SẮC ký LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) ppt _ HÓA PHÂN TÍCH

Trắc nghiệm, bài giảng pptx các môn chuyên ngành Y dược hay nhất có tại “tài liệu ngành Y dược hay nhất”; https://123doc.net/users/home/user_home.php?use_id=7046916. Slide bài giảng môn hóa phân tích ppt dành cho sinh viên chuyên ngành Y dược. Trong bộ sưu tập có trắc nghiệm kèm đáp án chi tiết các môn, giúp sinh viên tự ôn tập và học tập tốt môn hóa phân tích bậc cao đẳng đại học ngành Y dược và các ngành khác

SẮC KÝ LỎNG HIỆU

NĂNG CAO

High Performance Liquid

Chromatography

Bài giảng pptx các môn ngành Y dược hay nhất có

https://123doc.net/users/home/user_home.php? use_id=7046916

MỤC TIÊU

Trình bày được cấu hình của một máy HPLC.

Trình bày được các thông số đặc trưng của HPLC.

Phân biệt được các kỹ thuật HPLC và phạm vi áp dụng của từng loại Đánh giá một qui trình phân tích bằng kỹ thuật HPLC.

Rửa và bảo quản cột.

Đánh giá qui trình phân tích bằng kỹ thuật HPLC.

Hệ HPLC Waters 600E

1 KHÁI NIỆM VỀ HPLC

HITACHI L-2000

HITACHI LACHROM ELITE HTA SYSTEM

Năm 1967- 1968: Huber, Hulsman, Giddinngs đã công bố PP sắc ký lỏng mới

có tên là SK lỏng tốc độ cao (HSLC), hiệu lực cao (HELC) hay áp suất cao và ngày nay mang tên chính thức là HPLC.

HPLC hay Sắc ký lỏng hiệu năng cao là kỹ thuật sắc ký tách hỗn hợp trên cột được nhồi đầy bằng các hạt có kích thước ≤ 10 μm

Do vậy phải dùng một bơm có áp suất cao (high pressure)  300atm để đẩy pha

động (Mobile Phase) MP qua cột với tốc độ dòng khoảng vài ml/phút và cho phép

phân giải nhanh (High Performance) một lượng mẫu nhỏ cỡ 20 μg.

ELUANT in COLUMN ELUATE out COLUMN  ELUATE out  COLUMN  ELUATE out

Chất rửa giải vào CỘT Dung dịch rửa giải ra

Quá trình cho chất lỏng đi qua cột gọi là sự rửa giải (ELUTION) Trong quá trình này, chất tan được vận chuyển trong môi trường phân tách bằng một dòng chất lỏng hay chất khí

được gọi là chất rửa giải (ELUANT) Dung dịch sau khi qua cột có chứa chất tan được gọi là dung dịch rửa giải (ELUATE).

Pha tĩnh có thể tác động lên chất tan bằng:

- Cơ chế hấp phụ như trong trường hợp của oxyt nhôm đã được hoạt hố, silicagel, nhựa trao đổi ion.

- Cơ chế phân bố giữa pha tĩnh và pha động như trong trường hợp chất lỏng được tẩm hay phủ lên bề mặt của chất mang trong pha tĩnh.

- Trong thực tế cả hai cơ chế trên đều tác động lên quá trình phân tách.

Để tiến hành có kết quả tốt trong HPLC điều quan trọng là phải hiểu thấu đáo về bản chất các thành phần của hệ sắc ký gồm : Chất tan ( chất cần

phân tích), pha tĩnh và pha động

Trong quá trình tách riêng ra của chất tan, lực tương tác phân tử đã tham gia vào việc thiết lập sự cân bằng của ba thành phần trên

Lực tương tác phân tử được mô tả một cách định tính chính là độ phân cực tương đối của ba thành phần này.

Chất cần phân tích có độ phân cực tăng lên theo các nhóm chức:

Hydrocarbon < ether < ester < Cetone < aldhehyde < amide < amine <

Alcohol< H2O

- Dùng loại thủy tinh trung tính, rửa sạch có thể tích từ 100ml  2 lít

- Dùng bình thủy tinh màu nếu chứa những chất nhạy cảm với ánh sáng.

- Dùng nắp đậy thích hợp để tránh bay hơi dung môi.

- Bình được gắn với một ống bằng polytetrafluoroetylen (d=1-3mm) để

dẫn pha động từ bình chứa đến bơm

2.1 BÌNH CHỨA DUNG MÔI PHA ĐỘNG

2 CÁC THÀNH PHẦN CƠ BẢN CỦA HPLC

Xử lý dung môi động

Lọc qua màng lọc thích hợp tùy theo loại dung môi

Dung môi là nước: cellulose nitrat hay cellulose acetat KT 0,45 và 0,22

Hỗn hợp dung môi hữu cơ và nước: RC (regenerated cenlulose) hay polyamid

nylon

Dung môi hữu cơ: lọc qua màng lọc teflon

vệ sinh (ngâm trong dung dịch acid nitric 5% hoặc methanol+ đánh siêu âm

khoảng 15’, rửa lại bằng nước cất đã được lọc qua màng lọc 0,45m

Đuổi khí dung môi

Lọc dưới áp suất giảm

Đuổi khí dung môi bằng siêu âm (Ultrasonic)

Đuổi khí dung môi bằng sạc khí helium

đánh siêu âm để đuổi khí hoà tan hay khí dưới dạng treo (sức kháng trở 18MΩ).Ω).)

2.2 BỘ PHẬN KHỬ KHÍ (DEGASSER)

Dung môi

MΩ).àng tổng hợp chất dẻo đặc biệt

Thùng chân không

Valve selenoid Cảm biến áp suất

Bo mạch điều khiển

Bơm chân không

Dung môi cung cấp đến bơm

Hình 2.1 Sơ đồ khối bộ phận khử khí bằng cách sục khí helium

Hình 2.2 Sơ đồ hệ thống khử khí trực tiếp

Dung môi qua hệ thống khử khí sẽ qua màng tổng hợp nhựa đặc biệt, những khí hòa tan trong dung môi có ái lực và linh độ cao hơn với màng này so với các phân tử dung môi lỏng vì thế khí được đuổi ra ngoài hệ thống.

Chất lỏng được khử khí

Đầu bơm:

 Hút pha động vào thân bơm

 Đẩy pha động từ thân bơm vào cột sắc ký

 Thân bơm:

Aùp suất khơng đổi

Lưu lượng thay đổi

Di chuyển đơn giản Lưu lượng khơng đổi Aùp suất khơng đổi Thân bơm thể tích nhỏ

Một pitơng Lưu lượng khơng đổi Aùp suất thay đổi

Hai piitơng Lưu lượng khơng đổi Aùp suất khơng đổi Thể tích khơng giới hạn

2.3.BƠM (Pump)

Dual piston design

Piston drive actuating elements

- Chỉ lấy được một loại dung môi không tự động

pha trộn được dung môi

- Không tăng tốc độ dòng đột ngột

- Theo dõi áp suất bơm trong quá trình phân tích

- Định kỳ rửa lọc dung môi đầu vào

- Nạp đầy hệ thống HPLC bằng methanol, acetonitril hay hỗn hợp của chúng với nước khi không tiến hành phân tích để tránh sự phát triển của nấm mốc

Bơm đẳng dòng (isocratic pump)

- Phối hợp dung môi hợp lý tránh kết tủa chất điện giải trên đường ống

- Dùng dung môi trung gian một cách hợp lý khi phối hợp dung môi

- Cân bằng cột bằng hỗn hợp dung môi – nước với tỷ lệ tương tự như hỗn hợp DMΩ) đệm

- Rửa kỹ đường ống chứa đệm bằng nước sau khi kết thúc quá trình phân tích, sau đó rửa lại bằng hỗn hợp dung môi methanol hay acetonitril với nước.

- Lấy đồng thời 4 loại dung môi động

- Chạy được chương trình dung môi (gradient) một cách uyển chuyển và đa dạng

- Tiết kiệm dung môi

Hệ thống bơm tứ phân (quaternary pump)

Bộ phận khử khí có thể đặt trong đơn vị bơm

giúp giảm không gian phân tích

Pressure signal

2 nd plunger

Pressure sensor

Cấu trúc bên trong của bơm Hitachi 2130

Áp suất hoạt động tối đa của bơm thuờng là 6000psi

1bar = 0,987atm = 14,7psi

Proportioning Valves

Flow Cell Column

SMASH/HTA System with Low Pressure Mixing

Bộ phận đuổi khí

Valves chia tỉ lệ

Tế bào đo Cột

Phối trộn dung môi

Bơm trung tâm

Typical High Pressure Gradient Configuration

High Pressure Mixing

 Solvents are mixed on the injector side

or high-pressure side of the pump

 Two pumps control the mixing at different flow rates

 Applications demanding superior gradient performance with low delay volumes, flow rates below 200 l/min, or rapid gradient formation

Mixer

2.2 Bộ phận tiêm mẫu

 Bơm bằng syringe thẳng vào cột

 Ưu điểm:

 Tiện lợi, đơn giản, hiệu lực cao

 Hạn chế thể tích ngoài cột

 Thể tích thay đổi: 5 – 100 l

 Dùng dưới áp suất cao và tự động hóa được (autosampler)

Bơm Mẫu tự động (Autosampler)

phim bom mau tu dong cua hplc.flv

Cũng là phương pháp đưa mẫu phân tích vào cột bằng van bơm với thế tích xác định Nhưng hệ thống này sẽ tự động bơm mẫu sau khi cài đặt chương trình điều khiển với thể tích bơm mẫu có thể thay đổi 1-100l

Ưu điểm

- Độ lặp lại cao

- Độ chính xác cao

- Có thể tự động hóa được

vào dòng chảy tiêm mẫu gây nhiễm.

Mẫu nhiễm bị lắng đọng trên thành ngoài và đường rãnh của kim

(Thành ngoài kim tiêm)

Hình minh họa sự lấy mẫu

trong autosampler

Groove(đường rãnh)

Nguyên nhân nhiễm mẫu phân tích①

Nguyên nhân nhiễm mẫu phân tích①

Đường dẫn dòng chảy đến cột

Gía đỡ kim tiêm

Kim tiêm Mẫu nhiễm trên thành ngoài của kim bị đọng trên thành

ngoài của kim

Mẫu nhĩem lắng đọng vào dòng chảy dung môi đến cột gây nhiễm

Nguyên nhhân nhiễm mẫu phân tích

Nguyên nhhân nhiễm mẫu phân tích ②

Nguyên nhhân nhiễm mẫu phân tích ② ②

② （ Lỗ kim tiêm ）

Hình minh họa sự lấy mẫu

trong autosampler

3.3.1 TIỀN CỘT (PRE-COLUMN, GUARD COLUMN, SCAVENGER C)

- Hấp phụ, giữ lại các tiểu phân tạp kích thước nhỏ có thể sẽ gây nghẹt hay phá hủy cột sắc ký nhằm kéo dài tuổi thọ cột

- Trong sắc ký lỏng- lỏng, cột bảo vệ có tác dụng bảo hòa pha động với pha tĩnh làm cho sự mất dung môi là tối thiểu

- Cấu tạo chất nhồi cột bảo vệ giống như cộ phân tích nhưng kích thước hạt lớn hơn một ít, làm áp suất hệ thống tăng lên 200-300psi

- Thường 3 tháng phải thay tiền cột hay áp suất cao hơn áp suất lịch sử 50%

3.3 CỘT SẮC KÝ

 Thép không rỉ hay thủy tinh đặc biệt

 Cột phân tích

 Dài: 10 – 30 cm

 Đường kính trong: 4 – 10 mm

 Cỡ hạt pha tĩnh: 3 – 10 m

 Thường dùng: 15 hay 25 cm x 4 – 6 mm, 5 m, H = 40000 – 60000 đĩa/mét

 Hiện nay: 5 – 10 cm x 1 – 4,6 mm, 1,7 m, H = 100.000 đĩa/mét

 Cột chế hóa

B

Hợp chất B Hợp chất A

2.4 ĐẦU DỊ (DETECTOR)

 Chất tan đi qua đầu dò  tạo những tín hiệu điện

 Sự thay đổi về độ lớn vật lý chất tan thay đổi sẽ chuyển thành xung điện và đọc được trên máy ghi

 Sự đáp ứng đầu dò tỷ lệ với lượng chất tan, lặp lại và độc lập với chất rửa giải (trừ trường hợp gradient đối với vài loại đầu dò).

Việc lựa chọn detector để sử dụng phải dựa trên tính chất hĩa lý của chất cần được phân tích như: khả năng hấp thụ uv-vis, huỳnh quang, chỉ số khúc xạ, độ dẫn, khuyếch tán ánh sáng…

Một detcetor lý tưởng phải có:

- Độ nhạy cao, khả năng phát hiện phải thấp hơn giới hạn 0,1g mẫu trong 1ml pha động

- Đáp ứng rộng rãi đối với các mẫu cần phân tích hay có những đặc tính

đèn TB đo

Khuyếch đại tín hiệu

TB quang điện

HỆ THỐNG QUANG HỌC TRONG ĐẦU DÒ UV-VIS HITACHI-2420

2.4.1 ĐẦU DÒ UV-VIS

- Phổ biến nhất hiện nay trong HPLC với nguyên tắc là pha động chứa chất phân tích được rửa giải từ cột đi ngang qua tế bào đo sẽ hấp thu năng lượng bức xạ uv-vis nếu như chất phân tích có cấu trúc không no hay có màu

- Sự hấp thu bức xạ này bởi các chất tan tuân theo định luật Lambert-Beer.

- Dung môi dùng trong trường hợp này không hấp thu hay hấp thu rất ít tại bước sóng phân tích và chỉ cho phép chứa lượng cực nhỏ các tạp chất hấp thu trong vùng uv-vis

Ưu điểm

Độ nhạy cao (3ng/ml), giá thành không quá cao, dễ vận hành

Ít phụ thuộc vào các thay đổi điều kiện (nhiệt độ, tốc độ dòng )

Nhược điểm

Đòi hỏi dung môi phù hợp và tinh khiết

Chon lọc các chất tan hấp thu trong vùng Uv-vis

2.4.2 Đầu dò dãy diod quang (Photo-diode array detector, PDA)

 Phát triển từ UV-Vis

 Sử dụng rộng rãi nhất

 Tia đa sắc sau khi qua tế bào đo được đưa đến một cách tử để phân thành các tia đơn sắc rồi đi đến một dãy diod quang

 Mỗi diod quang nhận một tia tương ứng với một băng có độ dài sóng hẹp

 Mỗi một diod phát hiện sự hấp thu ở 1 bước sóng nhất định

 Toàn bộ dãy diod được quét nhiều lần trong 1 giây bởi bộ phận vi xử lý

 Thu được phổ UV-Vis của pic

 Ưu điểm:

 Phát hiện đồng thời chất được phân tích ở nhiều bước sóng khác nhau, giúp cho việc xác định được bước sóng hấp thụ tối đa của một chất cũng như phát hiện các tạp chất và các chất gây nhiễu ở bước sóng thấp hơn, không đặc trưng.

 Cung cấp thông tin về độ tinh khiết của peak.

 Cung cấp phổ UV/Vis của một peak, giúp kiểm tra độ tinh khiết của peak lần nữa và có ích trong việc định danh peak.

 Cung cấp phổ ba chiều giúp cho việc chọn điều kiện thích hợp để định lượng cũng như định danh các mẫu phân tích.

 Nhược điểm:

 Độ nhạy kém hơn đầu dò UV-Vis thông thường

Cell

Programmable slit Grating

1024 element diode array

190 nm

950 nm

Tungsten lamp Deuteriumlamp

Extended wl range

Holmium oxide filter

Automated wl verification

Fast Optimization of Sensitivity and resolution

Excellent wl resolution

Lens

Cell

Programmable slit Grating

1024 element diode array

190 nm

950 nm

Tungsten lamp Deuteriumlamp

Extended wl range

Holmium oxide filter

Automated wl verification

Fast Optimization of Sensitivity and resolution

Excellent wl resolution

Photodiode array (1024 bits)

The light intensity of each wavelength is

converted into a corresponding electrical

signal.

Slit

Flow cell

Eluate from colomn flowed

The light intensity is increased by reflecting the ultraviolet

light from the D2 lamp and by transmitting the visible light

from the W lamp The light intensity is increased by a

factor of 5 compared with our earlier product.

New optical system (patent pending) for the model L-2455U diode array detector

Condensing mirror

The light from the D2 lamp and the light from the W lamp are merged and directed to the flow cell

D2 lamp

Ultraviolet light source

d=1mm, l=10mm

Đèn D2

Thấu kính Tế bào

dòng Khe

Sơ đồ khối của DAD

Sắc ký đồ 3 chiều của clarithromycin trong chế phẩm Peak của dung mơi hay tạp

Peak của Clarithromycin

2.4.3 Đầu dò tán xạ ánh sáng bay hơi

Giai đoạn 1: phun sương

• Dung dịch rửa giải được phun sương

• Trộn với khí nitơ

• Hình thành hạt phân tán

Giai đoạn 2: Bốc hơi pha động

 Hạt phân tán đi qua buồng nhiệt

 Pha động bốc hơi khỏi hạt

 Phân lập chất phân tích thành những giọt nhỏ

(Evaporative light scattering detector, ELSD)

Giai đoạn 3: Phát hiện

 Chất phân tích là cácphần tử nhỏ của mẫu thử đi qua tế bào đo được chiếu chùm tia laser của đèn nguồn và gây tán xạ ánh sáng

 Ánh sáng khuyếch tán được giữ lại bởi ống nhân quang hay diode quang và chuyển thành tín hiệu điện tỉ lệ với lượng chất tan

Ưu điểm

- Phát hiện tất cả các hợp chất cĩ sự bay hơi thấp hơn

sự bay hơi của pha động

- Độ nhạy cao

- Giới hạn phát hiện rất thấp (ng)

Nhược điểm

- Sử dụng với pha động dễ bay hơi

- Mẫu phân tích cĩ sự bay hơi thấp hơn sự bay hơi của pha động

Đầu dò huỳnh quang

Đầu dò khúc xạ kế vi sai( RI)

Đầu dò Sử dụng Giới hạn phát hiện Chú ý

Khúc xạ vi sai Vạn năng  0,7 g/ml

Quang phổ UV-Vis, cố định Chọn lọc  3ng/ml Hay được dùng nhất

Quang phổ UV-Vis, thay đổi Chọn lọc  3ng/ml Phải chương trình hóa độ

hấp thu cực đại Huỳnh quang Chọn lọc  8 pg/ml

Đầu dò điện hóa Chọn lọc  1 pg/ml Rất nhạy, dùng rộng rãi

Đo độ đẫn Chọn lọc

ion

 0,2 % của sự sai lệch độ dẫn Để khảo sát ion và hợp chất có thể ion hóa Tán xạ ánh sáng bay hơi Chọn lọc  1 ng đối với

glucose

Khảo sát đường và những chất có áp suất hơi yếu Khối phổ Vạn năng Cực nhỏ Đắt tiền, lĩnh vực áp dụng

rộng rãi Đầu dò với phản ứng (UV hay

HPLco che hay.flv

3 CÁC THÔNG SỐ ĐẶC TRƯNG TRONG HPLC

Để hai chất tách hoàn toàn:

 Hai chất phải cĩ tốc độ di chuyển khác nhau rõ rệt

 Hai pic phải gọn hẹp và cân đối Không có sự giãn pic.

3.1 Tốc độ di chuyển của các chất

3.1.1 Tốc độ di chuyển của một chất

Thời gian lưu (Retention time)

t’ R = t R - t M

Hệ số dung lượng k’(capacity factor)

k’: bản chất các pha, chất tan, nhiệt độ, đặc điểm cột

1 < k’ < 8

Hệ số chọn lọc (selectivity factor)  =

B lưu giữ mạnh hơn A nên  > 1 1,05 <  < 2,00

A R

B R A

B A

B

t

t k

k K

' '



3.1.2 Tốc độ di chuyển tỷ đối của hai ch t ất

3.2.1 Hình dạng- Sự bất đối của pic

Đường cong phân bố chuẩn Gaussian

Hệ số bất đối (0,8 < AF < 1,2)

3.2.2 Sự giãn pic (peak spreading)

- Sự giãn pic hay sự mở rộng dải là một hiện tượng đặc biệt quan trọng trong sắc ký Được nghiên cứu qua lý thuyết đĩa và lý thuyết động học

- Sự giãn pic là kết quả di chuyển nhanh hay chậm khác nhau giữa các phân

tử của cùng một chất trong khi đi qua cột sắc ký

- Một cột sắc ký có hiệu lực cao sẽ cho các pic nhọn (ít bị giãn)

- Pic ra muộn sẽ tù hơn pic ra sớm

3.2.2.1 Lý thuyết đĩa

1941 Martin và Synge đã dùng lý thuyết này để mô tả quá trình sắc ký Theo đó cột sắc ký có thể phân ra thành nhiều lớp mỏng xếp sát nhau được gọi là đĩa lý thuyết, ở mỗi đĩa diễn ra sự phân bố cân bằng tức thời của các chất tan giữa pha tĩnh và pha động Khi một phần mới pha động đưa vào đĩa sẽ làm dịch

chuyển cân bằng và một phần chất tan theo pha động sang đĩa tiếp theo, cân bằng mới được thiết lập và cứ tiếp tục như vậy chất tan được phân bố vào một

số đĩa giữa có nồng độ cực đại so với các đĩa lân cận 2 bên sự phân bố chất tan dọc theo cột tuân theo phương trình: