Hóa phân tích, Thuốc kháng sinh, Dược phẩm, Betalactam, Phương pháp phân tích hiện đại.

Có rất nhiều phương pháp phân tích hàm lượng kháng sinh trong các mẫu sinh học như quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis, phương pháp von-ampe hòa tan, sắc ký lỏng hiệu năng cao với nhiều det

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-* -

NGUYỄN THỊ ÁNH TUYẾT

NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG KHÁNG SINH HỌ BETALACTAM TRONG ĐỐI TƯỢNG DƯỢC PHẨM VÀ SINH HỌC BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HIỆN ĐẠI

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

HÀ NỘI – 2013

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN THỊ ÁNH TUYẾT

NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG KHÁNG SINH HỌ BETALACTAM TRONG ĐỐI TƯỢNG DƯỢC PHẨM VÀ SINH HỌC BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HIỆN ĐẠI

HÀ NỘI – 2013

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các

số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và nội dung này chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào trước đó

Hà Nội, tháng 2 năm 2013

Tác giả luận án

Nguyễn Thị Ánh Tuyết

LỜI CẢM ƠN

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy PGS TS NGUYỄN VĂN RI và

GS TS PHẠM HÙNG VIỆT đã giao đề tài và tận tình hướng dẫn, động viên, giúp

đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình làm luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn Quý thầy cô, các anh chị cán bộ trong Bộ môn Hóa Phân tích, Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Trung tâm nghiên cứu công nghệ môi trường và phát triển bền vững - Đại học Khoa học Tự nhiên Đại học Quốc gia Hà Nội đã tận tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị cán bộ nghiên cứu, Ban Lãnh đạo Viện Khoa học công nghệ môi trường (INEST) đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận án

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Ban Chủ nhiệm Khoa Cơ bản, Trường Đại học Y- Dược Thái Nguyên đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi được học tập và hoàn thành bản luận án

Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn bố mẹ, anh chị, gia đình và bạn bè, đồng nghiệp những người luôn động viên, chia sẻ mọi khó khăn cùng tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận án

Hà Nội, tháng 2 năm 2013

Nghiên cứu sinh

Nguyễn Thị Ánh Tuyết

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁN vi

KÝ HIỆU ĐƠN VỊ ĐO LƯỜNG CÁC ĐƠN VỊ ĐO LƯỜNG viii

DANH MỤC CÁC BẢNG ix

DANH MỤC CÁC HÌNH xii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Giới thiệu chung về chất kháng sinh β- lactam 4

1.1.1 Tính chất vật lý và hoá học 7

1.1.2 Tác dụng 9

1.1.3 Tính chất quang học của các β- lactam 10

1.2 Tình hình lạm dụng kháng sinh ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay 10

1.3 Một số phương pháp định lượng β- lactam 13

1.3.1 Phương pháp quang học 13

1.3.2 Phương pháp điện hóa 14

1.3.3 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 15

1.3.4 Phương pháp điện di mao quản- electrophoresis (CE) 19

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Mục tiêu nghiên cứu 25

2.2 Phương pháp nghiên cứu 25

2.2.1 Kỹ thuật phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). 25

2.2.1.1 Phương pháp RP - HPLC, detector UV 26

2.2.1.2 Phương pháp RP - HPLC, detector huỳnh quang 31

2.2.1.3 Ứng dụng phương pháp RP - HPLC, detector huỳnh quang để phân tích mẫu 34

2.2.1.4 Phương pháp xử lý số liệu phân tích 36

2.2.2 Kỹ thuật điện di mao quản (CE) 39

2.3 Hóa chất, mẫu phân tích và thiết bị, dụng cụ 50

2.3.1 Hóa chất 50

2.3.2 Mẫu phân tích 52

2.3.3 Thiết bị và dụng cụ 53

2.3.3.1 Thiết bị 53

2.3.3.2 Dụng cụ 54

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 56

3.1 Tách và xác định đồng thời kháng sinh -lactam bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 56

3.1.1 Kỹ thuật RP - HPLC, detector UV 56

3.1.1.1 Chọn các thông số máy đo để phát hiện chất phân tích 56

3.1.1.2 Hệ dung môi pha động 57

3.1.1.3 Đánh giá thống kê phương pháp phân tích - lactam bằng phương pháp RP-HPLC 64

3.1.1.4 Phân tích mẫu 70

3.1.2 Kỹ thuật RP- HPLC, detector huỳnh quang. 73

3.1.2.1 Khảo sát các điều kiện tạo dẫn xuất giữa  - lactam và thuốc thử NBD-F 73

3.1.2.2 Tối ưu hóa các điều kiện tách và định lượng một số kháng sinh họ  - lactam 77

3.1.2.3 Đánh giá phương pháp phân tích 85

3.1.2.4 Phân tích mẫu 90

3.1.3 Kết luận về phương pháp HPLC 94

3.2 Tách và xác định đồng thời kháng sinh β- lactam bằng kỹ thuật điện di mao quản điện động học kiểu mixen (MEKC) 95

3.2.1 Chọn các thông số máy điện di 95

3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của dung dịch điện giải đến quá trình điện di 96

3.2.2.1 Ảnh hưởng của thành phần dung dịch đệm 96

3.2.2.2 Ảnh hưởng pH của dung dịch đệm điện di 96

3.2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất mixen SDS 99

3.2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đệm 101

3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng thời gian bơm mẫu 104

3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng thế điện di 105

3.2.5 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ của mao quản 107

3.2.6 Đánh giá thống kê phương pháp phân tích -lactam bằng MEKC 109

3.2.6.1 Khảo sát khoảng tuyến tính và lập đường chuẩn 109

3.2.6.2 Độ chính xác 112

3.2.6.3 Độ lặp lại của phép đo 116

3.2.6.4 Giới hạn pháp hiện và giới hạn định lượng của phương pháp CE 116

3.2.7 Phân tích mẫu 117

3.2.7.1 Phân tích mẫu dược phẩm 117

3.2.7.2 Phân tích mẫu nước tiểu 119

3.2.8 Kết luận về phương pháp điện di (CE) 125

3.3 So sánh kết quả phân tích của các phương pháp MEKC, HPLC- UV, HPLC- huỳnh quang 126

KẾT LUẬN 128

KIẾN NGHỊ 130

DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN131 TÀI LIỆU THAM KHẢO 132

PHỤ LỤC 141

KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁN

6APA : Axit 6-amino penicillanic

Gram (-) : Gram âm (vi khuẩn)

Gram (+) : Gram dương (vi khuẩn)

HLB : Chất hấp phụ (hydrophilic lipophilic balance)

Hpíc : Chiều cao píc sắc kí

HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao

(High performance Liquid Chromatography) HPLC-MS : Sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối khối phổ

MAX : Giá trị cao nhất

MEKC : Điện di mao quản điện động học kiểu Mixen- MEKC

(Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography) MeOH : Metanol

OXA : Oxacillin

PENG : Penicillin G

RP- HPLC : Sắc kí lỏng hiệu năng cao pha đảo

(Reversed phase- High performance liquid chromatography) rpm : Vòng / phút

RSD : Độ lệch chuẩn tương đối

SDS : Natri dodecyl sunfat

SP : Pha tĩnh (static phase)

SPE : Chiết pha rắn (solid phase extraction)

Spic : Diện tích píc sắc kí

TCA : Axit tricloaxetic

UV : Tia cực tím (ultra violet)

v/v : Thể tích /thể tích

KÝ HIỆU CÁC ĐƠN VỊ ĐO LƯỜNG ĐƯỢC VIẾT TẮT

% : Phần trăm

µg : Microgam

µm : Micromet Cal : Calo

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Phân loại và cấu trúc một số penicillin 5

Bảng 1.2 Phân loại và cấu trúc một số cephalosporin 7

Bảng 1.3 Hằng số axit của các kháng sinh nghiên cứu 9

Bảng 2.1 Các điều kiện tách và xác định  - lactam 33

Bảng 2.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình tách các β- lactam bằng CE 47

Bảng 2.3 Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 51

Bảng 2.4 Thông tin mẫu thuốc phân tích 52

Bảng 3.1 Sự phụ thuộc k’ vào pH của pha động chạy sắc ký 58

Bảng 3.2 Sự phụ thuộc của k’ vào thành phần pha động chạy sắc kí 60

Bảng 3.3 Thời gian lưu (phút) và diện tích píc (mAu.s) của các chất phụ thuộc vào nồng độ đệm 61

Bảng 3.4 Tóm tắt các điều kiện thực nghiệm tối ưu để tách các β- lactam 63

Bảng 3.5 Sự phụ thuộc của Spic vào nồng độ chất phân tích 65

Bảng 3.6 LOD và LOQ của phương pháp HPLC-UV Vis 66

Bảng 3.7 Độ chính xác của phương pháp phân tích HPLC/UV (0,15 µg/ml) 67

Bảng 3.8 Độ chính xác của phương pháp phân tích HPLC/UV (0,40 µg/ml) 68

Bảng 3.9 Độ chính xác của phương pháp phân tích HPLC/UV (0,80 µg/ml) 69

Bảng 3.10 Độ lặp lại của phép đo ở các nồng độ chất phân tích khác nhau 70

Bảng 3.11 Kết quả tính hàm lượng kháng sinh trong mẫu dược phẩm. 71

Bảng 3.12 Hiệu suất thu hồi của mẫu nước tiểu 72

Bảng 3.13 Sự phụ thuộc của Spíc vào nhiệt độ phản ứng 74

Bảng 3.14 Sự phụ thuộc của Spíc vào lượng dư thuốc thử. 76

Bảng 3.15 Sự phụ thuộc của thời gian lưu và hệ số tách của các chất vào pH pha động 78

Bảng 3.16 Sự phụ thuộc của thời gian lưu vào tỉ lệ giữa dung môi hữu cơ

và đệm 79

Bảng 3.17 Thời gian lưu và diện tích píc của các chất phụ thuộc vào nồng

độ đệm 82

Bảng 3.18 Thời gian lưu và diện tích píc của các chất phân tích phụ thuộc vào tốc độ pha động 83

Bảng 3.19 Sự phụ thuộc của Spic vào nồng độ chất phân tích 85

Bảng 3.20 Các giá trị Ftính, Fbảng và phương trình đường chuẩn của các kháng sinh β- lactam 87

Bảng 3.21 Độ chính xác của phương pháp phân tích tại nồng độ các chất 0,15 µg/ml 88

Bảng 3.22 Độ chính xác của phương pháp phân tích tại nồng độ các chất 0,40 µg/ml 88

Bảng 3.23 Độ chính xác của phương pháp phân tích tại nồng độ các chất 0,80 µg/ml 89

Bảng 3.24 Độ lặp lại của phép đo ở các nồng độ chất phân tích khác nhau 89

Bảng 3.25 Thông tin mẫu thuốc phân tích 90

Bảng 3.26 Kết quả độ thu hồi xác định β-lactam theo phương pháp thêm chuẩn trong mẫu thuốc 91

Bảng 3.27 Kết quả phân tích các β- lactam trong mẫu nước tiểu 92

Bảng 3.28 Hiệu suất thu hồi của CEP, CEC và AMP trong mẫu huyết thanh 93

Bảng 3.29 Ảnh hưởng của pH đến thời gian di chuyển của β-lactam 97

Bảng 3.30 Ảnh hưởng nồng độ SDS đến thời gian lưu của β-lactam 99

Bảng 3.31 Ảnh hưởng của nồng độ đệm tới thời gian lưu (phút) 102

Bảng 3.32 Ảnh hưởng của thời gian bơm mẫu tới thời gian lưu (phút) 104

Bảng 3.33 Ảnh hưởng của thế điện di tới thời gian lưu (phút) 106

Bảng 3.34 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới thời gian di chuyển β-lactam 107

Bảng 3.35 Tổng kết các điều kiện tối ưu 109

Bảng 3.36 Chiều cao píc β-lactam tại các nồng độ khác nhau 110

Bảng 3.37 Độ chính xác của phương pháp phân tích (1 µg/ml) 113

Bảng 3.38 Độ chính xác của phương pháp phân tích (5 µg/ml) 114

Bảng 3.39 Độ chính xác của phương pháp phân tích (10 µg/ml) 115

Bảng 3.40 Đánh giá độ lặp lại của phương pháp phân tích 116

Bảng 3.41 Giới hạn phát hiện của phương pháp 117

Bảng 3.42 Thông tin và đặc điểm từng loại thuốc 117

Bảng 3.43 Kết quả tính hàm lượng kháng sinh trong mẫu thuốc 118

Bảng 3.44 Hiệu suất thu hồi ở các nồng độ CH3OH khác nhau 120

Bảng 3.45 Hiệu suất thu hồi ở các thể tích rửa giải tạp chất khác nhau 121

Bảng 3.46 Kết quả phân tích nồng độ AMO và CEP trong mẫu nước tiểu người tình nguyện 124

Bảng 3.47 So sánh LOD, LOQ, kết quả phân tích mẫu dược phẩm của phương pháp MEKC và HPLC 126

Bảng 3.48 Kết quả phân tích các mẫu sinh học bằng phương pháp HPLC 127

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Công thức cấu tạo các kháng sinh penicillin 5

Hình 1.2 Công thức cấu tạo các kháng sinh cephalosporin 6

Hình 1.3 Độ bền khung cephalosporin 8

Hình 1.4 Axit cephalosporoic 8

Hình 1.5 Sơ đồ các bước trong quá trình chiết pha rắn 21

Hình 1.6 Cơ chế SPE phân tích các mẫu nước 21

Hình 1.7 Cấu trúc của pha tĩnh cột SPE dùng cho các mẫu sinh học 22

Hình 1.8 So sánh yếu tố lưu giữ (k’) giữa cột C18 và cột Oasis® HLB 22

Hình 1.9 Sơ đồ tổng quát chiết SPE với cột Oasis® HLB 23

Hình 2.1 Sơ đồ chi tiết hệ thống máy HPLC 26

Hình 2.2 Sơ đồ phân tích mẫu dược phẩm theo kỹ thuật HPLC, detector UV 29

Hình 2.3 Phân tích mẫu nước tiểu bằng RP-HPLC, detetor UV 30

Hình 2.4 Sơ đồ cấu tạo của detector huỳnh quang. 31

Hình 2.5 Sơ đồ xử lý mẫu dược phẩm 34

Hình 2.6 Sơ đồ phân tích mẫu nước tiểu bằng phương pháp HPLC, detector huỳnh quang 35

Hình 2.7 Sơ đồ xử lý mẫu huyết thanh phân tích HPLC- huỳnh quang 36

Hình 2.8 Sơ đồ nguyên tắc cấu tạo của hệ CE 41

Hình 2.9 Cấu trúc của các Mixen và dòng EOF trong MEKC 43

Hình 2.10 Sơ đồ phân tích mẫu dược phẩm theo phương pháp CE 48

Hình 2.11 Hệ thống CE Model 1602A – Agilent 54

Hình 2.12 Hệ thống HPLC model LC-20AD của hãng Shimadzu 54

Hình 3.1 Sự phụ thuộc ki’ vào pH của pha động chạy sắc ký 59

Hình 3.2 Sự phụ thuộc ki’ vào thành phần pha động chạy sắc ký 60

Hình 3.3 Sự phụ thuộc diện tích pic sắc ký vào tốc độ pha động 62 Hình 3.4 Sắc đồ sắc ký của 5 chất kháng sinh họ β-lactam tại điều kiện tối ưu:

đệm axetat 10mM pH 3,50; tỷ lệ ACN/MeOH/đệm là 10/20/70 (v/v/v);

tốc độ 0,8ml/phút; nhiệt độ cột tách 300C; thể tích mẫu 20µl; detector

đơn bước sóng 225nm. 64

Hình 3.5 Đường chuẩn của các β-lactam trong khoảng nồng độ 0,10µg/ml đến 2,0µg/ml 66

Hình 3.6 Đồ thị xác định các chất β- lactam theo phương pháp thêm chuẩn 72

Hình 3.7 Đồ thị sự phụ thuộc Spíc vào nhiệt độ phản ứng 74

Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc Spíc vào thời gian phản ứng 75

Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc Spíc vào lượng dư thuốc thử (NBD-F). 76

Hình 3.10 Sự phụ thuộc ki’ vào pH của pha động 78

Hình 3.11 Sắc ký đồ của 3 kháng sinh β-lactam (1) là CEP, (2) là CEC và (3) là AMP tại các tỉ lệ dung môi hữu cơ/đệm (v/v) khác nhau 80

Hình 3.12 Sự phụ thuộc ki’ vào tỉ lệ ACN/MeOH 81

Hình 3.13 Sắc đồ sắc ký của 3 kháng sinh β-lactam: (1) là CEP; (2) CEC; (3) AMP ở các nồng độ đệm khác nhau 83

Hình 3.14 Sắc đồ sắc ký của 3 kháng sinh β-lactam ở điều kiện tối ưu. 84

Hình 3.15 Đường chuẩn của các β-lactam trong khoảng nồng độ 0,05µg/ml đến 2µg/ml 86

Hình 3.16 Phổ hấp thụ của các β-lactam (nồng độ 10µg/ml ) 95

Hình 3.17 Ảnh hưởng pH dung dịch đệm điện di đến độ điện di hiệu dụng của β-lactam 97

Hình 3.18 Ảnh hưởng của nồng độ SDS trong dung dịch đệm điện di đến độ điện di hiệu dụng của β-lactam 99

Hình 3.19 Sắc đồ điện di của β-lactam tại nồng độ đệm 20mM, 25mM, 30mM và 35mM 102

Hình 3.20 Ảnh hưởng của nồng độ đệm đến độ điện di hiệu dụng của β-lactam 103

Hình 3.21 Ảnh hưởng của thời gian bơm mẫu tới chiều cao píc sắc ký 104

Hình 3.22 Sắc đồ điện di của các betalactam ở các thế điện di khác nhau 106

Hình 3.23 Ảnh hưởng của thế điện di đến độ điện di hiệu dụng của β-lactam 106

Hình 3.24 Ảnh hưởng nhiệt độ tới độ điện di hiệu dụng của β-lactam 107

Hình 3.25 Sắc đồ điện di của các β-lactam tại điều kiện tối ưu như trên 109

Hình 3.26 Sắc đồ điện di của β-lactam tại nồng độ 15ppm 110

Hình 3.27 Đường chuẩn của 7 loại β-lactam có nồng độ 1-10ppm 112

Hình 3.28 Ảnh hưởng nồng độ CH3OH đến hiệu quả chiết SPE 120

Hình 3.29 Ảnh hưởng thể tích rửa giải tạp chất bẩn đến hiệu quả chiết SPE 121

Hình 3.30 Sơ đồ phân tích β-lactam trong mẫu nước tiểu kết hợp cột chiết pha rắn Oasis® HLB và MEKC 122

Hình 3.31 Sắc đồ điện di của mẫu nước tiểu lấy từ người tình nguyện uống AMO và CEP 125

MỞ ĐẦU

Các kháng sinh là thuốc thiết yếu trong y học hiện đại, nhờ các thuốc kháng sinh mà y học có thể loại bỏ được các dịch bệnh nguy hiểm đối với con người và động vật như dịch hạch, dịch tả, thương hàn và điều trị hiệu quả nhiều loại bệnh gây

ra bởi vi khuẩn.Từ khi Alexander Fleming tìm ra penicillin (1928) thì việc điều trị các bệnh nhiễm khuẩn có những tiến bộ rất lớn, kháng sinh đã giúp điều trị được nhiều bệnh hiểm nghèo, mang lại sự sống cho con người mà trước đó y học không

có khả năng chữa trị

Đối với các nước đang phát triển, thuốc kháng sinh lại giữ một vị trí rất quan trọng, vì các nước này do điều kiện vệ sinh kém và mức sống còn thấp nên thường xảy ra các dịch tả, kiết lị, nhiễm khuẩn đường hô hấp… Ở nước ta có một số tài liệu công bố các kháng sinh chiếm 25-30% tổng số thuốc sử dụng hàng năm mà hiện chưa có một tài liệu chính xác nào công bố về việc điều tra chi tiết vấn đề này, nhưng chắc chắn các thuốc kháng sinh là các thuốc được sử dụng nhiều nhất ở nước

ta và ở các nước đang phát triển, còn ở các nước Châu Âu và Nhật Bản… thì các nhóm thuốc được sử dụng nhiều nhất lại là thuốc điều trị tim mạch, các thuốc điều trị các bệnh thần kinh- tâm thần, các thuốc chống viêm và các thuốc giảm béo Kháng sinh họ β-lactam gồm rất nhiều loại như: Penixilin, Ampixilin, Amoxilin … với vô số các tên biệt dược khác nhau, các loại kháng sinh trên có thể đơn độc hoặc được kết hợp với một số hóa chất khác như Augmentin (gồm Amoxilin và muối của axit Clavulanic), Unasyn (gồm Ampixilin và Sulbactam) Các thuốc này đều có hoạt phổ kháng khuẩn rộng, dùng để điều trị hầu hết các bệnh nhiễm khuẩn cho người hoặc cho vật nuôi

Tuy nhiên, sự lạm dụng kháng sinh, sử dụng kháng sinh không đúng liều lượng và cách dùng kháng sinh không đúng sẽ dễ bị vi khuẩn nhờn thuốc, kháng thuốc, từ đó việc chữa trị càng khó khăn [2 Đối với những người cao tuổi, lượng

dư kháng sinh trong nước tiểu nhiều, còn gây ra các bệnh về thận Đồng thời, lượng

dư này thải ra môi trường sẽ gây lên những hậu quả vô cùng nghiêm trọng Vì vậy,

kiểm soát và phân tích thuốc kháng sinh đối với người bệnh là biện pháp cần thiết

để nâng cao hiệu quả sử dụng chúng Mặt khác bằng việc phân tích hàm lượng kháng sinh trong máu, hay trong nước tiểu ta có thể biết được hàm lượng kháng sinh nó tồn tại trong cơ thể là bao nhiêu, có đủ hàm lượng để tiêu diệt vi khuẩn hay không, từ đó có được phác đồ điều trị hợp lý

Có rất nhiều phương pháp phân tích hàm lượng kháng sinh trong các mẫu sinh học như quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis, phương pháp von-ampe hòa tan, sắc ký lỏng hiệu năng cao với nhiều detector khác nhau, đặc biệt là phương pháp điện di mao quản mới được phát triển gần đây Vì vậy việc nghiên cứu lựa chọn phương pháp phân tích đảm bảo độ đúng, độ chọn lọc, chi phí phân tích không cao, đơn giản, có thể áp dụng để kiểm tra song hành với các phương pháp trong dược điển là cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn Trong số các phương pháp phân tích công cụ hiện đại đó thì phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao và điện di mao quản có nhiều lợi thế, có thể đáp ứng được yêu cầu đặt ra, vì vậy chúng tôi chọn phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao và điện di mao quản để tách và xác định kháng sinh β-lactam Hơn nữa ở nước ta phương pháp điện di mao quản chưa được nghiên cứu nhiều Xét

về hiệu quả tách và thời gian phân tích, phương pháp điện di mao quản có rất nhiều lợi thế nên gần đây các nhà khoa học bắt đầu quan tâm tới phương pháp này Do đó

chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu phân tích đánh giá hàm lượng kháng sinh họ

betalactam trong đối tượng dược phẩm và sinh học bằng phương pháp phân tích hiện đại”, đây là đề tài có tính thực tiễn, cấp thiết khoa học và phù hợp với tình

hình phát triển kinh tế của nước ta hiện nay

Xuất phát từ những vấn đề trên, mục tiêu của luận án đặt ra là nghiên cứu và tối ưu các điều kiện của kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao, điện di mao quản để tách và định lượng đồng thời một số kháng sinh họ β-lactam trong đối tượng dược phẩm và sinh học, nhằm tìm phương pháp phù hợp để phân tích β-lactam trong các mẫu sinh học, đặc biệt là trong nước tiểu

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN ÁN BAO GỒM:

(1) Nghiên cứu và chọn các điều kiện tối ưu như các thông số của máy, pha tĩnh, pha động… để tách và xác định đồng thời 5 kháng sinh họ betalactam bằng kỹ thuật RP- HPLC với detector UV Đánh giá phương pháp phân tích và ứng dụng phân tích các mẫu dược phẩm, mẫu nước tiểu

(2) Nghiên cứu điều kiện tối ưu tạo dẫn xuất phát huỳnh quang của các betalactam với thuốc thử 7-Fluoro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole (NBD-F) để tách

và xác định đồng thời 3 kháng sinh betalactam bằng kỹ thuật RP- HPLC/ detector huỳnh quang, đánh giá phương pháp phân tích

(3) Ứng dụng phương pháp RP- HPLC/ detector huỳnh quang có độ nhạy và

độ chọn lọc cao để phân tích các mẫu dược phẩm và đặc biệt là phân tích các mẫu sinh học: nước tiểu và mẫu huyết thanh

(4) Nghiên cứu tìm và chọn những điều kiện tối ưu như thông số máy điện di mao quản, kích thước mao quản, thế áp vào 2 đầu mao quản, dung dịch đệm điện di

để tách và xác định đồng thời 7 chất kháng sinh betalactam bằng kỹ thuật điện di mao quản điện động học mixen

(5) Ứng dụng phương pháp điện di mao quản điện động học mixen xác định hàm lượng kháng sinh betalactam trong mẫu dược phẩm và mẫu nước tiểu

Điểm mới về khoa học của luận án: Phương pháp tách và xác định đồng thời

kháng sinh họ betalactam đây là nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam có tính chất hệ thống, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector huỳnh quang để phân tích kháng sinh betalactam trong mẫu sinh học ở nước ta chưa có công trình nào đề cập tới, đặc biệt phương pháp điện di mao quản (MEKC) tiến hành phân tích đồng thời 7 chất kháng sinh betalactam trong mẫu dược phẩm và nước tiểu cũng chưa có công trình nào công bố

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về chất kháng sinh β- lactam

* Lịch sử ra đời [13]

Năm 1928, Alexander Fleming phát hiện ra khả năng kháng khuẩn của nấm

Penicillium notatum, mở đầu cho nghiên cứu và sử dụng kháng sinh, và sau đó là

hàng loạt những nghiên cứu, sản xuất và sử dụng kháng sinh phát triển mạnh do tác dụng hơn hẳn trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn so với các thuốc kháng sinh khác

Sự xuất hiện đề kháng với các kháng sinh β-lactam bắt đầu ngay cả trước khi kháng sinh β-lactam đầu tiên penicillin được phát hiện Enzyme β-lactamase đầu

tiên đã được xác định ở Escherichia coli trước khi penicillin được giới thiệu để sử

dụng trong y học lâm sàng [19]

Kháng sinh là những chất tạo thành do chuyển hoá sinh học, có tác dụng ngăn cản sự tồn tại hoặc phát triển của vi khuẩn ở nồng độ thấp, được sản xuất bằng sinh tổng hợp hoặc tổng hợp theo mẫu các kháng sinh tự nhiên

* Kháng sinh β-lactam

- Định nghĩa:

Là các kháng sinh mà phân tử chứa vòng β-lactam Gồm các nhóm: penicillin, cephalosporin, monobactam, cacbapenem trong đó hai nhóm sử dụng phổ biến và lớn nhất là penicillin và cephalosporin

Các penicillin thu được từ môi trường nuôi cấy nấm Penicilium notatum và

Penicillium chryrogenum, bán tổng hợp từ axit 6_amino penicillanic (6APA)

Các cephalosporin tự nhiên được phân lập từ môi trường nuôi cấy nấm

Cephalosporium acremonium và bán tổng hợp từ axit 7_amino cephalosporinic

(7ACA) xuất phát từ các kháng sinh thiên nhiên

- Cấu trúc và phân loại:

+ Nhóm các penicillin

Các penicillin đều có cấu trúc cơ bản gồm 2 vòng: vòng thiazolidin, vòng

O

CO R

COOM

2 3 4 1

5 6 7

Tên gọi chung công thức của các penicillin khi chưa có mạch nhánh ở vị trí số

6 là: Axit (2S,5R,6R)-

3,3-Dimethyl-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic)

Khi thay thế R bằng các gốc khác nhau, những cacbon bất đối có cấu hình 2S,

5R, 6R ta có các penicilin có độ bền, dược động học và phổ kháng khuẩn khác

nhau Với M là gốc cation thường là: K, Na, H

Nhóm kháng sinh penicillin được chia thành 3 nhóm chính với hoạt tính khác nhau [13]

Bảng 1.1 Phân loại và cấu trúc một số penicillin

Không kháng lactamase

O CH3

oxazole-4-carbonyl)amino]

6-[(5-methyl-3-phenyl-1,2-Là các Penicillin bán tổng hợp Phổ hẹp như nhóm I

Kháng penicillinase, không tác động vào vòng

Tên kháng sinh R Hoạt tính

Cloxacillin

(CLO)

C N

O CH3

Cl

6-{[3-(2-chlorophenyl methyl-oxazole-4- carbonyl]amino}

CH- phenylacetyl] amino)

6-([(2R)-2-amino-2-Phổ rộng, tác dụng cả khuẩn gram (+) và (-) Không kháng β-

penicillinase Amoxicillin

(AMO)

NH2NH2

CH-HO

hydroxyphenyl)-acetyl]amino}

6-{[(2R)-2-amino-2-(4-+ Nhóm các cephalosporin [9, 13]

Các cephalosporin cấu trúc chung gồm 2 vòng: vòng β-Lactam 4 cạnh gắn với 1 dị vòng 6 cạnh, những cacbon bất đối có cấu hình 6R, 7R Khác nhau bởi các gốc -R

H N

O

CO

R1

N S

R3

R2

COOM

1 2 3 4 5

6 7 8

Hình 1.2 Công thức cấu tạo các kháng sinh cephalosporin

Tên gọi chung của các cephalosporin khi chưa có có mạch nhánh (gốc R) là:

Axit (6R,7R) 8-oxo-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylic

Khi thay đổi các gốc R, những cacbon bất đối có cấu hình 6R, 7R được các

cephalosporin có độ bền, tính kháng khuẩn và dược động học khác nhau

Dựa vào phổ kháng khuẩn, các cephalosporin chia thành 4 thế hệ Các cephalosporin thế hệ trước tác dụng trên vi khuẩn gram dương mạnh hơn, nhưng trên gram âm yếu hơn thế hệ sau Trong bản luận án này, chúng tôi chỉ trình bày thế

hệ I (CEP); thế hệ II (CEC) và thế hệ III (CEF)

Bảng 1.2 Phân loại và cấu trúc một số cephalosporin

I: Phổ tác dụng trung bình, tác dụng

mạnh nhất trên vi khuẩn gram (+),

yếu nhất trên gram (-) Không bền và

II: Có phổ tương tự thế hệ I Tuy nhiên

tác dụng trên vi khuẩn gram (+) yếu

hơn, còn trên các vi khuẩn gram (-)

mạnh hơn thế hệ I Thuốc thải trừ chủ

yếu qua nước tiểu dạng không đổi

Cefaclor (CEC)

-H -Cl

III: Tác dụng tốt trên vi khuẩn gram

(-), trên vi khuẩn gram (+) thì tác

dụng kém penicillin và cephalosporin

thế hệ I Bền với β-lactamase

Cefixim (CEF)

S

N N

phần chứa đồng thời nhóm –COOH và –NH2 Cực đại hấp thụ chủ yếu do nhân phenyl, tùy vào cấu trúc khác nhau làm dạng phổ thay đổi (đỉnh phụ, vai, sự dịch chuyển sang bước sóng ngắn hoặc dài, giảm độ hấp thụ)

N S

O

NH

N S

Các cephalosporin có tính axit khá mạnh của axit α, β không no:

Bảng 1.3 Hằng số axit của các kháng sinh nghiên cứu

Tên kháng sinh pKa1 Tên kháng sinh pKa1 Tên kháng sinh pKa1Penicillin (PEN) 2,74 Amoxicillin (AMO) 2,8 Cloxacillin (CLO) 2,7 Ampicillin (AMP) 2,7 Cephalexin (CEP) 2,6 Cefixim (CEF) 2,75 Oxacillin (OXA) 2,72

1.1.2 Tác dụng

- Cơ chế

Các penicillin có khả năng axyl hóa các D- alanin tranpeptidase, làm cho quá trình tổng hợp peptidoglycan không đƣợc thực hiện Sinh tổng hợp vách tế bào bị ngừng lại Ít tác dụng trên vi khuẩn gram (-) Mặc khác, các penicillin còn hoạt hóa enzym tự phân giải murein hydroxylase làm tăng phân hủy vách tế bào, kết quả là vi

khuẩn bị tiêu diệt [11]

Ngăn cản xây dựng và giảm độ bền của màng tế bào vi khuẩn nên chủ yếu kìm hãm sự tồn tại và phát triển của vi khuẩn Các kháng sinh β-lactam có hoạt phổ rộng[13]

- Kháng thuốc [16]:

Vi khuẩn sinh ra các β-lactamase, là enzim có tác dụng mở vòng β-lactam, theo phản ứng ái nhân vào nhóm C=O, làm kháng sinh mất tác dụng Tất cả các cách kháng không sinh ra β-lactamase để thực hiện gọi là kháng gián tiếp (đƣợc gọi

là kháng methicillin)

- Độc tính:

Các kháng sinh β-lactam độc tính thấp, nhƣng cũng dễ gây dị ứng thuốc: dị ứng, mày đay, vàng da, gây độc với thận, rối loạn tiêu hóa…nguy hiểm nhất là sốc phản vệ

Thuốc không dùng cho trẻ sơ sinh và bà mẹ trong thời kỳ cho con bú Chống chỉ định dị ứng với thành phần của thuốc

- Đánh giá tác dụng kháng sinh

Hoạt lực của kháng sinh chính là tác dụng ức chế sự phát triển của kháng sinh đối với một chủng vi khuẩn nhạy cảm và được đánh giá bằng đơn vị sinh học (UI)

Có hai kiểu tính hoạt lực của các thuốc kháng sinh:

+ Tính bằng đơn vị quốc tế (UI: unite international) ví dụ: penicillin G thử trên một chủng tụ cầu vàng thì 1 UI bằng 0,6µg penicillin G natri tinh khiết, hay 1mg penicillin G tương đương 1667 UI; 1 UI bằng 0,627 µg penicillin G kali tinh khiết + Tính bằng đơn vị khối lượng (mg, g…) đối với nhiều kháng sinh thiên nhiên

và bán tổng hợp [9, 13]

1.1.3 Tính chất quang học của các β- lactam

Các β-lactam đều là những hợp chất không có mầu, có tính chất hấp thụ quang trong vùng UV, cụ thể nhóm penicillin thì đa số các gốc R axyl hóa trên axit 6- amino penicillanic (6APA) đều là vòng thơm nên cho phổ hấp thụ ở vùng UV Còn các cephalosporin có cấu trúc cephem nên cho hai hấp thụ cực đại ở 220 nm và 260

nm Hầu hết các chất đều không có tính chất phát huỳnh quang

1.2 Tình hình lạm dụng kháng sinh ở Việt Nam và trên Thế giới hiện nay

Tính hình lạm dụng kháng sinh và không kiểm soát gây nên nguy cơ các vi khuẩn kháng dần các kháng sinh nói chung và kháng sinh β-lactam nói riêng ngày càng gia tăng [5, 12]

S pneumoniae được các nhà y học xem là một trong các tác nhân hàng đầu

gây nhiễm khuẩn hô hấp cấp trong cộng đồng Trước đây, điều trị nhiễm trùng do S

pneumoniae là tương đối rất dễ dàng nhờ vi khuẩn rất nhạy cảm với các kháng sinh

và penicillin luôn là kháng sinh hàng đầu Tuy nhiên trong vài thập niên trở lại đây,

nhiều nghiên cứu đã báo động tình hình vi khuẩn S pneumoniae kháng penicillin

trên các châu lục, đặc biệt là ở châu Á: Nghiên cứu toàn cầu của chương trình Alexander năm 1996-1997 [62 đã ghi nhận tỷ lệ đề kháng penicillin rất cao ở Hồng Kông (53,1%); kế đó là Pháp (30,6%), Mexico (27,2%), Ireland (13,8%), và

Hungary (11,8%) Tiếp theo, chương trình Alexander năm 1998-2000 [60 thực hiện trên 26 quốc gia cho thấy tỷ lệ kháng penicillin cao nhất cũng là Hồng Kông (69,9%), kế đó là Pháp (40,5%), Israel (29,7%), Nhật Bản (28,5%), Tây Ban Nha (26,4%), Mỹ (25%), Nam Phi (17,9%), Bồ Đào Nha (10,9%) và Anh (10%) Tổng kết chương trình nghiên cứu đa quốc gia Protek 1999-2000 [40 cũng cho kết quả phát hiện tỷ lệ kháng penicillin rất cao ở châu Á (53,4%) với cả 3 quốc gia tham gia đều có tỷ lệ kháng penicillin rất cao là Hàn Quốc (71,5%), Hồng Kông (57,1%), Nhật Bản (44,5%)

Rồi các nghiên cứu của ANSORP đã chỉ điểm được các quốc gia như Việt Nam, Hàn Quốc, Hồng Kông và Đài Loan chính là các điểm nóng tại Châu Á về

tình hình S pneumoniae kháng penicillin Theo các nghiên cứu của ANSORP [49], tình hình S pneumoniae đề kháng kháng sinh đang ở tình trạng thật sự đáng báo động ở nhiều quốc gia châu Á Theo nghiên cứu 2000-2001 trên S pneumoniae xâm

lấn phân lập được từ lâm sàng đã ghi nhận một tỷ lệ đề kháng rất cao đối với penicillin ở Việt Nam (71%), Hàn Quốc (55%), Hồng Kông (43%), và Đài Loan (39%) Tỷ lệ đề kháng cao và có khuynh hướng chung ngày càng gia tăng đối với macrolides cũng được ANSORP ghi nhận tại hầu hết các quốc gia tham gia nghiên cứu [49 , đặc biệt tại Việt Nam (65% năm 1996-1997, đến 88% năm 1998-2001), Hàn Quốc (từ 75% lên 85%), Trung Quốc (từ 35% lên 76%), Singapore (từ 28% lên 53%), hay Đài Loan luôn giữ ở mức độ cao (89% và 87%)

Tại Việt Nam, theo báo cáo của Nguyễn Kim Phượng năm 1997 tại 23 trạm y

tế ở Hải phòng, 69% bệnh nhân được uống kháng sinh, 71% bệnh nhân không dùng kháng sinh đúng liều lượng và đúng thời gian dưới 5 ngày

Theo [12 , qua thống kê tại khoa Dị ứng - Miễn dịch lâm sàng Bệnh viện Bạch Mai cho thấy, hơn 70% bệnh nhân dị ứng do dùng kháng sinh, trong đó có không ít trẻ em Sốc phản vệ do dùng kháng sinh là tai biến nghiêm trọng nhất, dễ gây tử vong Nhiều trường hợp dị ứng thuốc gây giảm hồng cầu, bạch cầu, thiếu máu huyết tán, xuất huyết giảm tiểu cầu, tổn thương tế bào gan Phó giám đốc Bệnh viện Nhi Trung ương Nguyễn Văn Lộc thừa nhận, tiền mua kháng sinh đang chiếm tới 60%

tổng kinh phí mua thuốc của bệnh viện Nhiều loại kháng sinh gần như đã bị kháng

hoàn toàn Đối với vi khuẩn E.coli (gây bệnh tiêu chảy, viêm phổi, nhiễm trùng

huyết), tỉ lệ kháng thuốc ở Ampiciline là 88%, Amoxiciline là 38,9% Đối với vi

khuẩn Klebsiella (gây bệnh nhiễm trùng huyết và viêm phổi), tỉ lệ kháng thuốc của

ampiciline gần 97% và amoxiciline là 42%

Các nhà chuyên môn đã báo động về hậu quả nguy hiểm của sự lạm dụng kháng sinh từ nhiều chục năm nay Năm 1981, sau hội nghị ở Santa Domingo, các nhà chuyên môn đã thành lập “Liên hiệp sự sử dụng kháng sinh hợp lý” (Alliance for the prudent use of antibiotics) có thành viên thuộc 93 quốc gia nhằm chống lại sự lan tràn của các bệnh do vi trùng kháng thuốc tại các nước đang phát triển

Năm 2001, Tổ chức Y tế Thế giới đã đề ra “Kế hoạch toàn cầu để kiểm soát sự

đề kháng kháng sinh” Kế hoạch đề cập đến mọi hoạt động y tế của tất cả các quốc gia đã phát triển cũng như đang phát triển: phòng thí nghiệm phải tăng cường khả năng chẩn đoán các bệnh nhiễm trùng, giúp chẩn đoán nhanh chóng và chính xác,

đo lường độ nhạy của kháng sinh, đo nồng độ kháng sinh trong máu Ngành dược cần cung cấp đầy đủ thuốc thiết yếu, ngăn ngừa sự lưu hành của các thuốc giả, 5% lượng thuốc lưu hành tại các nước đang phát triển là thuốc giả mạo, không đúng phẩm chất, hàm lượng hoặc không có hoạt chất

Nếu ngăn ngừa được sự phát triển của các vi trùng kháng thuốc chúng ta sẽ bảo vệ được môi trường sống, duy trì được sự hữu hiệu của kháng sinh, hạn chế được chi phí về y tế và cứu được nhiều sinh mạng

Theo nghiên cứu của Phạm Hùng Vân và cộng sự, 204 chủng S pneumoniae

bao gồm 96 chủng xâm lấn và 108 chủng không xâm lấn được thu nhận từ 10 bệnh viện khác nhau tại Việt Nam, bao gồm hai bệnh viện lớn tại Hà Nội, một bệnh viện lớn tại Đà Nẵng, và 7 bệnh viện tại thành phố Hồ Chí Minh Các chủng vi khuẩn này được làm thử nghiệm E-test để phát hiện đề kháng penicillin và amoxicillin/clavulanic axit và thử nghiệm kháng sinh đồ phương pháp khuếch tán kháng sinh trong thạch một số kháng sinh khác như macrolides, sulfamethoxazol/trimethoprim, chloramphenicol và fluoroquinolones Kết quả cho

thấy có đến 80% các S pneumoniae kháng được penicillin với 38% và kháng vừa

với penicillin 42%, 72% đề kháng erythromycin, 86% kháng clarithromycin, 74% kháng azithromycin, 75% kháng sulfamethoxazol-trimethoprim và 29% kháng chloramphenicol; vi khuẩn hãy còn nhạy cảm cao với linezolide, các fluoroquinolones và amoxicillin/ clavulanic axit với tỷ lệ đề kháng khá thấp từ 0% đến 2% Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy vi khuẩn kháng penicillin có tỷ

lệ đề kháng các kháng sinh erythromycin, clarithromycin, azithromycin và sulfamethoxazol-trimethoprim cao hơn một cách rất có ý nghĩa thống kê so với vi khuẩn kháng vừa

Còn theo [12], đã có 235 chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus từ 7 phòng thí

nghiệm vi sinh của 7 bệnh viện ở Đà Nẵng, Cần Thơ và thành phố Hồ Chí Minh được gửi về trung tâm nghiên cứu Kết quả ghi nhận được cho thấy 39% đối với ciprofloxacin, 38% đối với cefuroxime, 30% đối với amoxicillin-clavulanic axit, 34% đối với cefepime, 28% đối với ticarcillin clavulanic axit, 38% đối với chloramphenicol, 25% đối với cotrimoxazol, 17% đối với levofloxacin, và chỉ 8% đối với rifampicine

1.3 Một số phương pháp định lượng β- lactam

1.3.1 Phương pháp quang học

Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis là phương pháp phân tích dựa trên tính chất hấp thụ quang học của chất cần phân tích hoặc có tính phát quang… Các phương pháp này đơn giản, dễ tiến hành, thông dụng, được ứng dụng nhiều khi xác định β-lactam, đặc biệt trong dược phẩm Các β-lactam hấp thụ UV nhưng độ hấp thụ không cao, chúng cũng tạo phức với một số ion kim loại giúp nâng cao độ nhạy của phép đo Trong nhiều trường hợp, các β-lactam được thủy phân thành các chất đơn giản hơn để phân tích

Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV dựa vào phản ứng giữa nhóm acetyl của cephalexin với anhydrit axetic trong dung dịch nước tại pH = 11,5 để tạo thành α-acetamidocephalexin và sau đó đo quang tại bước sóng 335 nm của α-acetamidocephalexin mercuric mercaptide, khoảng nồng độ tuân theo định luật Beer

là 30-340 μg/ml [20 Một số thuốc thử khác được sử dụng để định lượng cephalexin có trong thuốc đã được công bố [21, 45, 54, 67]

Theo [29 , AMO và AMP được xác định trong thuốc uống bằng phương pháp phổ hấp thụ phân tử Dung dịch phân tích có pH=7, KCl 50 mM, PdCl2 10 mM tạo phức màu vàng được phát hiện ở bước sóng 335 nm, giới hạn phát hiện thu được lần lượt là 0,76 μg/ml và 0,76 μg/ml

Các chất mà có khả năng phát huỳnh quang không nhiều, đặc biệt là các β- lactam không có tính chất phát quang nên để đo được các β- lactam theo hướng này cần phải dẫn xuất hóa để tạo sản phẩm có tính chất phát quang, sử dụng detector huỳnh quang để định lượng chúng Theo A Fernández-González và cộng sự [43] dùng Cu2+ thủy phân và tạo phức với AMP, với bước sóng kích thích 343 nm, phát

xạ 420 nm có giới hạn phát hiện thu được 4.10-7 M (0,16 μg/ml) Phương pháp này kết hợp phương pháp dòng chảy cho hiệu quả và tốc độ phân tích cao, sử dụng để phân tích AMP trong thuốc uống, huyết thanh…Còn Wei Liu và cộng sự [76 thì sử dụng phản ứng quang hóa của β-lactam với hệ luminol-K3Fe(CN)6 kết hợp phương pháp chiết pha rắn đã phân tích một số β-lactam trong sữa: PEN là 0,5 μg/ml, cefradine 0,04 μg/ml, cefadroxil là 0,08 μg/ml, CEP là 0,1 μg/ml

Việc kết hợp giữa quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis và chiết pha rắn là điều kiện bắt buộc vì các mẫu thực tế thường rất phức tạp, các phương pháp quang học chủ yếu chỉ dùng xác định riêng rẽ từng chất kháng sinh và trong các đối tượng có nhiều yếu tố ảnh hưởng hay chất tương tự chất phân tích, việc xác định sẽ kém chính xác Ngoài ra, trong nhiều trường hợp chất phân tích cần thủy phân mới phát hiện được cũng là sự hạn chế của phương pháp này

1.3.2 Phương pháp điện hóa

Một số phương pháp điện hóa đã được ứng dụng để phân tích các β-lactam nhưng không phổ biến Theo Daniela P Santos và cộng sự [39 , sử dụng sensor điện thế phân tích AMO, đạt giới hạn phát hiện 0,92 μM (0,39 μg/ml) trong môi trường đệm axetat 0,1 M pH= 5,2

Tác giả Li và Chen [56 đã xác định cephalexin trong môi trường kiềm Còn Yet Benner thì xác định cephalexin trong môi trường axít H2SO4 0,125 M, sóng cực phổ tại thế -1,25 V, khoảng tuyến tính giữa cường độ dòng và nồng độ cephalexin

từ 1-70 μg/ml Mặt khác cũng xác định cephalexin nhưng tác giả Fogg [44 đã xác định bằng phương pháp đo cực phổ một trong số các sản phẩm thủy phân sau khi hydro hóa ở pH = 7,4 ở 1000C trong 1 giờ

Tác giả Xu và các cộng sự [79 đã nghiên cứu tính chất điện hóa của cephalexin trong điều kiện có mặt và không có mặt H2O2, tác giả cũng đã tối ưu hóa các điều kiện xác định cephalexin trong mẫu thuốc và mẫu huyết thanh với kỹ thuật cực phổ quét thế tuyến tính Cụ thể, cephalexin cho sóng khử trong môi trường HCl 0,03 M tại thế -1,24 V Với nồng độ cephalexin cao hơn 8,68 µg/ml thì có thêm sóng khử khác quan sát được tại thế Ep = - 0,9 V Khi có mặt H2O2, sóng khử tại thế

Ep = - 0,9 V được xúc tác bởi H2O2 khử thành gốc tự do OH- tạo thành sóng xúc tác Tuy nhiên, sóng khử tại thế E p = -1,24 V giữ nguyên, hầu như không thay đổi Việc định lượng cephalexin trong mẫu dựa vào sóng khử, có khoảng nồng độ xác định là 1,0.10-7 M - 2,5.10-5 M, giới hạn phát hiện là 5,0.10-8

M

Với phương pháp điện hóa thì hầu hết các tác giả đều tập trung nghiên cứu cephalexin, Chailapakul [37 đã sử dụng điện cực màng mỏng kim cương có thêm lượng nhỏ Bo để nghiên cứu tính chất điện hóa của glutathione và cephalexin trong môi trường đệm cacbonat 0,1M pH= 9,2 Khoảng động học tuyến tính cho glutathione là 0,1-5,0 mM với giới hạn phát hiện là 10 μM Đối với cephalexin thì giới hạn phát hiện là 5,0 mM Một số tác giả khác đã xác định họ cephalosporin bằng phương pháp cực phổ, phương pháp von-ampe hòa tan [46, 48, 63, 64, 72]

1.3.3 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Trong những năm gần đây, phương pháp HPLC đã đóng một vai trò vô cùng quan trọng trong việc tách và phân tích các chất trong mọi lĩnh vực khác nhau, nhất

là trong việc tách và phân tích lượng vết các chất Phương pháp HPLC với cột tách pha đảo được sử dụng rất rộng rãi để xác định các kháng sinh β-lactam trong các

loại mẫu khác nhau do có nhiều ưu thế so với các phương pháp khác vì có độ chính xác, độ nhạy, độ lặp lại cao, khoảng tuyến tính rộng…

Detector ghép nối trong máy HPLC cho phép phát hiện sự xuất hiện chất sau khi rửa giải Hiện nay có rất nhiều loại detector được sử dụng cho mục đích này đã

mở rộng khả năng phân tích được rất nhiều loại chất bằng phương pháp HPLC Đối với phân tích dư lượng kháng sinh β-lactam, detector khối phổ (MS) là một sự lựa chọn ưu tiên do có thể phát hiện và phân tích chất trong các đối tượng phức tạp Theo dược điển Việt Nam, hàm lượng cephalexin được xác định bằng phương pháp HPLC với thành phần pha động: metanol-acetonitril - dung dịch kalidyhidrophotphat 0,136% - nước (2 : 5 : 10 : 83), pha tĩnh được nhồi C-18 (5 µm), detector tử ngoại đặt tại bước sóng 254 nm, thể tích tiêm 20 µl, tốc độ dòng 1,5 ml/phút [9]

Theo tài liệu [55 cũng xác định cephalexin thì thành phần pha động là acetonitril - metanol- đệm axetat pH 4,2 (10 : 10 : 80% v/v/v), giới hạn phát hiện cephalexin là 1 μg/ml trong mẫu huyết tương và 5 μg/ml trong mẫu nước tiểu Phương pháp HPLC cho phép xác định được đồng thời họ cephalosporins với cột tách C-18, thành phần pha động là metanol - tetrahydrofuran - nước theo tỉ lệ

16 : 4 : 80, giới hạn phát hiện là 0,5 μg/ml [61, 74]

J.M Cha và cộng sự [35 dùng phương pháp HPLC/ MS để phân tích β-lactam trong nước sông và nước thải Điều kiện chạy sắc ký: cột Xterra MS RP C18 (2,1mm×50mm, 2,5μm); pha động: A = axit focmic 0,1%, B = metanol (MeOH), C= Acetonitril (ACN); chạy gradient: bắt đầu A/B/C = 90:5:5 (v/v/v), 8 phút A/B/C=50:40:10, 20 phút A/B/C=90:5:5; tốc độ pha động 0,25 ml/phút; nhiệt độ cột

450C; thời gian 20 phút Áp dụng phân tích AMO, AMP, oxacillin (OXA), CLO, cephapirin có giới hạn phát hiện của phương pháp là 8 – 10 ng/l với nước bề mặt,

13 – 18 ng/l với nước thải trước xử lý, 8 – 15 ng/l với nước thải sau xử lý

Theo dược điển Việt Nam [9 , hàm lượng các β-lactam được xác định bằng phương pháp HPLC như amoxicillinic với thành phần pha động: metanol – natri dyhidrophotphat monohydrat 0,78% (pH=4,4) theo tỷ lệ thể tích (5 : 95), pha tĩnh C-18 (5 µm), detector tử ngoại đặt tại bước sóng 220 nm, còn hàm lượng cephalexin

được xác định bằng phương pháp HPLC với thành phần pha động: metanol - acetonitril - dung dịch kalidyhidrophotphat 0,136% - nước (2 : 5 : 10 : 83), pha tĩnh được nhồi C-18 (5µm), detector tử ngoại đặt tại bước sóng 254 nm

Tác giả Blanchflower WJ và cộng sự [32], dùng HPLC/MS phân tích penicillin V, PEN, oxacillin, CLO, dicloxacillin trong thịt, thận và sữa Điều kiện chạy sắc ký: cột Inertsil ODS2 (4,6 mm×150 mm, 5 μm); pha động: ACN – (C2H5)3N 0,5% (45/55), dùng nafcillin làm nội chuẩn đạt giới hạn phát hiện trong sữa 2-10 μg/kg, trong thịt 25-100 μg/kg

Một detector quan trọng trong phương pháp HPLC là detector huỳnh quang, có

ưu điểm độ nhạy, độ chọn lọc cao Theo tác giả C.Y.W Ang và cộng sự [22] dùng cột Spherisorb ODS2 (250 mmx4,6 mm, 5 μm) phân tích AMO trong cá (pha động: ACN/đệm photphat 50mM pH 5,6 – 20/80; detector huỳnh quang: 258 nm – 440 nm) và AMP trong sữa bò (pha động: ACN/đệm photphat 10 mM pH 5,6 – 24/76; detector huỳnh quang: 346 nm – 422 nm) đạt giới hạn phát hiện lần lượt 0,5 μg/kg

và 0,3 μg/kg Tuy vậy, do các β-lactam ít tạo phức phát huỳnh quang và cơ chế phát quang dựa trên phản ứng quang hóa [22, 58 , nên chỉ áp dụng với số ít chất hoặc phân tích riêng từng chất chứ không áp dụng phân tích đồng thời nhiều kháng sinh cùng lúc được

Tác giả Wenhong Luo và cộng sự [77] sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao xác định đồng thời dư lượng amoxicillin và ampicillin trong sữa bò nguyên liệu và chế biến Phương pháp sử dụng detector huỳnh quang Mẫu được thêm 40 ml đệm photphat 0,01 M (pH 4,5), thêm muối tungstate natri và axit sulfuric để loại protein và sử dụng cột chiết pha rắn C18 Amoxicillin và ampicillin được phản ứng với salicylaldehyde để tạo thành các chất dẫn xuất huỳnh quang, sau

đó được tách bằng sắc ký lỏng và phát hiện bằng detector huỳnh quang Độ thu hồi trung bình của amoxicillin và ampicillin ở nồng độ 5, 10 và 20 ng/ml > 80%, với hệ

số biến thiên CV < 5% Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) cho

amoxicillin là 1,1 và 2,4 ng/ml tương ứng, LOD và LOQ của ampicillin là 1,0 và 1,7

ng/ml, tương ứng

β-lactam kháng sinh được kê đơn nhiều cho việc điều trị các bệnh nhiễm trùng

vi khuẩn Tác dụng kháng sinh phụ thuộc thời gian phát huy hiệu quả diệt khuẩn tối

ưu khi nồng độ thuốc được duy trì trên nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Nồng độ

kháng sinh thường được duy trì ở mức 2-4 lần MIC Mà thời gian trên nồng độ ức

chế tối thiểu: T> MIC (trong đó T là thời gian nồng độ thuốc được duy trì, MIC-

Minimal Inhibitory Concentration - nồng độ ức chế tối thiểu của một kháng sinh là

nồng độ thấp nhất mà kháng sinh có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn sau

khoảng 24 giờ nuôi cấy) là một trong các thông số quan trọng nhất để điều trị có

hiệu quả [17, 34 Nó thường có tác dụng kìm khuẩn khi T> MIC được duy trì 30%

của khoảng thời gian dùng thuốc cho penicillin, 40% đối với cephalosporin và 20%

đối với carbapenems, và diệt khuẩn khi T> MIC vượt quá 50% của khoảng thời gian

dùng thuốc kháng sinh penicilin, 60-70% cho các cephalosporin và 40% cho

carbapenems [38, 70 Những phát hiện này đã dẫn đến việc tối ưu hóa các phác đồ

liều lượng để tăng hiệu quả điều trị và giảm các thế hệ của những chất đề kháng với

các kháng sinh [41, 71 Vì vậy, theo dõi nồng độ kháng sinh trong huyết thanh là

việc vô cùng quan trọng Nhiều tác giả dùng phương pháp HPLC/UV đã phân tích

kháng sinh β-lactam trong các dịch sinh học, bao gồm cả huyết tương người [41, 78 Ngoài ra, LC/MS/MS được coi là kỹ thuật ưa thích để xác định lượng vết

các chất trong mẫu sinh học như máu, huyết thanh, nước tiểu và các mô [80 Như

trong [68 , tác giả dùng phương pháp LC/MS/MS để định lượng kháng sinh β-lactam gồm clavulanic axit trong các mô của lợn, trong thận bò [42, 59] kháng

sinh β-lactam trong sữa nguyên liệu [69 , cefepime trong chuột [33] và amoxicillin

trong huyết tương người [52]

Ngoài ra, còn dùng các detector khác như detector điện hóa, detector độ dẫn…

để phân tích các β-lactam

Nói chung, khi phân tích kháng sinh trong các đối tượng mẫu phức tạp như thực phẩm, mẫu sinh học, mẫu nước thải, việc xử lý mẫu đối với các phương pháp đều đòi hỏi qui trình xử lý phức tạp do các kháng sinh liên kết chặt chẽ với nền mẫu

và có nhiều chất nhiễu cần loại trừ Qui trình xử lý chủ yếu sử dụng chiết lỏng lỏng hay chiết pha rắn (SPE)…

1.3.4 Phương pháp điện di mao quản- electrophoresis (CE)

Gần đây, phương pháp CE được sử dụng rộng rãi do tính chất ưu việt về hiệu quả tách cao, thời gian tách ngắn, lượng mẫu tiêu tốn ít Phương pháp đã được ứng dụng để tách và xác định các kháng sinh β-lactam trong nhiều đối tượng mẫu khác nhau Hầu hết các công trình đều quan tâm đến việc áp dụng model MEKC để tách

và xác định các penicillin trong mẫu môi trường [72 , hoặc trong mẫu dược phẩm [47, 57, 65]

Biyang Deng và cộng sự [31 đã sử dụng phương pháp điện di với detector điện quang hóa xác định AMO trong nước tiểu người với giới hạn phát hiện thấp 0,31 μg/l, khoảng tuyến tính rộng 1 μg/l – 8 mg/l cùng độ thu hồi cao 95,77%, độ lệch chuẩn tương đối không lớn hơn 2,2% và thời gian phân tích ngắn 6 phút/ mẫu

L Nozal, L Arce1,A.R´ıos, M Valcárcel [62 sử dụng phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu mixen (MEKC) với thành phần dung dịch đệm điện di gồm 40 mM đệm borat, 100 mM SDS pH 8,5 Tiến hành phân tích tại thế điện di 10

kV, nhiệt độ 200C, thời gian bơm mẫu 10 s Phương pháp cho phép tách 6 kháng sinh gồm: AMO, AMP, PENG, OXA, penicillin V và CLO đã được ứng dụng phân tích trong mẫu nước thải của trang trại chăn nuôi Giới hạn phát hiện từ 0,14 đến 0,27 mg/l, độ lệch chuẩn tương đối từ 0,25 đến 0,86%, diện tích pic 1,3 đến 4,15%

Độ thu hồi trên 96%

Attila Gaspar và cộng sự [24 đã tách và xác định thành công 14 kháng sinh họ cephalosporin bằng phương pháp điện di mao quản vùng (capillary zone electrophoresis – CZE) Quá trình tách dùng đệm photphat 25 mM có pH = 6,8 Phương pháp này tách được 14 kháng sinh trong vòng 20 phút, giới hạn phát hiện

14 kháng sinh cefalosporin, cefoxitin, cefazolin, cefadroxil, cefoperazon,

cefamandol, cefaclor, cefalexin, cefixim, ceftibuten, cefuroxim, ceftazidim, cefotaxim, ceftriaxon trong vùng 0,42 – 1,62 mg/l Trong đó cefalexin và cefixim có giới hạn phát hiện tương ứng 1,62 và 0,89 mg/l; khoảng tuyến tính 5 – 200 mg/l Mục đích của phương pháp được ứng dụng để nghiên cứu độ bền của kháng sinh họ cephalosporins trong nước tại nhiệt độ khác nhau (+25, +4 và -180C) Kết quả cho thấy các kháng sinh giảm nồng độ không lớn hơn 20% tại nhiệt độ phòng sau khi pha loãng

M.I.Bailon-Perez và cộng sự [28 sử dụng phương pháp CZE và detector UV – DAD, pha động dùng hệ đệm tris 175 mM pH 8,0 và 20% (v/v) ethanol, dùng kĩ thuật chiết pha rắn làm sạch và làm giàu mẫu ứng dụng phân tích đồng thời AMP, AMO, dicloxacillin, CLO, OXA, PEN, nafcillin trong nền mẫu nước (nước sông, nước thải…) Giới hạn phát hiện tương ứng 0,8; 0,8; 0,25; 0,30; 0,30; 0,9; 0,08 μg/l cùng độ thu hồi đạt 94 – 99% với độ lệch chuẩn tương đối thấp hơn 10%

Phương pháp MEKC cũng được M.I Bail ´on P´erez, L Cuadros Rodr´ıguez,

C Cruces-Blanco [26 tách và xác định 9 loại kháng sinh β-lactam gồm cloxacillin, dicloxacillin, OXA, PENG, penicillinV, AMP, nafcillin, piperacillin, AMO trong mẫu dược phẩm Các điều kiện tối ưu được chọn là 26 mM đệm Borat, 100 mM SDS pH 8,5 làm chất nền điện di và thế điện di 25 kV Giới hạn phát hiện LOD 0,35 đến 1,42 mg/l, giới hạn định lượng 2,73 đến 5,74 mg/l, độ lệch chuẩn tương đối thời gian lưu từ 1,5 đến 1,7% Độ thu hồi từ 91 – 95,6%

* Chiết pha rắn (solid phase extraction - SPE)

Chiết pha rắn (SPE) là một phương pháp chuẩn bị mẫu để làm giàu và làm sạch chất phân tích từ dung dịch bằng cách hấp phụ lên một cột chiết pha rắn, sau

đó chất phân tích được rửa giải (giải hấp) bằng một dung môi thích hợp Ưu điểm của phương pháp SPE là hiệu suất thu hồi cao, khả năng làm sạch chất phân tích lớn, dễ tự động hóa, lượng dung môi sử dụng ít và có thể kết hợp tốt với phương pháp điện di mao quản (CE) SPE ra đời từ những năm 1970 và dần dần thay thế phương pháp chiết lỏng-lỏng [35]

Quá trình chiết pha rắn gồm 4 bước chính như sau:

B 1 Hoạt hóa cột B 2 Nạp mẫu B 3 Rửa giải

Hình 1.5 Sơ đồ các bước trong quá trình chiết pha rắn

Chọn cơ chế chiết SPE theo mẫu phân tích [18]

Cơ chế SPE cho phép phân tích mẫu trong dung môi nước:

Với các mẫu nước, việc quyết định sử dụng hợp chất hấp phụ nào là dựa vào đặc tính phân cực và đặc tính ion của chất phân tích quan tâm Nếu chất phân tích là ion và phân tử phân cực thì nên sử dụng chất hấp phụ có tính trao đổi ion Trong trường hợp chất phân tích phân cực mà không có tính ion thì tốt nhất nên sử dụng chất hấp phụ theo nguyên tắc pha đảo (ví dụ C18) Còn nếu chất phân tích không phân cực, thì việc chọn pha đảo với chất hấp phụ C8 hoặc C18 là phương án tối ưu

Hình 1.6 Cơ chế SPE phân tích các mẫu nước

* Kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) sử dụng cho chất phân tích trong các đối tượng mẫu sinh học [75]

Chiết pha rắn (SPE) với pha tĩnh kết hợp giữa cơ chế chiết pha đảo và tương tác ưa nước (hydrophilic-lypophilic water-wettable reversed phase) đã được áp

dụng rất hiệu quả trong phân tích các đối tượng mẫu sinh học nói chung và mẫu nước tiểu nói riêng

Hình 1.7 Cấu trúc của pha tĩnh cột SPE dùng cho các mẫu sinh học

Oasis® HLB (hydrophilic-lipophilic balance) là một chất hấp phụ kết hợp cơ chế tương tác pha đảo và tương tác ưa nước Pha tĩnh này được trùng hợp từ hai monome có tỷ lệ bằng nhau là N-vinylpyrolidon có tính ưa nước và divinylbenzen

có tính kỵ nước Chất hấp phụ Oasis có cấu trúc không gian lớn (thể tích lỗ rỗng là 1,3cm2/g), có diện tích bề mặt trên một đơn vị khối lượng pha tĩnh cao (810m2/g) Các nhóm chức phân cực của monome N-vinylpyrolidon đã tạo ra các hốc phân cực nên pha tĩnh Oasis có hệ số lưu giữ đối với các chất phân tích phân cực cao hơn 3 lần

so với cột C18 truyền thống đồng thời có khả năng làm việc trong khoảng pH rộng

Pha tĩnh Oasis có khả năng lưu giữ tốt các thành phần phân cực, các hợp chất axit, bazơ và cả trung tính, rất thích hợp để chiết và làm giàu các đối tượng thuốc trong mẫu máu và mẫu nước tiểu như kháng sinh β-lactam, các sulfonamids, các quinolones

với các mẫu sinh học

Chất hấp phụ chiết pha rắn thường được sử dụng gồm các loại:

Chất hấp phụ pha thường: các silica trung tính, oxit nhôm

Chất hấp phụ pha ngược: các silica trung tính đã được ankyl hoá nhóm OH Chất có khả năng trao đổi ion

Chất rây hay sàng lọc phân tử theo kích thước

Rửa loại tạp chất (H2O + 5% MeOH)

Rửa chiết chất phân tích (MeOH)

Bay hơi và hòa tan