Nghiên cứu này tiến hành nhằm mục tiêu xác định đột biến khảng thuoc thứ phát T790M trên gen EGFR ờ 'bệnh nhân ung thự phổi không tế bào nhỏ có dấu hiệu kháng thuốc điều trị đích.Kỹ [r]
Trang 1MÓI LIÊN QUAN GIỮA KIẺU GEN SNP309GG - MDM2
VÀ NGUY C ơ UNG THƯ PHỔI
Báo cáo viên: ThS.BSNT Trần Khánh Chi (Bộ m ôn H o á s in h , Trường Đại h ọ c Y H à Nội) Giáo viên hướng dẫn: TS.BS Trần Huy Thịnh (Bộ m ôn Hoá sinh, Trường Đ ại h ọ c Y H à Nội)
TÓM TẮT
Đặt vấn đề: Protein MDM2 đóng vai trò quan trọng trong quố trình sinh trưởng và chết theo chương trình cửa
tế bào thông qua tương tàc với[protein p53 Đa hỉnh thái nucleoỉid đơn (Single Nucleotide Polymorphism- SNP) tạ[ vị trí 309 vởi sự biến đồi T>G gen MDM2 đã đuực chỉ ra sự tăng mức độ MDM2 RNA và prvtein MDM2 cố thế dẫn đến ung thư phổi Mục tiêu nghiên cứu: xác định nguy cơ mắc ung thư phổi Hên quan đền SNP 309 T>G gen MDM2 Đối tượng nghiên cứu: 227 bệnh nhân được chần đoán xác đĩnh ung thư phổi nguyên phát tại Trung tâm
Hô hấp, Trvng tâm Y học hạt nhân và Ung bướu - Bệnh viện Bạch Mai và 297 người không mắc ung thư phổi đuực phân tích một số đặc điểm về lâm sàng và xác định SNP 309 T>G gen MDM2 liên quan đến nguy cơ gây ung thư phổi Kết quả: kiểu gen SNP 309GG của gen MDM2làm gia tăng nguy cơ ung thư phồi 1,6 lần với OR-1,6; 95%CI=1,10-2,41 và nguy cơ ung thư phổi không tế bào nhỏ 1,58 lần với OR=1,58; 9 5 % C M ,04-2,41
nguy cơ ung thư phổi và ung thư phổi không tế bào nhỏ theo mô hình gen lặn, khi kết hợp với hút thuốc /á nguy
cơ mắc ung thư phổi cao hơn 2,21 lần.
Từ khóa: Gen MDM2, SNP 309 T>Ggen MDM2, ung thưphỗi.
SUMMARY
MDM2 309 GG POYMORPHISM AND RISK OF LUNG CANCER
Tran Khanh Chi, Tran Huy Thinh (Hanoi Medical University) Background: The MDM2 protein plays an important role in regulating cell proliferation and apoptosis via interaction with p53 protein Single nucleotide polymorphism (SNP) located in nucleotide 309 T> G MDM2 gene has been shown to be related to lung cancer Purposes: this study was conducted to identify the correlation between the MDM2 SNP309 and lung cancer risk Materials and method: 227 patients were diagnosed with lung cancer in the Respiratory Center, Nuclear Medicine and Oncology Center-Bach Mai hospital and 279 controls patients were selected to analyze clinical features and the association o f MDM2-SNP309 with lung cancer risk Results: the 309GG genotype was associated with a significantly increased risk o f lung cancer (OR=1.6; 95%CI=1.10-2.41),adenocarcinoma (OR=1.58; 95%CI-1.04-2.41) in recessive model The person with 309GG genotype, who were also smoking, had 2.21 fold higher risk o f lung cancer (95%CI = 1.31-2.73) Conclusion: the
309 GG genotype is associated with increasing lung cancer risk and adenocarcinoma in recessive model (OR = 1.6, 95%CI =1.1- 2.41) and the 309GG genotype with smoking further increases lung cancer risk (OR=2.21; 95%CI = 1.31-2.73),
Keywords: MDM2 gene, MDM2-SNP 309 T>G, lung cancer.
Ung thư phổi (UTP) là bệnh lý ác tính vởi tỷ lệ mới đa hình thái của gen MDM2 ghi nhận SNP quan trọng mắc 1,8 triệu người (12,9%) và 1,6 triệu người nhất nằm ở vị trí 309 - SNP309 (rs2279744), trong đó (19,4%) tử vong hàng năm trên thế giới [1] Tuy nhiên, sự biến đổi từ nucleotid T thành nucieotid G đã được
cơ chế bệnh sinh UTP vẫn chưa hoàn toàn sáng tỏ, vì chứng minh làm tăng ái lực của sự hoạt hóa phiên mã vậy UTP thực sự là một thách thức cho nền y tế toàn Sp1 dẫn đến sự biểu hiện ở mức độ cao hớn mRNA cầu trong đó có Việt Nam.Bên cạnh yếu tố nguy cơ vả protein của MDM2, gây ức chế côn đường tín hiệu chính là hút thuốc lá.hiện nay các nhà khoa học tập p53 [7] Đa hình thái này được chì ra liên quan đến trung nghiên cứu vai trò của kiểu gen trong việc xác nhiều loại ung thư trong đỏ có UTP Tuy nhiên, các kết định những cá thể nhạy cảm với ung thư Nghiên cứu quồ nghiên cứu trên thế giới vẫn chưa khẳng định sự sâu về lĩnh vực này có íhể giúp sự hiểu biết sâu hơn nhất quán ở các quần thể nghiên cứu khác nhau,
về nguy cơ UTP và các gen nhạy cảm Đề tài này được tiển hành với mục tiêu: Xác định
Nghiên cứu này tập trung vào gen MDM2, yếu tố nguy cơ mắc ung thư phổi liên quan đến SNP309 T>G
điều hoà âm tính protein p53 - một protein có vai trò áp gen MDM2.
chế ung thư trong con đường tín hiệu p53 [2][3Ị Gen ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u MĐM2 nằm trên nhảnh dài của nhiễm sắc thể sổ 12 ở 1 Đối tipợng nghiên cứu
vị trí băng 3 giữa vùng 14 đến vùng 15 Protein MDM2 227 mẫu 'máu cùa bệnh nhân UTP nguyên phát tại
có thể gắn trực tiểp với protein p53 và ức chế hoạt tính Trung tâm Hô hấp, Trurig tâm Y học hạt nhân vồ Ung của chung, đồng thời MDM2 còn thúc ổẩy quá trình bướu - Bệnh viện Bạch Mai, được chẩn đoán xác định giáng hoá protein p53 trong tế bào thông qua con bằng mô bệnh học
Trang 2279 mẫu máu cùa nhóm chứng không mắc các loại
ung thư, tươnc; ứng về tuổi và giới với nhóm bệnh
2 Hóa chẫit
Hoá chất dùng trong nghiên cứu được cung cấp
bởi các hãng QIAGEN, Sigma, Fermentas!
3 Phương pháp nghiên cứu
Tách chiết DNẢ tong số từ các mẫu máu theo
phương pháp sử dụng enzyme protease K và phenol:
chloroform: isoamyl alcohol
Xác định kiểu gen SNP309 của gen MDM2 bằng
phương pháp RFLP-PCR (Restriction Fragment
Length Polymorphism - PCR):
Khuếch đại vùng gen SNP309 của gen MDM2
bằng phương pháp PCR, sử dụng cặp mồi đặc hiệu:
F: 5’-CGCGGGAGTTCAGGGTAAAG-3'
R: 5-CTGAGTCAACCTGCCCACTG-3’
Phân íích RFLP: Đoạn gen được nghiên cứu chứa
trinh tự nhận biết của enzym M spAIỈ (CCGịCTG) tại
vị trí SNP309 Binh thường vị trí SNP309 cùa gen
MDM2 là T, không chứa vị trí nhận bỉếỉ của enzym
MspAli, đoạn gen được khuếch đại không bị cắt và
giữ nguyên kích ỉhước 157bp, tượng ứng với kiểu
MspAli, do đó đoạn gen bị cắt và tạo ra cốc đoạn DNA
có kích thước 48 bp và 109 bp, tương ứng VỚI kiều
allele G (mutant type-GG)
4 Xử Ịý sổ lieu
Sử dụng phần mềm SPSS 20.0, tính ỉoán tỷ suất
chênh OR, 95%CI, sự khác biệt có ý nghĩa íhống kê
khi p < 0,05
5 Đạo đức trong nghiên cứu
Đề ìài đâ được íhông qua Hội đồng Đạo đức
Trường Đại học Y Hà Nội Bệnh nhân hoàn toàn tự nguyện tham gia vào nghiên cứu Bệnh nhân có quyền rúí lui khỏi nghiên cứu khi không đồng ý tiếp tục tham gia vào nghiên cứu Các thông tin cá nhân được đảm bảo bí mật
KẾT QUẢ
1 Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu
Đặc điểm
Nhóm ung thư phổi
■ n = 227
Nhóm chứng
n = 279 p n{%) n<%) Tuổi (năm) 60,27 ± 9,07 61,17 ±
11,99 0,18 Giới Nam 169 (74,4) 194(69,5) 0,23
Nữ 58 (25,6) 85 (30,5)
Mô bệnh học
UTP không
tế íế bao nhỏ
UTBM tuyến 181 (79,8) UTBM vảy 13(5,7) UTBM loại
khác 10(4,4) UTP tê bào nhỏ 23(10,1) Hút thuốc lá Có 121 (53,3) 111 Í39.8) 0,03
Không 106 (46,7) 168 (60,2)
Nhận xéí:
Tuổi trung binh cùa nhóm bệnh là 60,27±9,07 không khác biệì với tuồi của nhóm chứng là 61,17 ± 11,99 Tỷ lệ nam/nữ là 2,91/1
Ung thư biểu mô tuyến chiếm ìỷ lệ cao nhất trong các typ mô bệnh học
Tỷ lệ hút thuốc lá ở nhóm bệnh íà 53,3% cao hơn
có ý nghĩa so với nhóm chứng (p=0,03)
Không gặp nữ giới hút thuốc lá írong nghiên cứu
2 Kết quả phân tích PCR-RFLP SNP309 T>G gen MDM2
157 bp
“ 109 bp
»48 bp
Hình 1: Hình ảnh điện dĩ sản phầm cắt đoạn gen MDM2 mang SNP309T>G bằng enzym MspAli
Kiếu gen.dị hợp tử TG
Nhận xét: Sản phẩm cắt đoạn gen MDM2 mang gen đồng hợp tử G/G gồm 2 băng DNA có kích thước SNP309 bởi enzym M spAli gồm các đoạn DNA co 109 bp và 48 bp (giếng 2,4,6, 7, 10, 11) Mầu mang
Trang 3kiểu gen dị hợp tử T/G gồm 3 băng DNA có kích thước
157bp, 109 bp và 48 bp (giếng 3, 9)
Bang 2: Tần sổ các kiểu gen SNP309 T>G gen
Kiểu gen
Ung thư phổi (n = 227)
Nhỏm chứng (n - 279) OR (95%CI)
TT 60 26,4 65 23,3 (Reference)1,00
TG 102 44,9 158 56,6 0,7(0,46-1,08)
GG 65 28,6 56 20,1 1,26 (0,76-2,08)
AlenT 222 48,9 288 51,6
Alert G 232 51,1 270 48,4
GG với
rr+TG
TT+TG 162 71,4 223 79,9 (Reference)1,00
GG 65 28,6 56 20,1 1,6(1,10-2,41)
GG+TG với
TT
(Reference) GG+TG 167 73,6 65 23,3 0,85(0,26-1,27)
Nhận xét:
- Kiểu gen dị hợp tử SNP 309TG chiếm tỷ lệ cao
nhất ờ cả nhỏm bệnh và nhóm chứng.
- SNP 309GG làm tăng nguy cơ mắc UTP 1,6 lần
theo mô hình gen lặn
Bảng 3: Tân sổ các kiểu gen SNP 309 T>G gen
MDM2 và nguy cơ mắc ung thư phổi liên quan đến
Nhóm
OR
GG/TT
(95%CI)
OR
TG fiT (95%C!)
OR GG/TG+TT (95%C!)
OR GG+TG/TT (95%CỈ) Giởi
Nam
1,28
(0,71-2,29)
0,7 (0,42-1,16)
1,6 (1,01-2,61)
0,86 (0,53-1,38)
Nữ
1,19
(0Í45-3.15)
0,7 (0,32-1,61)
1,5 (0,67-3,35
0,83 (0,38-1,8) GPB
UTBM
không
tế bào
nhỏ
1;3
(0,77-2,17)
0,74 (0,48-1,16)
1,58 (1,04-2,41)
0,89 (0,58-1,35) UTBM
tế bào
nhỏ
1,02
(0,35-2,98)
0,41 (0,15-1,14)
1,74 (0,68-4,44)
0,57 (0,23-1,4) Hút
thuốc
Có 1,89
(0,9-3,96)
1,05 (0,54-2,03)
1,83 (1,02-3,27)
1,3 (0.7-2.4)
Không
0,78
(0,38-1,59)
0,5 (0,28-1,89)
1,23 (0,67-2,24)
0,37 (0,53-1,98)
GG và
hút
thuốc
OR = 2,21 (95%CI = 1,31-2,73)
tăng nguy cơ mắc UTPỞ nam giới và UTP không tế
bào nhỏ lần lượt 1,6và 1,58 lần theo mô hình gen lặn
Hút thuốc iá làm tăng nguy cơ mắc UTP 1,83 lần theo mô hình gen lặn của SNP 309GG gen MDM2 Người mang kiểu gen SNP 309GG có hút thuốc lá
sẽ tăng khả năng mắc UTP 2,21 lần
BÀN LUẬN Tuổi trung bình của nhóm bệnh nhân UTP trong nghiên cứu íà 60,27±9,07 không khác biệt với tuổi của nhóm chứng ià 61,17 ± 11,99 (p=0,18).Kết qua này phù hợp với ghi nhận cùa một sổ nghiên cứu trong nước.Theo Ngô Quý Châu và cộng sự (2012), tuổi trung binh của bệnh nhân UTP là 58,9 ± 8,6 [8] Kết quả nghiên cứu cho thấy tĩ lệ nam /nữ là 2,91/1 phù hợp với đặc điểm dịch tễ học của UTP ở nam nhiều hơn ở nữ [1]
Kết quả nghiên cứu ghi nhận kiểu gen đồng hợp tử SNP 309GG làm gia tăng nguy cơ mẳc UTP 1,6 lần so với kiểu gen kết hợp SNP 309TT và TG (OR=1,6; 95%CI=1,1-2,41; mô hình gen íặn) Kết quả này phù hợp với nghiên cứu trên người miền Bắc Trung quốc
do Xu Wang và cộng sự công bố năm 2014 ghi nhận
tỷ lệ mắc UTP cao hơn ở nhóm người mang kiều gen SNP 309GG so với TG+TT (p=0;043); đồng thời Xu Wang không thấy mối liên quan của tính đa hỉnh SNP
309 gen MDM2 với nguy cơ mắc UTP theo mô hình gen trội cũng như nguy cơ mắc UTP nói chung[9j.Gui
và cộng sự năm 2009 ghi nhận kiểu gen SNP 309GG gen MDM2 íàm tăng nguy cơ mắc UTP ở người châu
Ả với OR = 1,34; 95% Cl = 1,01—1,79 [7j
Phân tích mốir liên quan giữa SNP 309 gen MDM2 với thói quen hút thuốc lá cho thấy một sự gia tăng khả năng mắc UTP 2,21 lần ở những người kĩẻu gen GG
có hút thuốc lá.Điều này phù hợp với những nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh hút thuốc lá ĩà yểu tố ngụy cơ chính dẫn đến UTP và người có kiểu gen SNP 309GG hút thuốc ỉá làm nguy cơ mắc UTP cao gấp hơn 2 lần Tuy nhiên, kết quả thu được từ nghiên cứu của chúng tôi tráỉ ngược với công bố của Wenwu
He và cộng sự năm 2012 ghi nhận nguy cơ mắc UTP tăng ở người không hút thuốc lá mang kiểu gen GG (OR=1,328; 95% Cl= 1,119-1,575) [10] Điều này gợi ý một sự tương tác phức tạp giữa kiểu gen nhạy cảm ung thư vởi các yểu tố nguy cơ khác trong qũa trình phát sinh phát triền ung thư và cần được nghiên cứu sâu hơn ve cơ chế bệnh học phân tử
Phân tích mối liên quan cùa SNP309 gen MĐM2
VỚI typ mô bệnh học, nghiên cứu của chúng tôi ghi nhận kiểu gen GG làm tăng khả năng mắc UTP không
tế bào nhỏ 1,58 lần Sun Ha Park và cộng sự năm
2006 công bố kiểu gen SNP 309GG gen MDM2 làm tăng nguy cơ ung thư biểu mô tuyến 1,91 lần (OR = 1,91, 95% Cl = 1,16— 3,14) [11] Chúng tôi cũng tiến hành phân tích tìm mốỉ liên quan của SNP 309 gen MDM2 theo giới và ghi nhận sự gia tăng nguy cơ mắc UTP có ý nghĩa ở nhóm namgiới theo mô hình gen ịặn (OR=1,6; 95%CI=1,01-2,61) Kết quả này ngược với nghiên cứu của Wenwu He và cộng sự năm 2012 ghi
nhận nguy cơ mắc UTP tăng ở nữ giới mang kiểu gen
GG (OR-1,282; 95% Ci= 1,062-1,548) [10] Cơ chế để giải thích sự khác biệt này hiện vẫn chưa rỗ ràng, nhưng có khả năng liên quan đến các receptor của
Trang 4estrogen ảnh hường đến điều hoà biểu hiện gen
MDM2 Việc nghiên cứu sâu về cơ chế bệnh sinh UTP
trong mối liên quan tương tác giữa kiểu gen với các
yếu tố nguy cơ khốc sẽ đưa ra những hieu biết toàn
diện, giúp chúng ta có thể dự phòng, tiên lượng cũng
như cải thiện chất lượng điều trị cho bệnh nhân UTP
nói riêng và ung thư nói chung
KẾT LUẬN
Kết quả nghiên cứu ghi nhận kiểu gen đòng hợp tử
SNP 309GG gen MDM2 làm tăng nguy cơ ung thư
phổi nguyên phát 1,6 lần (OR = 1,6; 95%CI =1,1 -
2,41), ung ỉhư phổi không tế bào nhỏ 1,58 lần và 1,6
lần ở nam giới theo mô hinh gen lặn (OR=1,6;
95%CI=1,01-2,61).Kiểu gen SNP 309GG gen MDM2
kết hợp hút thuốc ỉá làm tăng nguy cơ mắc ung thư
phổi 2,21 lần (OR = 2,21; 95%Ci = 1,31-2,73)
Nghiên cứu được thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí
từ nhiệm vụ Quỹ gen cấp Nhà nước “Đánh giả đặc
điềm di truyền người Việt Nam" Nhóm nghiên cứu
trân trọng cảm ơn Trung tâm Hô hấp, Trung tâm Y học
hạt nhân và Ung bướu - Bệnh viện Bạch Mai, Trung
tâm Gen-Protein thuộc Trường Đại học Y Hà Nội đã
tạo điều kiện giúp đỡ trong quá trinh nghiên cứu
TÀI LIẾU THAM KHẢO
1 Jacques Ferlay, Isabelle Soerjomataram, Rajesh
Dikshit et a! (2015) Cancer incidence and mortality
worldwide: Sources, methods and major patterns in
GLOBOCAN 2012 Int J Cancer, 136: E359-E386
2 Ryan K M , Phillips A.C., Vousden K.H (2001)
Regulation and function of the p53 tumor suppressor
protein, CurrOpin Ceil Biol, 13(3): 332-7
3 Zamzami N., Kroemer G (2005) p53 in apoptosis control: an introduction, Biochem Biophys Res Commun, 331(3), 685-7
4 Wu H, Leng RP (2011) UBE4B, a ubiquitin chain assembly factor, is required for MDM2-mediated p53 polyubiquitination and degradation Cel! Cycle, 10: 1912- 1915
5 iwkuma T., Lozano G (2003) MDM2, an introduction, Molecular Cancer Research, 1(14): 993-
1000.
6 Moll U.M., Petrenko o (2003) The MDM2-p53 interaction, Molecular Cancer Research, 1 (14): 1001-8
7 Gui X.H., Qiu L.X., Zhang H.F ei al (2009) MDM2
309 T/G polymorphism is associated with lung cancer risk among Asians, European journal of cancer, 45:2023-26
8 Ngô Quý Châu, Lê Hoàn, Nguyễn Thanh Phương (2012) “Nghiên cứu đặc điễm iâm sàng và cận lâm sàng ung thư phổi nguyên phái di căn sọ não íại Trung tâm Hô hấp- Bệnh viện Bạch Mai”, Tạp chí Y học Lâm sàng, 68: 30-34
9 Xu Wang, Lina Jin, Jiuwei Cui (2014).Mouse double minute-2 homoiog (MOM2)-rs2279744 polymorphism associated with lung cancer risk in a Northeastern Chinese population Thoracic Cancerô: 91-96
10 VVenwu He, Jianxiong Long, Lei Xian và cs (2012).MDM2 SNP309 polymorphism is associated with iung cancer risk in women: A meta-analysis using METAGEN, Experimental and therapeutic medicine, 4: 569-576
11 Park S.H., Choi J.E., Kim E.J và cs (2006) MDM2 309T>G polymorphism and risk of lung cancer in a Korean population, Lung cancer, 54,19-24
PHÁTHIỆN ĐỘT BIẾN T790M THỨ PHÁT TRÊN GEN EGFR
Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ PHỔI KHÔNG TÉ BÀO NHỎ
Người thự c hiện: Trần Quốc Đạt
(Nghiên cứu viên - TT nghiên cứu Gen-Protein Trường ĐH Y Hà Nội)
Cán bộ hướng đẫn: PG STS Trần Vân Khánh
(Bộ môn Bệnh học phân tử - Khoa K ỹ thuật Y học, Trường ĐH Y Hà Nội
Trung tâm nghiên cứu Gen-Protein Trường ĐH Y Hà Nọi)
TÓM TÁT
Liệu pháp điều trị ung thư trúng đích (targeted cancer íherapy) ra đời đã trở thành bước tiến bộ vượt bậc trong việc điều trị ung thư phổi không tế bào nhỏ Liệu pháp này có hiệu quả rô rệt đối với nhóm bệnh nhẩn đuực xác định là có đột biến đâp ứng với thuốc ức chế hoạt tỉnh tymsine kinase (TKI - tyrosine kinase inhibitor) của EGFR (đột biển LREA exon 19 và L858R exon 21) Tuy nhiên, sau khoảng 10-20 tháng điều trị, đa số bệnh nhân ung thư phổi xuất hiện tình trạng kháng thuốc th ứ phát do s ự phát sinh m ột sổ biển đ ổ i ở cấp độ phàn 'tử của khối U,
trong đó sự xuất hiện đột biến mới T790M thuộc exon 20 trên gen ẼGFR chiếm đa số các trường hợp Nghiên cứu này tiến hành nhằm mục tiêu xác định đột biến khảng thuoc thứ phát T790M trên gen EGFR ờ 'bệnh nhân ung thự phổi không tế bào nhỏ có dấu hiệu kháng thuốc điều trị đích.Kỹ thuật giải trình tự gen trực tiếp và kỹ thuật Scorpions ARMS (Scorpions-Amplification Refractory Mutation System) với độ nhạy caođuực áp dụng đề xác định đột biến Kết quả cho thấy đã phát hiện được 5/11 (45%) bệnh nhân có đột biến khàng thụềc T790M exon
o n t r A r , s t A o U t u ể L ! Í L Ỉ - J n J ' í -
thiệu một ca lâm sàng điển hình của hiện tượng kháng thuổc TKI.
Từ khóa: Ung thư phổi không tế bào nhố, EGFR, khống TKI, đột biển thứ phát T790M.