Xây dựng quy trình định lượng các acid amin không thay thế trong nước mắm bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần (lc

– tandem mass spectrometry LC/MS/MS has widely been used because of many advantages: low limit of detection, good repeatability, analysing many kinds of matrices, reducing analysis time

Ch ký:

Ch ký: Cán b ch m nh n xét 2: TS Phan Ng c Hòa

m m

II NGÀY GIAO NHI M V : 02/ 2011

III NGÀY HOÀN THÀNH NHI M V : 07/2011

Tôi xin cam oan lu n v n là k t qu nghiên c u c a riêng tôi, không sao chép c a ai N i dung lu n v n có tham kh o và s d ng các tài li u, thông

tài li u c a lu n v n

Tác gi lu n v n

Tr n i Ngh a

ki n thu n l i cho em trong quá trình th c hi n lu n v n

Cu i cùng, em c ng xin chân thành cám n các th y cô, b n bè trong b môn Công ngh th c ph m và khoa Công ngh hóa h c c a tr ng i h c Bách Khoa Tp.H Chí Minh ã giúp , ng vi n, t o i u ki n cho tôi trong su t th i gian

h c t p t i tr ng

kh i ph hai l n (LC/MS/MS) ang c nghiên c u và ng d ng nhi u vì có các

u i m là nh y cao, l p l i t t, phân tích c nhi u n n m u, các acid amin không c n ph i t o d n xu t nên th i gian phân tích c ng c rút ng n

Nghiên c u này kh o sát các quy trình làm s ch, tách chi t 9 acid amin không thay th trong n n m u n c m m k t h p v i kh o sát các i u ki n s c ký tách các acid amin này trên c t phân tách và cu i cùng kh o sát các thông s c a máy kh i ph nh l ng Các thông s thích h p phân tích nh sau:

theo 2 c ch : lo i tr ion và trao i ion v i ch ng trình gradient n ng :

T Acetonitrile – n c c t (30:70) b sung TFA 0,05% (pha ng A) n Acetonitrile – n c c t (30:70) b sung TFA 0,3% (pha ng B) trong th i gian 30 phút

! chính xác và úng d i 20%

Hi u su t thu h i u trên 85% ngo i tr Lysine là 80%

! không m b o o t 8 – 13 % ngo i tr Lysine là 20%

Lu"n v#n này ã xây d ng th m nh và ngh c m t quy trình nh l ng các acid amin không thay th trong n c m m b ng ph ng pháp s c ký l ng ghép

– tandem mass spectrometry (LC/MS/MS) has widely been used because of many advantages: low limit of detection, good repeatability, analysing many kinds of matrices, reducing analysis time when performing without amino acids derivatization

This research focused on the purification and extraction of 9 essential amino acids from fish sauce, the separation on chromatography column and the quantification on tandem mass spectrometry The suitable technological parameters

of the amino acids quantification were as follows:

The amino acids from fish sauce were extracted and purified by methanol,

C18 powder and activated carbon

Separation was achieved on Primesep 100 column using 2 mechanisms: ion – exclusion and ion – exchange with the concentration gradients program: From trifluoroacetic acid 0,05% in acetonitrile – water (30:70) (mobile phase A) to trifluoroacetic acid 0,3% in acetonitrile – water (30:70) (mobile phase B) in 30 minutes

Quantification was acquired by tandem mass spectrometry (MS/MS) AB Sciex Triple Quad 5500 using electrospray ionization (ESI) in the MRM scan type, positive mode

After performed method validation, the results were presented as follows: Calibration curves were linear over the range 0,5 – 250 µmol/L

Limit of detections of each amino acids were 0,0167 - 0,03 µmol/g, limit of quantifications of each amino acid were 0,05 - 0,1 µmol/g

Relative standard deviations of repeatability and accuracy were below 20% Recoveries of almost amino acids were above 85% (except 80% for Lysine) Uncertainties of almost amino acids were 8 – 13% (except 20% for Lysine)

- CV (Coefficient of Variation): H s bi n ng

pháp s c ký l ng ghép kh i ph 2 l n

kh i ph 2 l n

- r (Repeatability): l p l i

- Rw (within – laboratory Reproducibility): tái l p n i b phòng thí nghi m

- Ubias ( Bias Uncertainty): không m b o o theo l ch (hi u su t thu h i)

- URw (Within – laboratory Uncertainty): không m b o o theo tái l p

n i b phòng thí nghi m

M c l c

1 Ph n m u 6

2 T ng quan 7

2.1 T ng quan v n c m m 7

2.1.1 Gi i thi u v n c m m 7

2.1.2 Thành ph n c a n c m m 7

2.1.3 Các h enzym trong s n xu t n c m m 8

2.1.4 Quy trình s n xu t n c m m 8

2.1.5 Các y u t nh h ng n quá trình ch bi n n c m m 9

2.1.5.1 nh h ng c a nhi t .9

2.1.5.2 nh h ng c a mu i 9

2.1.5.3 nh h ng c a nguyên li u 10

2.1.5.4 nh h ng c a di n tích ti p xúc 10

2.1.5.5 nh h ng c a ph ng pháp p mu i 11

2.1.6 Tiêu chu n ánh giá ch t l ng n c m m 11

2.2 T ng quan v acid amin .12

2.2.1 Gi i thi u chung v acid amin 12

2.2.2 Phân lo i các acid amin 12

2.2.3 Các tính ch t chung c a các acid amin 16

2.2.3.1 Tính tan 16

2.2.3.2 Tính phân c c 16

2.2.3.3 Tính quang ho t 17

2.2.3.3 Vai trò c a các acid amin 17

2.3 T ng quan v các ph ng pháp phân tích acid amin 17

2.3.1 Ph ng pháp s c ký gi y .17

2.3.2 Ph ng pháp s c ký b n m ng 18

2.3.3 Ph ng pháp s c ký khí (GC) .18

2.3.4 Ph ng pháp s c ký l ng hi u n ng cao (HPLC) 18

3 M c tiêu nghiên c u 20

4 Nguyên li u và ph ng pháp nghiên c u 21

4.1 Nguyên li u 21

4.1.1 Ch t chu n 21

4.1.2 i t ng nghiên c u 21

4.2 D ng c , trang thi t b , hóa ch t 22

4.2.1 D ng c 22

4.2.2 Trang thi t b 23

4.2.3 Hóa ch t 24

4.3 N i dung nghiên c u 25

4.3.1 Kh o sát các thông s kh i ph 27

4.3.1.1 Các thông s c nh 27

4.3.1.2 Các thông s kh o sát 28

4.3.1.3 Cách th c th c hi n 28

4.3.2 Kh o sát các thông s s c ký 29

4.3.2.1 Các thông s c nh 29

4.3.2.2 Các thông s kh o sát 29

4.3.3 Kh o sát các quy trình chi t acid amin trong n c m m 32

4.3.4 Th m nh quy trình nh l ng b ng các ph ng pháp th ng kê .37

4.3.4.1 Kho ng tuy n tính (Linear range) 37

4.3.4.2 Gi i h n phát hi n và gi i h n c a ph ng pháp (MLOD, MLOQ)37 4.3.4.3 chính xác (Precision) 37

4.3.4.4 úng (Accuracy) 39

4.3.4.5 không m b o o U (Uncertainty) 40

5 K t qu và bàn lu n 42

5.1 Kh o sát các thông s kh i ph 42

5.2 Kh o sát c a các thông s s c ký 43

5.3 Kh o sát các quy trình chi t acid amin trong n c m m 46

5.3.1 Kh o sát quy trình 1 46

5.3.2 Kh o sát quy trình 2 47

5.3.3 Kh o sát quy trình 3 48

5.3.4 Kh o sát quy trình 4 49

5.4 Th m nh quy trình nh l ng 50

5.4.1 Kho ng tuy n tính 50

5.4.2 Xác nh gi i h n phát hi n và gi i h n nh l ng c a ph ng pháp 53

5.4.3 Xác nh chính xác 57

5.4.3.1 Xác nh l p l i 57

5.4.3.2 Xác nh tái l p n i b phòng thí nghi m 59

5.4.3 Xác nh úng 62

5.4.4 Xác nh không m b o o 71

5.5 Xây d ng quy trình nh l ng 72

5.5.1 Quy trình x lý m u n c m m 72

5.5.2 Quy trình ch y máy LC/MS/MS 72

5.5.2.1 Các thông s s c ký 72

5.5.2.2 Các thông s kh i ph 73

5.6 Áp d ng quy trình nh l ng các acid amin trong n c m m 75

6 K t lu n 76

7 Ki n ngh 78

8 Tài li u tham kh o 79

Danh m c hình

Hình 4.1: M u n c m m Nam Ng 22

Hình 4.2: B cô quay chân không Buchi R- 210 23

Hình 4.3: B chi t SPE Vacumn Manifold c a Supelco 23

Hình 4.4: H th ng máy s c ký l ng hi u n ng cao Shimadzu 24

Hình 4.5: u dò kh i ph 2 l n AB Sciex Triple Quad 5500 24

Hình 4.6: Các giai o n ti n hành kh o sát vi c phân tích các acid amin trong n c m m 26

Hình 4.7 : Quy trình [1] tách các acid amin trong n c m m 33

Hình 4.8 : Quy trình [2] tách các acid amin trong n c m m 34

Hình 4.9 : Quy trình [3] tách các acid amin trong n c m m 35

Hình 4.10 : Quy trình [4] tách các acid amin trong n c m m 36

Hình 5.1: C t Primesep 100 khi pH >1.00 45

Hình 5.2: C t Primesep 100 khi pH <1.00 46

Hình 5.3: th bi u di n ng chu n c a Threonine n ng t 0,5 - 250 µmol/L 50

Hình 5.4: th bi u di n ng chu n c a Valine n ng t 0,5 - 250

µmol/L 50

Hình 5.5: th bi u di n ng chu n c a Methionine n ng t 0,5 - 250 µmol/L 51

Hình 5.6: th bi u di n ng chu n c a Leucine n ng t 0,5 - 250

µmol/L 51

Hình 5.7: th bi u di n ng chu n c a Isoleucine n ng t 0,5 - 250 µmol/L 51

Hình 5.8: th bi u di n ng chu n c a Phenylalanine n ng t 0,5 - 250 µmol/L 52

Hình 5.9: th bi u di n ng chu n c a Histidine n ng t 0,5 - 250 µmol/L 52

Hình 5.10: th bi u di n ng chu n c a Lysine n ng t 0,5 - 250

µmol/L 52

Hình 5.11: th bi u di n ng chu n c a Arginine n ng t 0,5 - 250 µmol/L 53

Danh m c b ng

B ng 1.1: !nh h ng c a các ph "ng pháp p mu i n t c p mu i theo th i

gian 11

B ng 1.2: Các Acid amin monoamino_monocacboxylic 12

B ng 1.3: Các acid amin monoamino_dicacboxylic 13

B ng 1.4: Các acid amin diamino_monocacboxylic 13

B ng 1.5: Các acid amin ch#a Sulfur 14

B ng 1.6: Các acid amin vòng th"m 14

B ng 1.7: Các acid amin d vòng 15

B ng 1.8: Các amit c a acid amin 15

B ng 1.9: Tính tan S(g/L) c a các acid amin trong n c 25 o C 16

B ng 4.1: H$n h%p chu n g c c a các acid amin và n ng t ng acid amin trong h$n h%p 21

B ng 4.2: Các dung môi, hóa ch&t s' d ng trong bài nghiên c#u 24

B ng 4.3: Các thông s v( ph kh i l %ng 27

B ng 4.4: Ch "ng trình gradient n ng th# 1 29

B ng 4.5: Ch "ng trình gradient n ng th# 2 30

B ng 4.6: Ch "ng trình gradient n ng th# 3 31

B ng 5.1: Th t o ion chính (DP) và các n ng l %ng phân m nh ion (CE) c a các acid amin 42

B ng 5.2: N ng và di n tích peak t "ng #ng c a Threonine 50

B ng 5.3: N ng và di n tích peak t "ng #ng c a Valine 50

B ng 5.4: N ng và di n tích peak t "ng #ng c a Methionine 51

B ng 5.5: N ng và di n tích peak t "ng #ng c a Leucine 51

B ng 5.6: N ng và di n tích peak t "ng #ng c a Isoleucine 51

B ng 5.9: N ng và di n tích peak t "ng #ng c a Phenylalanine 52

B ng 5.10: N ng và di n tích peak t "ng #ng c a Histidine 52

B ng 5.11: N ng và di n tích peak t "ng #ng c a Lysine 52

B ng 5.12: N ng và di n tích peak t "ng #ng c a Arginine 53

B ng 5.13: tín hi u (S/N) c a Threonine c a 8 m u tr ng thêm chu n (1 µmol/L) 54

B ng 5.14: tín hi u (S/N) c a Valine c a 8 m u tr ng thêm chu n 54

(1 µmol/L) 54

B ng 5.15: tín hi u (S/N) c a Methionine c a 8 m u tr ng thêm chu n (1 µmol/L) 54

B ng 5.16: tín hi u (S/N) c a Leucine c a 8 m u tr ng thêm chu n (0,5 µmol/L) 55

B ng 5.17: tín hi u (S/N) c a Isoleucine c a 8 m u tr ng thêm chu n (0,5 µmol/L) 55

B ng 5.18: tín hi u (S/N) c a Phenylalanine c a 8 m u tr ng thêm chu n (0,5 µmol/L) 55

B ng 5.19: tín hi u (S/N) c a Histidine c a 8 m u tr ng thêm chu n (1 µmol/L) 56

B ng 5.20: tín hi u (S/N) c a Lysine c a 8 m u tr ng thêm chu n 56

(1 µmol/L) 56

B ng 5.21: tín hi u (S/N) c a Arginine c a 8 m u tr ng thêm chu n (1 µmol/L) 56

B ng 5.22: Kh o sát l)p l i c a 3 m u n c m m không thêm chu n trong cùng ngày phân tích 57

B ng 5.23: Kh o sát l)p l i c a 6 m u n c m m thêm chu n n ng thêm vào

B ng 5.24: Kh o sát l)p l i c a 3 m u n c m m không thêm chu n trong ngày

phân tích khác 59

B ng 5.25: Kh o sát tái l)p n i b phòng thí nghi m c a 6 m u n c m m không thêm chu n trong 2 ngày phân tích khác nhau 60

B ng 5.26 : Kh o sát l)p l i c a 6 m u n c m m thêm chu n n ng thêm vào 5 µmol/g trong ngày phân tích khác 60

B ng 5.27: Kh o sát tái l)p n i b phòng thí nghi m c a 12 m u n c m m thêm chu n n ng thêm vào 5 µmol/g trong 2 ngày phân tích khác nhau 61

B ng 5.28: Kh o sát úng c a Threonine 62

B ng 5.29: Kh o sát úng c a Valine 63

B ng 5.30: Kh o sát úng c a Methionine 64

B ng 5.31: Kh o sát úng c a Leucine 65

B ng 5.32: Kh o sát úng c a Isoleucine 66

B ng 5.33: Kh o sát úng c a Phenylalanine 67

B ng 5.34: Kh o sát úng c a Histidine 68

B ng 5.35: Kh o sát úng c a Lysine 69

B ng 5.36: Kh o sát úng c a Arginine 70

B ng 5.37: không m b o o theo tái l)p phòng thí nghi m, không m b o o theo l ch bias, không m b o o toàn ph n 71

B ng 5.38: Ch "ng trình gradient n ng .73

B ng 5.39: DP và CE c a các acid amin 74

B ng 5.40: Giá tr các acid amin trong m u n c m m Nam Ng 75

s ng ký 6007 570517 75

1 Ph n m u

rãi trong m th c c a các n c Châu Á ! Vi t Nam, n c m m th "ng có trong b#a n hàng ngày c a h u h t m$i gia ình

h ng v c tr ng riêng cho t&ng vùng mi n Nh Phú Qu c, n c m m

c ch bi n t& cá c m, t i Phan Thi t thì n c m m c ch bi n t& cá

n c ho c t i (ng b ng sông C u Long thì n c m m t& cá linh, m t s thì

m m n i ti ng Vi t Nam nh : Phú Qu c, Phan Thi t, Nha Trang…

Trong n c m m thành ph n ch y u và quy t nh n ch t l ng giá tr dinh d )ng ó chính là các acid amin nh Lysine, Valine, Glutamic, Arginine, Methionine, Tyrosine, PhenylAlanine, Threonine, Leucine, IsoLeucine…

Hi n nay * ánh giá ch t l ng và giá thành c a n c m m, các trung tâm ki*m nghi m v n ang d a vào tiêu chu n xác nh m t ng c a n c

m m b ng ph ng pháp Kjeldahl r(i quy ra hàm l ng m amin Ph ng pháp này có khuy t i*m là không th* phân bi t c các lo i h p ch t có

ch a m dinh d )ng và các h p ch t ch a m không dinh d )ng M t s

c s s n xu t ã l i d ng vào tiêu chu n trên, làm t ng m b ng cách thêm urê vào n c m m * làm gi m giá thành s n xu t, i u ó gây ra nh#ng nh h ng nghiêm tr$ng n s c kh e ng "i tiêu dùng

Tr c th c tr ng trên, chúng tôi th c hi n tài này nh m:

th* là nhóm acid amin không thay th - b ng ph ng pháp s c ký l ng ghép kh i ph 2 l n (LC/MS/MS)

Làm c s * xác nh ch t l ng n c m m b ng các ch+ tiêu v acid amin

2 T ng quan

2.1 T ng quan v( n c m m [1], [8], [9], [10], [16], [21]

2.1.1 Gi i thi u v( n c m m

N c m m là h,n h p mu i các acid amin c th y phân t& protein trong th t

cá v i tác nhân là h enzyme có s-n trong n i t ng cá cùng v i m t s vi khu n

+ Các acid bay h i: 404 – 533 ( acid propionic)

+ Các amin bay h i: 9,5 - 11,3 (isopropylamine)

Các ch t vô c : NaCl chi m nhi u nh t (250 – 280 g/L) và m t s ch t khoáng khác nh Ca; Mg; S; P; I

Các vitamin: B1; B2; B12; PP

2.1.3 Các h enzym trong s n xu&t n c m m

G(m 3 h l n:

H Metalo-protease ( hay còn g$i là Aminodipeptidase):

m nh trong th"i gian u lên men n c m m, gi m d n tháng th 3 v sau H enzyme có ho t tính m nh, có kh n ng th y phân r ng rãi i v i các nhóm peptide khác nhau Nhóm enzyme này là nhóm enzyme trung tính, pHopt = 5-7,

pI = 4-5, n nh v i ion Ca2+ và Mg2+ và m t ho t tính khi có các ion Zn2+,

Pb2+, Hg2+

H enzyme serine – protease:

i*n hình là enzyme trypsine, có nhi u trong n i t ng cá ! giai o n u, h enzyme này ho t ng y u, t i tháng th 2 ho t ng m nh t i c c i, và t i tháng th 3 b t u gi m d n khi protein trong n c m m phân gi i g n nh hoàn toàn H enzyme này ho t ng pH = 5-10, pHopr= 9

H enzyme acid – protease:

Có trong n i t ng cá H enzyme này d/ b c ch b i n(ng mu i kho ng 15% nên ch+ ho t ng trong th"i gian u c a quá trình th y phân H này ch+ óng vai trò th y u trong quá trình s n xu t n c m m

2.1.4 Quy trình s n xu&t n c m m

Quá trình s n xu t n c m m g(m 2 giai o n:

Giai o n thu0 phân protein nh" enzyme protease, quá trình này x y ra càng tri t * thì ch t l ng n c m m càng ngon, m càng cao

Protein → acid amin, peptid

Giai o n t o h ng th m: giai o n này n c m m ã “ng u” (chín), t o mùi v

c tr ng do s t o thành c a các acid h#u c nh acid formic, acid acetic, acid

propionic, acid butylic (ng phân t o ra b i vi khu n Pediococcus halophilus

trong quá trình lên men Ngoài ra, nh#ng nghiên c u v n c m m cho th y tác nhân quan tr$ng trong vi c hình thành mùi th m c tr ng c a n c m m là các

lo i vi khu n k khí sinh nha bào là Clostridium, em c y vào môi tr "ng th ch-

pepton s' sinh ra mùi c a n c m m

2.1.5 Các y u t nh h ng n quá trình ch bi n n c m m 2.1.5.1 !nh h ng c a nhi t

Th"i gian p mu i gi m khi nhi t c a cá c nâng cao, khi nâng nhi t

c a dung d ch hay c a cá khi p mu i ph i th n tr$ng, vì quá trình ng m

mu i c a cá luôn ch m h n quá trình lên men phân gi i i v i cá có chi u dày

l n, nhi u m) d i da và v y dày thì nhi t thích h p khi p mu i là 5 –

7oC i v i cá nh có th* mu i nhi t cao h n vì quá trình ng m mu i nhanh h n s phá ho i c a vi sinh v t và th "ng nhi t thích h p là 37 – 50oC

NaCl là mu i trung tính, n u l ng mu i cho vào t n bão hòa (358g/l

20oC) s m thì protein trong c th* cá khó hòa tan mà ngay c nh#ng protein tan trong dung d ch c1ng có th* b t a Nh v y l ng m t ng c ng trong

ph n n c ch p s' b gi m N u n(ng mu i loãng thì có tác d ng nh ch t kích thích thúc y tác d ng c a enzym làm cho protein b th y phân nhanh h n,

Các lo i cá khác nhau có thành ph n c u trúc hóa h$c khác nhau, c bi t

là h vi sinh v t t(n t i trong cá c1ng khác nhau Cá t i, giá tr kinh t cao h n

là nguyên li u t t nh t cho quá trình ch bi n n c m m Nh#ng loài cá nào có thành ph n protein cao, n c ít thì ch bi n ra n c m m có l ng m cao

Nh#ng loài cá nào có c u trúc th t l ng l2o, c th t m m, m ng mình, ít

v y d/ ch bi n h n, ch p mau chín h n Cá có nhi u m) c1ng không thích

h p ch bi n n c m m, khi ch bi n ch p m) n i lên trên d/ b oxy hóa làm cho n c m m có mùi ôi khét khó ch u và m t ph n m) b th y phân sinh ra các acid y u bay h i làm cho n c m m có v chua

Tùy thu c vào khu v c s ng c a cá, các lo i cá s ng t ng n c trên và

t ng n c gi#a nh : cá c m, n c, thu, trích… ch bi n n c m m cho ch t

l ng cao nh t Cá s ng t ng áy ch t l ng n c m m không t t l m vì chúng n bùn, rong rêu

2.1.5.4 !nh h ng c a di n tích ti p xúc

* t o i u ki n t t cho vi sinh v t ho t ng c1ng nh rút ng n th"i gian

ch bi n n c m m, thì ta ph i xay nh , p d p, c t khúc, ánh khu y… khi ó

Cá xay nh thì di n tích ti p xúc l n nh t nh ng protein d/ b bi n tính nhi u nh t m c dù vi sinh v t phát tri*n t t Trong quá trình kéo rút d/ b t c

Cá p d p v n gi# c hình d ng nguyên con và c th t m m ra, t bào

b v) màng, nguyên sinh ch t ng m ra t o i u ki n cho vi sinh v t phát tri*n

3u i*m không gây hi n t ng t c

Nói chung trong các bi n pháp c h$c trên thì cá p d p có u i*m h n

c , vì v y * t ng di n tích ti p xúc, rút ng n th"i gian ch bi n ta nên s d ng

ph ng pháp p d p cá

2.1.5.5 !nh h ng c a ph "ng pháp p mu i

Nhìn chung thì t c p mu i c a ph ng pháp p mu i khô và t h,n h p bé h n m t ít so v i t c p mu i trong dung d ch, nh ng n u p

mu i trong dung d ch tu n hoàn thì t c l i nhanh n#a Ng "i ta ã ch ng minh c r ng mu i trong dung d ch tu n hoàn th"i gian gi m i 1,3 l n so v i

p mu i khô, gi m i 1,8 l n so v i p mu i trong dung d ch không tu n

2.1.6 Tiêu chu n ánh giá ch&t l %ng n c m m

Hi n nay các nhà s n xu t n c m m t i Vi n Nam u áp d ng tiêu chu n TCVN 5107:2003 do Ban k4 thu t tiêu chu n c a B Khoa H$c và Công ngh ban hành Tiêu chu n này có các quy nh v hoá h$c nh hàm l ng nit t ng,

hàm l ng nit amin, hàm l ng mu i… Các ch+ tiêu v vi sinh nh t ng s vi

sinh v t hi u khí, s khu n l c E.coli, Coliform…

2.2 T ng quan v( acid amin [3], [8], [9], [10], [16], [21]

2.2.1 Gi i thi u chung v( acid amin

cacboxyl –COOH trong phân t

Các α- acid amin là n v c s câú t o nên c u trúc cu protein c a c th*

s ng

Công th c c u t o t ng quát cu α-acid amin là:

CH

COOH R

2.2.2 Phân lo i các acid amin

g p thành 1 s nhóm chính sau:

• Nhóm 1: Acid amin m ch th ng :

B ng 1.2: Các Acid amin monoamino_monocacboxylic

B ng 1.3: Các acid amin monoamino_dicacboxylic

B ng 1.4: Các acid amin diamino_monocacboxylic

B ng 1.5: Các acid amin ch#a Sulfur

CH2 CH COOH

HN

CH 2 CH COOH

• Nhóm 4: Amit c a acid amin

B ng 1.8: Các amit c a acid amin

+ Nhóm các acid amin có th* thay th : Alanine, Glycine, Glutamic Acid, Aspartic acid, Tyrosine, Asparagine, Cysteine, Cystine, Serine, Proline

2.2.3 Các tính ch&t chung c a các acid amin 2.2.3.1 Tính tan

B ng 1.9: Tính tan S(g/L) c a các acid amin trong n c 25 o C

- Tính phân c c c a Ser vàThr là do nhóm –OH trong phân t có kh n ng t o liên

k t hidro liên phân t v i n c

- Tyr có ch a 1 nhóm –OH phenol có kh n ng ion hóa Tyr ion hoá trong môi

tr "ng ki m y u, vì th c1ng c coi là 1 acid amin phân c c Tuy nhiên d a vào

kh n ng tan trong n c c a Tyr t i pH trung tính thì nó c xem nh là acid amin không tan trong n c

Tyr, Phe

- Các acid amin phân c c trong n c nh : Thr, Glu, His, Ser, Asp, Gln, Lys,

2.2.3.3 Tính quang ho t

Tr& Gly , các α-C c a các acid amin còn l i u là C b t i Ngh5a là nó liên k t

v i 4 nhóm khác nhau.Vì trung tâm b t i này nên các acid amin này có tính quang ho t, chúng làm quay m t ph6ng "ng i c a ánh sáng phân c c Ngoài

2.2.3.3 Vai trò c a các acid amin

Các Acid amin là n v c b n t o nên các protein trong c th* s ng, nói cách khác các acid amin là các “viên g ch” t o nên các phân t protein

Trong các lo i acid amin thì acid amin thay th c th* có th* t t ng h p khi

th thì c th* không th* t sinh t ng h p c mà ph i b t bu c b sung t& kh u

ph n n hàng ngày Các acid amin không thay th giúp kích thích c th* phát tri*n N u thi u 1 trong các lo i acid amin không thay th có th* d n n m t s

b nh nguy hi*m

Ví d :

Thi u Lysine: c th* s' h p thu Calci không t t làm x ng mau chóng b thoái hoá

Thi u Methionine: ! nam gi i s' thi u hormone sinh d c testosterone

Thi u Leucine: Vi c i u hoà hàm l ng "ng trong máu s' b r i lo n

2.3 T ng quan v( các ph "ng pháp phân tích acid amin

2.3.1 Ph "ng pháp s c ký gi&y [2]

Ph ng pháp s c ký gi y nhu m màu v i thu c th Ninhydrin dùng * nh tính,

và bán nh l ng các acid amin t& d ch th y phân protein ây là ph ng pháp

c i*n dùng trong ki*m nghi m th c ph m H dung môi phân tách th "ng c

s d ng là : Phenol - H2O, ho c n-butanol - acetic acid - H2O Tùy theo h dung môi các acid amin có th t và giá tr Rf khác nhau

2.3.2 Ph "ng pháp s c ký b n m ng [2]

Các thu c th dùng * phân tách acid amin th "ng dùng: Ninhydrin, 2,4 –

dinitrophenyl (DNP), 5 – dimethylaminonaphthalene – 1 – sulfonyl (dansyl)…

M t s dung môi dùng * phân tách acid amin:

- n–butanol - acetic acid - H2O

2.3.3 Ph "ng pháp s c ký khí (GC) [22]

Ph ng pháp s c ký khí là m t k4 thu t phân tích acid amin có r t nhi u u i*m:

nh y cao, kh n ng phân tách r t t t Tuy nhiên h n ch l n nh t c a ph ng pháp này là ph i t o d n xu t d/ bay h i * phân tích v i m t s ph n ng t o d n

xu t thông d ng nh heptafluorobutyryl, trifluoroacetyl, chloroformates…, vi c t o

d n xu t này ph i làm b ng tay nên có l p l i không t t, có th"i gian x lý m u lâu và không phân tích c ch t Arginine

2.3.4 Ph "ng pháp s c ký l ng hi u n ng cao (HPLC) [4], [5], [8], [10], [11], [17], [20]

Các ph ng pháp phân tích acid amin b ng s c ký l ng truy n th ng:

T o d n xu t ti n c t (Pre-column): T o d n xu t và phân tích b ng c t pha

o (Reverse phase) Các ch t t o d n xu t th "ng là o-phthaldialdehyde

(PITC), 1 – dimethylaminonaphathalene – 5 – sulphonyl chloride (dansyl – Cl) 3u i*m c a ph ng pháp này vi c t o d n xu t n gi n, và th"i gian phân tích nhanh Khuy t i*m c a ph ng pháp này là tái l p c a vi c phân tích các m u th c ph m th p, nguyên nhân là vì ch a lo i b vi c t ng tác n n c a m u th c ph m Ví d nh Cystine (Cys) nhi u lúc không phát

hi n c khi t o d n xu t v i OPA Trong khi ó v i PITC thì tái l p và tuy n tính th p

T o d n xu t h u c t (Post – column): T o d n xu t và phân tích b ng c t trao i ion Ch t t o d n xu t th "ng dùng là ninhydrin, OPA Ph ng pháp này r t thích h p cho các m u th c ph m và có n n m u ph c t p 3u

xu t, l p l i cao, tuy n tính cao Khuy t i*m c a ph ng pháp này là

s ph c t p c a quá trình t o d n xu t sau c t, và th"i gian phân tích trên máy dài ( 1,5 - 2h), và n(ng acid amin trong d ch phân tích ph i l n (LOD

= 10 – 50 pmol/mL cho m,i acid amin)

ph ng pháp s c ký l ng ghép kh i ph m t l n ho c nhi u l n ( LC/MS, LC/MSn) Ph ng pháp này có các u i*m: nh y r t cao, l p l i, tuy n tính cao, và không c n t o d n xu t, th"i gian phân tích c1ng ng n

h n, có th* phân tích nhi u n n m u h n Ngoài ra ph ng pháp này còn

nh danh r t t t d a trên ph kh i l ng c tr ng c a t&ng acid amin Khuy t i*m c a ph ng pháp này là giá thành thi t b cao, và n(ng m u phân tích ph i r t nh

M t s k4 thu t phân tách trên c t phân tích trong ph ng pháp s c ký l ng

+ S d ng c t s c ký pha o (Reverse phase column): ng "i ta s d ng các

h p ch t b t c p ion (ion-pairing) nh perfluorinated carboxylic acids * phân tách các acid amin trên c t C18 r(i cho qua u dò kh i ph ESI – MS (electrospray ionization – mass spectrometer) Tuy nhiên vi c s d ng các

h p ch t b t c p ion trên c t pha o v i u dò kh i ph ESI – MS có th*

d n n các v n nh : hi n t ng m t ion (Ion suppression), hi n t ng nhi/m (contamination) b ngu(n kh i ph ( MS source)

+ S d ng c t trao i ion (ion exchange column): k4 thu t này s d ng các

ch t nh ammonium acetate và acid acetic làm pha ng * phân tách các acid amin trên c t trao i ion SCX r(i cho qua u dò kh i ph 3u i*m

c a vi c phân tách này là phân tách y các acid amin: nhóm acid, nhóm trung tính cho t i nhóm baz , l p l i t t Khuy t i*m c a ph ng pháp này là th"i gian phân tách m u trên c t v n còn dài (70 – 80 phút / m t l n

ch y)

+ S d ng c t chuyên d ng phân tích acid amin : Vi c phân tách các acid amin trên c t này d a trên 2 c ch : s d ng k4 thu t lo i tr& ion (ion exclusion) và k4 thu t trao i ion (ion exchange) Vi c k t h p c 2 c ch trên s' rút ng n th"i gian phân tích m u trên c t (25 – 30 phút/ m t l n

ch y) Vi c s d ng c t này hi n nay v n ch a có c nghiên c u và tri*n khai r ng rãi, vì th trong tài này, chúng tôi s' nghiên c u vi c phân tách trên c t này

3 M c tiêu nghiên c#u

4 Nguyên li u và ph "ng pháp nghiên c#u

Các lo i acid amin

N(ng (µmol/ml) (±4%)

4.1.2 i t %ng nghiên c#u

- N c m m Nam Ng do công ty Masan s n xu t:

+ Ngày s n xu t: 19/01/2011, H n s d ng: 19/01/2012

+ S ng ký: 6007 570517

Màu t ng h p brown HT (155), màu t nhiên caramel (150a)

4.2 D ng c , trang thi t b , hóa ch&t

4.2.2 Trang thi t b

B cô quay chân không Buchi R – 210

B chi t SPE Vacumn Manifold c a Supelco

u dò kh i ph 2 l n(MS/MS) AB Sciex TripleQuad 5500

Hình 4.2: B cô quay chân không

Buchi R- 210 Hình 4.3: B chi t SPE Vacumn Manifold c a Supelco

Hình 4.4: H th ng máy s c ký l ng

hi u n ng cao Shimadzu

Hình 4.5: u dò kh i ph 2 l n AB Sciex Triple Quad 5500

4.2.3 Hóa ch&t

B ng 4.2: Các dung môi, hóa ch&t s' d ng trong bài nghiên c#u

B t than ho t tính LC/MS/MS grade Agilent

N c c t 2 l n

4.3 N i dung nghiên c#u

B c 1: Kh o sát và t i u hóa các i u ki n * phân tích các acid amin trên

Hình 4.6: Các giai o n ti n hành kh o sát vi c phân tích các acid amin trong

n c m m

Ch y ch tiêm tr c ti p chu n acid min n(ng 125 µmol/L vào u dò

kh i ph b ng b m syringe pump (ch infusion) * tìm các thông s kh i

ph

+ S d ng ki*u ch y “Q1 MS” * xác nh th t o ion DP cho t&ng

ch t acid amin Kh o sát t& 10 - 300, b c nh y (step) c nh: 5 Ch$n th cho ra c "ng tín hi u (intensity) c a ion chính cao nh t + S d ng ki*u ch y “product ion” * xác nh n ng l ng phân

m nh ion CE cho t&ng ch t acid amin Kh o sát t& 5 – 50, b c nh y (step) c nh: 1 Ch$n n ng l ng cho ra c "ng tín hi u c a ion

4.3.2 Kh o sát các thông s s c ký [19]

4.3.2.1 Các thông s c nh

- H pha ng :