Nghiên cứu sản xuất bộ Protein chuẩn dùng cho xác định trọng lượng phân tử Protein - Enzym bằng phương pháp sắc ký và điện di

The enzymes catalase and peroxidase from serum 0 ; blood group o were inhibited by the preparates from tree Glycosmis pentaphylla very high, inthem preparate of lea[r]

r ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HOC T ự NHIÊN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự NHIÊN

NGHIEN c ư ư SAN XUAT BỌ PROTEIN CHƯAN

DÙNG CHO XÁC ĐỊNH TRỌNG LƯỢNG

PHÂN TỦ PROTEIN-ENZYM BANG PHƯƠNG

PHÁP SẮC KÝ VÀ ĐIỆN DI.

Mã số: QGTD.0106

- Những người tham gia:

TS Phan Tuấn Nghĩa

TS Nguyễn Bích Nhi

TS Nguyễn Liêu Ba

Phần thứ nhất

TÓM TẮT BÁO CÁO

- Bộ thứ nhất gồm 5-6 protein, có khối lượng phân tử từ 14-97 kDa.

- Bộ thứ hai gồm 5-6 protein, có khối lượng phân tử từ 45-280 kDa dùno xác định khối lượng phân tử trong sắc kỷ và điện di

5.TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN c ứ u CỦA ĐỀ TÀI:

-Điều tra, phát hiên nguồn nguyên liệu động thực vật và vi sinh vật giầu protein cần khai thác.

- Nghiên cứu các Quy trình và phương pháp tối ưu để khai thác từng loại protein chuẩn ở dạng tinh khiết.

-Thành lập bộ protein chuẩn (Kit-Protein-Standai1s) có thành phần, tỷ lệ hợp lý írona các phạm vi khối lượng phân tử từ 14-97 kDa và 45-280 kủa.

- Kiểm tra, so sánh với các bộ protein chuẩn hiện nay trên thươnq trường.

- Điều chỉnh thành phần, tỷ lệ và hoàn thiện bộ protein chuẩn cần sản xuất.

- Tiến tới hoàn thiện bộ protein chuẩn theo tiêu chuẩn quốc tế.

protein chuẩn, nguồn nguyên liệu, quy mô sản xuất,

b Đã có nhiều sản phẩm tham gia triển lãm

Hội trọ’ kỹ th u ậ t “ Techm ark “ Giảng võ 10 / 2003

c Các kết quả có triể n vọng úmg dụng thực tiễn:

Bô P rotein chuẩn I (Dùng cho điện di S D S -polyacryiam id)

Bô P rotein chuẩn II (dùng cho phương pháp sắc ký)

07 Sinh viên đã bảo vệ Khoá luận tốt nghiệp theo hương đề tài

02 Cao học tốt nghiệp theo hương đề tài

e Công bố:

Đã công bố:

+ 05 Táp chi Quốc gia + 03 bác cáo Hội nghị Quốc tế + 01 Hội nghị trong nước

NGUYỄN QUỒC KHANG

SU M M AR Y OF REPORT

a Title o f P ro je c t:

Studies preparations o f the Kit- protein- Standarts using

fo r determ inaties m olecular weights o f protein-enzym es

b y chrom atography and electrophoresis.

b C oordinator:

Prof Dr NGUYEN QUOC KHANG

c Menbers of Project:

Dr Phan Tuan Nghia

Dr .Nguyen Bich Nhi

Dr Nguyen Lieu Ba

10, Main results:

a- Results in Science and technology:

+ Make known very much Plants, Animals and Microoraanisms have contained content of proteins high.

+ Perfecting methods for Purifications proteins as:

15 Lectin Artocarpus, Soybean,

b- R esults in p ra ctica l application: Obtained:

MOLECULAR WEIGHT PROTEIN STANDARDS AND KITS

Individual Proteins incluted in the MW-SDS-116 Kit I

Individual Proteins incluted in the MW-320 Kit II

c- Results in training:

Seven B Sc students have successfully fulfilled their graduating theses under this project.

d~ P ublications: + 05 papers on Journals

-I- 03 International Conferences + 01 National Conference

Phẩn íhứ hai

1 Đ ẶT VÂN ĐỂ

Việc nghiên cứu protein đã được nhiều nước trên thế giới tiến hành

từ những năm đầu r JS íiiế kỷ XVIII Nhiều protein enzym đã được sản xuất ở dạng tinh sạch hay tinh khiết như Samnhe đã kết tinh được Urease đậu tương ngay từ năm 1926, năm 1930 Nortrop đã kết tinh được Pepsin

từ dịch dạ dầy và Trypsin tụy tạng và những năm 60 của thé kỷ XX, người

ta đã đi đến tổng hợp được các protein bằng phương pháp nhân tạo như Insulin, Ribonuclease (Đức, Mỹ, Trung quốc) và cho đến nay, người ta đã sản xuất trên 200 protein - enzym có đầy đủ nguồn gốc xuất sứ, tính năng, cấu trúc phân tử và khả năng ứng dụng Song việc sản xuất các protein chuẩn cũng mới chỉ được quan tâm từ những năm 70 của thế kỷ

th ứ x x , đó là các bộ Protein chuẩn của Sigma ra đời để làm phương tiện cho sự nghiên cứu và phát triển Sinh học phân tử đương thời và tiếp nối đến nay.

Mỹ, Anh, Pháp, Đức, Nga, Thuỵ điển, Nhật, đã sản xuất rất nhiều các protein chuẩn, nhưng không hiểu lý do nào đó rnà cho đến nay hầu như chưa có bộ protein chuẩn nào thay thế được các bộ Protein chuẩn của Sigma và Bio-Rad Phải chăng các bộ Protein chuẩn này đã đạt mức đô tuyệt hảo mà c.hưa ai sánh kịp (Sigma chemical Company, USA- 1999).

Nước ta, xuất phát là một nước lạc hậu không chỉ về kinh tế mà cả non yếu về khoa học kỹ thuật, nên được xếp vào các nước mới phát triển Chính vì lẽ đó mà mọi lĩnh vực khoa học kỹ thuất chúng ta còn phải nhờ

sự trợ giúp từ bên ngoài, nhất là các ngành khoa học thực nghiệm Cho nên Công nghệ Sinh học mới bắt đầu di nhập vào nước ta từ 1980 Còn Sinh học Phân íử c ó thể nói mới chỉ là những bước đi ban đầu Do đó các công trình nghiên cứu finh sạch và tinh chế protein còn rất hạn hẹp có thể nói là chưa có gì đáng ghi nhận, nhất là các protein tinh khiết và protein chuẩn có thể nói bằng không Gần đây có xuất hiện một vài công trình tinh sạch lectin, protein đã được trình bày trong các hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc (1999) hay Hội nghị Sinh học Quốc tế Hà nội (2001) vừa qua.

Xuất phát từ những tình hình về lĩnh vực sản xuất và sử dụng

protein chuẩn trong và ngoài nước, khiến chủng tòi trăn trở và ham muôn

có hy vọng cẩn phải sản xuất các bộ Protein chuẩn góp phần làm giảm

những khó khăn trong nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Sinh học Phân

tử của đất nước, đổng thời góp phần làm cho dân giầu nước mạnh.

Xuất phát từ những cơ sở trình bày trên, chúng tôi đề xuất dự án sản xuất các bộ Protein chuẩn dùng cho xác định trọng lượng phân tử Protein-enzym bằng phương pháp sắc ký và điện di Dự án này dựa vào các cơ sở sau:

- Dựa vào kết quả nghiên cứu protein-enzym của các tác giả tham gia đề tài trong nhiều năm qua.

- Dựa vào những điều cho biết từ các bộ protein chuẩn (Kit-Protein-

Standarts) của các hãng Sigma và Bio-Rad đang thịnh hành trên thị

- Đã xây dưng xong đề cương chi tiết.

- Đã bảo vệ và thông qua Để cương nghiên cứu của để tài.

- Đã xây dựng xong đề cương khái quát và kế hoạch thực hiện.

2.2 CÔNG VIỆC CHUẨN BỊ:

- Đã soạn thảo tóm tắt mục dích, muc tiêu, nội dung nghiên cứu và ỉrao đổi với các thành viên trong đề tài.

- Đã tiến hành phân công nội dung công việc cho từng thành viên muốn tham gia và ký hợp đồng trách nhiệm.

- Đã mua sắm hoá chất tương đối đủ cho các cơ sô' thí nghiệm của

đề tài.

- Mua sắm thiết bị cần thiết (Máy điện di đứng)

- Mua sắm dụng cụ chuyên dùng (Máy cất đạm, )

- Đã tiến hành điều tra các nguồn nguyên liệu tự nhiên như động

lượng phân tử từ thấp đến cao Kết quả kiểm tra trên SDS-PAGE cho thấy trong dịch chiết protein tổng số từ thực vật (hạt lúa, đô tương, lá

trứng gà, trứng vịt, huyết thanh máu bò, cá chạch, huyết thanh sam,

và vi sinh vật (E co// ) có một số băng protein có trọng lượng phân tử cao trên 100 kDa Mục tiêu của việc điều íra này là tìm được các mâu

dễ kiếm rẻ tiền, nhất là các mẫu không phức tạp về thành phần protein, khai thác đơn giản nhất Trình tự đã thực hiện:

a Điều tra nguồn nguyên liệu giầu protein cẩn khai thác, để thực hiện nhiệm vụ này đã tiến hành các công việc sau:

- Dựa vào các tài liệu đã công bố protein chung của các đối tượng,

để !ựa chọn đực các đối tượng, mẫu vật có chứa protein cần khai thác.

- Tiến hành các thí nghiệm định tính và định lượng, phân tích thành phần, đặc trưng lý hoá và sinh học.

- Định hướng thu thập mẫu vật theo khai thác, thu thập, đặt hàng, thuê khoán chăm sóc, đầu tư kinh phí, kỹ thuật và điều kiện sản xuất,

b Nghiên cứu các phương pháp khai thác cho từng loại protein đã iựa chọn để khai thác cho hợp lý để đạt hiệu xuất cao và chất lượng thật tối, do đó đã tiến hành:

-■ Phân tích các tính chất đặc trưng của từng protein cần khai thác.

- Tìm các điểu kiện xử lý mẫu vật, làm đồng nhất mô, phá vỡ tế bào, giữ được protein nguyên thể và bển vững.

- Tìm các dung môi, dung dịch tối ưu cho mỗi protein cần tách chiết

và khai íhác có hiệu quả cao và hợp lý.

- Tìm các điều kiện kết tủa và loại muối loại dung môi, cũng như các nhân tố sử dụng trong xử lý, tách chiết, cần thiết khi tinh sạch và điều chế protein theo tiêu chuẩn bắt buộc.

c) Đã nghiên cứu hoàn thiện các phương pháp tinh sạch thích hợp cho từng loại protein cần khai thác, sản xuất theo yêu cầu của bộ protein chuẩn, nên:

- Cần biết được đặc trưng lý hoá và phân tử của từng loại protein muốn khai thác.

- Tiến hành thử nghiệm các bước tinh sạch, nét riêng cho mỗi

Sau khi đã làm tốt khâu chuẩn bị ở trên, chúng tôi tiến hành các phương pháp tinh chế các protein riêng theo các nhóm tác giả, như sau :

Nguyễn Quốc Khang

Sau nhiều nghiên cứu và thử nghiệm, chúng tôi đã thành công qui trình tinh sạch lectin cá chạch, có thể mô tả tóm tắt như sau: Cá chiết rút bằng đệm PBS, có pH 7,2, ly tâm thu dịch trong, kết tủa bằng ammonium-sulfate ở 60% bão noà, ly tâm thu kết tủa Kết tủa hoà tan vào đệm phosphat 0,020M có pH5 (đệm A), sau đó thẩm tích đối đệm A Dịch thẩm tích hấp phụ vào CM- Cellulose Dùng đệm phosphat 0,20 M

có pH 8,5 (đệm B) để tách rút lectin ra khỏi CM- Cellulose Dịch tách rút cho chạy sắc ký trao đổi ion trên cột DE- Cellulose Tách rút lectin ra khỏi DE- Cellulose bằng gradient nồng độ NaCi từ 0 đến 1,0 M trong đệm B (bảng 1 và hình 1)

2.3 T R I Ể N K H A I C Ô N G VIỆC:

Bảng 1 Các bước tinh sạch lectin từ cá chạch

có SDS- polyacrylamid Điều đó có thể nói đây là mọt !ectin ít thấy trong

tự nhiên- dạng nguyên thể là monomer 21 ± 3 kĐa (hinh2)

2.3.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP TINH SẠCH LECTIN HẠT MUỔNG LÁ

TRÒN (Crotalaria striata)

T R Ầ N THỊ LONG VÀ N G U Y Ê N Q UỐ C K HA N G _

nhiều về thành phần hoá học, nhưng là một cây bán hoang dại có hàm lượng nitơ cao (3

- 4,5%), nên đã được đổng bào miền Trung

và miền Bắc Việí nam trồng làm phân xanh Đặc biệt, cây muổng lá tròn có chứa một loại lectin đặc hiệu với hồng cầu nhóm máu A của người.

Mục đích của công trình này là tìm hiểu khả năng khai íhác và tinh sạch lectin hạt muồng

!á tròn (Crotaỉaria striaía) có hiệu xuấí cao và phẩm chất tốt, góp phần khai thác tài nguyên sinh vật để sử dụng trong nước và xuất khẩu.

Sau nhiều thăm dò và thử nghiệm, chúng tôi đã thành công phương pháp tinh sạch lectin từ hạt muống lá tròn nhu' sau:

1 Phương pháp th ứ n h â t:

Phương pháp thứ nhất được tiến hành như sau: Bột hạt muồng đã nghiền nhỏ mịn hoà vào nước với tỷ lê 1 / 20, khuây đều 30 phút và ngâm qua đêm trong tủ lạnh Ly íâm 4.000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch trong (lặp lại vài iần như trên) Dịch ly tâm các lẩn gộp lại, ta được dịch lectin thô Dịch thô cho hấp phụ vào bột DEAE-Celiulose đã chuẩn bị trước Rửa sạch bằng nước cất Dùng ammonium-su!fate 0,2 M íách rút lectin ra khỏ! DEAE-Celluiose trên phễu lọc hút Dịch lecíin thu được thêm tinh thể ammoniuiĩì-suiíaíe vào đến nồng độ 70% bão hoà Khuấy tan hết muối, để kết íủa hoàn toàn trong 30 phút Ly tâm thu kết tủa Kết tủa hoà tan vừa đủ bằng nước cất và đem thẩm tích qua đêm đối nước cất ở 4°c Dịch thẩm tích đưa iên cột trao đổi ion DEAE-Cellulose (2,5 X 10 cm) Tách rút lecíin khỏi cột bằng gradient nồn.q độ NaCi từ 0,0 đến 0,5 M trong đệm phosphai 0,05 M và có pH 8,0 Kếí quả tách rut lectin ghi tóm tắt ở hình 1 và tinh sạch lectin muồng tóm tắt trong bảng 1,

Crotalaria síriaía

Đ V / g v à O D 2 8 0 X 1 0 0.5M NaCI

Hình Phân chia lectin hat muổng lá tron qua cột trao đổi ion DE-Cellulose

Bảnq ; Các bước tinh sạch ectin hạt muồng ỉá tròn

so với dịch thô ban đầu và

một băng duy nhất trên điện

khối lượng phân tử là 30 kDa

(hình 2) Khi phân tích sắc ký

cột thì lectin này có cấu trúc

•&fấ£

Hình 2 Điện di đồ lectin muồng lá tròn

1 Protein chuẩn: 96,

66, 45, 31, 23, 14 kDa

2 Chế phẩm DE-II 3.Kết tủa (NH4)2S 0 4 4-6: D E -C e ll-I

7 Dich thỏ Hình 2 Điện di đổ

Ngoải ra còn có thể tinh sạch theo các phương pháp khái

7

2.3.3 TINH SẠCH LECTIN TỪ NHỊ HOA SEN (Nelumbo nucifera)

Nguyên Quốc Khang

Để tinh chế lectin từ nhị hoa sen, chúng tôi đã thăm dò và thử nghiệm chiết xuất lectin bằng các dung dịch khác nhau Kết quả cho thấy đệm PBS (Phosphate-Buffer-Saltz) có pH 7,2 có hiệu lực hơn cả.

Chúng tôi đã nghiên cứu thành công phương pháp tinh chế lectin từ nhị hoa sen, tóm tắt bằng mô hình như sau (hình 1) Kết quả cho thấy: Lecíin nhị hoa sen có thể tinh chế theo phương pháp đơn giản qua các bước: chiết xuất bằng đệm PBS có pH 7,2, kết tủa bằng ammonium- suifate 60 % bão hoà, sắc ký trao đổi ion trên CM- Cellulose và DE- Cellulose Bằng phương pháp này, chế phẩm iectin thu được có độ sạch cao gấp 5 iần so với dịch thô ban đầu và hoạt động riêng ià 170667 đơn

vị trên mg protein Có hiệu suất khai thác khoảng 10 % theo protein và 50

% theo hoạt độ lectin Kết quả điện di SDS- polyacrylamid là một băng duy nhất với khối lượng 25 ± 1,87 kDa (hình 2).

r á c h ch iế t bằnq N aC L 0,5 fvl

K ẻ { tỏa và th âm tích [LECTIN

Hình 1: Quj trìn h tin h c h ế iectin nhi sen

2.3.4 TINH CHẾ ALBUMIN TRỨNG GÀ

TRẦN THỊ LONG VÀ NGUYỄN QUÓC k h a n g

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC Tự NHIÊN, ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÁ NỘI

1 Nguyên tắc:

Lòng trắng trứng gà chứa khoảng 12 % albumin của protein trứng, albumin trứng có điểm đẳng điện 4,6 và dễ tan trong nước, bị kết tủa bằng ammonium-sulfate ở nồng độ bán bão hoà Dựa vào các đặc tính này của albumin, chúng tôi đã tách albumin ra khỏi các protein khác bằng các phương pháp thích hợp Qua nhiều thăm dò và thử nghiệm, chúng tôi

đã thành công phương pháp tinh sạch albumin trứng gà mỏ tả tóm tắt như sau:

2 Hoà tan album in írứna:

Dùng các quả trứng gà tươi (mới đẻ), rửa sạch vỏ và thấm khô Dùng lưới dao mỏna, băm nhẹ một nhát ngang qua vỏ chính giữa quả trứng (iưỡi dao không làm vỡ màng lòng đỏ) Nhẹ nhàng bửa vỏ trứng làm hai phần (một phần có chứa lòng đỏ), chắt gạn lấy hết lòng trắng Lòng trắng thêm nước cất gấp 4 lần thể tích lòng trắng Khuấy nhẹ cho tan đều lòng trắng Sau đó dùng vải nilon sạch ỉọc lấy dịch đồng nhất và írong.

3 Kết tủa albu m in:

Dịch trứng íhu được ở trên, thêm NaCI vào đến 0,1 % và khuấy đều Sau đó dùng axit acetic 10 % điều chỉnh khối dịch tới pH 4,6 Để ở nhiệt độ phòng khoảng 10 phút cho kết íủa hoàn toàn Ly tâm 10.000 v/1 phút trong 10 phút ỉhu kết tủa.

4 Sắc kỷ trao đổi ion qua cột CM- C ellulose:

Kết tủa bước 3, đem hoà tan vừa hết vào đệm phosphat 0,02 M có

pH 6,0 (đệm A) và thẩm tích qua đêm ở 4°c bằng đệm A Dịch thẩm tích cho ỉên cột CM-Cẹllulose (2,5 X 10 cm) đã chuẩn bị trước Tách rút albumin khỏi cột bằng gradient Na2H P 0 4 từ 0,0 đến 0,2 M Vân tốc 20 mi/giờ, chia 5 phân đoạn Quá trình sắc ký này được mô tả tóm tắt trên hình 1 Từ hình 1 cho thấy protein trứng tập trung chủ yêu ở các phân đoạn từ 18 đến 22 và sau đó có đỉnh thứ hai từ các phân đoạn 27-28-29.

9

Qua kiểm tra thành phần protein, nhận thấy chế phẩm có độ sạch chưa cao, trong điện di SDS còn nhiều băng protein lạ.

Hình 1 Phân chia albumin trứng gà qua cột CM-Cellulose

5 Tái sắc ký trao đổi ion qua cột CM-Cellulose:

Các phân đoạn 18 đến 22 sau khi qua cột CM-Cellulose ở trên được thu gom lại và chỉnh về pH 6,0 Dịch sau khi chỉnh pH được pha

cm) đã chuẩn bị trước Rửa cột bằng đệm A và sau đó tách rút albumin khỏi cột bằng gradient từ 0,0 đến 1,0 M NaCI trong đệm A Vận tốc tách rút 20 ml/giờ chia 5 phân đoạn Quá trình tái sắc ký này được trình bày tóm tắt trên hình 2.

Hình 2 Albumin trứng tái sắc ký trao đổi ion qua cột CM-Cellulose

2.3.5 TINH CHẾ LYSOZYM TỪ LÒNG TRẮNG TRỨNG GÀ:

^7r ầ n (77/ / Ẩ líitK Ị o à Q li) 111/1'II Q ttfle 3 C l u u t i f

T RƯ ỜN G ĐAI II OC K HOA II ỌC T ư NHIÊN, ĐAI HOC ọ u ố c GIA MÀ NÔI

Lysozym có nhiều trong lòng trắng trứng gà, nó có điểm đẳng điện khoảng pH 11,5 và có khối lượng của protein đơn phân, nguyên thể là khoảng từ 14 đến 15 kDa Sau khi kết tủa albumin ở pH từ 4,5 - 4,7 thì lysozym không bị kết tủa mà còn tồn tại trong dung dịch Lợi dụng những đặc tính này của lysozym, chúng tôi đã thành công phương pháp tinh sạch lysozym từ lòng trắng trứng gà, có thể mô tả tóm tắt như sau:

1 Thu nhận lysozym lòng trắng trứng gà

Dùng các quả trứng gà tươi (mới đẻ), rửa sạch vỏ và thấm khô Dùng lưới dao mỏng, băm nhẹ một nhát ngang qua vỏ chính giữa quả trứng (lưỡi dao không làm vỡ màng lòng đỏ) Nhẹ nhàng bửa vỏ trứng làm hai phần (một phần có chứa lòng đỏ), chắt gạn iấy hết lòng trắng Lòng trắng thêm nước cất gấp 4 lẩn thể tích lòng trắng Khuấy nhẹ cho tan đểu lòng trắng (không để tẹo bọt) Sau đó dùng vải nilon sạch lọc lấy dịch đồng nhất và trong.

Dịch trứng thu được ở trên, thêm NaC! vào đến 0,1 % và khuấy đểu Sau đó dùna axit acetic 10 % điều chỉnh khối dịch tới pH 4,6 Để ở nhiệt độ phòng khoảng 10 phút cho kết tủa hoàn toàn Ly tâm 10.000 v/1 phút írong 10 phút thu kết tủa albumin Còn dịch được điểu chính bằng Tis-bazơ đến pH 8,3 Ly tâm thu dịch trong suốt (cũng có thể thu dịch sau kết íủa albumin trứng ở pH 4,6 ở trên theo phương pháp 4).

3 Sắc ký trao đổi ion qua cột CM-Cellulose

Dịch ly tâm thu được ở bước 3, đưa lên cột CM-Cellulose (2,5 X 10 cm) đã chuẩn bị trước Tách rút lysozym khỏi cột bằng gradient Tris-bazơ

từ 0,0 đến 0,05 M Quá trình sắc ký này được mô tả tóm tắt trên hình 1

Từ hình 1 cho thấy protein trứng tập trung chủ yếu ở các phân đoạn từ 3 đến 9, đính thứ hai từ các phân đoạn 21 đến24 và đỉnh thứ ba từ phân đoạn 29 ớến 31 Thu protein ở đỉnh 2 là đỉnh lysozym.

Qua kiểm tra thành phần protein, nhận thấy chế phẩm có độ sạch cao trên 96%, trong điện di SDS còn 1 băng protein duy nhất với khối lượng phân tử 14,3 kDa (hình 2).

13

2.3.6 TINH CHÊ ALBUMIN TỪ HUYẾT THANH MÁU BÒ

TRẦN THỊ LONG VÀ N GU Y Ễ N ọ u ố c k h a n g Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Q uốc gia Hà nội

Huyết thanh máu bò có chứa khoảng trên 10 % protein, trong đó chủ yếu là albumin Albumin huyết thanh máu bò có điểm đẳng điện 4,5 - 4,7 và dễ tan trong nước, bị kết íủa bằng ammonium-sulfate ở nồng độ bán bão hoà Dựa vào các đặc tính này của albumin, chúng tôi đã tách albumin ra khỏi các protein khác bằng các phương pháp thích hợp Qua nhiều íhăm dò và thử nghiệm, chúng tôi đã thành công phương pháp tinh sạch albumin từ huvết thanh máu bò mô tả như sau:

1 Lấy h u yết thanh máu bò:

Khi chọc tiết bò, tiết chảy ra, hứng vào các chai Lavie đã có chứa dung dịch chống động khoảng một phần ba chai Trộn đều nhẹ nhàng (không để võ' hồng cầu) Máu chống đôna mang về được ly tâm 2000 vòng/ phút trong 5 phút để thu huyết thanh Huyết thanh thu được có thể dùng ngay hay bảo quản trong điều kiện lạnh sâu (dưới - 10 °C) đến khi làm thí nghiệm.

3 Sắc ký ái lực trên C ibacron blue F3G.A:

Kết tủa ly tâm bước 2, được hoà tan vào đệm phosphat 0,02 M, có

pH 8,0 (đệm A) đến thể tích 500 ml, sau đó thêm vào 5 g khô hợp chất mầu Cibacron blue F3G-A đã chuẩn bị trước (10 g Sephadex G 100 + 2 g Cibacron F3G.A) Khuây đều trong 2 giờ, đem lọc hút và rửa bằng đệm A đến sạch Sau đó cho phản hấp phụ bằng đệm A có thêm 2 M ammonium-suiíate Dịch tách rút thêm ammonium-sulfate đến nồng đô 60% bão hoà Ly tâm thu kết tủa.

Kết tủa bước 3, đem hoà tan vừa hết vào đệm phosphat 0,02 M có

pH 6,0 (đệm B) và thẩm tích qua đêm ở 4°c bằng đệm B Dịch thẩm tích cho lên cột CM-Cellulose (2,5 X 10 cm) đã chuẩn bị trước Tách rút albumin khỏi cột bằng gradient NaCI từ 0,0 đến 1,0 M Quá trình sắc ký này được mô tả tóm tắt trên hình 1 Từ hình 1 cho thấy protein huyết thanh máu bò, sau khi đã qua bước sắc ký ái lực thì proỉein tập trung chủ yếu ở các phân đoạn từ 18 đến 22 và sau đó có đỉnh thứ hai từ các phân đoạn 27-28-29.

0 0 2 8 0 x 10

1 0 M NaCI

35 T

Hình 1 Phân cnia albumin huyết thanh máu bò qua cột CM-Celỉulose

Đem phân tích bằng điện di SDS-polyacryiamid đã phát hiện albumin huyết thanh máu bò tách rút khỏi cột ClVi-Cellulose từ nồng độ NaC! khoảng 0,4 M Chế phẩm của phương pháp này có độ tinh sạch trên 95% và là một băng protein duy nhất trên điện di đồ (hỉnh 2).

* Đố! với albumin huyếí thanh bò còn có thể tinh sạch theo phương pháp tinh sạch albumin trứng gà ở trên Các bước tiến hành giống nhau hoàn toàn từ bước kết tủa pH 4,7 đến các bước tiếp theo Cuối cùng thu chế phẩm như albumin trứng.

15

•«~66kDa

2.3.7.TINH SẠCH CHẤT ứ c CHỂ TRYPSIN (TI) TỪ HẠT ĐẬU TƯƠNG

(Glycine max L.)

PHAN TUẤN NGHĨA VÀ ĐĂNG QUANG HƯNG

K hoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

1 Đặt vâVi để.

hình với khối lượng phân tử 8 kDa và 20 kDa và được gọi tương ứng là chất ức chế Bowman-Birk và chất ức chế Kunitz íheo cách gọi của các tác giả lần đầu tiên phát hiện và tinh sạch chúng [2, 4,] Cho đến nay các tính chất của cả hai chất ức chế này đã được nghiên cứu rất kỹ [1, 6], cả hai chất đều đã được một số hãng hoá chấí tinh sạch và sản xuất làm các protein chuẩn cho việc xác định khối lượng phân tử bằng sắc ký lọc gel và bằng điện di Tuy nhiên, ở Việt nam cho đến nay chưa có công trình nào báo cáo về việc tinh sạch các chất ức chế này Nghiên cứu của chúng tối nhằm mục đích thiết lập một qui trình tương đối đơn giản, dễ áp dụng để tinh sạch chất ức chế Kunitz (KI), với khối lượng 20 kDa vốn khá bền với nhiệt, có hàm lượng tương đối cao trong nguồn nquyên liệu bột đâu tương

dễ kiếm, giá rẻ để có thể sử dụng như một protein chuẩn cho việc đánh giá khối lượna của các protein thay cho việc nhập ngoại giá cao.

2 Chuẩn bị dịch c h iế t hạt đậu tương.

Hạt đậu íương được nghiền mịn 20 g bột nghiền mịn được loai mỡ bằng ete etyiic (theo tỷ lệ 1 g bột 5 ml ete) Pha nổi ở trên chứa mỡ trong ete được gạn bỏ, phần bột đã loại mỡ được cho làm bay hơi ete ở nhiệt độ phòng.

Bột đậu tương loại mỡ được chiết bằng đệm Tris-HCỊ 20 mM, phi 7,5 có chứa 50 mM KCI (đệm A) theo tỷ lệ 1:5 (khối ỉượna:thể tích) tronG 1 giờ Dịch đồng thể được ly tâm ở 14.000 v/ph trong 20 phút ở 4 c Dịch trên tủa được thu lại Kết tủa được chiết lại với cùng đệm A nhưng theo tỷ lệ 1:3 (w:v) và thu dịch trên tủa bằng ly tâm.

3 Sắc ký trao đổi ịon qua cột DE-52 ceì!uiose.

Dịch chiết hạt đậu tương của hai lần được trộn lai và cho lên cột DE-52 clelluíose (có kích thước 1,6x 8 cm) đã được cân bằna với đệm A ỏ' trên Tốc độ ỉên cột là 20 mi/giờ.

Sau khi cho toàn bộ dịch chiết chảy qua cột, cột được rửa bằng đêm A cho đến khi A280 của dịch rửa chiết nhỏ hơn 0,005 (khoảng 120 ml) và

sau đó được phản hấp phụ bằng gradient NaCI từ 0,05-1,OM pha trong cùng đệm A Tốc độ rửa chiết là 25 ml/giờ với môi phân đoạn thu là 2ml.

4 Sắc ký qua cột lọc gel Sephadex G-100

Các phân đoạn II có TIA của bước sắc ký qua cột DE-52 cellulose được dồn lại, loại muối bằng thẩm tích, cô đặc đến 2 ml và cho sắc ký qua cột

bằng cùng đệm A Cột được rửa chiết bằng cùng đệm A với tốc độ dòng chảy 20 ml/giờ, thu mỗi ống 2,5 ml.

Sắc ký đồ phân đoạn II sau khi qua cột lọc gel có 1 đỉnh protein lớn và một vùng đỉnh kéo dài đến ống thứ 40, tuy vậy chỉ có một đỉnh TIA, ứng với các ống íừ 10-22 là có TIA Như vậy bước sắc ký lọc gel đã cho phép loại bỏ nhiều protein không mong muốn, nhờ đó độ sạch của chế phẩm

Ki đã được tăng lên 12,6 lần so với ban đầu (bảng 1) Tuy vậy, kết quả chạy SDS-PAGE cho thấy chế phẩm vân còn một số băng protein khác nhau, chứng tỏ cần phải được tiếp tục tinh sạch.

P ro te in

Sỏ phàn đoan

Hình 2: sắc ký qua cột Sephadex G100 p h â n đoạn TI của hạt đậu

tươnơ.

Đỉnh TIA từ bước sắc ký lọc gel được thu lại, thẩm tích đối đệm A và cho sắc ký qua cột trypsin-sepharose 4B đã được cân bằng với đệm A có chứa 2 rnPvl CaCI2 Protein không hấp phụ và gắn không đăc hiệu được đẩy bằng dung dịch N a d IM pha trong cùng đệm A Phần protein gắn đặc hiệu trẻn cột được đẩy bằng dung dịch HCI 0,001 M có chứa 2 mM CaCI2 Kết quả phân tích cho phần dịch đẩy bằng NaCI có protein nhưng không có TiA Dịch phản hấp phụ có chứa cả protein và TIA Độ sạch của chế phẩm qua bước này tăng lên 37,2 lần.

Kết quả phân tích SDS-PAGE (hình 3) cho thấy, chế phẩm SBTI thu được (cột 6 và 8) có duy nhất một băng protein với kích thước bằng 20 kDa, nằm đúng vị trí của băng chất ức chế Kunitz từ đậu tương trên đường

19

chạy của các protein chuẩn Kết quả này chứng tỏ chế phẩm TI thu được

là đã tinh sạch Qui trình tinh sạch TI từ đậu tương được tóm tắt ở bảng 1 bao gồm các bước: loại mỡ bằng eter etylic và chiết bằng đệm Tris-HCI, săc ký qua cột trao đổi ion DE-52 cellulose, sắc ký lọc gel qua cột Sephadex G-100 và sắc ký ái lực qua cột Trypsin-Sepharose 4B.

Bảng 1: Tóm tắt qui trình tinh sạch chất ức chế trypsin 20 kDa từ hạt đậu tương

Kết quả tinh sạch

Protein (mg)

TIA (đơn vị)

Hoạt độ riêng (đơn vị/

mg protein)

Hệ số tinh sạch (lần)

Hình 3: Điện di gel polyacrylamid 12,5% có SDS chế phẩm chất TI từ đậu tương

1: Dịch chiết hạt đậu íương, 2: Đỉnh TIA thu từ cột DE-52, 3 và 4: đỉnh TIA thu từ cột Sephadex G-100, 6 và 8: Chế phẩm TI thu từ cột sác

ký ái lực Trypsin-Sepharose 4B, 7: Các protein chuẩn bao gồm:

Phosphorylase B, albumin huyết thanh bò, ovalbumin, cacbonic

anhydrasế, chất ức chế trypsin (KI) đậu tương và lacíalbumin.

21

2.3.8 CÁC KẾT QUẢ TINH SẠCH:f3- GALACTOSỈDASE VÀ

RNA POLYMERASE

NGUYỄN BÍCH NHÍ VÀ CÔNG s ự

Viện Công nghệ Sinh học

NGUYÊN LIỆU: thực vật, vi sinh vật

P H Ư Ơ N G P H Á P N G H IÊ N CỨ U:

1 Các kỹ thuật tách chiết và tinh chế protein

2 Điện di biến tính protein trên gel polyacrylamide (SDS-PAGE)

3 Xác định và nhận dạng protein bằng phương pháp sử dụng khối phổ

M ALD I-TO F MS và MS/MS

KẾT QUẢ:

/ Tìm nguồn nguyên liệu tự nhiên:

Đã tiến hành điều tra các nguồn nguyên liệu tự nhiên như động vật, thực vật và vi sinh vật để tìm kiếm những protein tự nhiên có trọng lượng phân tử cao trên 100 kDa Kết quả kiểm tra trên SDS-PAGE cho thấy trong dịch chiết protein tổng số từ thực vật (hạt lúa, đỗ tương )

cao trên 100 kDa.

2 Tách chiết và tinh chế một số protein có trọng lượng phân tử cao:

Xử lý mẫu:

OD6ũQnm khoảng 0,6 Li tâm thu tế bào Phá tế bào bằng siêu âm Hòa cặn tế bào vào dung dịch đệm tra mẫu (Tris-HCI 0.5M pH 6.8, Glycerol, SDS, [3-Mercaptoethanol, Bromophenol Blue).

® Hat lúa, đậu tương được bóc bỏ vỏ trấu, giã nhỏ, sấy khô, rây mịn Bột được chiết trong đệm Tris-HC! pH6.8 ở 37 °c trong 60 phút Li tâm thu dịch trong Dịch chiết bảo quản ở -20°c.

Tách chiết và linh chí’

• Các mẫu dịch chiết được phân tích bằng điện dy SDS-PAGE trên

gel polyacrylamide 12.5% và nhuộm bằng Commassie Brilliant Blue Cắt các băng protein có trọng lương phân tử cao tương đương khoảng 116 kDa và 155 kDa.

® Tách chiết và tinh chế các protein bằng phương pháp thôi gel Các băng protein được cắt từ bản gel, gom lại và cho vào túi thẩm tích chứa dung dịch đệm Glycine -Tris-HCI pH 8.3 Thôi protein từ gel bằng điện di Í0 0 V trong khoảng 60 phút Lặp lại 3 lần để thu hết

Speed-vac, bổ sung thêm glycerol nồng độ cuối cùng là 40% và

Giếng 1: Các protein có kích thước 155, 68 và 27 kDa;

Giếng 2: Thang Protein chuẩn thứ tự từ trên xuống:

Insulin A,B chain: 2.340 -3.400

Giếng 3: Các protein tách được có kích thước 116 và 27 kDa.

Các kết quả nhận được trên hình i cho thấy, băng proíein có trọng lượng phân tửkhoảng116 và 155 kDa đã được thu nhận (giếng 1,3) Bên cạnh đó chúng tôi còn nhận ổược các sản phẩm phụ có trọng lượng phân

23

tử khoảng 68 kDa (đối với sản phẩm 155 kDa) và khoảng 27 kDa (đối với

cả hai sản phẩm 155 và 116 kDa) Nguyên nhân có băng phụ có thể do

sự tự thủy phân các sản phẩm protein bằng proteinase nội bào Để tránh

có thêm băng phụ, có thể bổ sung các chất ức chế sự hoạt động của enzyme proteinase (Protease Inhibitor Coctail) đối với các tế bào vi khuẩn vào dịch protein.

Các kết quả nhận được trên hình 1 còn cho thấy đã thu nhận được hai loại protein có nguồn gốc tự nhiên có trọng lượng phân tử khá cao tương ứng khoảng 116 và 155 kDa, Hàm lượng protein nhận được khá cao (khoảng 2-4 mg/ml).

3 Xác định và nhận dạng các protein nhận được bthiíỊ phưanạ pháp khối p h ổ M A LD I-

T O F MS

Thủy phân protein bằng trypsin

Các protein sau khi được tinh sạch được thủy phân trực tiếp với trypsin Sau đó dịch thủv phân được làm khô bằng SPD 1010 Speed-vac System (ThermoSavant, M ỹ) Hòa lại cặn bằng 5ul dung dịch 50% acetonitrile có bổ sung 0.1 % TFA

Xác định protein bằng phương pháp khối phổ MALDI-TOF MS

iu l protein (tương đương với khoảng 5 pm ol) được nhỏ trực tiếp lên khay (plate), sau đó đổ khô ở nhiệt độ phòng Cho tiếp lu l dung dịch m atrix (20 m g/m l a-cyano-4- hydrocyninam ic trong 50% acetonitrile, 50% nước và 0.1% T F A ) rồi để khỏ hoàn toàn

ở nhiệt độ phòng Tiếp đó khay được đưa lên phàn tích trên hệ thông khối phổ QSTAR-

X L (M D S Sciex, Toronto, Canada) Phổ TO F-M S được xác định trono hai dải khối từ

500 amu đến 4500 amu với năng lượng xung laser phù hợp Chuẩn khối ngoài được tiến hành với 3 peptide của chất chuẩn Glu fibrinogen (Sigma) là 175.200 amu; 684,35 amu

và 1570,69 amu

Kết quả xác định protein kích thước 116 kDa (hình 2 3)

•M > ynOCCxXi

Hìnlt 2 Phổ TOF-MS của protein kích llurớc 1 16 kDa

sau khi thủy phân bans trypsin

Hình 2 cho thấv hình ảnh các mảnh pcptidc được thủy phân từ protein cổ trọng lượim phán tử 116 kDa Sử dụng phần mém M ASC O T (M a trix Science Co.) đẽ xác định và nhận dạng protein này (hình 3) đã chí ra rằng kích thước các manh peptide thu

tlưực trên phổ đều phù hợp cao nhất với [3-galactosidase có trọng lượng phân tử 116,278 kD a, số đăng kí CA A 2 35 7 3 trên Ni! ân hàng DO' liệu Prolein Quốc tê có nauổn

P ro b ab ility Based M owse Score

Score is -10*Log(P), where p is the probability that the observed match is

MASCOT (Matrix, Science Co.)

Tương tự, hình 4 là kết quả nhận dạng protein bằng phần mềm

DNÂ-directed RNA polymerase (EC 2.7.7.6) mạch beta có xuất xứ từ

E co//vối trọng lượng phân tử đã được xác định chính xác là 155,063 kDa

2.3.9 TÍNH SẠCH LECTIN TỪ HẠT ĐẬU TRẠCH LAI

(Phaseolus sp L)

Nguyễn Quốc Khang, Trần Thị Long

Khoa Sinh học-trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Hà nội

Việt nam có hệ sinh vật vô cùng phong phú và đa dạng, là điều kiện thuận lợi cho sản xuất các chế phẩm lectin từ sinh vật Các nhà khoa học Việt nam đã có nhiều công trình nghiên cứu, điều tra, khai thác và ứng dụng lectin Xuất phát từ những nhận thức trên, chúng tôi tiến hành đề tài “ Tinh sạch và một vài tinh chất lý hoá của lectin

trong các cây họ đậu đỗ của Việt nam

1 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:

1.1 Vật liệu:

- Hạt đậu Trạch lai (Phaseolus sp L) thu mua tại chi nhánh của Công ty giống rau quả Nhiệt đới Hà nội Nghiền nhỏ thành bột mịn dùng làm mẫu nghiên cứu (Hình 1)

- Hồng cầu các nhóm máu A, B, o và AB, do khoa

^ Huyết học và truyền máu, Bệnh viện Bạch mai

n cung cấp Máu được chống đông bằng ACD (Acid

Citric-Natricitrate-Dectoxandre) Hồng cầu trước khi dùng làm thí nghiệm được rửa sạch bằng nước muối sinh lý (0,9 %) và pha loãng 2 hay 4 % trong nước muối sinh lý (NaCI = 0,9%)

- Các hoá chất khác dùng dưới dạng sạch phân tích (pa) do các hãng Sigma, Merk, Serva, cung cấp

Đậu Trạch lai (Phaseolus sp.)

1.2 Phương pháp nqhiên cứu:

- Chiết rút tinh sạch và xác định tính chất của lectin đậu Trạch lai, theo những điều

mô tả của Nguyễn Quốc Khang [1],

- Xác định hoạt độ gây ngưng kết hồng cầu theo Gebauer [2],

- Xác định protein hoà tan theo Lowry với thuốc thử Phenol-Ciocalteur [3],

- Điện di trên gel-polyacrylam ide có và không có SDS theo Laemmli [4],

2 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN:

2.1 Sự có mặt của lectin trong hạt m ột sô giống đậu:

27

Để nghiên cứu lectin có hiệu quả, trước hết cẩn phải điều tra tìm kiếm đối tượng có lectin hàm lượng cao và có ý nghĩa Do đó, chúng tôi đã điều tra lectin ở một

số giống đậu thường gặp Kết quả điều tra được tóm tắt trong bảng 1.

Bảng 1 Hàm lượng protein và lectirt trong m ột sỏ giống đậu thường gặp

Potein Hoạt động chung

với các nhóm máu

Hoạt động riêng với các nhóm mau

Từ các dẫn liệu bảng 1 cho thấy: Đậu Trạch lai là giống đậu có hoạt động gây ngưng kết hồng câu nhóm máu A và B là cao nhất và chưa có công ỉrình nào công bố

về giống đậu này Do đó, chúng tôi đã lựa chọn đậu này làm đối tượng cho những nghiên cứu tiếp theo

2.2 Tinh sạch lectin đậu Trạch lai:

'2.2.1 Thăm dò điều kiện chiết rút và thu nhận lectin:

Để chiết rút lectin từ hạt đậu Trạch lai và thu nhận có hiệu quả, chúng tôi đã thử nghiệm các bước sau: ảnh hưởng của pH, nồng động muối và chất kết tủa

a Ảnh hưởng của phi đến khả năng chiết rút lectin đậu Trạch lai:

M ồ i mẫu ỉg bột clạu Trạch lai, hoà và ngâm vào 10 m l dệììì phosphate 0,05 M có các

/;/-/ tương ứng lủ: 5,0 - 5,5 - 6,0 - 6,5 - 7,0 - 7,5 - 8,0 - 8,5 vù 9,0 qua đêm trong tủ lạnh Sau đó ly râm 3000 vòng/phítl trong 15 phut thu dịch Dịch thu được dem xác định hoạt (lộng xây ni’ifiii’ kết hống cầu các nhóm máu fii>ưừị Kết quả thu dược ghi tóm tắt trong bả nạ 2.

Bảng 2 Ảnh hưởng pH đến khả năng chiết rút lectin từ hạt đậu Trạch lai

bằng các nồng độ muối ăn them vào đệm có pH 7,0 như sau: 0,0% - 0,5% - 0,9% -

1,5 - 2,0 và 3,0% Các kẽt quả phân tích thu được tóm tắt trong hình 2

Hình 2 Ảnh hường nồng độ muối NaCI đến chiết rút và hoạt độ lectin hạt đậu Trạch lai (Phaseolus sp.)

Các dẫn liệu hình 2 cho thấy, khi nồng độ muối tăng lên từ 0,0% đến 2,0% làm tăng khả năng chiết rút và hoạt độ lectin từ hạt đậu Trạch lai Sau đó nồng độ muối tăng, nhưng khả năng chiết rút và hoạt độ lectin hầu như khôna tăng mà còn giảm đi chút It, nhât là ở các nhóm máu B và o Hiện tượng này có thể do nồng độ muôi tăng đã làm muối hoá lectin gây ra giảm tính tan và hoạt tính lectin

c Thăm dò khả năng kết tủa lectin đậu Trạch lai

Sử dụng dung dịch đệm phosphate 0,05 M, có pH 7,0 và 2% NaCI (đệm A) chiêt rút lectin từ đậu Trạch lai Dịch lectin thu được kết tủa bằng các chất ethanol 60%, aceton 60% và am monium-sulfate 60% bão hoà Ly tâm thu kết tủa, hoà tan vào đệm A và xác định hoạt động gây ngưng kết hổng Kết quả phân tích tóm tắt trên hình 3

29

I)Lt Dcta 'ĩcta Dace Tacc Dam Tam

ưu th ế hơn cả Do dó, clníniỊ lô i tlìử /Ií>hiệm kết tủa lectin (lậu Trạch la i hainỊ nồm; íỉộ

ac etone từ 30% - 40% - 45% - 50% - 55% - 60% - 65% - 70'7(' Kef quà phân lích trình hày trên hình 3 như sau:

Hinh 4 Phân chia protein và lectin trong dịch chiết đậu Trach lai phu thuộc nồng độ

Protein phần dịch, Ld= Lectin phần dịch, Pt-P rotein phẩn tủa và Lt= Lectin phần tủa

Từ hình 4 cho thấy, khi tăng nồng độ acetone từ 30 % đến 65 % thì protein và lectin trong dịch chiết giảm dần, ngược lại protein và lectin trong kết tủa lai tăng lên,