Kết luận: Lần đầu tiên tại Việt Nam, chúng tôi đã xây dựng và áp dụng được quy trình chần ổoốn di truyền trước chuyển phôi bệnh teo cơ tủy bằng cách s ử dụng đồng thời hai kỹ thuật [r]
Trang 14 Qi Y., Zhang Y.,W ang z., Yang Y., Yuan Y., Niu
S., Pei P., Wang s., Ma Y., Bu D., Zou L., Fang F., Xiao
J.,Sun F., Zhang Y.,Wu Y.,Wang s., Xiong H.,Wu X
(2006), “Screening of common mitochondrial mutations in
Chinese patients with mitochondria!
encephaiomyopathies", Mitochondrion, 7, pp 147-150
5 Szuhai K., Ouweiand J M., Dirks R w , Lemaĩtre
M., Truffert J c., Janssen J M., Tanke H J., Holme
E., Maassen J A., Raap A K (2001), “Simultaneous
A8344G heteroplasmy and mitochondrial DNA copy
number quantification in Myoclonus Epilepsy and Ragged-
Red Fibers (MERRF) syndrome by a multiplex Molecular
Beacon based reai-time fluorescence PCR , Nucleic Acids
Research, 29(3), pp 1-6
6 Truong T H., Nguyen T V A., Nguyen V L„ Pham
V A., Phan T N (2014), “Screening of common point- mutations and discovery of new T14727C change in mitochondrial genome of Vietnamese encephaiomyớpaihy patients”, Mitochondrial DNA, 27, pp 441-448
7 Virgilio R., Ronchi D., Bordoni A., Fassone E., Bonato s., Donadoni c Torgano G., Moggio M., Corti
S., Bresolin N., Comi G p (2009), “Mitochondria! DNA G8363A mutation in the tRNA Lys gene: clinical, biochemical and pathological study", Journal Neurol Science, 281(1-2), pp 85-92
8 Zhang Y., Yang Y L , Sun F., Cai X., Qian N., Yuan Y., Wang z X.,Qị Y.,Xiao J X.,Wang X Y., Zhang Y H., Jiang Y w „ Qin J.,W u X R (2007), “Clinical and molecular survey in 124 Chinese patients with Leigh or Leigh-like syndrome", Journal of Inherited Metabolic Disease, 30(2), pp 265-267
NGHIÊN CỨU CHÁN ĐOÁN DI TRUYỀN TRƯỚC CHUYẺN PHÔI BỆNH TEO c ơ TỦY
Ths Nguyễn Thị Thanh Nga (Bộ môn Sinh học và D i truyền Yhọc, Học viện Quânỵ)
(Sinh viên năm thứ hai, Học viện Quân y)
BS Đào Hải Yên (Bênh viện Than khoáng sản)
Hướng dắn: PGS.TS Trần Văn Khoa
(Bộ môn Sinh học và Di truyền Y học, Học viện Quân y)
TÓM TẲT
Đặt vấn đề: Bệnh teo cơ tủy là bệnh thần kinh cơ ơo bị mất đồng hợp exon 7 gen SMNt trên nhiễm sắc thể số
5 Trẻ bị bệnh' teo cơ tủy thường có tiên luựng rất xấu và từ vong sơm Vì vậy, vẩn đề phòng tránh chủ động bệnh teo cơ tủy phải được ưu tiên hàng đầu Mục tiêu: mục tiêu chính của nghiên cứu là xây dựng được quy trình chẩn đoán di truyền trước chuyền phôi bệnh teo cơ tủy Đối tượng và phương pháp nghiên cưu: 17 bệnh nhi đã được chần đoán bị bệnh teo cơ tủy do mất đồng hợp tử exon 7 gen SMNt va bố mẹ của họ; 30 mẫu té bào phôi sính thiết từ phôi dư ngày 3; 04 gia ơình đã từng sinh con bị bệnh SMA và tự nguyện tham gia chẩn đoân di truyền trước chuyền phôi bệnh teo cơ tủy Kỹ thuật PCR- RFLP và minisequencing đế phát hiện đột biến gen SMNt gây bệnh teo cơ tủy Phương phâp nhân toàn bộ bộ gen nhằm khuếch đại bộ gen lên hàng nghìn lần Kết quả: Kỹ thuật PCR- RFLP đã được chuẩn hóa để phát hiện đột biến gen SMNt từ mấu toàn phần với hiệu suất la 100%
Kỹ thuật này cũng có hiệu quả nhân exon 7 gen SMNt từ các tế bào phôi sinh thiết là 93,33% Xây dựng đuực quỵ trình chẩn đoán di truyền trước chuyển phôi bệnh teo cơ tủy kết hợp sử dụng hai kỹ thuật PCR-RFLP va minisequencing Áp dụng quy trình xây dựng được đối với 04 cặp vợ chồng tự nguyện tham gia chẩn đoàn di truyền bệnh teo cơ tủy trước chuyển phôi và có 03 phôi đã được chuyển, một cặp vợ chồng đã sinh được một em
bé khỏe mạnh, một cặp đang mang thai Kết luận: Lần đầu tiên tại Việt Nam, chúng tôi đã xây dựng và áp dụng được quy trình chần ổoốn di truyền trước chuyển phôi bệnh teo cơ tủy bằng cách s ử dụng đồng thời hai kỹ thuật PCR-RFLP và minisequencing.
Từ khóa: Bệnh teo cơ tủy.
SUMMARY
PREIMPLANTATION GENETIC DIAGNOSIS OF SPINAL MUSCULAR ATROPHY
Nga Nguyen Thi Thanh*, Tuan Tran Van*, Cau Dong Phu* Yen Dao Hai**
(*: Military medical university; **: Coal and Mineral Hospital) Background: Spinal muscular atrophy (SMA) is a severe neurodegenerative autosomal recessive disorder Most o f patients are caused by the homozygous absence o f exon 7 o f the telomeric copy o f the SMN gene (SMNt) on chromosome 5 Until now, no specific treatment fo r SMA, only to treat the complications o f the disease
IS crucial SMA usually presents severe, high mortality rate So, the SMA prevention issues should be top priority Denved from practical needs, we conducted the project “Preimplantation Genetic Diagnosis o f spinal muscular atrophy" with the following objective setting up a preimplantation genetic diagnosis assay o f SMA Materials and Method: This study was earned out on 17 patients and their parents, 30 blastomeres were obtained from surplus
525
Trang 2embryos in day 3; 04 couples were Clinical PGD o f SMA Completing diagnostic procedures SMA genes by PCR
- RFLP and Minisequencing Then, setting up a preimplantation genetic diagnosis protocol o f spinal muscular atrophy on biopsied blastomeres Results: The PCR-RFLP method was completing in fresh blood from 17 patients and their parents to detect the homozygous deletion in exon 7 SMNt gene with the PCR efficiency of 96% The methods were also efficient, providing interpretable result in 93.33% (28/30) o f the blastomeres tested Four couples were treated using this method Three normal embryos were transferred resulting in one unaffected
I h / o h i r f h o n W n n o w / n / o o / ọ r a n n a n r ư c i t l \ J K s i i t Ỉ Ỉ KsCÃỈ ỳ J Ì i C t i i K J j r ir ' o í Ị f ' / < Ị C / Ạ n Q ’ ị A / ạ p r o t h e * t ị r t ĩ í t r ị Q Ị i r - n a o a f i i l i v c o i a r t f / i A P r a i r n n l a n t a f i n ni i / i U U f V ( l O ¥ * \ s c I I w i i i v i i i u i i s / O u V V /w u u » u i i j O w i u p u i u I r
Genetic Diagnosis o f spinal muscular atrophy by using both o f the techniques o f PCR-RFLP and minisequencing
in Vietnam,
Keywords: spinal muscular atrophy.
ĐẶT VẮN ĐỀ VÀ MỤC TỈÊU
Teo cơ tuỷ (Spina! muscular atrophv - SMA) là
bệnh thần kinh cơ di truyền lặn do đột biến gen SMNt
nằm trên nhiễm sắc thể số 5 Tỷ lệ mắc bệnh SMA ià
cộng đồng íà 1/50 Theo cách phân loại hiện hành,
dựa vào tuổi khởi phát bệnh và mức độ biểu hiện
bệnh, bệnh teo cơ tủy chia thành 3 type, type I, type II,
type III, trong đó type ! và II chiếm tỷ lệ chủ yểu và
thường mất sớm ờ lứa tuổi đi học do những biến
chứng suy hô hấp Hiện nay, chưa có phương pháp
nào chữa được bệnh SMA mà chỉ đỉều trị triệu chứng
ià chủ yếu và mỗi trẻ em mắc bệnh teo cơ tủy ra đời là
gánh nặng cho gia đình về tâm lý và tài chính Vì vậy,
chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu chẩn đoán di
truyền trước chuyển phôi bệnh teo cơ tủy” với những
mục tiêu:
1 Hoàn thiện được quy trình phất hiện đột biến gen
SMNt gây bệnh teo cơ tủy từ máu toàn phần.
2 Xây dựng được quy trình phát hiện đột biến gen
SMNt gây bệnh teo cơ tuy trên phôi thụ tinh trong ong
nghiệm.
3 Xãy dựng và ắp dụng được quy trình chẩn đoản
di truyền trước chuyển phôi bệnh teo cơ tủy cho gia
đình đã có con bị bệnh.
ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứ u
- Đối tượng nghiên cứu: 17 bệnh nhi đã được Bệnh
viện Nhi Trung ương chẩn đoán bị bệnh teo cơ tủy do
mất đồng hợp tử exon 7 gen SMNt và bố mẹ của họ
(51 người), 30 mẫu tế bào phôi được sinh thiết từ
những phồi dư ngày 3, 04 gia đình đâ tự nguyện tham
gia PGD bệnh teo cơ tỏy
- Các bước hoàn thiện quy trình phát hiện ổột biến
gen gây bệnh SMNt từ máu toàn phần
Thu mẫu máu toàn phần từ 51 người tham gia
nghiên cứu, tách ADN, tiến hành kỹ thuật PCR-RFLP
đế nhân và phát hiện đột biến gen SMNt gây bệnh teo
cơ tủy
Kỹ thuật PCR-RFLP
+ Trình tự mồi nhân exon 7 gen SMNt: F-5’-
cttccttttattttccttacagggatt-3’
R-5’-gtagggatgtagattaaccttttatct-3’
+ Chu trình nhiệt: 960C trong 5 phút; [940C trong 1
phút, 540C trong 1 phút, 720C trong 1 phút] X 35 chu
kỳ; 720C trong 10 phút, ù sản phẩm PCR vởi enzym
Hinfl để phân biệt exon 7 SMNỈ với exon 7 SMNc
Điện di gel agarose 3% kiểm tra kết quả
đo mẫỉ exon 7 2CQ SMNt (Khcmg maDg gen) lổObp — ^
78bp
Hình 1: Hỉnh ảnh minh họa kết quả đỉện di trên gel agarose 3% của exon 7 SMNt sáu khì ủ
với enzym Hinfl
Các bước xây dựng quy trình phát hiện đột biến gen SMNt gây bệnh teo cơ tủy trên phôi thụ tỉnh trong ống nahiệm: Tiến hành nhân toàn bộ bộ gen từ 30 mẫu te bào phôi sinh thiết theo các bước hướng dẫn của bộ kít GenomePlex® Single Ceil Whole Genome Amplification của hãng Sigma Lấy sản phẩm của bước trên để tiến hành kỹ thuật PCR-RFLP nhân và phát hiện đột biến gen SMNt gây bệnh
Các bước xây dựng và áp dụng quy trình chẩn đoán di truyền trước chuyển phôi bệnh teo cơ tủy cho gia đình có con bị bệnh
Nuôi phôi ngày 3 tiến hành sinh thiết; sau đó tiến hành nhân toàn bộ bộ gen từ các mẫu tế bào phôi sinh thiết theo các bước hướng dẫn của bộ kít GenomePlex® Single Cell Whole Genome Amplification cùa hãng Sigma; tiến hành đồng thời hai
kỹ thuật PCR-RFLP và minisequencing để phát hiện đột biến gen SMNt gây bệnh teo cơ tủy
Kỹ thuật minisequencing + Trình tự mồi nhân exon 7 gen SMNt F-5’- agactatcaacttaatttctgatca-3’
R- 5’- caccttccttctttttgattttgt-3’
+ Trình tự mồi minisequencing: 5’-cctttta ttttcctta cag g g ttt-3 ’
Sản phẩm thu được thêm vào 1 đơn vị enzyme SAP, ủ theo chu trình nhiệt: 370C trong 1 giờ và 750C trong 15 phút Điện di mao quản kiểm tra sản phẩm chạy minisequencirtg
Trang 3Người Ỉ M thường
SMNc-
Ngữòt bị bệnh
Hình 2: Hình minh họa kết quả điện di mao quản sản phẩm
nhân exon 7 gen SMNt của kỹ thuật minỉsequencing
ở vị trí nucleotid 214 trên exon 7 SMNt là c, còn
exon 7 SMNc là T vi vậy, với kỹ thuật
minisequencing, người binh ỉhường sẽ xuất hiện hai
đỉnh tương ứng G của exon 7 SMNt và A của exon 7
SMNc, người bị bệnh teo cơ tủy do mất đồng hợp
exon 7 SMNt chỉ có một đỉnh tương ứng A cùa exon
7 gen SMNc Ngoài ra, Đề đánh gỉá xem những mẫu
tế bào phôi sinh thiết được có bị nhiễm ADN ngoại íaỉ
hay không, tiến hành nhân 3 polymorphic marker
D5S641, D5S1977, D5S629
KẾT QUẢ
Hoàn thiện quy trinh phát hiện đột biến gen SMNt
gây bệnh teo cơ tuy từ máu toàn phần
E x a n 7 s e n S M N
L a d d e r _ A _
5 0 b p ' C l 3 5 1 i p
s
■W
Ấ
l ố O b p
1 0 2 b p
7 8 b p
Hình 3: Kết quả điện di gel agarose 3% sản phẩm nhân
exon 7 SMNt ỉừ máu toàn phần của gia đỉnh SMA1
Bệnh nhân C1 có sản phẩm nhân exon 7 gen
SMNt chỉ có 2 băng 160bp và 102bp của SMNc,
nghĩa là C1 bị mất đồng hợp exon 7 gen SMNt nên bị
bệnh teo cơ tuy Còn bổ B1 và Mẹ M1 đều có 3 băng
tương ứng exon 7 gen SMNt và SMNc nên họ ỉa
người mang gen Tương tự, tiến hành trên các gia đỉnh tiếp theo và kết qua cho thấy 17 người con cua
17 gia đinh đều phát hiện mất đồng hợp exon 7 gen SMNt, nghĩa ỉà cả 17 bệnh nhân đều bị bệnh teo cơ tủy Kết luận này hoàn toàn phù hợp với kết luận chẩn đoán gen cùa Viện Nhi Trung ương Như vậy, chúng tôi đã hoàn thiện được quy trình phát hiện đột biến gen SMNÍ gây bệnh SMA từ máu toàn phần
- Xây dựng quy trình phát hiện đột biến gen SMNt gây bệnh teo cơ tùy trên tế bào phôi
E x o n 7 S M N
L a d d e r
P 2 P 3 lO O bp p 4 P 5
Hình 4: Kết quả nhân exon 7 gen SMNt từ sản phẩm nhản toàn bọ gen của tế bào phôi: P1, P2, P3, P4, P5 tirơng ứng phôi 1, phôi 2, phôi 3, phôi 4, phôi 5
Trong hỉnh 4 cho thấy cả 5 mẫu tế bào phôỉ sinh thiết từ các mẫu phôi dứ đều có 3 băng tương ứng exon 7 gen SMNt, nghĩa ỉà cả 5 phôi đó đều bình thường Điều này hoàn toàn phù hợp với thực tế vỉ
cả 5 mẫu tế bào phôi đó đều sinh thỉet từ những phôi
dư bỉnh thường Tiếp tục thực hiện với các mẫu tế bào phôi còn lại với hiệu quả phản ứng nhân exon 7 gen SMNt từ các tế bào phôi là 93,33% (28/30)
Xây dựng và áp dụng quy trình chẩn đoán di truyền trước chuyển phôi bệnh teo cơ tùy cho gia đình có con bị bệnh
Từ những kết quả đạt được ở trên, chúng tôi đã
xây dựng quy trỉnh chẩn đoán di truyền trước chuyển
phôi bệnh íeo cơ tùy thể hiện ở sơ đồ tổng quát sau:
527
Trang 4Áp dụng quy trình trên cho 04 gia đình tự nguyện
tham gia nghiên cứu, kết quả như sau:
Bảng 1: Kết quả chần đoán di truyền trước chuyển
phôi cùa 04 gia đình tham gia nghiên cứu
STT ngày 3Phôi Phôi binh thưởng phôi chuyểnSố tế bào Kết quả
Trang 5Hiện nay, kỵ thuậỉ PCR-RFLP được dùng phổ biến
trên toàn thế giới để chẩn đoán gen bệnh teo cơ tủy,
trong đó có Việt nam, nên có íhể nói rằng kỹ thuật này
có tính chính xác và ổn định cao Hiệu quả phản ứng
PCR nhân exon 7 gen SMNt từ các tế bào phôi trong
thí ngiệm của chúng tôi íà 93,33% (28/30) Kết quả này
cũng tương đương với kết quả công bố của một số tác
giả khác ỉrên thế giới (bảng 2):
Bảng 2: Hiệu quả phản ứng PCR nhân exon 7-
SMNt từ tế bào phôi cùa một số tác giả trên thế giới
Tác giả
Năm
công
bố
Kỹ thuật PCR
sử dụng
Số tế bào phôi nghiên cứu
— So”
mẫu
cỏ sản phấm nhân exon
7 gen SMNt
Hiệu quả PCR
Dreesen
J c „ và
cs (21 1998
Daniels
G và cs
Moutou
c và cs
[5,6]
Fiorentino
F- và cs
[3]
2003 Nested- PCR vả
minisequencing 48 45 93,8%
Girardet
A và các
cs [4]
2008 Multiplex- PCR
và nested- PCR 17 15 88,2%
Theo thống kê ở bảng trên thi các tác giả đều tiến
hành nhân exon 7 gen SMNt trực tiếp từ tế bào phôi,
do đó phải tiến hành hai vòng PCR va mỗi mẫù tể bào
phôi sinh thiếỉ được chỉ thực hiện xét nghiệm chẩn
đoán được một lần và một kỹ thuật mà thôi
Thực tế, khi xây dựng bất cứ một quy trình chẩn
đoán nào đều phải đảm bao hai yếu tồ đọ chính xác và
độ ổn định cao Nghĩa là, xét nghiệm chần đoán đỏ
phải cỏ sự lặp lại và nên kết hợp nhiều phương pháp
đề chẩn đoan Vì vậy, chúng toi xây dựng quy trinh
phát hiện độí biến gen SMNt gây bệnh teo cơ tủy từ tế
bào phôi qua hai bước cơ bản:
1 Nhẩn toàn bộ gen, khuếch đại bộ gen lên hàng
nghìn lần
2 Sử dụng sản phẩm khuếch đại toàn bộ gen iàm
mẫu, tiến hành nhân exon 7 gen SMNt bằng hai kỹ
thuật PCR-RFLP và minisequencing để chẩn đoán
ở bước 1, chúng tôi chọn giải pháp khuếch đại bộ
gen lên hàng nghìn íần trước khi làm xét nghiệm tiếp
vì nó có ưu điểm vượt trội hơn hẳn so với việc nhân
exon 7 gen SMNt ìrực tiếp từ tế bào phôi như: Lượng
mẫu ADN thu được nhiều, có thể dùng cho rất nhiều
lần xét nghiệm và nhiều kỹ thuật khác nhau, thực tế là
chúng tôi đã tiến hành đong thời hai kỹ thuật PCR-
RFLP và minisequencing để phát hiện đột biến gen
SMNt gậỵ bệnh íeo cơ ỉủy từ tế bào phôi Hơn nữa, lượng mau ẤDN thu được nhiều thì mới có thề kếí hợp giữa xét nghiệm chẩn đoán di truyền ỉrước chuyền phôi bệnh teo cơ tủy với các xéỉ nghiệm sàng lọc bất thường di truyền khác, từ đó góp phần làm tang tỷ lệ ìhụ thài trong PGD,
ờ bước 2, chúng tôi chọn giải pháp tiến hành đồng thời hai kỹ thuật PCR-RFLP và minisequencing đe phát hiện đột biến gen SMNt gây bệnh teo cơ tủy từ tế bào phôi Một đều không thể phủ nhận là khi ỉhực hiện hai xét nghiẹm đồng thời để so sánh đối chiếu thì kết luận chẩn đoán đó sẽ có tính chắc chắn hơn, ổn định hơn
Tuy nhiên, với việc chẩn đoán đi truyền trước chuyển phôi bệnh ỉeo cơ tủy thì điều đó vẫn chưa đủ
vì SMA là bệnh di truyền lặn, nên nếu trong auá trình sình thiết phôi hoặc thao tác kỹ thuật không tổt có thể
bị nhiễm ADN từ ngoài vào (từ bố, mẹ hoạc kỹ thuật
viên thao tác) thi sẽ chẩn đoán phôi bệnh íhành phôi
thường, dẫn đến hậu quả cấy chuyển phôi bệnh Để tránh nhược điểm đó, chúng tôi lựa chọn 3 polymorphic marker D5S1977, D5S629, D5S641 để đánh gia nhiễm ADN ngoại lai bởi chúng có tính đa hinh và đặc trưng cho ca thề cao nên có thể dễ dànẹ phân tích phôi sinh thiết được có íính di truyền từ bo
và mẹ hay không
KẾT LUẬN
Đã hoàn íhiện được quy trình phát hiện đột biến gen SMNt gây bệnh íeo cơ tủy từ máu toàn phần bằng
cả hai kỹ thuật PCR-RFLP và minisequencing với kha năng phát hiện cao (17/17 gia đinh)
Đa xây dựng được quy trinh phát hiện đột biến gen SMNt gâỵ bệnh teo cơ tủy trên phôi thụ tinh trong ong nghiệm bằng kỹ thuật PCR-RFLP và minisequencing
Đã xây dựng đữợc và áp dụng thành công quy trình chẩn đoẩn di truyền trước chuyển phôi bệnh teo
cơ tủy cho 04 gia đinh: đã có 1 em bé không mang gen, khỏe mạnh ra đời, 1 cặp mang ìhai được 08 ĩháng, 1 cặp đang theo dõi, từ đỏ làm giảm gánh nặng cho gia đình và x i hội
TAI LIỆU THAM KHẢO
1 Daniels G et ai (2001) Six unaffected livebirths following preimplatation diagnosis for spinal muscular atrophy Mol.Hum Reprod., Vol.7, No.10 pp.995-1000
2 Dreesen J.c et ai (1998) Preimplantation genetic diagnosis of spinal muscular atrophy Mol.Hum Reprod., VoL4, No.9 pp 881-885
3 Fiorentino F et al (2003) The minisequencing method: an aitemative strategy for preimpiantation genetic diagnosis of single gene disorders Mol.Hum Reprod., VoL 9, No 7 pp 3 9 9 -4 1 0
4 Girardet A et a! (2008) Efficient strategies for preimplantation genetic diagnosis of spinal muscular atrophy, Fertility and sterility, Vo! 90, No 2
5 Moutou c et ai (2001) Alỉele- specific amplification
for preimpiantation genetic diagnosis (PGD) of spinal muscular atrophy Prenatal Diagnosis, 21,498-503
6 Moutou c et al (2003) Duplex PCR for Preimplantation genetic diagnosis (PGD) of spinal muscular atrophy, Prenatai diagnosis, 23, 685-689
529