Tại Việt Nam, các nghiên cửu liên quan đến chần đoán, phát hiện độc lực của các staphylococci và tính kháng Methỉciliin bằng các phương pháp truyền thống, tuy nhiên các ng[r]
Trang 1NGHIÊN c ứ u CHẨN ĐOÁN NHANH STAPHYLOCOCCI VÀ TÍNH ĐÈ KHÁNG METHICILLIN CỦA CHÚNG BẰNG KỸ THUẬT PCR ĐA MỒI
Những người thực hiện: Trần Thanh Loan, Trương Đình An Sơn
Bộ môn Vi sinh, Trường Đại học Kỹ thuật Y Dược Đà Nắng
Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Trần Đình Bỉnh
Bộ môn Vi sinh, Trường Đại học Y Dược Huế
ĐẶT VÁN ĐỀ
stảphyỉococci ỉà một tác nhân gây nhiều nhiễm
khuẩn thường gặp, chúng có thể gây nên nhiều bệnh
lý khác nhau như nhiễm khuẩn tiêu hóa, nhiễm khuẩn
da, nhiễm khuẳn đường tiết niệu, nhiêm khuẩn vết
thương, vết bỏng, viêm nội tâm mạc, nhiễm khuẩn
huyểt, viêm tủy xương.,.[2], [3], [4], [5] Các nhiễm
khuần do staphyiococci thương điều irị khó khăn do vi
khuển kháng íhuốc, rất nhiều cac staphylococci kháng
thuốc, đa kháng thuốc được phân lập từ bệnh nhân
Các vi khuẩn kháng Methiciliỉn íhường kháng với nhiều
thuốc khác, nên nó được xem như là “siêu vi
khuẩn”[2], [3], [6] Việc chẩn đoản sớm sự nhiễm
khuẩn do staphylococci và tính kháng thuốc của
chúng có vai trò rất quan trọnp trong điều trị Nhiều
nghiên cứu ứng dụng các yểu to tạo nên độc lực mạnh
cua Staphylococci như các yếu tố xâm nhiêm, sinh độc
íố, sinh các men phân huy protein, chất diệt bạch
cầu Trong đó, FemA, Coagulase là những chỉ thị
thường dùng để phát hiện các staphylococci có độc
lực ờ các phòng thí nghiệm.
Tại Việt Nam, các nghiên cửu liên quan đến chần
đoán, phát hiện độc lực của các staphylococci và tính
kháng Methỉciliin bằng các phương pháp truyền thống,
tuy nhiên các nghiên cứu ve kỹ thuạt sinh học phân tư
đe phát hiện gen mã hóa FemA, yếu tố độc iực của
các Staphylococci như Coagulase hoặc gen mecA đề
kháng Methicillin của các staphylococci chưa có nhiều
t2] ~
Đê tài: “Nghiên cứu chân đoán nhanh
Staphylococci và tính đề kháng Methiciliin của chúng
bằng kỹ thuật PCR đa mồi” nham mục tiêu xây dựng
quy trỉnh chẩn đoán nhanh staphylococci, xác định
gen mã hóa FemA, yếu íố độc !ực Coagulase và tinh
đề kháng kháng sinh Methicillin của chúng bằng kỹ
thuật PCR và so sánh với các phương pháp chẩn
đoán Staphylococci phòng thí nghiệm truyền thống,
phát hiện Coagulase và tính đe kháng kháng sinh
Methicilỉin của chúng
ĐÓI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
1 Đối tượng nghiên cứu
- 80 chủng VI khuẩn của các staphylococci gồm 45
chủng S.aureus và 35 chủng staphyococci coaguỉase
âm tính được phân iập bằng phương pháp ntioi cấy
thường quy
- Cac chủng vi khuẩn làm chứng gồm 01 chủng s
aureus có Coagulase (+), mecA (+), FemA (+), 01
chủng vi khuẩn Streptococcus pyogenes (chứng âm
Coagulase (-), mecA (-), FemA (-)
2 V ậỉ liệu nghiên cứu
2.1 Hóâ Chat, sinh phẩm
- Các loại môi trường nuôi cáy và thực hiện kháng sinh đồ: Môi trường nuôi cấy: íhạch máu, thạch thưởng, Chapman, BHI, Muelíer HỈnton Agar, môi ỉrường sinh vậí hóa học
- Các loại vật iíệu khác: Thuốc nhuộm Gram, Huyết tương thỏ, H202 3%, Nước muối sinh lý vô khuẩn, các loại đĩa kháng sinh Oxacillin và Cefocitin
- Các loại hóa chất để thực hiện PCR: Agarose, duncj dịch điện di, Ethidium Bromide, thang DNA chuan
2.2 Thiết bị, dụng cụ
- Các loại thiết bị: Tu ấm 350C và 370C, máy iắc rung (Vortex), tủ lạnh, các loại máy ly tâm, tủ an íoàn sinh học, máy luân nhiệt, buồng điện di, bàn đèn đọc kết quả điện di
- Các loại dụng cụ: Đèn cồn, kẹp đĩa kháng sinh, thước đo đường kính vỏng ức chế, khuyên cấy, tăm bông vô khuẩn, các loại vật iỉệu đề thực hiện PCR
3 Phương pháp nghiên cứu
3.1 Kỹ thuật nuôĩ cắy và định danh vi khuẩn Staphylococci
Các bệnh phẩm được cấy trên các môi trường đặc, lỏng tùy theo yêu cầu kỹ thuật của từng loại mẫu ngNệm Khi có khuẩn lạc nghi ngờ (màu vàng trên Chapman, tan máu B trên thạch máu ), làm phiến phếí nhuộm Gram kiểm tra hình thải Tiến hành phân lập và định danh theo quy trình truỵền thống chẩn đoán các Staphylococci là: cầ u khuan Gram dương đứng đám, catalase dương tính, xác định Staphylococci khi có các tiêu chuẩn sau: sắc íố vàng, lên men đường mannit, có coagulase dương tính Các Síaphyiococci coagulase âm tính khi có hay không lên men đường mannit, coaguỉase âm
[2J,[33-3.2 Kỹ thuật phát hiện vi khuẩn staphylococci kháng Methicillin qua trung gian mecA bằng kỹ thuật s ử dụng đĩa Cefoxitin (Theo CLSl 2011): Với
khoanh giấy cefoxitin 30ụg tren môi trường Mueiler Hinton Agar, trong Điều kiện nuôi cấy: 33-35 °c/16 -
18 giờ Đọc kết quả: ắ 21 mm = mecA diPơng tính; ằ
22 mm = mecA âm tính [1]
3.3 S ử dụng kỹ thuật PCR tìm gen mã hóa FemA, Coagulase và gen mecA
- Tách chiết DNA từ khuẩn lạc staphylococci: Tách chiết DNA bằng phương pháp nhiệt DNA của vi khuẩn sẽ được chuẩn b ĩ bằng cách lấy 1 khuẩn lạc cho vào ống eppendorf có chứa 250 MÍ nước cẩt Huyền dịch vi khuẩn này sẽ được chưng cách thủy ở nhiệt độ 990C trong 10 phút Sau đo quay ly íam 10.000 vổng/phút trorìg 10 phút Bỏ phần cặn lắng, lấy phần dịch noi đề sử dụng cho phản ứng
PCR [2], ự ], [8]
Trang 2- Cặp mồi (Primers): Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu
Coagulase 5'-ATAGAGATGCTGGTACAGG-3’
5'-GCTTCCGAĨTGTTCGATGC-3 603-872 Coaguíase Hookey eí ai (1998) [3]
2 mecA 5-CCTAGTAAATGCTCCGGAA-3’ 5’-CTAGTCCATTCGGTCCA-3 314 MRSA Nizami Duran (2012) [6]
3 FemA 5'-AAAAAAGCACATAACAAGCG-3‘
5’-GATAAAGAAGAAACCAGCAG-3' 132 S.aureus Nizami Duran (2012) [6]
* Thực hiện phẫn ứng PCR
Một phản ứng PCR y=25|il gồm: 1.5mM MgC!2,
200ịjM mỗi loại dNTP, 0,625 unit Taq DNA
polymerase, 0,5ụM mỗi mồi, Taq buffer, nưởc cất 2
iần*
Các bước tiến hành: Đối với mỗi mẫu, thực hiện
như sau: 20|il mix PCR pha ở trên + 5ịi\ dịch DNA tách
chiết, cho vao eppendorf 0,2mi Đặt chường trình cho
máy iuân nhiệt hoạt động:
Bước 1: 95°c 5 phút 1 chu kỳ
Bước 2:
95°c 30 giây
40 chu kỳ
51°c 30 giâv
72°c 30 giây Bước 3: 72°c 6 phút 1 chu kỳ
Điện di để phát hiện sản phẩm PCR: sản phẩm tạo
thành được điện di ờ điện thế 80V, trên thạch agarose
1% nhuộm với chất màu huỳnh quang tự nhiên và đọc kết quả ở buồng đọc huỳnh quang Sự hiện diện cua sản phẩm sẽ được so sánh với thang mẫu ĐNA ladder
100bp
4 X ử lý số liệu: Xử lý các số liệu thu thập đưực bằng phương pháp thống kê y học Độ nhạy và độ đạc hiệu của các thử nghiệm tính theo công thức của bảng 2x2 ià: Độ nhạy = a/a+c; Độ đặc hiệu = d/b+d [9]
KẾT QUẢ NGHIỀN cứ u
1 Tính chất sỉnh vật học của các staphylococci phân lập được
Bảng 1 Tính chất sinh vật học của các staphylococci
Tính chất
Vi khuẩn ' Câu khuấn Gram (+)n % Catalase (+)n % Mannit (+)n % Coagulase (+)n % Tan máu {+)n % sẳc íố vànqn %
S aureus 45 100,0 45 100,0 45 100,0 45 100,0 39 86,7 45 100,0 Staphylococci coagulase
Các Staphylococci được định danh và xác định độc
lực bằng phướng pháp truyền thống dựa vào tiêu bẩn
nhuộm Gram, tính chất Caíalase dương tính, làm đông
huyết tương, lên men đường Mannit, tính chất tan máu
và khuẩn íạc có sắc tố màu vàng
2 Đặc điểm kiểu hình và kĩểu gen về độc iực và
kháng Methiciliin của hai nhóm staphylococci
khảo sát
Bảng 2 Tính kháng thuốc Methiucillin của các
Các chùng vi
khuẩn
Số chủng
thừ
Tính kháng Methiciilin bằng test Cefoxitin qua trung gian mecA
sta coa (-) 35 15 42,9 20 57,1
Tống cộng 80 55 68,8 25 31,2
trung gian mecA qua test Cefoxitin kết quà cho thấy
các chùng S.aureus kháng Cefoxitin đếrì 88,9%, các
chùng staphylococci coaguiase âm tính kháng
Cefoxitin chi CO 42,9% Tỳ !ẹ đề kháng chung của các
chủng Staphylococci là 68,8%
Bảng 3 Kiểu gen mã hóa chủng vi khuẩn, độc lực
và kháng Methiucillin cùa các chủng staphylococci khảo sát
Các chủng
vi khuẩn Số chủng thử
FemA mecA Coagulase í+ì í-ì (+) {-) í+ì (-)
sta coa (-) 35 3 32 15 10 3 32 Tổng cộng 80 48 32 55 25 48 32 100,0% chủng có S.aureus có Coagulase dương tính với thử nghiệm Coagulase trên phiến kính đều có gen mã hóa Coagulase, các staphylococci Coaguiase
âm tỉnh (thử nghiệm Coagulase trôn phiến kính và trong ống nghiệm) có 8,6% (3 chủng) có gen mã hóa Coagulase
100,0% chủng có s.aureus có Coaguiase dương tính với thử nghiệm Coagulase trên phien kính đều có gen mã hóa FemA, các staphylococci Coagulase âm tính (thử nghiệm Coagulase tren phiến kính và trong ống nghiệm) có 8,6% (3 chùng) có gen mã hóa FemA 88,9% chủng có S.aureus có gen mã hóa mecA, các Staphylococci Coagulase âm tính có 42,9% (15 chủng) có gen mã hóa mecA
Trang 31 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 1314 15
Lane 7: DNA ladder
Lane 14 chủng s.aureus kháng Methiciilin (chứng
dương có Coagulase (+), mecA (+), FemA (+)
Lane 15: Chung V! khuẩn Streptococcus pyogenes
(chứng âm có Coagulase (-), mecA (-), FemA (-),
Lanes 2, 3, 9: chủng vi khuẩn có Coagulase (+),
mecA (+), FemA (+)
Lanes 1,2, 3, 5, 6, 8, 9 ,1 1 ,1 2 , 13: chùng vi khuẩn
có FemA (+)
Lanes 4, 10: chủng vi khuẩn chứng Ps
aeruginosa, E.coli CÓ FemA (-)
Bảng 4 Đánh giá giá trị của các kỹ thuật xác định
Coaguíase của các chủng S.aureus
"■\i$ếí quả PCR
Test Coaguìầse^,
Có gen mã hóa Coagulase
Không có gen
mã hóa Coagulase
Tổng cộng S.aureus
Staphylococci
Độ nhạy của kỹ thuật truyền thống xác định
Coagulase cùa staphylococci là 93,8%, kỹ thuật
truyền thống cũng đã bỏ sót 3 chủng staphylococci
có gen mã hóa Coagulase Độ đặc hiẹu cua kỹ thuật
truyen thống xác định Coagulase của các chủng
Staphylococci là 100,0%
Bảng 5 So sánh các kỹ thuật xác định tính kháng
Methiciliin của S.aureus
MecA (+) MecA {-)
Độ nhạy của kỹ thuật dùng dĩa Cefoxitin phát hiện tính kháng Methicillín ờ s.aureus !à 100,0%, độ đặc hiệu là 100,0%
Bảng 6 So sánh các kỹ thuật xác định íính kháng Methicillỉn của staphylococci coagulase âm tính
MecA (+) MecA (-)
Độ nhạy của kỹ thuật dùng dĩa Cefoxitin phát hiện tính kháng Methiciilin ở staphylococci coagulase âm tính là 100,0%, độ đặc hiệu là 100,0%
BÀN LUẬN Nghiên cứu 80 chùng của các staphylococci được định danh và xác định độc lực bằng phương pháp truyền thống dựa vào tiêu bản nhuộm Gram, tính chất Catalase dương tính, làm đông huyết tương, lên men đường Manrtit, tính chất tan máu và khuẩn lạc có sắc tố màu vàng Dựa vào các tính chất này, chúng ta đã có thể định danh khá chính xác S.aureus và các staphylococci coagulase âm tính Thời gian để định danh hết 40-48 giờ
Sử dụng kỹ thuật PCR đa mồi để xác định gen mã hóa FemA, òoaguiase và gen mecA đề kháng Meíhicĩllin của các chủng vi khuẩn cùa hai nhóm Staphylococci, kết quả có 48 chủng vi khuẩn của các Staphylococci có gen mã hóa Coaguiase, chiếm 60,0%, trong đó 100,0% chủng s.aureus có Coagulase dương tính với thử nghiệm Coaguiase trên phiến kính đều có gen mã hóa FemA, Coaguiase, tuy nhiên với các chủng staphylococci Coagulase âm tính (cả với thử nghiệm òoagulase
Trang 4trên phiến kính và trong ống nghiệm) lại có đến 8,6%
(3 chủng) có gen ma hóa ồoagúlase đồng thời
chúng cũng có gen mã hóa FemA Qua so sánh íhẩy
độ nhạy của kỹ thuật truyền thống xác định
Coagulase cho thấy với cả 2 nhóm staphylococci là
93,8%, trong đó đối với S.aureus thì độ nhạy đến
100,0% và độ đặc hiệu thì với nhóm staphylococci
coagulase âm tính là 100,0%, tuy nhiên, kỹ thuật này
không xác định được gen coagulase nên khi dùng
PCR thi có 3 chùng có gen Coaguỉase
Sử dụng kỹ thuật kháng sinh đồ khuếch tán trên
thạch theo phương phập Kirby-Bauer để xác định
tính kháng Methicillin bằng đĩa kháng sinh Cefoxitin
1qua ỉrung gian MecA, kết quả là các chủng s.aureus
có 88,9% kháng Ceíoxiỉin, còn các chủng
Staphylococci coaguíase âm tính kháng Cefoxitin !ai
đến 42,9%
Kết quà PCR xác định gen mecA, chúng tôi nhận
thấy 88,9% các chủng s.aureus có gen mecA và
42,9% các Staphylococci coaguiase âm tính có gen
mecA Qua so sánh thấy độ nhạy cùa kỹ thuật dùng
dĩa Cefoxitin phát hiện tính kháng Methicillin ở
S.aureus và staphylococci coagulase âm tính là
100,0%, độ đặc hiệu íà 100,0% Tác giả
Venkatakrỉshna Rao (2011) đã đánh giá hiệu quả của
phương pháp khoanh giấy khuếch tán với đĩa
Cefoxitin 30 jjg, kết quả ghi nhận độ nhạy và độ đặc
hiệu của đĩa Cefoxitin phát hiện tính kháng Methicillin
qua trung gian mecA cỏ cả độ nhạy và độ đặc hiệu íà
100% [7]
Chúng tôi đã xây dựng được quy trình PCR đa
mồi để xác định gen mã hóa FemA, Coagulase và
gen mecA của các staphylococci bằng kỹ thuật đa
mồi Chúng tôi lựa chọn thiết kế 3 cặp mồi để xác
định gen mã hóa FemA, Coaguiase và mecA có kích
thước sản phẩm khá khác biệt, chúng sẽ tách xa
nhau trong quá trinh điện di, tạo ra những băng cách
biệt nên dễ dàng nhận xét kết quả, tăng cao độ tin
cậy khi đánh giá kết quả Các tác giả khác cũng có
gợi ý tương tự [2],[3],[43,C5],[8] Quy trình tương đối
đơn giản, dễ thực hiện ờ tất cả các phòng thí nghiệm
hay phòng xét nghiệm có phương tiện cho PCR Kết
quả nhanh chóng và chính xác, rát hữu ích cho lâm
sàng để kịp thời điều trị các nhiễm khuẩn do
Staphylococci Nếu so sánh với quy trình chẩn đoán
Staphylococci và xác định tính kháng Methiciiiin theo
phương pháp truyền thống, chúng tôi nhận thấy:
- Phương pháp truyền thống: cho kết quả sớm
nhất là 40-48 giờ kể từ khi lấy mẫu nghiệm (nhuộm,
nuôi cấy, xác định coagulase, kỹ thuật đĩa kháng
sinh)
- Kỹ thuật PCR: cho kết quả sớm nhất là 20“24
giờ (nhuộm, nuôi cấy, PCR)
Với kỹ thuật 3 cặp mồi (triplex PCR) xác định gen
mã hóa FemA, Coaguiase và gen mecA cùa chúng
tôi, kết quả hoàn toàn đáng tin cậy, kỹ thuật thực hiện
không quá phức tạp, các phòng thí nghiệm ở các bệnh viện tuyến tỉnh đều có thể tiến hành được nhằm chẩn đoán sởm, chính xác các nhiễm staphyiococci
và tính kháng thuốc của chúng để có hướng điều trị kịp thời
KẾT LUẬN Qua nghiên cứu 80 chủng staphylococci bằng các phương pháp xét nghiệm vi sinh truyền thống và sử dụng kỹ thuật PCR, chúng tôi đã xây dựng được quy trỉnh PCR 3 cặp mồi (tripiex PCR) để xác định gen FemA, gen mã hóa độc lực Coagulase và gen mecA
Quy trình có thể thực hiện được ở các bệnh viện
tuyến tỉnh để chần đoán sớm, chính xác cấc nhiễm khuẩn do staphyiococci và tính kháng thuốc của chúng để điều trị hiệu quả
TA! LIỆU THAM KHẢO
1 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSi) (2011), Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-First Informational Supplement, M 100-S21.JISSBN 1-56238-742-1)
2 Trần Thu Hoa, Đỗ Thị Lan Hương, Nguyễn Thị Ngọc Loan, Hoàng Hiếu Ngọc, Phạm Hùng Vân (2009),
"Nghiên cứu chế tạo bộ thử nghiệm multiplex PCR phái hiện Staphylococci đề kháng Methỉciilin”, Y học TP Hồ Chí Minh, Tập 13, Phụ bản số 2, tr 176-180
3 Hookey J.v, Richardson J.F and Cookson B.D (1998), “Molecular typing of staphylococci Based on PCR Restriction Fragment Length Poiymorphis and DNA Sequence Analysis of the Coagulase gene” J of Clin Microbiol, Voi 36 (4), pp 1083-1089
4 Kalhor H, Shariati L, Validi M et al (2012),
“Comparison of Agar screen and duplex PCR methods
in determination of MRSA strains isolated from nasal carriage” African J of Microbiology Research, Vol 6(16),
pp 3722-3726
5 Motiagh Mohammad Reza Safari, Maesumeh Anvari (2010), “Rapid detection of meỉhicillỉn-resistaní Staphylococci by multiplex PCR", African Journal of Biotechnology, Vol 9(45), pp 7629-7631
6 Nizami D, Burcin o , Gu!ay G.D et al (2012), Antibiotic resistance genes & susceptibility patterns in Staphylococci, Indian J Med Res, 135, pp 389-396
7 Rao Venkatakrishna, Bhat Kishore, Kugaji Manohar, Pai Vidya, Shantaram Manjula (2011),
“Detection of Methiciliin Resistance in staphylococci: Comparison of Disc diffusion and MIC with mecA gene detection by PCR”, international Journal of Pharmacy and Biological Sciences, Voi 1, Issue 4, pp 518-521
8 Thean Y Tan (2002), “A Comparison of PCR detection of mecA with two standard methods of oxacillin disk susceptibility testing for coagulase- negative Staphylococci”, Journal of Medical Microbiology, Vol(51),
pp 83-85
9 Phạm Hùng Vân (2006), Kỹ thuật xét nghiêm vi sinh lâm sàng Nhà xuất bản Y học