Chiết xuất collagen từ da cá basa (pangasius bocourti) và triển vọng ứng dụng bổ sung vào kem dưỡng da

Trong thành phần của da, collagen chiếm khoảng 70% cấu trúc da và được phân bố ở lớp hạ bì của da, tạo ra một hệ thống nâng đỡ, hỗ trợ các đặc tính cơ học của da như: sức căng, độ đàn hồ

Nha Trang, tháng 6 năm 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

––––––––

NGUYỄN THỊ LÀI

CHIẾT XUẤT COLLAGEN TỪ DA CÁ BASA

(Pangasius bocourti) VÀ TRIỂN VỌNG ỨNG DỤNG

BỔ SUNG VÀO KEM DƯỠNG DA

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC (Ngành: Công nghệ Kỹ thuật Hóa học)

Nha Trang, tháng 6 năm 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

––––––––

NGUYỄN THỊ LÀI

CHIẾT XUẤT COLLAGEN TỪ DA CÁ BASA

(Pangasius bocourti) VÀ TRIỂN VỌNG ỨNG DỤNG

BỔ SUNG VÀO KEM DƯỠNG DA

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC (Ngành: Công nghệ Kỹ thuật Hóa học)

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN:

TS TRẦN THỊ HOÀNG QUYÊN

Trường Đại học Nha Trang

Khoa: CNTP

Bộ Môn Hóa Học

Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

Cán bộ hướng dẫn: TS Trần Thị Hoàng Quyên

Tên đề tài: “Chiết xuất collagen từ da cá basa (Pangasius bocourti) và triển vọng

ứng dụng bổ sung vào kem dưỡng da”

Lớp: 55CNHH

Nội dung nhận xét:

Hình thức:

Nội dung:

Những vấn đề còn hạn chế:

Kết luận, kiến nghị và điểm:

………

Nha Trang, ngày 03 tháng 07 năm 2017

Cán bộ hướng dẫn

Ký tên

NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN

Tên đề tài: “Chiết xuất collagen từ da cá basa (Pangasius bocourti) và triển vọng

ứng dụng bổ sung vào kem dưỡng da”

Lớp: 55CNHH

Nội dung nhận xét:

Hình thức:

Nội dung:

Những vấn đề còn hạn chế:

Kết luận, kiến nghị và điểm:

Nha Trang, ngày 03 tháng 07 năm 2017

Cán bộ phản biện

Ký tên

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình thực hiện đề tài vì kinh nghiệm còn ít ỏi và kiến thức còn hạn chế nên em đã gặp rất nhiều khó khăn, nhưng bên cạnh những khó khăn gặp phải thì em cũng nhận được rất nhiều sự động viên, ủng hộ, giúp đỡ từ bạn bè, thầy cô Chính những tình cảm tốt đẹp ấy, đã giúp em hoàn thành đề tài nghiên cứu của mình và có được những kinh nghiệm, kiến thức mới hữu ích cho bản thân Nay

em xin gởi lời cảm ơn chân thành nhất tới:

Ban Giám Hiệu trường Đại học Nha Trang, Lãnh đạo Khoa Công nghệ Thực phẩm cùng tất cả Quý Thầy Cô trong Bộ môn Công nghệ Kỹ thuật Hóa học đã tận tình truyền đạt cho em những kiến thức, kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình học tập và rèn luyện tại Trường

Em cảm ơn đến các Cán bộ quản lý Phòng thí nghiệm khu Công Nghệ Cao, các phòng thí nghiệm Hóa, các Khoa, Phòng Ban chức năng đã giúp đỡ, tạo điều kiện trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu đề tài

Đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới GV TS Trần Thị Hoàng Quyên, GV.TS Phan Vĩnh Thịnh đã quan tâm giúp đỡ, tận tình hướng dẫn em hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp này trong thời gian qua

Xin cảm ơn các bạn lớp 55CNHH đã giúp đỡ, chia sẻ, đóng góp ý kiến Cảm

ơn gia đình đã luôn bên cạnh ủng hộ, quan tâm, giúp đỡ trong suốt thời gian làm

đề tài

Do điều kiện thời gian cũng như kinh nghiệm còn hạn chế nên không tránh khỏi thiếu sót, em rất mong nhận được sự góp ý từ Quý Thầy Cô cùng các bạn để đề tài của em được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Sinh viên ký tên

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN 1

MỤC LỤC ii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC HÌNH viii

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 4

1.1 Tổng quan về collagen 4

1.1.1 Giới thiệu sơ lược về collagen 4

1.1.2 Các nguồn thu nhận collagen 5

1.1.3 Cấu trúc của collagen 6

1.1.3.1 Cấu trúc phân tử của collagen 6

1.1.3.2 Cấu trúc dạng sợi của collagen 7

1.1.4 Phân loại collagen 8

1.1.5 Tính chất của collagen 8

1.1.5.1 Tác dụng với nước 8

1.1.5.2 Tác dụng với axit và kiềm 9

1.1.5.3 Sự biến tính collagen 10

1.1.5.4 Tính kỵ nước của collagen 11

1.1.5.5 Tính chất của dung dịch keo 11

1.1.6 Ứng dụng của collagen 12

1.1.6.1 Trong y học và dược phẩm 12

1.1.6.2 Trong công nghiệp mỹ phẩm 13

1.1.6.3 Trong sản xuất kẹo 13

1.1.6.4 Trong công nghiệp sản xuất sữa và các sản phẩm từ sữa 14

1.1.6.5 Trong công nghiệp sản xuất đồ uống 15

1.1.6.6 Trong công nghiệp nhiếp ảnh 15

1.2 Tổng quan về cá basa 15

1.2.1 Sơ lược về cá basa 15

1.2.2 Đặc điểm sinh trưởng, sinh lý của cá basa 16

1.2.3 Các sản phẩm được chế biến từ cá basa 17

1.3 Tình hình nghiên cứu collagen trên thế giới và ở Việt Nam 17

1.3.1 Tình hình nghiên cứu collagen trên thế giới 17

1.3.2 Tình hình nghiên cứu collagen ở Việt Nam 21

1.4 Tổng quan về kem dưỡng da bổ sung collagen 22

1.4.1 Tổng quan về tác dụng làm chậm quá trình lão hóa của kem dưỡng da và quá trình lão hóa da 22

1.4.2 Tổng quan về kem dưỡng da có bổ sung collagen 24

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Đối tượng nghiên cứu 26

2.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 26

2.2.1 Hóa chất 26

2.2.2 Dụng cụ 26

2.2.3 Thiết bị 26

2.3 Phương pháp nghiên cứu 27

2.3.1 Quy trình chiết collagen từ da cá basa 27

2.3.1.1 Xử lý nguyên liệu 28

2.3.1.2 Quá trình khử béo 28

2.3.1.3 Quá trình khử khoáng 29

2.3.1.4 Quá trình khử màu, khử mùi 30

2.3.1.5 Chiết collagen 30

2.3.1.6 Lọc dịch 31

2.3.1.7 Kết tủa 31

2.3.1.8 Lọc kết tủa, ly tâm 31

2.3.1.9 Tinh sạch bằng phương pháp thẩm tích 31

2.3.1.10.Đông khô 33

2.3.2 Xác định một số thành phần và tính chất collagen 33

2.3.2.1 Xác định hàm lượng ẩm trong collagen 33

2.3.2.3 Xác định hàm lượng khoáng (tro) trong collagen 34

2.3.2.4 Xác định khối lượng phân tử collagen bằng phương pháp đo độ nhớt 34

2.3.2.5 Xác định khối lượng phân tử collagen bằng phương pháp sắc ký lọc gel 35

2.3.2.6 Xác định thành phần axit amin trong collagen bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 35

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37

3.1 Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình loại béo 37

3.1.1 Nồng độ NaOH loại béo 37

3.1.2 Thời gian loại béo sử dụng NaOH nồng độ 0,2 M 38

3.2 Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình khử khoáng 39

3.2.1 Dung môi khử khoáng 39

3.2.2 Thời gian loại khoáng với axit citric 41

3.3 Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình khử màu, khử mùi 42

3.3.1 Nồng độ H2O2 khử màu, khử mùi 42

3.3.2 Thời gian khử màu, khử mùi 43

3.4 Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết collagen 45

3.4.1 Nồng độ axit axetic dùng để chiết collagen bằng phương pháp không sử dụng pepsin 45

3.4.2 Tỷ lệ da cá/enzym để chiết collagen bằng phương pháp axit axetic 0,5 M kết hợp với enzym pepsin 46

3.4.3 Thời gian chiết collagen 47

3.5 Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình kết tủa dịch lọc thu

được sau quá tình chiết 47

3.5.1 Nồng độ NaCl dùng để kết tủa dịch lọc 47

3.5.2 Thời gian kết tủa dịch lọc với nồng độ NaCl 2,5 M 48

3.6 Quy trình thu nhận collagen tối ưu sau quá trình khảo sát 49

3.7 Kết quả phân tích collagen thu được từ da cá basa 51

3.7.1 Hàm lượng ẩm, khoáng trong collagen 51

3.7.2 Kết quả hình ảnh chụp kính hiển vi điện tử quét (SEM) cho biết cấu trúc collagen 51

3.7.3 Thành phần axit amin trong collagen thu được từ da cá basa 53

3.7.4 Xác định khối lượng phân tử bằng phương pháp đo độ nhớt sử dụng nhớt kế Ostwald 55

3.7.5 Xác định khối lượng phân tử của collagen bằng phương pháp sắc ký lọc gel 57

3.8 Ứng dụng thử nghiệm bổ sung collagen vào kem dưỡng trắng da 58

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 62

TÀI LIỆU THAM KHẢO 63

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Khảo sát nồng độ NaOH loại béo 37

Bảng 3.2 Khảo sát thời gian loại béo với NaOH 0,2 M 39

Bảng 3.3 Khảo sát nồng độ HCl khử khoáng 39

Bảng 3.4 Khảo sát nồng độ H2SO4 để loại khoáng 40

Bảng 3.5 Khảo sát nồng độ axit citric để khử khoáng 40

Bảng 3.6 Khảo sát thời gian tối ưu loại khoáng bằng axit citric nồng độ 0,003 M 41

Bảng 3.7 Khảo sát nồng độ H2O2 loại màu, mùi 43

Bảng 3.8 Khảo sát thời gian loại màu, loại mùi bằng H2O2 1% 43

Bảng 3.9 Khảo sát nồng độ axit axetic để chiết collagen 45

Bảng 3.10 Khảo sát tỷ lệ enzym/da cá tối ưu để chiết collagen 46

Bảng 3.11 Khảo sát thời gian chiết collagen tối ưu 47

Bảng 3.12 Khảo sát nồng độ NaCl để thu lượng tủa nhiều nhất 47

Bảng 3.13 Khảo sát thời gian kết tủa tối ưu 48

Bảng 3.14 Thành phần hóa học trong collagen thu từ da cá basa 51

Bảng 3.15 Thành phần axit amin trong collagen thu từ da cá basa 53

Bảng 3.16 Thời gian chảy của dung dịch và độ nhớt riêng 55

Bảng 3.17 Tín hiệu thu được của quá trình sắc ký 57

Bảng 3.18 Thành phần hóa chất để phối trộn kem 60

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình ảnh cấu trúc xoắn ba của collagen 7

Hình 1.2 Cấu trúc sợi của collagen 8

Hình 1.3 Hình ảnh cá basa 16

Hình 2.1 Quy trình chiết collagen 28

Hình 2.2 Hình ảnh mô tả quá trình thẩm tích 33

Hình 3.1 Da cá loại béo bằng NaOH những nồng độ khác nhau trong 20 h 37

Hình 3.2 Da cá ngâm NaOH với nồng độ 0,2 M và thời gian ngâm 20 h 39

Hình 3.3 Khảo sát nồng độ axit citric khác nhau để loại khoáng trong 30 phút 41

Hình 3.4 Da cá đã được loại khoáng bằng axit citric nồng độ 0,003 M trong 30 phút 42

Hình 3.5 Khảo sát nồng độ H2O2 khử màu, khử mùi ở những nồng độ khác nhau 43

Hình 3.6 Da cá được loại màu, mùi bằng H2O2 với nồng độ 1% thời gian ngâm 3 h 44

Hình 3.7 Phân loại da cá sau khử màu, khử mùi 44

Hình 3.8 Chiết collagen bằng axit axetic với những nồng độ khác nhau sau 24 h 45

Hình 3.9 Da cá sau khi chiết bằng axit axetic 0,5 M và enzym pepsin 1% trong thời gian 24 h 46

Hình 3.10 Dịch lọc thu được sau quá trình chiết 48

Hình 3.11 Kết tủa thu được bằng NaCl 2,5 M, thời gian kết tủa 24 h 49

Hình 3.12 Sơ đồ quy trình thu nhận collagen tối ưu 50

Hình 3.13 Hình ảnh SEM của collagen thu được từ da cá basa 51

Hình 3.14 Hình ảnh SEM của cá biển 52

Hình 3.15 Ảnh SEM của cá tầm sông Amur 53

Hình 3.16 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của độ nhớt riêng vào nồng độ 56

Hình 3.17 Tín hiệu thu được từ quá trình sắc ký 57

Hình 3.18 Hình ảnh phóng to của sắc ký đồ 58

Hình 3.19 Nguyên liệu để khảo sát bổ sung collagen vào kem dưỡng da 59

Hình 3.20 Sản phẩm kem bổ sung collagen sau thời gian 2 tháng 59

LỜI MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Trong cuộc sống ngày nay với sự tiến bộ của khoa học công nghệ và sự phát triển của kinh tế, thì cái đẹp luôn được con người ta coi trọng Từ xa xưa thì collagen đã được xem là loại thần dược kéo dài tuổi thanh xuân vì collagen có hoạt tính chống oxy hóa tự nhiên Collagen được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực từ y học, mỹ phẩm, thực phẩm cho đến công nghệ máy ảnh, do đó, collagen dường như

đã xuất hiện phổ biến trong đời sống của con người Để bổ sung collagen cho da ngoài việc ăn uống hằng ngày thì các chiết xuất từ nguồn tự nhiên cũng là nguồn sử dụng an toàn, vừa tận dụng được nguồn tự nhiên và có thể tạo ra collagen có giá trị thực tế Hiện nay, các sản phẩm làm đẹp có chứa collagen rất phổ biến và đa dạng,

từ sữa rửa mặt, mặt nạ, kem dưỡng da cho đến viên uống bổ sung, thực phẩm chức năng chứa collagen,…

Trên thế giới, collagen được sản xuất từ phế thải của các quá trình chế biến

da, xương và thịt động vật Tùy thuộc vào nguyên liệu ban đầu mà người ta có phương pháp sản xuất khác nhau Ở Việt Nam, mặc dù đã có rất nhiều cơ sở công nghiệp nuôi, chế biến cá basa và cá tra với tổng sản lượng thịt cá xuất khẩu đạt hơn 30.000 tấn/năm, nhưng da cá thì xuất khẩu trực tiếp với giá rất rẻ (khoảng 2–3 triệu đồng/tấn cấp đông), còn phế liệu vụn và ruột cá chỉ làm thức ăn gia súc hoặc phân bón Việt Nam vẫn phải nhập khẩu một số lượng lớn các loại collagen để đáp ứng nhu cầu của các ngành thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm trong nước

Để tận dụng nguồn phế thải da cá từ quá trình phi lê cá basa thì cần có một hướng nghiên cứu giải quyết vấn đề này nhằm đem lại giá trị kinh tế cao Nên tôi chọn đề tài nghiên cứu thu nhận collagen tinh sạch từ da cá basa Từ sản phẩm collagen được chiết xuất từ da cá basa thử nghiệm triển vọng ứng dụng bổ sung kem dưỡng da

2 Mục tiêu đề tài

- Thu collagen tinh khiết từ da cá basa (khoáng < 1%, độ ẩm < 10%)

- Xác định được một số đặc tính của collagen: thành phần axit amin, khối lượng phân tử, hình ảnh SEM cho biết cấu trúc của collagen

- Thử nghiệm triển vọng bổ sung collagen vào kem dưỡng da

3 Nội dung nghiên cứu

- Chiết xuất collagen từ da cá basa bằng phương pháp chiết sử dụng axit axetic kết hợp enzym pepsin

- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết collagen (nồng độ NaOH loại béo; nồng độ axit citric khử khoáng; nồng độ H2O2 khử màu, khử mùi; nồng độ axit axetic để chiết collagen; tỷ lệ enzym pepsin/da cá; nồng độ NaCl kết tủa) nhằm tối ưu quá trình chiết

- Nghiên cứu một số đặc tính của collagen thu được (hàm lượng khoáng, hàm lượng ẩm, xác định khối lượng phân tử, thành phần axit amin, hình thái cấu trúc qua hình ảnh chụp SEM)

- Thử nghiệm triển vọng bổ sung collagen vào kem dưỡng da đã được phối trộn sẵn

4 Phương pháp nghiên cứu

- Chiết collagen bằng phương pháp chiết ngâm dầm

- Xác định hàm lượng ẩm, khoáng bằng phương pháp sấy, nung

- Xác định khối lượng phân tử bằng phương pháp sắc ký lọc gel

- Xác định thành phần axit amin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

- Tinh sạch collagen bằng phương pháp thẩm tích sử dụng đệm photphat

- Thử nghiệm bổ sung collagen vào kem dưỡng da bằng phương pháp đồng hóa

5 Đối tượng nghiên cứu

Da cá basa (Pangasius bocourti) được thu mua sau quá trình phi lê ở siêu thị

Lotte Mart Nha Trang, phường Phương Sơn, thành phố Nha Trang Lựa chọn những con cá có kích thước gần bằng nhau khoảng 1,82,0 kg Lọc lấy da, cạo bỏ hết phần thịt và bảo quản đông

6 Khoa học và thực tiễn của đề tài

Nghiên cứu này đưa ra được quy trình chiết xuất collagen tinh sạch từ cá

basa (Pangasius bocourti) nuôi ở Đồng Bằng Sông Cửu Long, Việt Nam với điều

kiện tối ưu nhất cho hiệu suất cao và chỉ ra được triển vọng bổ sung collagen vào các sản phẩm chăm sóc da

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN1.1 Tổng quan về collagen

1.1.1 Giới thiệu sơ lược về collagen

Từ "collagen" có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp 'Kolla’ nghĩa keo và ‘genos’ là hình thành [11]. Collagen là một dạng đặc biệt của protein, collagen là protein chính của mô liên kết trong động vật và các protein có nhiều nhất trong động vật có vú Chiếm khoảng 25% đến 35% protein toàn thân Collagen chiếm 1% đến 2% của mô

cơ, và chiếm 6% tính theo trọng lượng gân, cơ bắp [12] Nó là thành phần chính của các mô liên kết giúp các tế bào liên kết lại với nhau [1] Collagen cung cấp cho các

mô liên kết những đặc tính nổi trội nhờ vào sự hiện diện rộng khắp và sự sắp xếp mang tính cấu trúc của nó Nó phân bố khắp nơi trong cơ thể, từ chỗ gân nối bắp chân với gót chân cho tới giác mạc Trong thành phần của da, collagen chiếm khoảng 70% cấu trúc da và được phân bố ở lớp hạ bì của da, tạo ra một hệ thống nâng đỡ, hỗ trợ các đặc tính cơ học của da như: sức căng, độ đàn hồi, duy trì độ ẩm,… Nó đóng vai trò kết nối tế bào, kích thích quá trình trao đổi chất, tạo độ đàn hồi cho da Sự suy giảm về số lượng và chất lượng collagen sẽ dẫn đến hậu quả lão hóa của cơ thể mà sự thay đổi trên da tay, da chân, khuôn mặt là dấu hiệu dễ nhận biết nhất: làn da bị khô, nhăn nheo bắt đầu từ các đường nhăn mảnh trên khóe mắt, khóe miệng, lâu dần thành nếp nhăn sâu, các đường nét khuôn mặt bị chùng nhão và chảy xệ Tùy theo độ tuổi, điều kiện sống và tác động của môi trường, da có thể bị lão hóa hoặc tổn thương, khi đó sợi collagen sẽ mất dần tính đàn hồi và săn chắc do cấu trúc collagen bị phá hủy Chính vì vậy, collagen đóng vai trò là một trong những chất quan trọng hàng đầu của ngành mỹ phẩm, đặc biệt là chăm sóc da, phẫu thuật thẩm mỹ, phẫu thuật bỏng,…[17]

Có thể nói, mất collagen là một trong những yếu tố quan trọng tạo nên sự già nua không chỉ ở dáng vẻ bên ngoài mà còn ở việc suy giảm cấu trúc và chức năng

của các cơ quan trong cơ thể Sự linh hoạt của nó là nhờ vào cấu trúc bậc phức tạp, tạo nên sự đa dạng trong tính chất nhằm phục vụ những chức năng nhất định [18]

1.1.2 Các nguồn thu nhận collagen

Hầu hết các collagen có nguồn gốc từ da bò và lợn Do sự bùng phát của dịch bệnh động vật nhất định như bò điên, chân và các bệnh miệng đã gây ra những hạn chế về việc sử dụng collagen động vật do có một khả năng của các bệnh lây truyền qua cho con người [11] Ngoài ra, người Hồi giáo và người Do Thái không chấp nhận bất kỳ sản phẩm thực phẩm lợn liên quan, trong khi người Hindu không tiêu thụ các sản phẩm trên [11] Do đó, các nhà khoa học đang tập trung vào nghiên cứu

để tìm ra nguồn collagen thay thế và collagen cá được coi là sự thay thế tốt nhất vì tiện lợi cao của nó, không có nguy cơ lây truyền bệnh và không có rào cản tôn giáo [12] Chất thải chế biến cá, bởi đánh bắt chưa sử dụng cũng như các loài cá sử dụng đúng mức, là những yếu tố hứa hẹn cho việc khai thác các collagen cá Phế thải chế biến cá thường bao gồm da, xương, vảy và vây Ấn Độ tạo ra hơn 2 triệu tấn chất thải mỗi năm từ hoạt động chế biến cá Chất thải chế biến từ cá nhiều khoảng 7085% tổng trọng lượng của đánh bắt Chúng thường được đổ vào đất hoặc kéo vào đại dương Xử lý các chất thải cũng đặt ra vấn đề môi trường cho chế biến thủy sản [11] Việt Nam là nước đang phát triển, có nền nông nghiệp với các sản phẩm phong phú Trong đó, các sản phẩm từ cá chiếm một phần lớn trong kim ngạch xuất khẩu Những năm gần đây, việc nuôi cá da trơn (cá tra, cá basa,…) rất phát triển, đặc biệt ở Đồng bằng sông Cửu Long Trong quá trình chế biến cá, bên cạnh những chính phẩm dùng cho việc xuất khẩu là một khối lượng lớn các phụ phẩm như: da, xương, vây,… Đây là những nguồn giàu collagen, có thể sử dụng thay thế cho những nguồn cung cấp collagen trước kia như da, xương từ bò, lợn Việc sử dụng những phế phẩm này góp phần làm tăng kinh tế của các loài cá da trơn ở nước ta

Trong số những nguồn thay thế, cá cung cấp nguồn nguyên liệu tốt nhất vì:

- Dễ tìm, có sẵn trong tự nhiên [11]

- Không liên quan với nguy cơ bệnh bò điên (BSE) bùng phát [12]

- Collagen cá là chấp nhận được đối với Hồi giáo và với hạn chế tối thiểu cho

Do Thái giáo [12]

- Có khả năng thu nhận được collagen với hiệu suất cao [11]

- Giải quyết được vấn đề ô nhiễm môi trường do chất thải từ quá trình chế biến cá

- Phù hợp hơn cho làn da của con người hơn collagen từ chăn nuôi và gia cầm Cho đến nay, hầu hết các loại mỹ phẩm trên nền collagen đều có chứa protein chiết xuất từ gia súc Nhưng do sự bộc phát của các loại bệnh nên collagen

từ gia súc đang dần rút khỏi phạm vi sử dụng, thay vào đó là nguồn collagen được trích từ cá, đặc biệt là da cá trơn Nguồn collagen được chiết tách từ nguồn nguyên liệu này có nhiều đặc điểm tốt hơn cho việc ứng dụng trong thực phẩm, y học và mỹ phẩm Trong công nghệp sản xuất mỹ phẩm, mỹ phẩm trên nền collagen từ gia súc

có tốc độ hấp thụ rất chậm trên da người Nhưng nguồn collagen trích ly từ cá thì hấp thu hoàn toàn trên da người Vì cá sống trong phạm vi lớn với các điều kiện về nhiệt độ, độ sâu và áp suất khác nhau Điều này có nghĩa là collagen trích từ da cá

có một sức chống chịu đặc biệt với các phá hủy lý và hóa học [12]

1.1.3 Cấu trúc của collagen

1.1.3.1 Cấu trúc phân tử của collagen

Collagen có kết cấu rất phức tạp Tropocollagen hay «phân tử collagen» là một đơn vị lớn hơn của collagen, nó dài khoảng 300 nm với đường kính 1,5 nm, tạo thành bởi ba chuỗi polypeptit, mỗi chuỗi này đều được sắp xếp theo một đường xoắn ốc phía tay trái (hình 1.1)

Ba chuỗi xoắn ốc được cuộn cùng nhau chiều thuận tay phải, «đường xoắn

ốc đặc biệt» hoặc đường xoắn ốc bộ ba, một cấu trúc bậc bốn được ổn định bởi nhiều liên kết hydro Một đặc điểm đặc trưng của collagen là sự sắp xếp đều đặn của các axit amin trong mỗi chuỗi mắt xích của từng chuỗi xoắn ốc collagen này Thông thường, các chuỗi theo mẫu sau: Gly-Pro-Y hoặc Gly-X-Hyl, ở đây X và Y

là các axit amin còn lại

Hình 1.1 Hình ảnh cấu trúc xoắn ba của collagen [20]

- Proline hoặc hydroxyproline tạo nên khoảng 1/6 tổng số chuỗi

- Glycine chiếm 1/3 số chuỗi, điều này có nghĩa là khoảng nửa chuỗi collagen không chứa glycine, proline hoặc hydroxyproline, các nhóm GXY khác thường trong các chuỗi peptit collagen anpha Sự phân bố đều đặn với hàm lượng glycine cao được tìm thấy ở một số ít loại protein dạng sợi, như sợi tơ tằm Chiếm từ 7580% của tơ tằm là: Gly-Ala-Gly-Ala với 10% serine [20]

1.1.3.2 Cấu trúc dạng sợi của collagen

Phần lớn collagen trong mạng lưới ngoại bào được tìm thấy ở dạng sợi, bao gồm những sợi mảnh, nhỏ Thông qua quá trình tạo sợi, các phân tử collagen tổ hợp với nhau hình thành nên các vi sợi bao gồm từ 48 phân tử collagen hoặc với số lượng nhiều hơn sẽ tạo thành các sợi Những sợi này có đường kính từ 10500 nm tùy thuộc vào loại mô và giai đoạn phát triển Các sợi collagen sẽ thiết lập nên các sợi lớn hơn và cao hơn nữa là các bó sợi [17]

Sợi collagen là các tổ hợp có cấu trúc bán kết tinh của các phân tử collagen Các vi sợi kết hợp tạo nên sợi lớn hơn Các sợi lớn hơn sẽ kết hợp với nhau tạo thành những bó sợi collagen Các sợi collagen được sắp xếp với những cách thức kết hợp và mức độ tập trung khác nhau để cung cấp đặc tính khác nhau của mô (hình 1.2) [17]

Các chuỗi collagen sắp xếp song song theo chiều dọc tạo thành các sợi với tính chu kì nhất định Chúng được sắp xếp so le nhau một khoảng 67 nm và có một khoảng trống 40 nm giữa những phân tử liền kề nhau [1]

Hình 1.2 Cấu trúc sợi của collagen [12]

Nhờ vào cấu trúc có thứ bậc, độ bền vốn có của các chuỗi xoắn ốc được chuyển sang các sợi collagen, tạo cho các mô có độ cứng, độ đàn hồi và những đặc tính cơ học riêng biệt [17]

1.1.4 Phân loại collagen

Collagen tồn tại ở nhiều bộ phận trong cơ thể Đã có 29 loại collagen được tìm thấy và công bố trong các tài liệu khoa học Sự đa dạng của loại collagen (collagen I, II, III) chủ yếu được xác định bởi sự tồn tại của một số axit amin với số lượng axit amin khác nhau

- Collagen loại I: có trong da, gân, mạch máu, các cơ quan, xương (thành phần chính của xương) Là chất dồi dào nhất trong cơ thể người Nó tạo thành hơn 90% khối lượng xương cơ bản và nó là collagen chính của dây chằng, giác mạc và nhiều

mô liên kết [4]

- Collagen loại II: có trong sụn xương (thành phần chính của sụn)

- Collagen loại III: da, vách mạch, các sợi tế bào của hầu hết các mô (phổi, gan, lá lách, ) [4]

- Collagen loại IV: thành phần chính cấu tạo màng tế bào [4]

- Collagen loại V: phổi, giác mạc, tóc, màng trong bào thai và xương [4] Các bệnh về collagen thường do sự khiếm khuyết của collagen gây nên tác động cho quá trình tổng hợp sinh hóa, sự sắp xếp, sự sao chép bị thay đổi, hoặc các quá trình khác trong việc hình thành của collagen [20]

1.1.5 Tính chất của collagen

1.1.5.1 Tác dụng với nước

Collagen không hòa tan trong nước mà nó trương nở trong nước, nguyên nhân

là do tương tác giữa các mạch polypeptit làm cho phân tử có những vùng kỵ nước và vùng phân cực mang điện tích sẽ tạo nên khả năng háo nước làm trương nở collagen

Cứ 100 g collagen khô có thể hút được khoảng 200 g nước Collagen kết hợp với nước, trương nở trong nước, độ dày tăng lên chừng 25% nhưng độ dày tăng lên không đáng

kể, tổng thể tích của phân tử collagen tăng lên 23 lần Do nước phân cực tác dụng liên kết phối trí của collagen làm giảm tính vững chắc của sợi collagen từ 34 lần Khi nhiệt độ tăng cao, tính hoạt động của mạch polypeptit tăng mạnh, làm cho mạch bị yếu

và bắt đầu đứt thành những mạch polypeptit tương đối nhỏ [17]

1.1.5.2 Tác dụng với axit và kiềm

Collagen có thể tác dụng với axit và kiềm, do trên mạch của collagen có gốc cacboxyl và amin Hai gốc này quyết định hai tính chất của nó Trong điều kiện có axit tồn tại, ion của nó tác dụng với gốc amin, điện tích trên cacboxyl bị ức chế (hình thành axit yếu có độ ion hóa thấp) Trái lại gốc amin bị ion hóa tạo NH3  [17]

Môi trường H+

Môi trường OH

Trong điều kiện có nước, nước có thể tác dụng với nhóm gốc có mang điện trong kết cấu protit và những ion Na+, Cl hình thành tác dụng hợp nước phụ của collagen, khiến collagen trong môi trường axit, kiềm có độ hút nước cao hơn trong nước nguyên chất Ngoài ra, axit và kiềm có thể làm cho collagen biến đổi như sau:

- Cắt đứt mạch muối (liên kết giữa – NH3 …COO) làm đứt mạch peptit trong mạch chính

- Làm đứt liên kết hydrogen giữa gốc –CO…NH của mạch xung quanh nó

- Làm axit amin bị phân hủy giải phóng amoniac [17]

Theo kết quả nghiên cứu tác dụng của vôi đối với collagen có thể làm tăng

độ phân giải của nó rất mạnh, trong điều kiện nhiệt độ thường thời gian dài có thể xúc tiến sự phân giải của collagen lúc nhiệt độ tăng lên hoặc xử lý bằng kiềm thì độ phân giải tăng lên [17]

Trong môi trường axit dưới tác dụng của nhiệt độ collagen có thể phân giải biến thành gelatin theo phản ứng:

C102H149N31O38 + H2O C102H151N31O39

Ngoài ra, collagen trong dung dịch muối trung tính cùng với gốc –COOH và

NH2 tạo thành các hợp chất muối Tác dụng phân giải collagen của NaCl so với

Na2SO4 mạnh hơn (do độ điện ly của NaCl lớn hơn)

1.1.5.3 Sự biến tính collagen

Dưới tác dụng của các chất hóa học như axit, bazơ, muối, các dung môi như rượu, các tác nhân vật lý như khuấy trộn cơ học, nghiền, tia cực tím,… Cấu trúc xoắn bậc ba của collagen bị biến đổi làm cho các liên kết hydro, các liên kết ion bị

to,xt

phá vỡ nhưng không phá vỡ được liên kết peptit, tức là cấu trúc bậc một vẫn giữ nguyên

Sau khi bị biến tính collagen thường có các tính chất sau [17]:

- Độ hòa tan giảm do làm lộ các nhóm kỵ nước vốn ở bên trong phân tử protein Tức là khi collagen chưa biến tính, các axit amin có các nhóm kỵ nước nằm bên trong phân tử collagen Khi bị biến tính, phân tử collagen lúc này chỉ là trình tự sắp xếp các axit amin mạch thẳng, làm cho các nhóm kỵ nước lộ ra nên độ hòa tan

cả collagen giảm đi

- Khả năng giữ nước giảm, cấu trúc bậc bốn giúp cho collagen có khả năng hydrat tạo thành màng hydrat bao quanh Khi biến tính mất đi cấu trúc bậc bốn thì khả năng hydrat hóa không còn, vì thế nên collagen giữ nước kém

- Hoạt tính sinh học ban đầu mất đi Do hoạt tính sinh học của một protein được quyết định bởi các cấu trúc bậc hai, bậc ba và bậc bốn Khi cấu trúc này mất

đi, protein chỉ là các polypeptit, và không có hoạt tính sinh học

- Tăng độ nhạy đối với sự tấn công của enzym proteaza do làm xuất hiện các liên kết peptit đối với trung tâm hoạt động của proteaza

- Tăng độ nhớt nội tại

- Mất khả năng kết tinh, collagen có khả năng kết tinh trong các môi trường muối hoặc cồn Ở các điều kiện pH nhất định dung dịch collagen không bền và kết tinh gọi là pH đẳng điện Khi bị biến tính điểm đẳng điện của protein không còn và chúng khó có thể kết tinh

1.1.5.4 Tính kỵ nước của collagen

Do các gốc kỵ nước của axit amin trong chuỗi polypeptit của collagen hướng ra ngoài, các gốc này liên kết với nhau tạo liên kết kỵ nước Độ kỵ nước có thể giải thích

là do các axit amin có chứa gốc R không phân cực nên nó không có khả năng tác dụng với nước Tính kỵ nước sẽ ảnh hưởng rất nhiều đến tính tan của collagen [17]

1.1.5.5 Tính chất của dung dịch keo

Khi hòa tan protein thành dung dịch keo thì nó không đi qua màng bán thấm Hai yếu tố đảm bảo độ bền của dung dịch keo là [17]:

- Sự tích điện cùng dấu của các protein

- Lớp vỏ hydrat bao quanh phân tử protein

- Khi dung dịch keo không bền, sẽ có hai dạng kết tủa: kết tủa thuận nghịch và kết tủa không thuận nghịch

+ Kết tủa thuận nghịch: sau khi chúng loại bỏ các yếu tố gây kết tủa thì protein vẫn có thể trở lại trạng thái dung dịch keo bền như ban đầu

+ Kết tủa không thuận nghịch: sau khi chúng ta loại bỏ các yếu tố gây kết tủa thì protein không trở về trạng thái dung dịch keo bền vững như trước nữa

- Tính chất hydrat hóa của collagen Trong quá trình hydrat hóa, protein tương tác với nước qua các nối peptit hoặc các gốc R ở mạch bên nhờ liên kết hydro Khi nhiệt độ tăng thì khả năng giữ nước của collagen giảm do làm giảm các liên kết hydro

1.1.6 Ứng dụng của collagen

Collagen được ứng dụng rộng rãi trong da, công nghiệp điện ảnh, dược phẩm, mỹ phẩm và vật liệu y sinh và thực phẩm Là một phần quan trọng của cơ thể (25% tổng lượng protein trong cơ thể), tầm quan trọng của collagen trong đời sống

là rất đa dạng Ngày nay, những ứng dụng từ collagen được khai thác rất tốt đáp ứng nhu cầu của con người, phục vụ tốt hơn mức sống ngày càng tăng của con người Trong tương lai, với sự tiến bộ của khoa học và công nghệ hi vọng sẽ tạo ra

ra nhiều sản phẩm từ collagen giúp cải thiện đời sống con người [21]

1.1.6.1 Trong y học và dược phẩm

Collagen là một vật liệu có khả năng phân hủy sinh học, tác dụng của collagen dựa trên sự kết hợp khả năng tạo màng và tạo gel một cách tự nhiên Collagen được sử dụng lĩnh vực y dược có mùi và vị trung hòa, không gây dị ứng

và được hấp thụ hoàn toàn trong cơ thể con người, có tính tương thích sinh học cũng như khả năng cầm máu nên có thể được chế tạo thành những dạng khác nhau,

là một loại vật liệu sinh học lý tưởng cho việc sản xuất các sản phẩm y học

Các đặc tính kỹ thuật của collagen được ứng dụng trong công nghệ dược phẩm [21]:

- Là một chất keo bảo vệ các thành phần nhạy cảm khỏi tác động của sự oxy hóa ánh sáng, sự hấp thụ ẩm, tạo mùi vị trung hòa, là chất ổn định của hệ nhũ tương, huyền phù Collagen được hấp thụ dễ dàng vào trong cơ thể và không gây dị ứng Ứng dụng một số đặc tính này người ta dùng collagen trong công nghệ sản xuất bao thuốc uống.

- Là chất tạo bọt và ổn định trong quá trình sản xuất chất bọt cầm máu Đặc tính này dùng để làm chất cầm máu, hàn gắn vết thương,…

- Có thể sử dụng làm chất thay thế máu tạm thời (plasma expander) giúp thay thế lượng máu đã mất, phục hồi lại thể tích máu và duy trì mức áp suất thích hợp, thành phần “Plasma expander” có chứa khoảng 3,55,5% collagen

- Đặc biệt, trong kỹ thuật nội soi và phẫu thuật thẩm mỹ, dịch thủy phân collagen được ứng dụng để bôi vào các ống nội soi, có tác dụng bôi trơn, vì thế các bác sĩ dễ dàng đưa các ống này vào cơ thể bệnh nhân mà không gây đau Sau thời gian từ 4060 phút, collagen sẽ tan trong cơ thể bệnh nhân mà không gây hại gì và

vì collagen còn là một polyme tự nhiên tạo cấu trúc cho da nên nó được dùng trong phẫu thuật tạo hình như bơm môi, căng da mặt,

1.1.6.2 Trong công nghiệp mỹ phẩm

Collagen có tác dụng chống lão hóa, ngăn ngừa và cải thiện nếp nhăn Khoảng 70% cấu trúc của da là collagen, phân bố chủ yếu ở lớp hạ bì của da Collagen tạo ra một hệ thống nâng đỡ, hỗ trợ các đặc tính cơ học của da như sức căng, độ đàn hồi, duy trì độ ẩm, làm cho da được mịn màng, tươi tắn và trẻ trung Collagen giúp duy trì độ ẩm tối ưu cho tế bào Ngoài ra, collagen còn được bổ sung vào một số sản phẩm dưỡng tóc để phục hồi tóc [21]

1.1.6.3 Trong sản xuất kẹo

Trong sản xuất kẹo, hai chỉ số quan trọng của dịch thủy phân collagen là chỉ

số Bloom và độ nhớt Tùy vào từng loại mà yêu cầu về hai chỉ số này khác nhau Chức năng của collagen là tạo nên sự bền bọt, tham gia tạo cấu trúc, độ dai của sản phẩm,…

Dịch thủy phân collagen được phân hạng và kiểm tra dựa vào cường độ được đặc trưng bằng chỉ số Bloom Chỉ số này càng cao thì độ bền gel của dịch thủy phân collagen càng lớn ở cùng một nồng độ Dịch thủy phân collagen có độ Bloom cao hay thấp được sử dụng trong các lĩnh vực khác nhau Những dịch thủy phân collagen có độ Bloom cao được sử dụng trong ứng dụng định hình sản phẩm.

Độ nhớt của collagen là một trong những yếu tố quan trọng trong công nghệ sản xuất bánh kẹo Độ nhớt của collagen có thể tác động đến quá trình cố định trong sản phẩm, đặc biệt là khi collagen có hàm lượng cao Chẳng hạn như đối với phương pháp tạo hình sử dụng khuôn tinh bột thì độ nhớt của collagen yêu cầu phải thấp để khối kẹo có thể chảy dễ dàng vào các khuôn, còn đối với phương pháp ép đùn thì độ nhớt của collagen phải cao để định hình cho sản phẩm [21]

1.1.6.4 Trong công nghiệp sản xuất sữa và các sản phẩm từ sữa

Dịch thủy phân collagen được sử dụng như một phụ gia tạo cấu trúc trong công nghiệp sữa và các sản phẩm từ sữa Chức năng của collagen trong sữa [21]:

- Tạo các mối liên kết với nước: collagen có khả năng trương nở để tạo liên kết gấp 5 lần khối lượng của chúng với nước Nó giúp ngăn cản sự rỉ nước trong các sản phẩm

- Củng cố cấu trúc cho các sản phẩm sữa: collagen không tạo phản ứng với các thành phần của sữa và phụ thuộc vào hàm lượng sử dụng, collagen có thể làm chặt cấu trúc, tạo lớp gel chắc từ dịch lỏng Ngoài ra, nó còn giúp ổn định các bọt khí của các sản phẩm từ sữa có bọt ở nhiệt độ thấp và ngăn cản sự hỏng cấu trúc cho sản phẩm trong suốt quá trình tồn trữ

- Collagen không mùi do đó không ảnh hưởng đến mùi vị của sản phẩm Nó không chịu sự tấn công của tác nhân oxy hóa, có khả năng ngăn cản sự biến tính và lưu giữ được mùi trái cây cho sản phẩm

- Collagen đóng vai trò như một chất keo làm nhiệm vụ bảo vệ sự đông tụ của sữa và casein Đồng thời khi có mặt một hàm lượng nhỏ của collagen trong các sản phẩm sữa thì cấu trúc của sản phẩm sẽ trở nên mềm mại hơn

- Trong các sản phẩm kem, dịch thủy phân colagen đóng vai trò của một tác nhân ổn định và nó có chức năng điều chỉnh độ nhớt của hỗn hợp, giúp bền vững hệ nhũ tương cho tới khi được sử dụng, ngăn cản sự biến tính trong quá trình bảo quản

- Đối với các sản phẩm sữa lên men có xử lý nhiệt, quá trình thanh trùng hay tiệt trùng cho các sản phẩm sữa lên men làm tăng thời gian bảo quản cho sản phẩm nhưng lại làm mất tính ổn định của cấu trúc sản phẩm Việc bổ sung hỗn hợp dịch thủy phân collagen và tinh bột trước khi thanh trùng sẽ giúp tạo cấu trúc tốt

1.1.6.5 Trong công nghiệp sản xuất đồ uống

Hiện nay, dịch thủy phân collagen được sử dụng phổ biến cho quá trình làm sạch rượu vang, bia và nước trái cây vì nó làm giảm độ đục, tăng giá trị cảm quan cho sản phẩm mà không ảnh hưởng tới hương vị của sản phẩm cuối cùng [21]

1.1.6.6 Trong công nghiệp nhiếp ảnh

Trong nhiếp ảnh, collagen là thành phần thiết yếu cho quá trình đông tụ và phát triển của dịch nhũ tương ảnh Là chất ổn định giữa thành phần gắn kết và hệ nhũ tương thuốc nhuộm Là tác nhân gắn kết trong quá trình sản xuất trong các giấy

in phun hiện nay Khả năng trương nở tốt và có tính bền vững cao

Là một phần quan trọng của cơ thể (25% tổng lượng protein trong cơ thể), tầm quan trọng của collagen trong đời sống là rất đa dạng Ngày nay, những ứng dụng từ collagen được khai thác rất tốt đáp ứng nhu cầu của con người, phục vụ tốt hơn mức sống ngày càng tăng của con người [21]

1.2 Tổng quan về cá basa

1.2.1 Sơ lược về cá basa

Cá basa, tên khoa học Pangasius bocourti, còn có tên gọi là cá giáo, cá sát bụng, là loại cá da trơn trong họ Pangasiidae có giá trị kinh tế cao Loài cá này là

thực phẩm quan trọng ở thị trường quốc tế Chúng thường được gắn nhãn ở Bắc

Mỹ và Úc với tên là "cá basa" hay "Pangasius bocourti" Cá basa được nuôi tập

trung tại nhiều nước trên thế giới như khu vực sông Chao Phraya của Thái Lan,… Ở Việt Nam, cá basa được nuôi để xuất khẩu với số lượng lớn chủ yếu ở Đồng bằng sông Cửu Long

Hình 1.3 Hình ảnh cá basa [19]

Về ngoại hình, cá basa rất dễ phân biệt đối với các loài khác trong họ cá tra Thân ngắn hình thoi, hơi dẹp bên, lườn tròn, bụng to tích lũy nhiều mỡ, chiều dài tiêu chuẩn bằng 2,5 lần chiều cao thân Đầu cá basa ngắn hơi tròn, dẹp đứng Miệng hẹp, chiều rộng của miệng ít hơn 10% chiều dài chuẩn, miệng nằm hơi lệch dưới mõm Dải răng hàm trên to rộng và có thể nhìn thấy được khi miệng khép lại, có 2 đôi râu, râu hàm trên bằng 1/2 chiều dài đầu, râu hàm dưới bằng 1/3 chiều dài đầu Răng trên xương khẩu cái là một đám có vết lõm sâu ở giữa và hai đám răng trên xương lá mía nằm hai bên Có 4046 lược mang trên cung mang thứ nhất, vây hậu môn có 3136 tia vây Răng vòm miệng với dải răng trên xương khẩu cái ở giữa và răng trên xương lá mía ở 2 bên Chiều cao của cuống đuôi hơn 7% chiều dài chuẩn Mặt lưng có màu nâu, mặt bụng có màu trắng [19]

1.2.2 Đặc điểm sinh trưởng, sinh lý của cá basa

Ở cá basa, thời kỳ cá giống cũng lớn khá nhanh, sau 60 ngày cá đạt chiều dài 810,5 cm, sau 78 tháng đạt thể trọng 400550 g, sau 1 năm đạt 7001.300 g Nghiên cứu về tăng trưởng cá basa cho thấy trong 2 năm đầu tiên cá tăng trưởng nhanh về chiều dài thân, càng về sau tốc độ này giảm dần Khi đạt đến một kích thước nhất định thì chiều dài thân hầu như ngừng tăng Ngược lại, trong 2 năm đầu tốc độ tăng trưởng về thể trọng chậm nhưng tăng dần về sau Nuôi trong bè sau 2 năm có thể đạt tới 2.500 g Trong tự nhiên đã gặp cỡ cá có chiều dài thân 0,5 m

Cá basa có tính ăn tạp thiên về thức ăn động vật, nhưng ít háu ăn và ít tranh mồi hơn cá tra Sau khi hết não hoàn, giai đoạn này cá ăn phù du động vật là chính

• Họ : Pangasiidae

• Giống: Pangasiidae

• Loài : P.bocourti

Khi cá ở giai đoạn lớn, cá basa cũng dễ dành thích nghi với các loại thức ăn từ động vật, thực vật, dễ kiếm như: hỗn hợp tấm, cám, rau quả, cá vụn và các phế phẩm nông nghiệp,… do đó rất thuận lợi cho việc nuôi cá trong bè [18]

1.2.3 Các sản phẩm được chế biến từ cá basa

Nguồn cá basa trong tự nhiên không thể đủ cung cấp cho chế biến công nghiệp mà chủ yếu được nuôi trong lồng bè Ngoài sử dụng ít trong thực phẩm ăn uống thì cá basa chủ yếu phục vụ cho công nghiệp

Trong công nghiệp, thì cá basa thường được chế biến dưới dạng phi lê đông lạnh chủ yếu để phục vụ cho thị trường xuất khẩu Hiện nay tình hình thị trường xuất khẩu cá basa vẫn chưa được ổn định nên cần điều chỉnh lại mục tiêu để ổn định ngành nghề và phát triển nghề nuôi cá này của Việt Nam [18]

Mỗi năm, sản lượng cá tra và cá basa có tổng sản lượng thịt cá xuất khẩu đạt hơn 30.000 tấn/năm, nhưng da cá thì xuất khẩu trực tiếp với giá rẻ (khoảng 23 triệu đồng/tấn cấp đông), còn phế liệu vụn và ruột cá chỉ làm thức ăn da súc hoặc phân bón [20]

1.3 Tình hình nghiên cứu collagen trên thế giới và ở Việt Nam

1.3.1 Tình hình nghiên cứu collagen trên thế giới

Cao H và Xu S (2007) thu nhận collagen loại II từ sụn xương ức gà Sụn xương ức gà đã được làm sạch để loại bỏ mô và rửa sạch với nước Các sụn được cắt thành những miếng nhỏ và khử chất béo với clorofom-metylic (2:1, v/v) Sau khi các mảnh mô được làm sạch với nước cất thì các phần cloroform không dùng đến được lưu trữ ở 20oC cho đến khi sử dụng Sau đó sụn xương ức đã được ly tâm

ở mức 10.000 rpm 10 phút sử dụng 1000 ml NaCl 0,2 M trong Tris-HCl 0,05 M Hỗn hợp sau đó được trích xuất bằng NaCl 1,0 M trong Tris-HCl 0,05 M (pH 7,5) tại 4oC trong 24 h Sau chiết xuất được tổng hợp bằng cách ly tâm 8000 rpm ở 4oC, quá trình hòa tan đã được thử nghiệm bằng cách trộn thử nghiệm với pepsin để đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ (4oC, 20oC và 37oC), thời gian (16 h, 32 h và 48 h) và tỷ

lệ enzym để kết tủa (1:100, 1:200 và 1:400) trên năng suất và cấu trúc thứ cấp của collagen loại II Tiếp theo phần collagen chiết sẽ đem ly tâm ở 10.000 rpm trong 30

phút để loại bỏ các chất không hòa tan Để kết tủa collagen, cho NaCl vào đến nồng

độ 0,9 M tiến hành kết tủa trong 16 h Collagen kết tủa sẽ hòa tan trong axit axetic 0,5 M (pH 2,5) và thẩm tích bằng đệm photphat 0,02 M (pH 7,4), sau đó đông khô Collagen đông khô được lưu trữ trong tủ lạnh (4oC), cho đến khi sử dụng Collagen tinh chế từ xương ức gà là điển hình loại của collagen II và có thể tìm thấy các ứng dụng trong thực phẩm chức năng Phương pháp này tận dụng được nguồn phế thải của gà là sụn Quá trình tách chiết collagen tương đối đơn giản Nhưng hệ dung môi

sử dụng để khử béo có chứa clorofom là dung môi rất độc, nếu rửa không sạch có thể ảnh hưởng đến sức khỏe người sử dụng collagen Nếu gà bị mắc bệnh dịch cúm gia cầm thì sản phẩm thu được cũng bị nhiễm virut làm lây lan qua con người [8]

Nagai T và Suzuki N (1999) điều chế collagen từ phế thải sau quá trình chế biến da, xương, vảy cá Để thu collagen từ da thì da được loại béo với 10% rượu butylic 1 ngày, rửa sạch với nước cất và đông khô Các chất không hoà tan được chiết xuất với axit axetic 0,5 M trong 3 ngày, ly tâm ở 1 h cho 20.000 rpm Phần dư được tái chiết xuất giống với phương pháp ở trên trong 2 ngày, và thực hiện trong cùng một điều kiện Tiến hành kết tủa collagen bằng cách thêm NaCl đến nồng độ 0,9 M, sau đó kết tủa collagen bằng cách bổ sung NaCl (nồng độ cuối cùng 2,6 M)

ở pH trung tính (trong Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5) Các kết tủa được thu bằng cách ly tâm trong 1 h với 20.000 rpm và hòa tan trong axit axetic 0,5 M, thẩm tích hòa tan axit axetic 0,1 M, nước cất, và sau đó đông khô Đối với collagen thu từ xương thì nguyên liệu xương sẽ được xử lý: các xương không hòa tan được khử canxi với EDTA 0,5 M (pH 7,4) trong 5 ngày bằng cách thay EDTA một lần một ngày Sau khi rửa cặn với nước cất, chất béo được loại bỏ bằng rượu butylic 10% Lượng dư sau đó được rửa bằng nước cất và đông khô Các bước đã được tiến hành như cho

da Thu collagen vây bằng cách: collagen được chiết xuất với axit axetic 0,5 M trong 3 ngày, và ly tâm trong 1 h cho 20.000 rpm Các mẫu đã được tách thành hai phần, hòa tan axit và không tan trong axit Collagen trong phần axit hòa tan được kết tủa bằng cách thêm NaCl đến nồng độ 0,8 M, theo sau là một lượng kết tủa hơn nữa của collagen bằng cách bổ sung NaCl (nồng độ cuối cùng 2,5 M) ở pH trung tính (trong

Tris HCl 0,05 M, pH 7,5) Kết tủa thu được bằng cách ly tâm 20.000 rpm trong 1 h Tiếp theo hòa tan trong axit axetic 0,5 M, thẩm tách với axit axetic 0,1 M, và sau đó đông khô Mặt khác, phần không tan trong axit đã được rửa sạch bằng nước cất và thẩm tách với EDTA 0,5 M (pH 7,4) trong 5 ngày bằng cách thay đổi các điều kiện EDTA một lần một ngày Sau khi các bước kết quả là rửa bằng nước cất, chất béo được loại bỏ với rượu butanol 10% trong 1 ngày, rửa sạch với nước cất và đông khô Các bước trên đây được tiến hành tương tự như cho da Sản phẩm collagen có nhiệt độ biến tính cao, có độ nhớt cao, có thể tận dụng được nguồn phế thải từ quá trình chế biến cá Có phương pháp tách chiết riêng cho từng nguyên liệu sử dụng khác nhau Quy trình trích chiết collagen trong nghiên cứu đơn giản Tuy nhiên, collagen thu được có độ tinh khiết còn thấp, trong bước chiết xuất chỉ sử dụng axit axetic nên hiệu suất thu nhận collagen không cao [15].

Muralidharan N và cộng sự (2011) thu nhận collagen từ da, xương và gân từ

bã cá, da cá trơn (Odonus niger) và đặc tính của chúng Nguyên liệu da, xương và

gân được cắt nhỏ thành từng miếng và được xử lý bằng NaCl 0,8 M (tỷ lệ w/v = 1:6) trong 10 phút, để loại bỏ các tạp chất Quá trình này được lặp lại 3 lần và sau

đó rửa bằng nước cất nguội Sau đó chúng được xử lý bằng NaOH 0,1 M với tỷ lệ 1:10 (w/v) trong 3 ngày Dung dịch NaOH được thay đổi mỗi ngày và cuối cùng rửa bằng nước cất nguội Collagen sau đó được chiết xuất bằng axit axetic theo 3 phương pháp khác nhau Phương pháp 1: collagen hòa tan axit được chiết xuất hai lần với axit axetic 0,5 M (tỉ lệ collagen/axit axetic = 1/10, w/v) trong 3 ngày Tiếp theo, phương pháp 2 sử dụng là collagen hòa tan trong axit lần đầu tiên được chiết xuất và sau đó collagen được chiết xuất với pepsin bằng cách thêm pepsin 0,1% (w/v) vào axit axetic 0,5 M Phương pháp cuối cùng là collagen hòa tan trong pepsin được chiết xuất hai lần Sau mỗi lần chiết, dung dịch được ly tâm ở 9000 rpm trong 20 phút ở 4oC Kết tủa dịch chiết bằng NaCl trong 24 h ở 4oC Các collagen kết tủa thu được ly tâm lần nữa ở 9000 rpm trong 20 phút ở 4oC Lượng chất dư được đặt trong túi lọc thẩm tích và lọc dưới đệm photphat trong 24 h ở 4oC.Các mẫu lọc sau đó được đông khô và bảo quản lạnh ở -20oC để phân tích thêm

Sản phẩm collagen thu được là collagen loại I có tính ổn định nhiệt cao Quá trình thu nhận collagen tương đối đơn giản, lượng hóa chất sử dụng ít Tuy nhiên thời gian loại béo bằng NaOH trong 3 ngày quá dài, làm thay đổi cấu trúc của collagen

và nồng độ kiềm mạnh nên phải rửa sạch da, xương, gân chưa có bước loại khoáng

Để chiết collagen có 3 bước nhưng chưa cụ thể được sử dụng phương pháp nào cho hiệu suất cao [11]

Seok Jeong H và cộng sự (2013) phân lập và đặc tính của collagen từ cá biển Nguyên liệu các xương được phá vỡ và chiết xuất với NaOH 0,1 N trong 3 ngày, lặp lại quá trình này 2 lần Sau đó lượng dư được rửa sạch bằng nước cất và đông khô Sau khi rửa cặn bằng nước cất, chất béo đã được loại bỏ với rượu butylic trong 3 ngày, thay đổi 1 lần 1 ngày Collagen sau đó được trích xuất bằng axit axetic với 2 phương pháp Phương pháp 1: collagen hòa tan axit được chiết xuất với axit axetic 0,5 M Phương pháp 2: collagen hòa tan axit emzym được chiết xuất bằng cách cho thêm 0,1% pepsin vào axit axetic 0,5 M, với mẫu/axit 2% (w/v) trong 4 ngày Sau đó đem ly tâm 3000 rpm trong 15 phút, lặp lại 4 lần Tiếp theo kết tủa bằng NaCl với nồng độ 0,7 M trong axit axetic 0,5 M, kết tủa các collagen bằng NaCl đến nồng độ 2,5 M Sau 1 ngày kết tủa thu được ly tâm ở 7000 rpm trong 10 phút, hòa tan trong axit axetic 0,5 M, thẩm tách với axit axetic 0,1 M, nước cất và đông khô Sản phẩm collagen thu được là collagen loại I, có cấu trúc sợi nhỏ, các sợi collagen không độc hại trong tự nhiên Phương pháp thu nhận tương đối đơn giản, quá trình trích xuất collagen bằng axit axetic chỉ được tiến hành bằng 2 phương pháp Tuy nhiên, nguyên liệu đã ngâm NaOH trong 3 ngày thì lượng béo đã được loại bỏ bớt nhưng vẫn sử dụng thêm rượu butylic nên để rửa sạch thì làm quá trình rửa nước cất phải kỹ và lâu hơn Tuy hàm lượng khoáng trong xương thấp nhưng chưa thấy bước loại bỏ khoáng [7]

Hema G.S và cộng sự (2013) Một phương pháp đơn giản để phân lập

collagen cá được chiết xuất từ cá ngừ vây dài (Thunnus alalunga), cá mập chó (Scoliodon sorrakowah) và cá trôi Ấn Độ (Labeo rohita) Phương pháp thu nhận

collagen: collagen hòa tan trong axit và collagen hòa tan trong pepsin được chiết

xuất từ da cá mập, da cá ngừ và da cá trôi Ấn Độ Tất cả các bước được tiến hành ở

4oC Các nguyên liệu ban đầu đã được băm nhỏ và trộn với NaOH 0,1 N (w/v = 1/30) và giữ khuấy trong 24 h qua một khuấy từ để loại bỏ các protein không phải là collagen Khối lượng xử lý đã được sàng qua một cái sàng thô Quá trình được lặp lại hai lần và lượng dư được rửa hai lần với 30 thể tích của nước cất ướp lạnh Lượng dư đã được đồng hóa trong một máy đồng hóa trong suốt với axit axetic 0,5

M (w/v = 1/30) trong một phút và cũng đã được khuấy trên một máy khuấy trong cho 24 h Các lớp phủ sau khi ly tâm (3000 rpm, 20 phút) được thu lại Lượng dư được chiết xuất với axit như đã trình bày ở trên và chất kết dính được lấy ra dưới dạng collagen hòa tan trong axit Phần còn lại từ bước trước được đồng hóa với axit fomic 0,5 M (nguyên liệu/axit = 1/30 (w/v)) trong 1 phút và khuấy trong 24 h Một phần pepsin (tỷ lệ enzym/gân 1:100) được thêm vào này và giữ khuấy trong 24 h NaCl tinh thể được thêm vào cả hai phần trên lên đến mức 10% và khuấy trong 24 h

để kết tủa collagen Chất kết tủa đã được thẩm tích trong bộ đệm Tris/glyxin (50

mM chứa 0,2 M NaCl, pH 7,4) và thẩm tích cùng một chất đệm trong 24 h và sau

đó ly tâm Collagen thu được đã được sấy khô và bảo quản lạnh để có được chất lượng tốt Sản phẩm collagen thu được với thành phần glyxine có hàm lượng cao hơn ở tất cả các bước chiết xuất collagen chiếm 1/3 tổng số axit amin Độ tinh khiết của collagen cao Sản lượng collagen trong da cá mập cao hơn so với da cá ngừ và

cá da trơn Tận dụng được nguồn phế thải từ quá trình chế biến cá, lượng hóa chất

sử dụng ít, phương pháp chiết xuất tương đối đơn giản Mẫu axit amin, điện di trên gel và độ hấp thụ ở collagen 200240 nm chiết xuất trong nghiên cứu này cho thấy quá trình chiết xuất tạo ra collagen tinh khiết với độ tinh khiết lớn hơn 99% Tuy nhiên, trong nghiên cứu này không thể ước lượng tryptophan trong các mẫu collagen [6]

1.3.2 Tình hình nghiên cứu collagen ở Việt Nam

Trần Thị Huyền và cộng sự (2011) Thu nhận collagen từ da cá tra bằng phương pháp hóa học Nguyên liệu da cá tra được rửa sạch, cắt miếng rồi đem xử lý kiềm để loại béo với nồng độ NaOH 0,2 M, tỷ lệ 1/10 (w/v) trong 20 h Sau khi xử

lý kiềm phải rửa sạch bằng nước cất để đưa về môi trường trung tính Bước tiếp theo khử khoáng bằng axit citric nồng độ 0,003 M, tỷ lệ 1/8 (w/v) trong 30 phút Da

cá sau khi xử lý axit citric được rửa lại bằng nước thường rồi đem xử lý H2O2 để tẩy màu cho nguyên liệu nhằm mục đích sản phẩm collagen thu được có màu sáng hơn

Để chiết collagen sử dụng axit axetic 0,5 M, tỷ lệ 1/10 (w/v) Thu kết tủa sau quá trình chiết với NaCl Tinh sạch collagen, thẩm tích trong dung môi Na2HPO4 0,02 M trong thời gian 36 h, thay dung môi 4 h một lần Cuối cùng đem sản phẩm sấy khô, bao gói và bảo quản lạnh đến khi sử dụng Collagen thu được có các thành phần hóa học và một số tính chất đặc trưng phù hợp với các tính chất của collagen thu nhận từ thủy sản Quy trình thu nhận collagen cụ thể, khảo sát đầy đủ các điều kiện để chọn được nồng độ, tỷ lệ và thời gian tối ưu Tuy nhiên, hiệu suất chiết collagen chỉ sử dụng axit axetic thấp, hàm lượng khoáng vẫn còn hơi cao [2]

Nguyen Hoang Dung và cộng sự (2011) Thu nhận collagen từ cá và ứng dụng Dung môi để loại bỏ các protein không phải collagen, mỡ, khử mùi: muối, pha loãng axit, rượu, chất tẩy rửa, H2O2, Dung môi để chiết xuất collagen: axit

(axit axetic, axit lactic) loãng, enzym (pepsin), vi khuẩn Bacillus, nấm men Nhiệt

độ: 04oC Sử dụng phương pháp chiết CO2 siêu tới hạn Collagen cá có tác dụng với da tốt hơn so với collagen từ da cầm, chiết CO2 siêu tới hạn thì sản phẩm tinh khiết hơn Dung môi không độc hại Collagen dễ bị phá vỡ cấu trúc ở nhiệt độ cao nên chiết bằng phương pháp này có thể ổn định được nhiệt độ ở 49oC Nhưng thiết

bị đắt tiền, yêu cầu áp suất cao, nhân công kỹ thuật cao [12]

Do đó, việc thu nhận collagen tận dụng da cá basa có ý nghĩa tạo ra sản phẩm

có giá trị gia tăng cao Triển vọng của nghiên cứu này là collagen bổ sung vào sản phẩm chăm sóc da

1.4 Tổng quan về kem dưỡng da bổ sung collagen

1.4.1 Tổng quan về tác dụng làm chậm quá trình lão hóa của kem dưỡng da

và quá trình lão hóa da

Kem dưỡng da có tác dụng làm tăng khả năng sinh tổng hợp của nguyên bào sợi, tạo ra môi trường sinh lý tối ưu, tăng cường hoạt động của tế bào, hydrat hóa,

và tổng hợp collagen, elastin và axit hyalorunic Hiệu quả mong muốn có thể đạt được do các vi khuẩn trong bề mặt bên ngoài của các sản phẩm chỉ chứa một thành phần hoạt chất hoặc dung dịch hỗn hợp thuốc các hợp chất khác nhau hoàn toàn tương thích sinh học và hoàn toàn hấp thụ được: axit hyalorunic, vitamin, khoáng chất, chất dinh dưỡng, nội tiết tố, nhân tố tăng trưởng, axit amin Các công thức phối trộn kem dưỡng da khác nhau khác nhau sẽ tạo ra những sản phẩm có đặc tính khác nhau Nhưng mục đích chung vẫn là bổ sung các dưỡng chất duy trì độ ẩm cho

da và làm chậm quá trình lão hóa da, [13]

Da lão hóa là một phần "tuổi già" của con người tự nhiên trở nên rõ ràng và theo thời gian theo các quỹ đạo khác nhau trong các cơ quan, mô và tế bào khác nhau Biểu hiện rõ rệt nhất của quá tình lão hóa da là trên khuôn mặt, đặc biệt là khóe mắt Da lão hoá là một quá trình sinh học phức tạp bị ảnh hưởng bởi sự kết hợp nội sinh hoặc nội tại (di truyền học, chuyển hóa tế bào, hoocmon và các quá trình trao đổi chất) và các yếu tố bên ngoài (phơi nhiễm ánh sáng mãn tính, ô nhiễm, phóng xạ, hóa chất, chất độc) Thay đổi tích tụ và sinh lý và những thay đổi tiến bộ trong mỗi lớp da cũng như sự thay đổi diện mạo của da, đặc biệt là trên các vùng da tiếp xúc với ánh nắng mặt trời Một sự mất mát đáng kể các cấu trúc dương tính cũng như giảm hàm lượng collagen loại VII (Col-7) có thể góp phần làm giảm nếp nhăn bằng cách làm yếu sự liên kết giữa lớp hạ bì và lớp biểu bì của da ở tuổi ngoài Da lão hóa tiếp xúc với ánh nắng mặt trời được đặc trưng bởi quá trình tổn thương các mô đàn hồi và collagen, gây ra nếp nhăn, chảy xệ Sự phân bố thưa thớt

và giảm hàm lượng collagen trong da có thể là do sự suy thoái collagen tăng lên bởi các chất ức chế metalloproteinase, serine và các proteaza khác không phụ thuộc vào sự sản xuất collagen giống nhau Trong da già hơn, collagen có vẻ không đều

và không tổ chức, tỷ lệ Col-3, Col-1 đã được chứng minh là tăng lên đáng kể, do sự mất Col-1 Ba thành phần cấu tạo chính của lớp hạ bì, collagen, elastin và axit hyalorunic là những chủ đề của phần lớn nghiên cứu chống lão hóa và những nỗ lực cho các chiến lược thẩm mỹ chống lão hóa liên quan đến da Do đó, có rất nhiều loại kem ra đời nhằm làm chậm quá trình lão hóa da [13]

Chức năng của một kem dưỡng da là để bảo vệ da khỏi sự khắc nghiệt từ môi trường và bất kỳ điều kiện khô của da Một làn da sẽ giúp da hoạt động bình thường, tức là phục hồi độ ẩm cho làn da khô, cho phép loại bỏ chất thải qua lỗ chân lông và làm mát cơ thể bằng cách bốc hơi nước (mồ hôi) và bức xạ, do đó trợ giúp trong việc duy trì nhiệt độ cơ thể bình thường Nếu kem làm mờ các lỗ chân lông của da với chất rắn, không trôi chảy, trơ, kết quả là lớp phủ dính dày trên da và ngăn cản các chức năng da bình thường, gây hại cho sức khoẻ [5]

1.4.2 Tổng quan về kem dưỡng da có bổ sung collagen

Với những tính chất và công dụng đối với da của collagen như đã trình bày ở trên thì kem dưỡng da có bổ sung collagen sẽ có công dụng tăng cường protein cấu trúc các elastin của da để sản sinh ra các tế bào da mới, giúp làn da hồi sinh nhanh chóng nên các vết thâm cũng sẽ bị làm mờ dần, bổ sung dưỡng ẩm cho da một cách

tự nhiên, kết hợp axit amin và protein kích thích cơ thể sản xuất ra collagen tự nhiên

như vitamin, polyphenol và flavonoid, làm giảm sự thoái hoá collagen bằng cách giảm nồng độ trung hòa các gốc tự do trong mô Các chất điều hòa tế bào, như viatmin A, peptit và các yếu tố tăng trưởng, có ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình chuyển hóa collagen và ảnh hưởng đến sản xuất collagen Để chống lão hóa thì có hai nhóm tác nhân chính có thể được sử dụng, các chất chống oxy hoá và các chất điều hòa tế bào Tuy nhiên, hiện nay nhóm chất chống oxy hóa được sử dụng nhiều hơn do giá thành và sự tiện lợi của nó [13]

Nhiều loại kem dưỡng da hiện đang được sử dụng bao gồm nhũ tương dạng nước trong dầu, một thành phần được tìm thấy trong nhiều loại kem như là một phần của pha dầu ở đó là lanolin hoặc hỗn hợp đó với các phần lanolin tinh khiết Hiệu suất của các loại kem dưỡng da có thể được tăng cường đáng kể bằng cách kết hợp các thành phần trong kem với collagen Trong thành phần của kem thì tỷ lệ phối trộn của collagen một lượng khoảng 3% đến 15% và tốt hơn là khoảng 10% trọng lượng của kem đã hoàn thành [16] Vì tính chất dinh dưỡng cao của collagen đối với vi sinh vật, cần phải kết hợp một lượng nhỏ chất bảo quản thích hợp với

collagen trong pha nước khi trộn kem mỹ phẩm Chất bảo quản điển hình là axit benzoic với lượng khoảng 0,05% đến 0,5% dựa trên trọng lượng của collagen được

sử dụng [16]

Như vậy, việc tách chiết collagen và bổ sung collagen vào kem dưỡng da là một nghiên cứu có ý nghĩa thực tiễn, có thể đem lại giá trị kinh tế cao

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Da cá basa đươc thu mua sau quá trình phi lê ở siêu thị Lotte Mart Nha Trang, phường Phương Sơn, Nha Trang Lựa chọn những con có kích thước gần bằng nhau, khối lượng khoảng 1,8–2,0 kg Lọc lấy da, loại bỏ phần thịt còn sót lại rồi bảo quản đông

2.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị

2.2.1 Hóa chất

- Axit axetic (Xilong, Trung Quốc) - Pepsin (Sigma Aldrich, Mỹ)

- Kem dưỡng trắng da (Đại Việt Hưng, Việt Nam)

2.2.2 Dụng cụ

- Bình tam giác (Duran, Đức)

- Pipet 10 ml, 5 ml (Hangzhou Sumer, Trung Quốc)

- Đĩa petri (Boeco, Đức)

- Bình định mức 1000ml, 500ml (Hangzhou Sumer, Trung Quốc)

- Máy ly tâm lạnh (Mikro 220r, Đức)

- Máy đông khô chân không (Labconco, Mỹ)

- Máy đồng hóa (Ika t25 digital ultra, Đức)

- Máy chụp SEM (Hitachi S-4800, Nhật)