Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật dựa trên PCR xác định nhanh tác nhân khủng bố sinh học, đặc biệt là Bacillus anthracis đang được quan tẩm.. anthracis Việt Nam được tách[r]
Trang 1NGHIÊN CỨU TRÌNH Tự CÁC GEN TIÊU BIỂU VÀ PHÁT TRIÉN
KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR MỚI CHẦN ĐOÁN BACILLUS ANTHRACIS GÂY BỆNH Ở VIỆT NAM
ThS Đinh Thị Thu Hằng, ThS Nguyên Thanh Việt
T - , í ~ * 1 ^ * I P A V n ỉ Ị Ị M A w ' j S m , /
ì t u n y ta m A rt* i f is ờ ỉiiti r Lsurvx* risjK* V /C Í I W u c m y
ThS Nguyễn Văn An (B M K V isinh y học, Bệnh viện Q u âtiy 1Ó3, Học viện Quân ý)
Hướng dẫn: PGS TS Nguyễn Thái sớ n
BMK Vi sinh y học, Bệnh viện Quân y 103, Học viện Quân y
TÓM TẮT
Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật dựa trên PCR xác định nhanh tác nhân khủng bố sinh học, đặc biệt là Bacillus anthracis đang được quan tẩm Trong công trình này, gen vrrA trên nhiễm sầc thể, gen độc lực pagA, cya, le f (plasmid pX01), capA, capB, capC (plasmid pX 02) từ các chủng B anthracis Việt Nam được tách dòng
và giải trình tự hoàn chỉnh Đã xác đính được 1 đột biến thêm nucleotide A trên gen vrrA, 1 đột biến đồng nghĩa, 2 đột biến sai nghĩa trên gen pagA và 1 đột biến đồng nghĩa trên gen cya Đặc biệt, 1 đột biến sai nghĩa lần đấu tiên được phát hiện trên gen capA chủng B anthracis Ba1 Cốc gen còn lại tương đồng 100% so với chủng tham chiếu B anthracis Vollum-USA Đồng thời, một phản ứng PCR đa mồi chứa chứng nội tại được thiết kế để phát hiện chính xác B anthracis Đày là công bố đấy đủ chi tiết đầu tiên trong nước về trình tự các gen tiêu biểu của B anthracis cũng như phát triển một cõng cụ hữu Ịch cho phép chẩn đoán nhanh B anthracis gây bệnh.
Từ khóa: Chứng nội tại, độc lực, PCR đa mồi, vi khuẩn than, Việt Nam,
SUMMARY
COMPLETE SEQUENCE ANALYSIS OF THE TYPICAL GENES OF BACILLUS ANTHRACIS AND DEVELOPMENT OF A NOVEL MULTIPLEX PCR FOR VIRULENT BACILLUS ANTHRACIS DETECTION IN VIETNAM
Dinh Thi Thu Hang, Nguyen Thanh Viet Bio-medical and Pharmaceutical Applied Research Centre, Vietnam Military Medical University
Nguyen Van An, 103 Hospital, Vietnam Military Medical University Development o f PCR-based techniques for rapid and accurate identification o f bioterrorism agents, especially Bacillus anthracis is interest in recent years In this study, the entire sequences o f the vrrA gene (chromosome), pagA, cya, le f genes (virulence plasmid pX01) and capA, capB, capC genes (virulence plasmid pX 02) o f ten B anthracis strains Ba1-10 isolated in Northern Vietnam were cloned and analyzed One insertion mutation at nucleotide position 346 A in the vrrA gene (10 strains), one synonymous and two missense mutations in the pagA gene and one synonymous mutation in the cya gene (Ba3, 4) Interestingly, one missense mutation was first identified in the capA gene o f B anthracis strain Ba1 The remaining genes had 100% similarity in comparison to the B anthracis references In addition, a multiplex PCR assay with primer pairs vrrAF1/R1, pagAF1/R1, capAF1/R1, including recombinant internal amplification control was developed fo r detection o f virulent B anthracis strains This is the first report in Vietnam that investigates the full-length o f the vrrA gene and some typical genes on virvlence plasmids pX 0 1 and pX 0 2 as well as develops a useful molecular tool for rapid detection o f virvlent B anthracis in Vietnam.
Keywords: Bacillus anthracis, internal amplification control, multiplex PCR, virulent, Vietnam.
ĐẶT VÁN ĐỀ VÀ MỤC TIÊU Bởi tính chất cếp tính, khả năng gây chết người Bacillus anthracỉs, tác nhân gây bệnh than được qua đường hô hấp kết hợp vởi khả năng phục hồi của tim thấy ờ nhiều quốc gia trên thế giới Khả năng gây bào tử sau khi tiếp xúc với nhiệt và phóng xạ khiến B bệnh của B, anthracis chủ yếu nhờ sự có mặt của các anthracis được sử dụng là vũ khí sinh học ở Việt
gẽn nằm trên hai plasmid !ớn là pX01 (182 kb) và Nam, bệnh than vẫn còn xuất hiện rải rác ở các tĩnh
pX02 {95 kb) - được gọi íà các plasmid độc lực miền núi phía Bắc như Sơn La, Điện Biên, Lai Châu, Plasmid pX01 chứa các gen sảrì xuất độc tố, trong khi [1] Gần đây (10/2014) ờ Mèo Vạc, Hà Giang đã ghi pX02 chứa các gen liên quan đển quá trình tổng hợp nhận 9 ca nhiêm bệnh than do ăn thịt gia súc chết vì
vò poiy-D-g!utamic acid [9] Chì những chùng có đầy bệnh than Sự xuất hiện trở lại cùa B anthracỉs một
đù hai píasmid này mới có khả năng gây bệnh nguy íần nữa cảnh báo mầm bệnh nguy hiềm này cần được hiểm Trên pX01, có ba gen quan trọng nhất lần lượt quan tâm đúng mức và có phương án phòng chống
ià gen pagẢ mẵ hóa cho kháng nguyền bảo vệ, cya hiệu quả, tránh để dịch bùng phát Trong công trinh
mã hóa cho yếu tố gây phù nề (edema factor - EF) - này, nhóm nghiên cứu giới thiệu quá trình phân lập, một adenylyl cyciase dẫn đến phù nề da trong cơ thể xác định trình tự đầy đù gen đặc trưng trên nhiễm sẳc
và let mã hóa cho yếu tố gây chết (lethal factor - LF) thể vrrA và các gen độc lực pagA, cya, ief (pXOỊ), [11] Plasmid pX02 chứa các operon capBCADE [5] capA, capB, capC (pX02) Điều này góp phần làm với các gen quan trọng là capA, capB, capò phong phú thêm những kết quả về phân tử cũng như
Trang 2có thêm dữ liệu tương đối hoàn chình về một số gen
tiêu biểu của các chủng B anthracis phân iập tại Việt
Nam Trên cơ sở kếỉ quả phân tích trinh tự này, kết
hợp với các nghiên cứu trên thế giới để phát triển một
kỹ thuật PCR đa mồi (multiplex PCR - mPCR) tối ưu
với ba gen đích lần lượt trên nhiễm sắc thể, pX01,
pX02 cùng chứng nội tại tái tổ hợp (IC) xác định chính
xác B anthracis gây bệnh trong tự nhiên Như vậy,
công trình nghiên cứu có hai mục tiêu sau:
Phân tích trình tự đầy đủ gen đặc trưng vrrA (trên
nhiễm sắc thể), các gen độc lực pagẤ, cya, lef
(plasmid pX01) và capA, capẻ, capC (plasmid pX02)
của các chủng B anthracis phân lập ở Việt Nam.
Phát triển kỹ thuật PCR đa mồi chứa chứng nội tại
tái tổ hợp xác định nhanh, chính xác B anthracis gây
bệnh trong tự nhiên.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIỀN cứ u
V ậỉ liệu
Cac chủng vỉ khuẩn: Mười chủng vi khuẩn B
anỉhracis được phân lập từ bệnh nhân, gia súc chết vì
bệnh than và môi trường được cung cấp bởi Học viện
Quân y và Viện Y học Dự phòng Quân đội, Cục Quân
y (Ba1-Ba10) Trong đó, có 3 chủng B aníhracis đầy
đủ độc lực (Ba1, Ba3 và Ba4), 1 chủng B anỉhracis chỉ
có pX01 (Ba6), 6 chủng còn lại là B anthracis không
độc Chủng B cereus Bc1 ổược sử dụng làm đổi
chứng ắm
Cac cặp mồi đặc hiệu được thiết kế để nhân toàn
bộ gen vrrA (chromosome), pagA, cya, ief (pX01) và
capẦ, capB, capc (pXÓ2) sử dụng phần mềm
primer3pius Ba cặp mồi phát hiện qen vrrA, pagA,
capA trong phản ứng mPCR được the hiện chi tiết ở
bảng 1
Chứng nội tại (internal amplification conirol-IC):
Plasmid tái tồ hợp JET1.2-capA-IC1 đã được thiết lập
trong nghiên cứu trước đây của nhóm tác giả [3] và
đăng ký sáng chế (Phụ lục 2) Plasmid này được thiết
kế theo hướng sử dụng chung với cặp mồi chẩn đoán
là capAF1/R1 (Bảng 1)7
Bảng 1 Các moi sử dụng trong phản ứng mPCR
chứa IC
Gen đích Trình tự (5'-3’)
Kích thước (bp) vrrA
(nhiễm
sắc thể)
vrrAF1 :CTGTAAGCCCTGTCGTCGAA
vrrARI :CCTCGCGCACTTCT TTTTCT 222
pagA
(plasmid
pX01)
pagAF1 :AAATGGAGCACGGCTTCTGA
pagARI :AGCCTGTATCCACCCTCACT 751
capA
(plasmid
pX02)
PJET1.2-capA-ICI
capAFI :TGACG ATGACG ATGGTTGGT
capARI:
GCTTCCTGTCTAGGACTCGG
610
1000
Phương pháp
Nghiên cứu được thiết kế theo phương pháp thực
nghiệm mô tả, phân tích phòng thí nghiêm và trên thực
địa, sử dụng các kỹ thuậí vi sinh kinh điển và sinh tìọc
phân tử
Các kỹ thuậỉ chính được tóm tắt như sau:
Tách dòng và giải trinh tự: Chủng vi khuẩn than được bấí hoạt ờ đieu kiện 121°C/20 phút sau đó tách DNA tổng số theo quy trình của nhà sản xuất (QIAamp DNA Mini Kit) Phản ứng PCR có độ chính xác cao được thực hiện trên máy PCR Eppendorf Mastercycíer pros (Đức) sử dụng hóa chat PCR High Fidelity (Thermo scientific) Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng kií GeneJet PCR purification và dòng hóa vào vector pJET1.2/blunt (Thermo scientific) Các piasmid tái tổ hợp sau khỉ được kiểm tra có chứa gen mong muốn được giải trình tự theo nguyên lý Sanger trên máy ABI 3730XL, sử dụng phần mềm Bioeđit và Genious R7 để xử lý, nối ghép tạo trinh tự toàn bộ các gen đích, so sánh và phân tích trinh tự thu được với các trình tự tham chiếu trên Genbank
Multiplex PCR chứa chứng nội tại: Từ kết quả giải trình tự, một phản ứng FCR đa mồi chứa chứng nội tại ổược thiết kế đề phát hiện chính xác các chủng B anthracis gây bệnh trong tự nhiên Chứng nội tại này được bồ suríg vào mẫu trong quá trình tách chiết DNA với các nồng độ khác nhau để xác định lượng tối thiểu vừa đủ có thể phát hiện được Các thử nghiệm đều được tiến hành song song với mẫu không chứa IC để
so sánh và mẫu đối chửng âm (nước deion) để kiểm soát ngoại nhiễm cũng như nhiễm chéo
Phản ứng mPCR có thành phần như sau: 1X Dream Taq Buffer; 2t0U Dream Taq Polymerases; dNTPs 0,25 mM mỗi ioại; 0,6-0,64 (aM mồi xuôi, mồi ngược mỗi loại, khoảng 10 ng DNA khuôn, điều chỉnh H20 đủ thể tích 25 Ị i l (Thermo scientific) Chu trinh mPCR được thiết kế: Biền tính 94oC/4 phút, tiếp theo
!à 30 chu kỳ (940C/45 giây; 56oC/40 giây; 72oC/40 giây), sau đó hoàn thành keo dài chuỗi ở 72° trong 6
phút Sản phẩm mPCR được điện dí kiểm tra trên gel agarose 1,5% TBE 0,5X, nhuộm ethidium bromide và chụp ảnh dưới ánh sáng u v (UVP Eppendorf)
Công trình được thực hiện tại Trung tâm Nghiên cứu ứng dụng Sinh Y Dược học và Bộ môn Khoa Vi sinh y học, Bệnh viện Quân y 103, Học viện Quân y từ tháng 05/2014 đến tháng 02/2015
KẾT QUẢ NGHIÊN c ứ u
độc lực của B anthracis
Gen vrrA (chromosome): Kết quả phân tích toàn bộ gen vrrA trên 10 chủng B anthracis nghiên cứu cho thấy gen vrrA giống nhau hoàn toàn về trình tự nucleotide giữa các chủng B arìthracis này và tương đồng từ 99-100% so vởi các chủng tham chiếu So với chủng B anthracis Vollum-USA, trình tự gen vrrA của các chủng phân lập ở Việt Nam chỉ sai khác 1 nucleotide (thêm nucleotide A ờ vị trí 346)
Gen pagA, cya, !ef (pX01): Ket quả phân tích toàn
bộ trình tự gen pagA các chủng than gây bệnh đã xác định được 3 đột biến điểm (T-»C), gồm 1 đột biến đồng nghĩa (T-»C)195 và 2 đột biến sai nghĩa (T~>C)1693, (T ^ C )Í7 9 9 khi so sánh với trình tự tham chiếu B anthracĩs Volium-USA Chỉ xác định được 1 đột biến đồng nghĩa (T~»C)600 trên gen cya chủng B anthracis Ba3 và Ba4 Đột biến này trước đó cũng đã được tìm thấy ở các chủng như B aníhracis A2012,
Trang 3Ames Ancestor, BFV Trong khi đĩ, gen ief cĩ trình tự
giống nhau và tương đồng 100% so vởỉ chủng tham
chiếu
Gen capA, capB, capC (pX02): Trên pX02, một
đột biến sai nghĩa hồn tồn mới (A->G)1048 được
xác định ở gen capA chủng B anthràcis Ba1 làm thay
đồi amino acid lysine íhành aiuíamic Đây !à đột biến
trước đĩ chưa được tìm thấy trong các nghiên cứu trên thế giới và cĩ thể khẳng định đay ià đột biến mới, phát hiện đầu tiên trên 1 chủng của Việt Nam (Ba1) (Hình 1) Hai gen cịn lại capB, capC cổ tính bảo tồn
cao, khong xảy ra đột biến ờ bất cứ điềm nào trên các
chùng nghiên cứu
1 0 1 0 1 0 2 0 Í 0 3 0 1 0 4 0 -.0 5 0 1 0 6 0 1 0 7 0 1 0 8 0 1 0 5 0 1 1 0 0 1 í - I - 1 I I 1 I I - 1 • • • • ! • • • • ! - • • • ! ■ ■ ' • < I i - i i : * - : 1
C P 0 0 7 S S 4 V o l l u m T M W T A T T C A RGM JGGJ.TCA C C M LÃ S C C aÕ T T Ã C C A G TC C A T T G C A T Ằ A A 7J.T C G TG T G T f.T C G T C M T T W C A A W kC R ? A C M J C C W G G G TG C TC TATG
A A E B 0 1 0 Ũ 0 0 4 4 H H R U S A .
B C 0 1 2 5 7 7 CDC Ể 8 4 .
KZ- K N 0 5 0 6 5 3 A B r 0 0 3
A Á Ẽ S 0 1 0 0 0 0 4 9 A u s t r a l i a 9 « .
N Z C P 0 0 7 7 0 2 B F V O S A .
J B I C 0 1 0 0 0 0 8 2 C a r b o s a p .
C P 0 0 8 8 4 8 H Y 0 0 1 c
NZ ABDH02000062 T s t a n k o v s .
« 2 ~ K M 0 5 0 S 5 0 Z im b a b w o 8 9 G
H C ~ 0 Ũ 3 9 8 I A 2 0 1 2
HC~ 0 0 7 3 2 3 A m e s A n c e s t o r + T
B o l V i e t n a m .<5
B&3 V i e t n a m
B a 4 V i e t n a m *
1 0 3 0 lOXO 1 0 3 0 10' 10 1 0 5 0 1 0 6 0 5 0 7 0 ! 0 8 0 1 0 9 0 110 0 _I I 1 i I 1 I - Ì -I I 1 « > I I I I I I I - - I i
C P 0 0 7 6 6 4 V o l l o t t T A iO ^ ÌA IT T C Ã A G A C G G A T C A C C A A A A C C a G ĨĨA C O A G T C C X T T C C A T A A A A A T C O T C T C T A T C G T C A A T T S A C A a A A G Ís T A C A T C C A A C G C T C C T C T A T C i , I E ~ p K !■ V -i L' Ì- - 0 K >f R V V R s i , ~ K r> f a is > f - « A A E R 0 1 0 0 0 0 4 4 K K A Ư 3 A .
1 ! i s !> K i- V ý: I i> K R V < Si i ỉ T T K Í ! !•' K Vi HC_012S77 coc 684 .
L ~ V E -X - K V t >> ! i - u> s w R V V R •; i T K D •; £ K Ĩ , w N Z K S 0 5 0 6 S 3 A B r 0 0 3 -
- 1 K •• ~ V K '■ V r '• !, 15 K :: R V 1 a T X a : * K t I A A E S 0 1 0 0 0 0 4 9 A u s t r a l i a 9 «
Ĩ ■} s ;; !' K ?■ V V Ũ I o K s B V ■/ p c- - T K '•> ■' K - ~ « N Z C Ẽ 0 0 7 7 0 2 B F V Ư S A -
" r o K s p K Ĩ V :■ E > o K i: R V V H Q T K ! j 1 K K ■; Si J P I G 0 1 0 0 0 0 8 Z C i r b o s a p , -
L r 5 K c :: !• K f- 9 •; c T - K X- s V P- ’2 L T K & T n K a A ;i C P 0 0 8 8 4 8 H Y O O l .G -
V í Q K s !■ K t> V s ft i I’r K t ỉ K V T « (,1 r, V K r ¥ K -V s z A B D N 0 2 0 0 0 0 6 2 T o l a n k o v s
“ L X' £ •: s r K ;■ V T n <\ o K R V R c- T K D ■' r i K ft V N Z _ K N 0 5 0 6 5 0 2 ii B b a b w a 8 9 G
V T V- r :: e ?; r V i! h i c K R 1> V R Í •- 1’ K 0 y K A 2 n K C 0 0 3 9 8 1 A Z 0 1 2 -
- ; i I 0 15 ÍỈ p K f- V r s T o K ! í s V ' ỉ s Q - ~ K 2 ■ s K •: V N C 0 0 7 3 2 3 J U u b s A n c a s t o r , - ^ - - .
B a l V i e t n a m y ' 1 ' * p ' I ' * ’ ’
B o 3 V l « t n u m V
Ỉ : i z ■:> E r r ỈT r V T A — D ĨC R V V B c- T K ữ 3 K v i A K B a 4 V i e t n a m .
( i V < !■ y :• V ■ ! ì K •- H V V Fi i ■( K i t ■■■ K s Í >■
Hình 1 So sánh trình tự nucleotide và amino acid cùa gen capA Ờ 3 chủng B anthracis Ba1, Ba3, Ba4 VỚỈ12 chủng B anthracis thạm chiếu trên Genbank (đoạn nucleotide cĩ xẩy ra đột biến điểm) Các chủng tham chiếu được ký hiệu theo thứ tự mã số, tên chủng/phân lập, nguồn gốc chủng, dấu chấm biểu thị nucleotide giống nhau, nếu cĩ đọt biển se đưọ-c
biểu thị bằng các nucleotide.
Như vậy, qua phân tích trình tự tồn bộ các gen
vrrA (nhiễm sac thể), pagA, cya, lef (pXỊ1), capA,
capB, capC (pX02) cho thấy: Sự sai khác về trình tự
nucleotide của các gen đích trên giữa chủng nghiên
cứu và các chùng tham chiểu là khơng nhiều Trinh tự
đầy đủ của các gen phân ịập đã được đăng ký trên
Genbank với mã sổ: KP2131Ị2, KP213103,
KP213104, KP213105-7, KP759885-7, KP759888-93
(Phụ lục 3 -1 7 )
chửa chứng nội tại tái tổ hợp xác định B anthracis
Để xác định B anthracis cĩ độc lực, cần chl ra
được chủng vi khuẩn than đĩ cĩ chứa đồng thời cả 2
plasmid độc íực là pX01 và pX02 Phản ứng mPCR
đã được thiềt kế với 3 cặp mồi ià vrrAF1/R1,
pagAF1/R1 và capAF1/R1 để xác đính sự cĩ mặt cùa
các gen tương ứng đặc trưng cho B anthracis Sản
phẩm mPCR khuếch đại đồng thời 3 gen đích của B
anthracis cỏ kích thước lần lượt là 222, 751 và 610 bp
xảc định các gen tương ứng vrrA, pagA và capA cùng
với sển phẩm khuếch đại plasmid IC (sử dụng chung
cặp mồi capAF1/R1, cho sản phầm cĩ kích thước 1kb)
dề dàng phân biệt tren bản điển di (Hình 2)
IC 1000 bp
pagA 751 bp capA 610 bp
vrrA 222 bp
Hình 2 Xác định B anthracỉs gây bệnh trong tự nhiên
bằng mPCR chứa chứng nội tại M: Marker 100 bp (Thermo scientific), ĐC {-): Đối chứng âm; ĐC(+): Đối chưng dượng sử dụng plasmid chứa cac gen pagA, capA, vrrA; B1-3: Các mẫu cần kiểm tra
Trang 4BÀN LUẬN
Việc phân tích trình tự các gen đặc írưng và gen
độc lực của các chủng B anthracis phân lập ờ Việt
Nam rất quan trọng Đây là công bố đay đủ nhất trong
nước về trình tự nucleotide gen vrrA và các gen đặc
trưng trên hai plasmid độc lực là pX01, pX02 Kết quả
cho thấy, sự sai khác về trình tự nucleotide của các
gen đích trên giữa chủng nghiên cứu và các chủng
tham chiếu là không nhiều Mức tương đồng cao phản
ánh tính đa dạng di truyền thấp cùa các chủng B
anthracis Một phần kết quả này đã được công bố
trong công trình nghiên cửu gần đây của nhóm tác giả
[2], Đột biến xảy ra ít được lý giải do B anthracis có
khả năng hỉnh thành bào tử, tồn tại írong đất qua
nhiều thập kỷ Do đó, cơ hội để tích lũy các đột biến
DNA bị hạn chế, dẫn đến sự biến đổi dí truyền tương
đối íỉ [7] Từ đó, việc thiết kế kỹ thuật PCR chẩn đoán
B anthracis và thư nghiệm dựa írên các chủng phân
lập trong nước hoàn toàn có thể chần đoán với chùng
từ các khu vực khác trên thế giới Đột biến mới
(A->G)1Q48 được xác định ờ gen capA trên chủng B
ànthracỉs Ba1 co íhề có ý nghĩa về đa dạng di truyền
gen capA, nên đưực quan tâm khi nghiên cứu, lựa
chọn chủng cho nhiều mục đích khác nhau
Đến nay, rất ít công bố về các phương pháp chẩn
đoán phân tư đề cập đen chứng nội tại IC [6,8] Chứng
nội tại ià cần thiết và gần như bắt buọc trong các phàn
ứng chẩn đoán dựa trên PCR Một số công trình cũng
đã nghiên cứu IC nhưng thường ià bổ sung trong giài
đoạn phản ứng khuếch đại nên không kiểm soát được
quá trỉnh tách chiết acid nucleic [10,12] Trong công
trình này, để kiểm soát toàn bộ các công đoạn xềí
nghiệm, lò được bổ sung vào mấu trong quá trinh tách
chiết với một iượng tối thiểu có thể phat hiện được
nhằm loại bổ tối đa anh hưởng đến hiệu quả ỉẩch chiết
cũng như mPCR Nồng độ ỈC được sử dụng ià
5x104copies/phản ứng (chi tiết quá trinh tối ưu mPCR
chứa IC đã được công bố trong bài báo gần đây cùa
nhóm nghiên cưu [4]) Sản phẩm IC xuấỉ hiện ở tất cả
các mẫu trên bản điện di, điều này chứng tổ quá trinh
tách chiết và mPCR đảm bảo, theo đó các kết quả xác
định là đáng tin cậy (Hình 2)
Có nhiều phương pháp từ đơn giàn đến phức tạp
được sử dụng để phát hiện B anthracis Nuôi cấy,
định danh trên môi trường thạch máu đòi hỏi nghiêm
ngặt về vấn đề an toàn sỉnh học Một số phương pháp
mien dịch như phát hiện kháng nguyên và độc tố B
anthracis có ứng dụng hạn chế do đọ nhạy và độ đặc
hiệu thấp Phản ứng mPÒR trong công trình này được
thực hiện đơn giản đã cho phép xác định nhanh, chính
xác B anthracis gây bệnh trong tự nhiên Điểm đặc
biệt ờ chỗ, mPCR có chứa ba cặp mồi dùng đề khuếch
đại đồng thời bốn sản phẩm gom ba gen đích vrrA,
pagA, capẠ của B anthracis và một gen IC Phản ứng
này đã khắc phục được hiện tượng đương tính gia
trong trường hợp chủng B anỉhracis không đay đủ độc
lực, giúp giam giá thành và thời gian chẩn đoán so với
việc phai thực hiện các phản ứng đơn Mặt khác, IC tái
ỉồ hợp được bổ sung vào mẫu trong quá trình tách
chiết ADN và khuếch đại đồng thời trong phản ứng
mPCR tối ưu cho phép xác minh kếí quả chẩn đoán, loại bỏ hiện tượng am tính giả
KẾT LUẬN_VA KIẾN NGHỊ
Kết luận: Trình tự đầy đủ gen đặc trưng vrrA (nhiễm sắc thể), các gen độc lực pagA, ief, cya (plasmid pX01) và capA, capB, cape (plasmid pX02) của 10 Chung B anthracis ở Việt Nam có sự sài khác không nhiều so vởi thể giới Một đột biến mới (A-»G)1048 được xác định ở gen capA trên chủng B anihracis Ba1 Đòng thời, đã phát triển thành công kỹ thuật PCR đa mồi chứa chứng nội tại tái íổ hợp xác định nhanh, chính xác B anthracis gẩy bệnh trong tự nhiên
Kiến nghị: Đánh giá khả năng phát hiện của kỹ thuật mPCR chứa IC xác định B anthracis trên thực địa và chế tạo bộ kit mPCR đa mồi chẩn đoán chính xác B anthracis
Lời cảm ơn: Công trinh này được hoàn thành nhờ
sự tài trợ kinh phí cùa Chương trình CNSH phục vụ An ninh, Quốc phỏng do Bộ Quốc phòng chủ quan thông qua nhiệm vụ “Nghiên cứu chế tạo kit PCR đa mồi xác định nhanh đồng thời hai tác nhân vi khuẩn than và dịch hạch” Mã số: 2013.75.58
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Nguyễn Ngọc Bảo, Đoàn Trọng Tuyên, Nguyễn Xuân Thanh Nghiến cứu đặc điểm di truyền phan tư mội
số yếu tố độc lực cùa chủng Baciiỉus anthracis lưu hành ơ khu vực mien núi phía Bắc Việt Nam Hội nghị khoa học Công nghệ Sinh họctọàn quốc 2013 2013 pp 594-8
2 Đinh Thị Thù Hằng, Sơn Nguyễn Thái Nghiên cứu toàn bộ trình tự gen pagA trên một số chủng Bacillus anthracis phân lập ở miền Bắc Việt Nam Tạp chí Y Dược học Quân sự 2015 40(3), pp 135-143
3 Đinh Thị Thu Hằng, Nguyễn Thái Sơn, Đoàn Trọng Tuyên và c s Thiết kể chửng nội tại tái tổ hợp trong phản ứng multiplex PCR chần đoán Bacillus anthracis Tạp chí
Y Dược học Quân sự 2015.40(6), pp 17-26
4 Đinh Thị Thu Hằng, Nguyễn Thối Sơn, Minh Nghiêm Ngọc, Phát triền phản ứng multiplex PCR chứa chứng nội tại ỉái tổ hợp xác định đồng thời vi khuẩn Bacillus anthracis và Yersinia pesíis Tạp chí Y học Dự phòng 2015 XXV(8 (168)), pp 239-246 _
5 Candela, I , Mock M., and Fouet A CapE, a 47- amino-acid peptide, is necessary for Bacillus anthracis poiygiutamate capsule synthesis J Bacterioi 2005 187(22), pp 7765-72
6 Eíỉerbrok, H., Nattermann H.t Oze! M., et a! Rapid and sensitive identification of pathogenic and apathogenic Bacillus anthracis by real-time PCR FEMS Microbiol Lett
2002 214(1), pp 51-9
7 Hugh-Jones, M and Blackburn J The ecology of Bacillus anthracis Mol Aspects Med 2009 30(6), pp 356-67
8 Kiee, s R., Ozel M., Appel B., et a! Characterization of Bacillus anthracis-like bacteria isolated from wild great apes from Cote d'Ivoire and Cameroon J Bacteriol 2006 188(15), pp 5333-44
9 Letant, s E., Murphy G A., Alfaro T M., et a! Rapid-viabiiity PCR method for detection of live, virulent Baciiius anthracis in environmental samples Appl Environ Microbiol 2011 77(18), pp 6570-8 _
10 Loiez, c., Herwegh s., Wallet F,, et al Detection of
Trang 5Yersinia pesiis in sputum by real-time PCR J Clin
Microbiol 2003 41 (10) pp .4873-5 _
11 Lovchik, J A., Drysdale M., Koehler T M , et aỉ
Expression of either lethal toxin or edema toxin by Bacillus
anthracis is sufficient for virulence in a rabbit model of
inhalational anthrax Infect Immun 2012 80(7), pp
2414-25
12 Ngan, G J „ Ng L M., Lin R I , et a!
Development of a novel multiplex PCR for the detection
and differentiation of Salmonella enterica serovars Typhi
and Paratyphi A Res Microbiol 2010.161(4), pp 243-8
PHỤ LỤC
Phụ lục gồm:
Phụ lục 1 Các bài báo đã công bố liên quan đến công
trình
Đinh Thị Thu Hằng và Nguyễn Thái Sơn Nghiên cứu
toàn bộ trình tự gen pagA ỉren một số chủng Bacilius
anthracis phân íập ở miền Bắc Việt Nam Tạp chí Y Dược
học Quân sự 2015.40(3), pp 135-143
Đinh Thị Thu Hằng, Nguyễn Thái Sơn, Đoàn Trọng Tuyên và CS Thiết kế chửng nội tại tái tổ hợp trong phản ứng multiplex PCR chẩn đoan Bacillus anthràcis Tạp chí
Y Dược học Quân sự 2015.40(6), pp 17-26
Đinh Thị Thu Hằng, Nguyễn Thái Sơn, Nghiêm Ngọc Minh Phát triền phàn ưng multiplex PCR chứa chửng nội tại tải tổ hợp xác định đổng thời vi khuẩn Bacillus
a n i u i a ^ i S V O t o r s i n i c a p c ? d ik > i <?ụ C m I Ỵ I t y i s U Ự f J i i U n y
2015 XXV(8 (168)), pp 239-246
Phụ lục 2, Đăng ký sáng chế của Cục Sở hữu Trí tuệ Việt Nam và Phiếu kết quả phân tích cua Viện Kiểm định Quốc gia vắc xin vồ Sinh phẩm y tế
Phụ lục 3 -17 Trinh tự các gen giải trình tự của các chủng B anthracis phân lập ở Việt Nam được đăng ký trên Genbank
Phụ lục 18 Giấy xác nhận ứng dụng kết quả đề tài (Phụ íục có minh chứng kèm íheo trong Báo cáo toàn văn đầy đu)
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ ĐỊNH DANH LOÀI MỘT
SỐ CHỦNG NẤM MEN VÀ XÁC ĐỊNH TỶ LỆ ĐÈ KHÁNG VỚI THUỐC KHÁNG NÁM BẰNG PHƯƠNG PHAP KHUẾCH TÁN TRÊN ĐĨA THẠCH
Ths Ngô Thị Minh Châu, TS.Tôn Nữ Phương Anh, CN Đ ỗ Thị Bích Thảo
Bộ môn Ký Sinh Trùng - Đại học Y Dược Huế, Việt Nam
TS Antoneila Santona, TS Siĩvana Sana, GS.Piero Cappucineỉli
Khoa Vi sinh lâm sàng và thực nghiệm - Đại học Sasarí, Cộng hòa Ý
TÓM TẮT
Nấm men là tác nhàn gây bệnh quan trọng ờ người, đặc biệt bệnh do nấm Candida sp là bệnh phò biến Nghiên cứu của chúng tôi được tiến hành irên 121 chung nấm men phân lập ở Bệnh viện Trường Đại học Y Dược Huế và Bệnh viện Trung ương Huế.
Mục tiêu: Định danh loài một so chủng nấm men phân lập được từ câc bệnh nhàn được chẩn đoán nhiễm nấm nông hoặc nấm sâu vả xác định tỷ lệ đề kháng với một số thuốc kháng nấm Phương pháp nghiên cứu: Chúng tôi âp dụng kỹ thuật khối phổ MALD! - TOF (Maldi Tof Mass: Matrix-assisted laser desorption/ionization Mass Spectrometry), kết hợp với kỹ thuật PCR và giải trình tự gen để định danh loài vi nấm Kháng nấm đồ được thụ-c hiền bằng phương pháp khuếch tán trên đ a thạch Kết quả: Có 121 chủng nấm phân lập được, trong đó
7,44%, c.orthopsilosis 4,96%, c.metapsilosis 0,83%, c.krusei 3,30%, c.guilliermondii 3,30%, c.famata 1,65%, c.norvegensis 0,83%, c.mesorvgosa 0,83% Ngoài ra chúng tôi cũng phân lập được 1 số loài nấm men khác như: Geotríchum capitatum 1,65%, Tríchosporon asahii 1,65% Đânh giá sự nhạy cảm của 6 loài vi nấm Candida
sp có tần xuất phân lập cao trong nghiên cứu này ghi nhận 100% nhạy càm với amphotericin B và nystatin Tỷ lệ
đề khàng của C non albicans yà c albicans với fluconazole và itraconazole lần lượt là 40,74%, 3,77% và 5,66%, 50% Kết quả của chúng tôi cũng ghi nhận 20,37% c non albicans và 18,86% c albicans đề kháng với 5- fluorocystocine Tỷ lệ đề kháng với caspofungin của c non albicans và c albicans lần iưọt là 7,41% và 13,2% Kết luận: Giống Candida sp chiếm ƯU thế với loài c albicans có tỷ lệ cao nhất Một số loài Candida non albicans biếm gặp được phân lập trong nghiên cứu này: c orthopsilosis, c.metapsilosis, c.norvegensis, và c.mesorugosa Ngoài ra cắc loài nấm men khác cũng được định danh gồm Geotríchum capitatum và Trichosporort asahii Tất cả loài Candida sp nhạy càm tot với amphotericin B và nystàtin, nhưng có một tỷ lệ đáng kề c non albicans đề kháng với kháng nấm thuộc nhóm azole.
Từ khóa: Nấm men, Candida sp, kỹ thuật khối phổ MALDI - TOF, khống nấm đồ, đề kháng.
SUMMARY
APPLICATION OF MOLECULAR TECHNIQUE TO IDENTIFY YEASTS SPECIES AND EVALUATION
Ths Ngo Thi Minh Chau, TS.Ton NuPhuongAnh, CN Đo Thi Bich Thao (Parasitology Department- Hue University o f Medicine and Pharmacy, Vietnam)
TS Antonella Santona, TS Silvana Sana, GS.Pieró Cappucinelli (Microbiology laboratory, Department Biomedical Science in Sassari, Italy) Background: Yeasts are important opportunistic pathogen in human, in which Candida sp are the most