói chung và cho những nhà nghiên cứu phát triển công nghiệp được nói riêng Với mong muốn đóng góp vào việc nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính

sinh học của các thảo dược dân tộc, chúng tôi tiến hành đề tài : “Nghiên cứu thành

phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào của cây Côm (Elaeocarpus griffithi)

với nội dung nghiên cứu như sau:

Nội dung

- Nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất trong dịch chiết etylaxetat

của cây Côm (Elaeocarpus griffithi), thuộc họ Côm (Elaeocarpaceae)

- Khảo sát hoạt tính độc tế bào của dịch chiết etylaxetat tổng cũng như các chất phân lập được

CHƯƠNG1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung về cây Côm

1.1.1 Mô tả về thực vật

Côm(Elaeocarpus griffithii) là loại cây đại mộc cao khoảng 10-25m, thân

thẳng, gốc có bạnh bè thấp, cành non màu nâu nhạt, nhánh non có lông mịn Lá có phiến mỏng hình mác dài 7-10 cm, rộng 2,5-3,5 cm, đầu có mũi nhọn, mép lượn sóng, có răng cưa mềm, hoa mọc thành từng chùm ở nách hay đầu cành, đài hoa có năm lá đài hình tam giác, nhị nhiều Quả hình thận dài 1,5 cm, đường kính 0,8 – 1cm, khi chín có màu đen Gỗ cây màu trắng vàng có thể dựng làm nhà, đóng đồ mộc thông thường xẻ ván Nhân dân nhiều nơi thường chặt hạ cây này để mục trong rừng

để gây trồng nấm hương[1,2]

Hình 1: Cây Côm (Elaeocarpus griffithi) thuộc họ Côm (Elaeocarpaceae)

1.1.2 Phân bố sinh thái

Côm (Elaeocarpus griffithii) là loại cây nhiệt đới và cận nhiệt đới, với một

ít là cây ôn đới Phần lớn các loài cây thường xanh Cây mọc rải rác trong rừng thứsinh ở độ cao từ 400 m trở xuống Cây ưa sáng, mọc nhanh, thích hợp với đất

sét pha Tái sinh hạt tốt, ra hoa vào tháng 8-9, có quả chín tháng 12 đến tháng 1 năm sau [1,2]

Chúng được tìm thấy ở Madagascar, Đông Nam Á, Malaysia, miền đông Australia, New Zealand, Tây Ấn và Chile Họ này chứa khoảng 605 loài cây thân gỗ và cây bụi trong 12 chi Ở Việt Nam có 38 loài phân bố từ Tuyên Quang đến Phú Quốc

Các loài trong họ Elaeocarpaceae phần lớn loài cây này có hoa lưỡng tính hoặc khác gốc và chúng mọc thành cụm [1,2]

1.2 Những nghiên cứu trước đây về cây Côm (Elaeocarpus griffithii)

Cho đến nay, chưa có công trình nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học nào được công bố về loài thực vật này

Các nghiên cứu về các loài khác thuộc chi này cho thấy thành phần hóa học của

các hợp chất của chi Elaeocarpus rất đa dạng Nổi bật về thành phần hóa học của các

loài trong chi này là các hợp chất alkaloid Các chất đã được phân lập từ loài

Elaeocarpus grandislà rudrakine (1), grandisines A (2), Isoelaeocarpiline (3),

grandisines C, D, E, F, and G (4-8)cho thấy khả năng liên kết mạnh với cơ quan

thụcảm δ-opioid của người với giá trị IC50 nằm trong khoảng 9,9 - 75,4µg/ml Các

nhà khoa học đã chứng minh rằng cơ quan thụ cảm δ-opioid có liên quan chặt chẽ

tới các triệu chứng đau kinh niên [6,23]

Hình 2 Một số hợp chất alkaloid từ loài Elaeocarpus grandis

Trong một nghiên cứu khác về loài Elaeocarpus fuscoides,Anthony R

Carroll và cộng sự cũng đó phân lập được các alkaloid là elaeocarpenine (9), isoelaeocarpicine (10), isoelaeocarpine (11) và elaeocarpine (12) Kết quả khảo sát

hoạt tính sinh học cho thấy các hợp chất này có khả năng liên kết mạnh với cơ quan

thụ cảm δ-opioid Đặc biệt hợp chất 9 cho thấy khả năng liên kết mạnh với cơ quan

thụ cảm δ-opioid với IC50 là 2,7 g/ml [22]

Hình 3 Một số hợp chất alkaloid từ loài Elaeocarpus fuscoides

Ngoài ra, các dẫn xuất của axit ellagic cũng được tìm thấy trong một số loài

của chi Elaeocarpus Khi nghiên cứu về loài Elaeocarpus parvifolius, K Nabeta và

cộng sự đã phân lập được các hợp chất là 4-O-methylellagic acid 3 0-(200,300

-di-O-acetyl)-a-rhamnoside(13), methylellagic acid 3 0 -a-rhamnoside (14), methylellagic acid 3 0 -(300 -O-acetyl)-a-rhamnoside (15), and 4-O-methylellagic acid 3 0 -(400 -O-acetyl)-a-rhamnoside (16)[10] Trong đó, hợp chất 13 và 15 cho

4-O-hoạt tính kháng ký sinh trùng babesia rất đáng quan tâm Các dẫn xuất của axit ellagic cũng được tìm thấy trong loài Elaeocarpus mastersii như hợp chất 4,40-O-

dimethylellagic acid 3-(200,300-di-O-acetyl)-a-l-rhamnoside (17)

Mặt khác, cũng từ loài này, các nhà khoa học đã phân lập được hai hợp chất

triterpen cucurbitacin D(18) vàcucurbitacin F(19) có hoạt tính gây độc tế bào rất

khả quan trên các dạng tế bào ung thư khác nhau với các giá trị ED50 trong khoảng

0,01 – 1,9 g/ml [5]

Hình 4 Một số hợp chất phân lập từ loài E parvifoliusvàE mastersi

Từ dịch chiết vỏ cây của loài Elaeocarpus habbemensis,thu thập ở phía nam

tỉnh Papua New Guinea, tháng 01 năm 1999 Peter L Katavic và các cộng sự đã

phân lập được hai hợp chất alkaloid pyrrolidine mới đó là habbemines A (20) and B

(21) như là một đồng phân quang học của nhau hỗn hợp đồng phân habbemines A

and B cho thấy khả năng liên kết mạnh với cơ quan thụ cảm δ-opioid của người với

IC50 là 32,1 M.[24]

Hình 5: Một số hợp chất từ loài Elaeocarpus habbemensis

1.3 Tổng quan về bệnh ung thƣ

1.3.1 Cơ sở khoa học của bệnh ung thƣ

Ung thư là một tên chung dùng để gọi một nhóm bệnh trên 200 loại khác nhau về nguồn gốc của tế bào, căn nguyên, tiên lượng và cách thức điều trị nhưng

có những đặc điểm chung, đó là sự phân chia không kiểm soát được của tế bào, khả năng tồn tại và phát triển của các cơ quan và tổ chức lạ

Các khối u thường được sinh ra từ một tế bào ban đầu và phải mất nhiều năm cho tới khi có một kích thước đủ lớn để có thể nhận thấy được Quá trình phát triển

từ một tế bào duy nhất thành một khối u trải qua nhiều giai đoạn Thông thường,

các tế bào lành có một tuổi nhất định và tuân thủ theo một quy luật chung là “phát

triển – già – chết” Các tế bào chết đi lại được thay thế bằng các tế bào mới Cơ thể

có một cơ chế kiểm soát quy luật này một cách chặt chẽ và duy trì số lượng tế bào ở mỗi cơ quan, tổ chức ở mức ổn định

Bệnh ung thư bắt đầu khi có một tế bào vượt qua cơ chế kiểm soát này của

cơ thể, phát triển và sinh sôi không ngừng, hình thành một đám tế bào có chung một đặc điểm là phát triển vô tổ chức, xâm lấn và chèn ép vào các cơ quan và tổ chức xung quanh Các tế bào ung thư có liên kết lỏng lẻo, dễ dàng bứt ra khỏi khối u mẹ, theo mạch máu và mạch bạch huyết di cư đến các tổ chức và các cơ quan mới, bám

lại và tiếp tục sinh sôi nảy nở (quá trình này gọi là di căn) Các ung thư chèn ép

hoặc di căn vào các cơ quan giữ chức năng sống của cơ thể bệnh nhân như não, phổi, tim, gan và dẫn đến tử vong

Ung thư thường gặp nhất là ung thư phổi, ung thư tiền liệt tuyến, ung thư ngực và ung thư ruột Theo thống kê của cơ quan nghiên cứu ung thư quốc tế (International Agency for Research on Cancer, IARC) thì năm 2002, trên toàn thế giới ước tính có khoảng 10,9 triệu người mới mắc bệnh ung thư Nhìn chung số bệnh nhân ung thư ngày càng tăng

1.3 2 Chu kỳ tế bào

Các tế bào của sinh vật Eukaryotae trải qua nhiều giai đoạn nối tiếp nhau và kết thúc bằng sự phân chia tạo ra tế bào mới Toàn bộ quá trình tế bào đến tế bào

thế hệ kế tiếp được gọi là chu trình tế bào, gồm 4 giai đoạn: M, G1, S và G2.Nếu tế bào có chu kỳ bị tạm thời ngưng trệ hay bị đảo ngược thì được xem như lâm vào một trạng thái tĩnh lặng gọi là pha G0 [3]

Hình 6: Chu kỳ tế bào Pha G 0 (hay là thời kỳ sau nguyên phân) trong pha này tế bào không tham gia vào chu kỳ và ngừng phân chia

Pha G1: Kéo dài từ sau khi tế bào phân chia đến bắt đầu sao chép vật chất di

truyền Sự tích lũy vật chất nội bào đến một điểm nào đó đạt điểm tới hạn thì tế bào bắt đầu tổng hợp ADN

Pha S: là giai đoạn tổng hợp ADN

Pha G2:Trong suốt giai đoạn này số lượng ADN tăng gấp đôi cho đến khi tế bào

phân chia

Pha M: là giai đoạn nguyên phân

Các thuốc chống ung thư thường được phân loại theo phương thức hoạt động của chúng Nhiều tác nhân chống ung thư hoạt động theo cách thức phụ thuộc vào chu kỳ tế bào

 Tác nhân alkyl hóa (alkylants)

 Tác nhân chống lại quá trình trao đổi chất

 Tác nhân ức chế tổng hợp protein ở tiểu đơn vị ribosome

 Các chất tương tác với ADN và phức hệ enzyme ADN

 Gây độc trong quá trình phân bào

 Vacxin và kháng thể

1.3.2.1 Các tác nhân alkyl hóa (alkylants)

Electrophiles là những chất có khả năng liên kết cộng hóa trị với ADN tại một điểm Chúng tạo ra liên kết giữa hai điểm trên cùng một sợi ADN (cầu nối sợi đơn) hoặc trên sợi đôi ADN (cầu nối liên sợi) gây phá vỡ ADN Trong nhóm này, các ví

dụ điển hình là cyclophosphamide (Endoxan), carmustine, cis-plantin (Neoplatine), melphalan (Alkeran) và chlorambucil (Leukeran).Các chất trong lớp này hoạt động trên pha sinh trưởng (G1) của chu kỳ tế bào

Hình 7: Các tác nhân alkylants

1.3.2.2 Những tác nhân chống lại quá trình trao đổi chất (ức chế quá trình tổng hợp acid nucleic)

Cytosine arabinosidelà chất can thiệp vào quá trình tổng hợp ADN và chuyển đổi

nhanh chóng vào triphosphate arabinoside cytosine gây tổn thương ADN trong pha S Cytosine arabinoside ức chế enzyme ADN, ARN polymerase và enzyme nucleotide reductase cần thiết để tổng hợp ADN.Khi được sử dụng như là một chức năng kháng virus thì cytarabine sẽ ức chế deoxycytidine [16]

Methotrexatecó khả năng ức chế dihydrofolate reductase (DHFR),một loại enzyme

tham gia vào quá trình sinh tổng hợp axit fonic.[25] Ái lực củamethotrexate với

DHFR gấp 1000 lần so với folate DHFR xúc tác chuyển đổi dihydrofolate đếnhoạt động tetrahydrofolate Axit folic là cần thiết cho tái tổng hợp nucleoside thymidine

và tổng hợp ADN Ngoài ra, folate là cần thiết để tổng hợp purine Do đó, tất cả tổng hợp purine sẽ bị ức chế Methotrexate ức chế sự tổng hợp của DNA, RNAs, và proteins

5-flourouracile là một trong những chất điển hình của lớp chất chống ung thư loại

này Hoạt tính chống ung thư của fluorouracile nhờ chuyển hóa thành fluorodesoxyuridine monophosphate Hợp chất này chính là chất ức chế đặc hiệu đối với thymidilate-synthetase – chất chịu trách nhiệm xúc tác quá trình methyl hóa axit desoxyuridilique thành axit thymidilic

5-Hình 8: Những tác nhân chống lại quá trình trao đổi chất

1.3.2.3Tác nhân ức chế tổng hợp protein ở tiểu đơn vị ribosome

Girolline là một dẫn xuất 2-aminoimidazole Nghiên cứu in vitro cho thấy rằng

girolline có tác dụng ức chế tổng hợp protein và làm ngừng chu kỳ tế bào ở giai đoạn G2

Homoharringtonine là một alkaloid được phân lập từ câyCephalotaxus

harringtonia, thuộc họ (Cephalotaxaceae) Hợp chất này có khả năng ức chế tổng

hợp protein bằng cách tác động sớm vào giai đoạn kéo dài peptide[30]

Hình 9: Ức chế tổng hợp protein

1.3.2.4 Các chất tương tác với ADN và phức hệ enzyme topoisomerase I và II Tác nhân đan xen vào chuỗiAND

Doxorubicin tương tác với ADN bằng cách đan xen và ức chế sinh tổng hợp đại

phân tử [11] [18] Nhờ vào cấu trúc phẳng, doxorubicine có khả năng xen vào giữa các vòng xoắn được tạo thành giữa các bazơ của chuỗi ADN và như vậy ngăn chặn quá trình sao mã

Với cơ chế hoạt động tương tự, trong lớp chất này còn có actinomycin D.[27] Đây

là một cyclopeptid có chứa phần cấu trúc phẳng được hình thành từ các vòng thơm

ơ

Hình 10: Các chất đan xen chuỗi AND

Ức chế enzymetopoisomerase I và II

Topotecan là một dẫn xuất bán tổng hợp của camptothecin Camptothecin là một

sản phẩm tự nhiên được chiết xuất từ vỏ cây của loài Camptotheca acuminata

Topoisomerase-I là một enzyme có chức năng tháo xoắn một mạch Khi topoisomerase-I tháo xoắn sợi đơn, topotecan xen giữa các bazơ của ADN Sự đan xen này sẽ phá vỡ quá trình sao chép ADN và cuối cùng dẫn đến cái chết của tế bào Các tế bào động vật có vú không thể sửa chữa những sợi đôi bị phá vỡ

này.[26]Trong nhóm ức chếenzymetopoisomerase-I,Irinotecan cũng là một trong

những chất điển hình của nhóm này

Etoposide tạo thành một phức hợp với ADN và enzyme topoisomerase II, ngăn

ngừa sự co xoắn của sợi ADN và dẫn đến phá vỡ sợi ADN.[13,12]

Hình11: Ức chế enzyme topoisonmerase I và II 1.3.2.5 Gây độc trong quá trình phân bào

Colchicine ức chế vi ống trên thoi gián phân bằng cách liên kết với tubulin, một

trong những thành phần chính của vi ống Tubulin là cần thiết để điều khiển quá trình phân bào và do đó colchicine có chức năng như một “chất độc phân bào hoặc

chất độc của thoi” [36]

Vincristine và Vinblastine là alkaloid chiết xuất từ cây dừa cạn Catharanthus

roseus(L.)G.Don Chúng ngăn chặn nhưng có thể phục hồi được sự phân chia gián

phân ở giai đoạn trung kỳ Nhờ sự liên kết của thuốc với các vi cấu trúc hình ống khi gián phân, vincristine ức chế được sự tạo thành thoi gián phân Trong tế bào ung thư, vincristine ức chế một cách chọn lọc cơ chế sửa đổi ADN ; và bằng cách ức chế ARN-polymerase phụ thuộc ADN, vincristine ức chế được sự tổng hợp ARN Ở nồng độ cao vinblastine có thể hiện nhiều tác dụng phức tạp tổng hợp acid nucleic

gia tăng của các tế bào khối u và sản xuất kháng thể đặc hiệu

Vaccin CDX-110 phòng chống các bệnh u thần kinh đệm, một loại u não ác tính và thường gặp nhất Vaccin nhắm vào khối u, gây ra một phản ứng miễn dịch đặc hiệu để chống lại một loại protein ở trên bề mặt của các tế bào ung thư não, protein này là dạng thụ thể màng tế bào đột biến, có tên gọi là EGFRvIII, liên quan đến sự tăng trưởng của ung thư

Các nhà khoa học thuộc Trường Đại học Gorgia Mỹ vừa nghiên cứu một loại

vaccin mang tên Herceptin khả năng phòng ngừa tổng hợp lên tới khoảng 7 loại

ung thư có tỷ lệ tử vong cao như hiện nay: ung thư tiền liệt tuyến, ung thư tụy, ung thư đường ruột và ung thư buồng trứng…Vaccin này có chứa một lượng nhỏ các protein có tên là MUC1, có tác dụng luyện tập cho hệ miễn dịch cơ thể, từ đó hệ miễn dịch có thể nhận biết sự xuất hiện của tế bào ung thư và hệ miễn dịch có thể chủ động tấn công [38]

Cevac là một loại vắc-xin chống lại bệnh ung thư đại tràng, là một kháng

thể đơn dòng gây ra một phản ứng miễn dịch với CEA (Carcino Embryonic

Antigen) Kháng nguyên CEA này hiện diện trong ung thư ruột

Mặt khác,việc điều trị kết hợp các loại vaccin với thuốc hóa trị liệu làm tăng

tỷ lệ sống sót: Herceptin thường gắn liền với taxol và ceavac được dùng cho bệnh nhân kết hợp với fluorouracil-5 và leucovorin

Đề kháng với các chất chống ung thư là một trong những thách thức lớn của hóa trị liệu Sự đề kháng này được gây ra bởi nhiều yếu tố và cơ chế vẫn chưa được hiểu rõ Yếu tố có thể là do:

- Gây ra từ sự sửa chữa ADN giống như polymerase-β

- Giảm sự xâm nhập của thuốc vào trong tế bào (làm giảm nồng độ của thuốc trong các tế bào)

- Sự gia tăng từ trong ra ngoài của các khối u tế bào đa kháng

- Hấp thụ thuốc trong tế bào ngăn, ngăn cản tiếp xúc của thuốc với tế bào mang bệnh

- Sự biến đổi hoặc thay đổi enzyme đích

Điều trị ung thư bằng vaccin cũng có nhiều tác dụng phụ và đôi khi còn gây chết người Với những thách thức này, việc tìm kiếm các loại thuốc mới chống ung thư là cần thiết và các phân tử từ tự nhiên luôn là nguồn tài nguyên quý giá

1.3.3 Ứng dụng của các hợp chất tự nhiênt trong điều trị ung thƣ

Hiện nay, ung thư vẫn là bài toán khó đối với y học và là căn bệnh đáng sợ nhất

của con người do chưa có thuốc đặc trị Vì thế, các nhà khoa học vẫn không ngừng

kiếm tìm các hợp chất mới để tiêu diệt căn bệnh của thời đại, nhất là khi các phương pháp điều trị hiện nay như hóa trị, xạ trị, phẫu thuật đều để lại tác dụng xấu, nhiều bệnh nhân Ung thư chết do suy kiệt trước khi chết vì ung thư

Trong hành trình đó, các nhà nghiên cứu đã tách chiết các hợp chất hóa học

và trên cơ sở đã bán tổng hợp và tổng hợp ra rất nhiều hợp chất có khả năng ức chế

sự phát triển và diệt tế bào ung thư như

Các nhà nghiên cứu tại Viện nghiên cứu Y khoa Sanford-Burnham, đứng đầu

là Kristiina Vuori, MD, Ph.D., đã phát hiện ra một hợp chất tự nhiên là sceptrin được tìm thấy trong các loài bọt biển, làm giảm sự di chuyển của các tế bào ung thư

và có độc tính rất thấp

Những nghiên cứu lâm sàng bước đầu đã chỉ ra rằng Curcumin có tác dụng tốt với một số bệnh ung thư như: ung thư tuyến tụy, ung thư vú, ung thư da, ung thư trực tràng…

Một nghiên cứu của Đại học Missouri, Mỹ cho thấy, resveratrol-một hợp chất được tìm thấy trong quả nho và rượu vang đỏ có thể khiến một số tế bào ung thư như nhạy cảm hơn với xạ trị

Ngày nay, các nhà khoa học vẫn đang miệt mài nghiên cứu nhằm tìm được những hợp chất có hoạt tính cao trong điều trị ung thư

1.4 Các phương pháp nghiên cứu độđộc tế bào

Một vài phép so màu nhanh đã được miêu tả trong thử nghiệm trên các dòngtế bào

ung thư ở mức độ in vitro, trong đó hiện nay người ta thường sử dụng haiphương

pháp là: phương pháp MTT và phương pháp SRB

1.4.1Phương pháp MTT

Trong những năm gần đây, phương pháp tetrazolium (MTT) được sử dụngphổbiến Phương pháp này lần đầu tiên được miêu tả bởi Tim Mosmann trên tạpchí

Immunological Methods năm 1983 [1] Theo tác giả, muối tetrazolium đượcdùng để

triển khai phép thử so màu, qua đó đánh giá về sự sống sót và khả năngphát triển của tế bào động vật Nguyên lý của phép thử là vòng tetrazolium bámchặt vào ti thể

của tế bào hoạt động, dưới tác dụng của enzym dehydrogenase, màuvàng của MTT biến đổi thành màu tím formazan Kết quả đọc trên máy quang phổvà có độ chính xác cao Phương pháp được dùng để đo độ độc của chất nghiên cứu,khả năng phát triển và hoạt động của tế bào

1.4.2 Phương pháp SRB

Phép thử SRB được phát triển bởi Philip Skehan và cộng sự năm 1990 đểđánh giá độc tính của chất nghiên cứu và khả năng phát triển của tế bào trong ứngdụng sàng lọc thuốc ở qui mô lớn Nguyên tắc của phép thử là khả năng nhuộm màucủa SRB lên protein¸ SRB nhuộm bằng cách phá vỡ màng tế bào, những mảnh vỡ tếbào không bị nhuộm, do đó không ảnh hưởng đến số liệu thực nghiệm.Phương pháp SRB dựa trên khả năng liên kết tĩnh điện và sự phụ thuộc vàopH của các dư lượng amino acid của các protein Dưới các điều kiện môi trườngaxit nhẹ, SRB liên kết với các dư lượng amino acid trên các protein của các tế bàođã được cố định bằng trichloroacetic acid (TCA) và sử dụng bazơ yếu như Tris-baseđể hòa tan và đo mật

độ quang của dịch chiết từ tế bào một cách định lượng

1.5 Phân loại các hợp chất thứ cấp trong thực vật

Thực vật là nguồn cung cấp các hợp chất dùng làm dược liệu hoặc phụ gia thực phẩm có giá trị Nhữn sản phẩm này được biết như là các chất trao đổi thứ cấp, thường được hình thành với một lượng rất nhỏ trong cây và chức năng trao đổi chất chưa được viết đầy đủ Chúng dường như là sản phẩm của các phản ứng hóa học của thực vật với môi trường hoặc là sự bảo vệ hóa học chống lại vi sinh vật và động

vật Những nghiên cứu về các hợp chất thứ cấp có nguồn gốc thực vật đã phát triển

từ cuối những năm 50 của thế kỷ 20 Các chất trao đổi thứ cấp có thể xếp trong ba nhóm chính là alkaloid, tinh dầu và glycoside

Các alkaloid có dạng tinh thể là các hợp chất chứa nitrogen, có hoạt tính sinh lý

trên tất cả động vật và được sử dụng trong công nghiệp dược Họ alkaloid bao gồm: codein, caffeine và morphine Một số loài thực vật chứa nhiều alkaloid như: cây thuốc phiện (họ Papaveraceate; cây canh kin a (họ Rubiaceae); cây cà độc dược, thuốc lá và khoai tây Người ta thường gặp trong một cây tập hợp alkaloid có cấu trúc hóa học gần giống nhau Đôi khi toàn cây chứa alkaloid, đôi khi chỉ tập trung trong lá Các alkaloid có hoạt tính sinh học rất khác biệt, một số tác dụng lên hệ thần kinh (caffeine, atropine, strychnine…), một số tác dụng lên các cơ (veratrin, atropine…), một số tác dụng lên mạch máu, một số khác tác dụng lên bộ máy hô hấp Alkaloid thường độc với liều lượng lớn nhưng với liều lượng nhỏ, chúng được

sử dụng làm thuốc chữa bệnh

Các tinh dầuchứa hỗn hợp terpenoid, được sử dụng như chất mùi, chất thơm và

dung môi Giống như những lipid khác, các terpenoid không tan trong nước Terpên được xây dựng từ những đơn vị 5 carbon và được thiết lập từ nhiều đơn vị isoprene,

ví dụ monoterpene chứa 2 đơn vị isoprene

Các glycoside bao gồm các hợp chất phenol và flavonoid, saponin và các

cyanogenic glycoside, một số trong chúng được sử dụng làm thuốc nhuộm, chất mùi thực phẩm và dược phẩm

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Mẫu thực vật

Cây Côm (E griffithii) được thu hái vào ngày 5 tháng 2 năm 2004 tại Qùy

Châu, Nghệ An và được ThS Nguyễn Quốc Bình (Bảo tàng thiên nhiên – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) định tên Mẫu tiêu bản số VN 1249 được lưu trữ tại Viện Sinh thái Tài nguyên và Sinh vật – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Vỏ cây tươi sau khi sấy khô, xay nhỏ thu được 1,4 kg nguyên liệu

2.1.2 Các dạng tế bào

Các dạng tế bào ung thư ở người được cung cấp bởi ATCC gồm: KB (Human

epidermic carcinoma) – ung thư biểu mô, là dòng luôn luôn được sử dụng trong các

phép thử độ độc tế bào; và MCF-7 (Human breast carcinoma) – ung thư vú

2.1.3 Thiết bị và hóa chất tách chiết mẫu thực vật

Sắc ký bản mỏng phân tích: sử dụng bản mỏng nhôm tráng sẵn silicagel 60F254 Merk, độ dày 0,2mm

Sắc ký cột tổng sử dụng silica gel cỡ hạt 63- 100 mm

Sắc ký cột thường sử dụng silica gel cỡ hạt 40m - 63 m

Các loại cột sắc ký với kích cỡ khác nhau

Bản mỏng được kiểm tra bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254, 365nm sau đó hiện màu bằng thuốc thử Ce(SO4); thuốc thử vanilin-H2SO4 (vanillin 1,2g; MeOH 200ml, CH3COOH 25ml; H2SO4 11ml)

Điểm nóng chảy đo trên máy BUCHI Melting Point B545 (Thụy Sĩ) của viện Hóa học, viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR được ghi trên máy Brucker

Avance500MHz viện Hóa học, viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Các dung môi như n-hexan, etyl axetat, diclometan, metanol, aceton, etanol đều được cất lại trước khi sử dụng để chạy sắc ký cột và sắc ký bản mỏng

2.1.4 Thiết bị và hóa chất thử hoạt tính gây độc tế bào

Môi trường nuôi cấy tế bào: AMEM và AMEM có bổ sung 1% insulin, trypsin-EDTA (Gibco, Hoa kỳ)

Dung môi để hòa tan chất cần thử hoạt tính: DMSO

Tủ ấm CO2 (Innova CO-170); Tủ cấy vô trùng cấp I ( Labcaire), cấp II (SterilGard II);

Máy li tâm (universal 320 R); Kính hiển vi ngược (Axiovert 40 CFL)

Tủ lạnh sâu -25oC, - 800C

Buồng đếm tế bào (Fisher, Hoa kỳ)

Máy quang phổ (GENios Tecan)

Bình nitơ lỏng bảo quản tế bào và các dụng cụ thí nghiệm thông thường khác

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Các phương pháp hóa học

2.2.1.1 Phương pháp chiết dịch etylaxetat tổng

Dựa vào nguyên lý chiết và tài liệu tham khảo chúng tôi thực hiện ngâm chiết với dung môi có độ phân cực tăng dần Thực hiện ngâm chiết mẫu lần lượt với các dung môi etylaxetat và MeOH ở nhiệt độ thường Mỗi loại dung môi tiến hành ngâm chiết 3 lần, mỗi lần trong vòng 24h

2.2.1.2 Sắc ký cột (Colum chromatography - CC)

Sắc ký cột là phương pháp thường được sử dụng để phân tách các chất dựa vào độ phân cực của chúng hoặc tùy theo kích thước phân tử Trong nghiên cứu này, việc phân lập các chất được thực hiện bằng sắc ký cột với chất mang là silica gel (hệ dung môi rửa giải với độ phân cực tăng dần) hoặc gel LH-20

Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silicagel Merck loại 40 - 63m với dung môi rửa giải thích hợp

2.2.1.3 Sắc ký lớp mỏng ( Thin layer Chromatography – TLC)

S¾c ký lớp mỏng là phương pháp nghiên cứu hiệu quả để phân tích và xácđịnh số lượng các nhóm chất khác nhau có trong thành phần dịch chiết thực vật

hoặc các phân đoạn tách ra từ đó Dựa trên nguyên tắc các chất khác nhau có độ dịch chuyển khác nhau nên tách ra ở vị trí khác nhau Đây là phương pháp vi lượng, hiệu quả tách cao và thời gian thực hiện ngắn

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng silicagel Merck 60 F254, dày 0,25 mm Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng (λ = 254 nm và λ = 366

nm ) và dung dịch thuốc thử Ce(SO4)2

Đối với sắc ký bản mỏng, việc lựa chọn dung môi hay hệ dung môi cho độ phân tách tốt là quan trọng nhất Cụ thể với các yêu cầu khảo sát thì chọn hệ dung môi sao cho các vệt phân tách nhau tốt nhất

2.2.1.4 Phổ khối lượng (Mass spectrometry - MS)

Khối phổ là một trong các phương pháp được sử dụng để xác định khối lượng phân tử của chất nghiên cứu dựa vào sự phát triển ra ion phân tử, từ đó giúp xây dựng công thức phân tử

Phổ khối lượng phun mù điện tử ( Electron Spray Ionization Mass Spectra) được đo bằng phương pháp ESI trên máy Agilent 1120 tại Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.2.1.5 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều (Nuclear magnetic resonance spectrometry - NMR)

Phổ NMR là phương pháp hiện đại trong việc phân tích cấu trúc các hợp chất hóa học, dựa trên nguyên tắc cộng hưởng của các hạt nhân của các nguyên tử khi được đặt trong một từ trường Trong phổ NMR có hai thông số có đặc trưng liên quan đến cấu trúc hóa học của một phân tử là độ dịch chuyển hóa học δ và hằng số

tương tác spin – spin J Từ các dữ liệu phân tích các phổ 1D và 2D NMR cho phép

xây dựng cấu trúc phân tử của mẫu đo

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân được đo trên máy Bruker AM 500 FT-NMR Spectrometer, Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam với TMS là chất chuẩn nội

2.2.2 Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào

Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa kỳ

(NCI)xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất

có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro

Các dòng tế bào ung thư nghiên cứu được nuôi cấy trong các môi trường nuôi cấy phù hợp có bổ xung thêm 10% huyết thanh bê (FBS) và các thành phần cần thiết khác ở điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2, 37 oC, độ ẩm 98%, vô trùng tuyệt đối) Tùy thuộc vào đặc tính của từng dòng tế bào khác nhau, thời gian cấy chuyển cũng khác nhau Tế bào phát triển ở pha log sẽ được sử dụng để thử hoạt độc tính Mẫu thô có IC50 50 g/ml; chất sạch có IC50 30 g/ml được đánh giá là có hoạt tính gây độc tế bào, có khả năng ức chế sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư

Thử độc tế bào:

- Mẫu thử được pha loãng theo dãy nồng độ là 128 g/ml; 32g/ml; 8g/ml;

2g/ml; 0,5g/ml Bổ xung 200l dung dịch tế bào ở pha log nồng độ 3 x 104 tế bào/ml vào mỗi giếng (đĩa 96 giếng Giếng điều khiển có 200 l dung dịch tế bào 3x104 tế bào/ml Ủ ở 370C/ 5% CO2 trong 72h

- Sau 72h thêm 50 l MTT (1mg/ml pha trong môi trường nuôi cấy không huyết thanh) và ủ tiếp ở 370C/4 giờ; loại bỏ môi trường, thêm 100 l DMSO lắc đều đọc kết quả ở bước sóng 540 nm trên máy spectrophotometter Genios TECAN

đ ề ể ẫ

đ ề ể GI: Phần trăm kìm hãm sự phát triển

Giá trị IC50 được tính dựa trên kết quả số liệu phần trăm kìm hãm sự phát triển của

tế bào bằng phần mềm máy tính table curve

Thí nghiệm được lặp lại với n = 3

2.3 Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào của cây Côm 2.3.1 Thành phần hóa học

2.3.1.1 Phân lập cặn chiết etylaxetat

Vỏ cây được thu hái, phơi khô trong bóng mát, sấy khô ở 40-50oC cho đến khi

độ ẩm đạt≤13% và nghiền nhỏ cân được 1,44 kg Nguyên liệu này được ngâm chiết lần lượt với etylaxetat (3 lần, mỗi lần 24 giờ), sau đó là MeOH (3 lần, mỗi lần

24 giờ), thu được các dịch chiết tương ứng là etylaxetat và MeOH Các dịch

chiết này được cất loại dung môi dưới áp suất thấp, kết quả thu được 52g cặn chiết

etylaxetat và 172,8g cặn chiết MeOH Trong khuôn khổ luận văn chúng tôi chỉ tập

trung nghiên cứu phần cặn chiết EtOAC.Quy trình tách chiết dịch etylaxetat được

trình bày theo sơ đồ sau:

Sơ đồ 2.1: Sơ đồ tách chiết dịch etylaxetat từ vỏ cây Côm 2.3.1.2 Phân lập các chất có trong cặn chiết etylaxetat

Cặn chiết etylaxetat được phân tách bằng sắc ký cột trên cột silicagel, hệ

dung môi rửa giải là CH2Cl2/MeOH với tỷ lệ MeOH tăng dần từ 0 - 30 %, thu được

5 phân đoạn được ký hiệu từ E1 – E5 Phân đoạn E1 được phân tách trên cột silica

gel với hệ dung môi n-hexan/CH2Cl2 gradient với tỷ lệ CH2Cl2 tăng dần từ 50-

70% thu được 24 phân đoạn ký hiệu là E1.1-E1.24 Phân đoạn E1.7 được tinh chế

trên cột silica gel với hệ dung môi n-hexan/CH2Cl2gradient với tỷ lệ CH2Cl2 tăng

dần từ 2- 40% thu được 2 phân đoạn ký hiệu là E1.7.1 và E1.7.2 Phân đoạn E1.7.1

tiếp tục được tinh chế trên cột silica gel với hệ dung môi n-hexan/CH2Cl2 gradient

(95:5) và giải hấp cột với hệ dung môi CH2Cl2 / MeOH gradient cho hợp chất F1

(12 mg) Phân đoạn E1.12 được kết tinh lại trong hệ n-Hexan:diclometan (3:7) thu

được 103 mg tinh thể hình kim, màu trắng Hợp chất này được nhận dạng là

Bã

Ngâm chiết trong MeOH (3 lần, mỗi lần 24h) Cất loại dung môi dưới áp suất thấp

Bã

sitosterol dựa vào việc so sánh điểm nóng chảy và sắc ký lớp mỏng (TLC) với hợp

chất β-sitosterol chuẩn có sẵn trong phòng thí nghiệm

Phân đoạn E2 xuất hiện chất rắn màu trắng, chất rắn được lọc và rửa lại nhiều lần với hệ CH2Cl2/MeOH, thu được 45 mg hợp chất F2.Ngoài ra, dịch lọc

được quay khô rồi tinh chế trên cột silicagel với dung môi rửa giải là CH2Cl2 / MeOH gradient thu được 30 mg chất bột màu trắng Hợp chất này được nhận dạng

là β-sitosterol glucoside dựa vào việc so sánh nóng chảy và sắc ký lớp mỏng (TLC)

với hợp chất β-sitosterol glucoside chuẩn có sẵn trong phòng thí nghiệm

Phân đoạn E5 được phân tách trên cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/ MeOH/HCOOH (80:15:5) gradient thu được 11 phân đoạn ký hiệu là E5.1-E5.11 Tinh thể của phân đoạn E5.4 được tinh chế trên cột sephadex LH 20 cho hợp chất

F3 (7 mg) Tinh thể của phân đoạn E5.9 tiếp tục được tinh chế lại trên cột sephadex

LH-20thu được hợp chấtF4(5 mg)

Sơ đồ 2.2: Sơ đồ phân lập các hợp chất của dịch EtoAc từ vỏ cây Côm

2.3.2 Khảo sát hoạt tính gây độc tế bàocủa các chất phân lập đƣợc từ dịch chiết etylaxetat

Các chất đã tinh sạch được tiến hành thử hoạt tính theo các phương pháp đã nêu trong phần 2.2.2

Cân 3mg chất cần thử, hòa tan bằng DMSO (150μl) có giếng chất nồng độ đầu là 20mg/ml Tiến hành pha loãng tiếp theo tỉ lệ ¼ để được các nồng độ chất thử tiếp theo Chất sau khi hòa tan trong DMSO được pha loãng về các nồng độ thấp hơn bằng nước cất cho các nồng độ lần lượt là 2,56 mg/ml; 0,64 mg/ml;0,16 mg/ml; 0,04 mg/ml; 0,01 mg/ml Sử dụng 10 μl chất thử đã pha loãng cho mỗi giếng thử nghiệm để được các nồng độ 128 g/ml; 32g/ml; 8g/ml; 2g/ml; 0,5g/ml

Tiến hành thử theo các phương pháp đã nêu

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Trong khuôn khổ dự án Pháp – Việt về “Nghiên cứu hóa thực vật thảm thực vật Việt Nam”, cây Côm đã được thử sơ bộ hoạt tính sinh học Kết quả cho thấy dịch chiết etylaxetat của vỏ cây Côm thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào KB (ức chế 89,45 % ở nồng độ 1 µg/ml) Chính vì vậy vỏ cây Côm được tiến hành tách chiết và phân lập các chất theo các phương pháp đã trình bày ở mục

2.3.1.1và mục 2.3.1.2

3.1 Xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập được từ dịch chiết etylaxetat

Từ cặn chiết EtoAc chúng tôi tiến hành phân lập các hoạt chất theo sơ đồ 2.2

Kết quả thu được 4 chất sạch kí hiệu là F1-F4 Các chất này được xác định cấu trúc

hóa học bằng cách kết hợp các phương pháp phổ và so sánh số liệu phổ của chúng với các dữ liệu phổ đã được công bố

3.1.1 Chất F1 (pentacosyl ferulate)

Trên phổ EI-MS của F1 cho thấy sự xuất hiện của pic ion phân tử [M]+ tại m/z 544 Trên phổ 1H-NMR thấy xuất hiện tín hiệu của nhóm methyl ở trường cao

δH 0,88 (t,J = 7 Hz, CH3-25’) và một nhóm methoxy (OCH3) ở δH 3,915 Ở vùng trường thấp thấy xuất hiện tín hiệu của 3 proton đặc trưng cho vòng thơm bị thế hệ ABX,ở δH 6,86 (d,J = 8 Hz, H-5), 7,05 (dd,J = 2 Hz và 8Hz, H-6) và 7,08 (d,J=2Hz, H-2) Ngoài ra còn có tín hiệu của 2 proton alken có cấu hìnhtrans (E) ở δH 6,39

(d,J=16Hz, H-8) và 7,61 (d,J=16Hz, H-7) Ngoài ra còn có tín hiệu của 24 nhóm

methylen, trong đó nhóm methylen có tín hiệu proton ở δH 4,10 (t, J = 6,5 Hz, CH21’) cho thấy nhóm này liên kết với dị tố oxy

-Trên phổ 13

C NMR và DEPT của F1, ngoài các tín hiệu tương ứng với các

nhóm đã được quan sát trên phổ 1H NMR, còn xuất hiện tín hiệu của nhóm cacbonyl cacboxylate tại δC 167,8 và 3 cacbon thơm bão hòa ở δC126,1, 147,4 và 148,5 Các cacbon ở δC 147,4 và 148,5 cho thấy chúng được liên kết với nguyên tử oxy

Kết hợp pic ion phân tử trên phổ khối lượng với các tín hiệu 1D NMR,

công thức phân tử của chất F1 được xác định là C35H60O4 Phân tich phổ 2D NMR cho thấy sự có mặt của 2 mảng cấu trúc của hợp chất F1: A)axit ferulic, B)pentacosan-1-ol Việc kết nối giữa 2 phần cấu trúc này được thực hiện nhờ phân tích phổ HMBC Trong đó tương tác giữa cacbon cacboxylate ở với proton của nhóm CH2-1’ ở được quan sát thấy trên phổ HMBC của F1 Điều này cho thấy hợp chất F1 là ester của axit ferulic và pentacosan-1-ol Như vậy hợp chất F1 được xác định là pentacosyl ferulate Hợp chất này đã được phân lập trước

đây từ loài Bauhainia manca

Hình 13: Cấu trúc hóa học của hợp chất F1

δC Độ chuyển dịch hóa học của C

δHm Độ chuyển dịch hóa học của H multiplet

3.1.2 Chất F2 (Axit 3,3’,4’-tri-O-metyl-4-[O-β-D-(2”-acetyl)-glucopyranoside]-ellagic)

Hợp chất F2 được phân lập dưới dạng chất rắn màu trắng Phổ khối ESI-MS

cho pic ion giả phân tử [M+Na]+ ở m/z 571 Trên phổ 1H-NMR của hợp chất F1, cho

tín hiệu của 3 nhóm metoxy ở δH 3,91 (s, 3H); 3,97 (s, 3H); 3,99 (s, 3H) và tín hiệu của

2 proton vòng thơm ở δH 7,32 (s, 1H) và 7,71 (s, 1H) Ngoài ra, còn có tín hiệu của 1

nhóm axetyl ở δ H 2,10 và các proton của đường nằm trong khoảng δ H 3,39-5,36 trong

đó proton anome H-1” ở δ H 5,36 (d, J=8,0 Hz, 1H) Phổ 13C-NMR và DEPT xác nhận

sự có mặt của các tín hiệu của 25 cacbon trong đó có nhóm đường [δ C60,4 (CH2-6”), 69,6 (C-5”), 73,5 (C-3”), 73,7 (C-2”), 77,4 (C-4”), 98,9 (C-1”)], 3 nhóm metoxy, 1 nhóm axetyl và 14 cacbon sp2 Độ chuyển dịch hóa học của các tín hiệu tại δ C157,6 (C-7’) và 157,8 (C-7) cho thấy nhiều khả năng đây là các tín hiệu của nhóm cacbonyl

lacton Các dữ kiện thu được cho phép giả thiết F2 là dẫn xuất của axit ellagic Điều

này được khẳng định nhờ phân tích phổ HMBC (Hình 14) Ngoài ra, trên phổ HMBC cho thấy H-1” của nhóm đường tương tác với C-4 của khung axit ellagic chứng tỏ nhóm đường gắn kết ở vị trí C-4 Tương tác giữa H-2’’ của nhóm đường với nhóm cacbonyl của axetyl chứng tỏ nhóm axetyl gắn với đường ở vị trí C-2’’ Tương tự, 3 nhóm OCH3 tạiδ H 3,99, 3,97 và 3,91 đượcxác định tương ứng tại vị trí C-3, C-3’ và C-4’ nhờ tương tác giữa chúng trên phổ HMBC Kết hợp các phương pháp phổ 1D và

2D-NMR và so sánh với tài liệu đã công bố [32] Cho phép xác định hợp chất F2 là

axit 3,3’,4’-tri-O-metyl-4-[O-β-D-(2”-acetyl)-glucopyranoside]-ellagic

Hình 14:Cấu trúc hóa học của chất F2

δC Độ chuyển dịch hóa học của C

δHm Độ chuyển dịch hóa học của H multiplet

3.1.3 Chất F3 (axit 3,3’-di-O-metyl-4-O-α-rhamnoside-ellagic)

Hợp chất F3 được phân lập dưới dạng chất rắn màu trắng, điểm nóng chảy

186-187oC Phổ khối ESI-MS cho pic ion phân tử [M+H]+

ở m/z 477 So sánh tín

hiệu phổ 1D NMR của F3 và F2 cho thấy có các sự khác biệt sau: thiếu tín hiệu của

1 nhóm metoxy và tín hiệu của của phần glucopyranose của F2 được thay thế bằng

tín hiệu của đường rhamnopyranose [δC17,9 (CH3-6”), 70,0 (C-2”), 70,3 (C-4”), 70,4 (C-5”); 71,5 (C-3”), 99,8 (C-1”)] Phân tích phổ HMBC cho phép xác định liên kết của nhóm rhamnopyranose tại C-4 và 2 nhóm metoxy tại C-3 và C-3’ của khung axit ellagic Phân tích chi tiết phổ 1D và 2D NMR và so sánh với tài liệu đã

được công bố [27]cho phép xác định hợp chất F3 là axit

δC Độ chuyển dịch hóa học của C

δHm Độ chuyển dịch hóa học của H multiplet

Hình 15: Cấu trúc hóa học của chất F3

3.1.4 Chất F4 (Axit 3-O-metyl-4-O-α-rhamnoside-ellagic)

Hợp chấtF4 được phân lập dưới dạng chất bột trắng Phổ ESI-MS cho pic ion

phân tử [M+H]+ ở m/z 463 Phổ 1D NMR của F4 cho các tín hiệu gần giống với 3,

ngoại trừ sự thiếu vắng tín hiệu của 1 nhóm metoxy Phân tích phổ 2D NMR và so

sánh với tài liệu tham khảo, hợp chất F4 được xác định là axit

3.2 Kết quả khảo sát hoạt tính gây độc tế bào của các chất phân lập đƣợc từ dịch EtOAc

Các tế bào ung thư là những tế bào kém biệt hóa do sự phân chia quá nhanh chóng và diễn ra liên tục Chúng có khả năng vượt qua sự kiểm soát của hệ miễn dịch của cơ thể và tăng cường xâm lấn vào các tổ chức sống lân cận Những chất có khả năng phòng chống và điều trị ung thư là những chất có khả năng ngăn ngừa sự hoạt động và bắt giữ các tác nhân gây ung thư, ức chế quá trình tiến triển bệnh thông qua sự ức chế hoạt động của một số enzyme hay tác động gây biệt hóa tế bào Phép thử sinh học để sàng lọc và tìm kiếm các hoạt chất chữa trị bệnh ung thư sử dụng chính tế bào ung thư làm đối tượng nghiên cứu

Trong nghiên cứu của chúng tôi, các dịch chiết thô của cây Côm cũng được kiểm tra hoạt tính ức chế sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư thông qua phép thử độc tế bào với 02 dòng tế bào ung thư đặc trưng được lựa chọn là KB (ung thư biểu mô), MCF-7 (ung thư vú) Kết quả thử độc tế bào được trình bày ở bảng 3.5

Bảg 3.5:Kết quả thử hoạt tínhđộc tế bàocủa các chất phân lập đƣợc từ câyCôm

Các kết quả thử nghiệm cho thấy:

Hợp chất F4và F1 không thể hiện hoạt tính trên cả 2 dòng tế bào ung thư thử

nghiệm với giá trị IC50>128 μg/ml Chất đối chứng dương Elipticine thể hiện hoạt

tính gây độc đối với cả hai dòng tế bào ung thư với giá trị IC50 trong khoảng từ 0,31 μg/ml- 0,53 μg/ml, kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước đây.Mặt

khác, hợp chất F3 thể hiện hoạt tính ức chế sự phát triển của tế bào ung thư KB với

giá trị IC50 là 28,3 μg/ml, trong khi đó hợp chất này hầu như không thể hiện hoạt

tính trên dòng MCF-7 So sánh cấu trúc hợp chất F3 và F4 cho thấy 2 hợp chất này chỉ khác nhau về sự có xuất hiện của nhóm methoxy trong hợp chất F3 Hợp chất

F3 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên dòng KB cao hơn so với hợp chất F4 Như

vậy nhóm chức methoxy có thể đóng vai trò quan trọng đối với hoạt tính ức chế

dòng tế bào KB của chất F3 Chất F2 có hoạt tính ức chế khá cao trên 2 dòng tế bào

KB và MCF7 với giá trị IC50 lần lượt là 7,04 μg/ml và 24,8 μg/ml Như vậy, chất F2 được đánh giá là có hoạt tính gây độc tế bào khá mạnh Các kết quả thử nghiệm gây độc tế bào đối với các dòng tế bào ung thư thực nghiệm trên đây cho phép sử dụng F2như một hoạt chất có nguồn gốc thảo dược trong việc phòng và điều trị ung thư,

có khả năng ức chế sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư biểu mô và ung thư vú

Cặn chiết tổng ban đầu etylaxetat có hoạt tính ức chế rất cao trên dòng tế bào

KB với giá trị IC50<1,0 μg/ml Trong khi đó các hợp chất sạch phân lập được từ cặn chiết EtOAc của cây Côm có hoạt tính gây độc tế bào ung thư yếu hơn so với kết quả thu được đối với cặn tổng ban đầu Điều này có thể giải thích là hợp chất có hoạt tính mạnh có hàm lượng thấp, nên chưa phân lập được hoặc có thể xẩy ra hiện tượng hiệp đồng giữa các chất có trong cặn chiết ban đầu

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Kết luận:

1 Loài CômElaeocarpus griffithi đã được nghiên cứu hóa học theo định hướng hoạt

tính sinh học Lần đầu tiên từ cây này đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 4 chất, đó là:

2 Kết quả khảo sát hoạt tính của 4 chất phân lập được là F1, F2, F3, F4 cho thấy:

 Chất F2 có hoạt tính độc trên 2 dòng tế bào là KB và MCF7 với giá trị IC50 lần lượt là 7,04 μg/ml và 24,8 μg/ml là hoạt chất có tiềm năng trong việc nghiên cứu

sử dụng làm thuốc hỗ trợ và phòng chống ung thư vì có tác dụng gây độc tế bào trên 2 dòng tế bào ung thư là ung thư biểu mô và ung thư vú Đặc biệt là tính gây độc cao ở tế bào ung thư biểu mô Vì vậy, cần nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính hướng đích trong chữa trị ung thư của hoạt chất này

 Chất F3thể hiệnhoạt tính gây độc trên dòng ung thư biểu mô KB với giá trị IC50